香猪ATGL基因的克隆_验证及其在不同猪品种的编码区序列比较
第29卷 第2期 2011年6月
四川农业大学学报
Jour nal of Sichuan A g ricultur al U niv ersity
V ol.29 N o.2Jun.2011
收稿日期:2011-03-22
基金项目:国家973计划项目(2006CB102100)。责任作者:马长伟(E -mail:chw ma@https://www.wendangku.net/doc/d28275516.html,)
do i:10.3969/j.issn.1000-2650.2011.02.022
香猪ATGL 基因的克隆、验证及其在
不同猪品种的编码区序列比较
杨 勇1,马长伟2,赵春江3,吴常信3
(1.四川农业大学食品学院,四川雅安 625014; 2.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;
3.中国农业大学动物科技学院,北京 100094)
摘要:A T GL 基因是近年来发现的一个新基因,其表达产物脂肪甘油三酯脂肪酶(AT GL )被证明是催化三酰基甘油水解第一步反应的限速酶。本研究采用电子克隆和RT -PCR 的方法克隆并验证了贵州小香猪A T GL 基因的cD -N A 序列。克隆的香猪A T GL 基因其cD NA 序列全长2102bp,其中编码区1461bp,编码486个氨基酸。通过测序分析发现,不同猪品种间A T GL 基因的cDN A 序列及预测的蛋白质序列高度保守。关键词:A T GL 基因;电子克隆;cDN A 克隆;编码区序列;序列比较;香猪
中图分类号:Q 754;Q785;S828 文献标志码:A 文章编号:1000-2650(2011)02-0253-07
Cloning and Verification of ATGL Gene in Min-i pig and
Comparison of the Coding Sequence in Different Porcine Breeds
YANG Yong 1,M A Chang -w ei 2,ZH AO Chun -jiang 3,WU Chang -x in 3
(1.Colleg e of F ood Science,Sichuan Ag ricultural U niversit y,Y aan 625014,Sichuan,China;
2.Co llege o f Foo d Science and Nutr itional Engineering ,China A gr icultural U niver sity,Beijing 100083,China;
3.Colleg e of A nimal Science and T echno log y,China A g ricult ur al U niv ersity ,Beijing 100094,China)
Abstract:A T GL g ene w as recently identified as a nov el gene and its ex pr ession product w as named as adipo se trigly ceride lipase (ATGL),w hich w as pro ved to be the rate -limiting enzyme
that catalyse the initial step in triacy lgly cerol hydrolysis.A to tal o f 2102bp cDNA sequence of AT GL g ene w as clo ned by using the electro nic cloning and RT -PCR methods fr om Guizhou min-i pig in this study.T he co ding region of AT GL g ene cDNA w as 1461bp,w hich encoded 486amino acids.Sequencing analysis indicated that the cDNA sequence of AT GL gene and the predicted pr o -tein sequences w ere hig hly conserved among different po rcine br eeds.
Key words:AT GL gene;in silico cloning;cDNA cloning ;coding sequence;sequence compar-i sion;m in-i pig
脂肪甘油三酯脂肪酶(AT GL)也称为含类似马铃薯块茎储藏蛋白(patatin )磷脂酶结构域2(PNPLA 2),它是最近新发现的水解脂肪的酶类。在2004年和2006年,奥地利一个研究小组先后在Science 上发表论文证明了AT GL 是甘油三酯(TG)水解第一步的限速酶
[1-2]
,因此,AT GL 对贮存
于动物体内脂肪组织以及非脂肪组织中的脂质分解代谢发挥着极其重要的作用[3-4]
。很久以来,人们一
直认为激素敏感脂肪酶(H SL)是决定脂肪组织中脂肪动员和水解的关键酶类[5],可是新的研究表明,H SL 基因敲除小鼠并未出现肥胖特征,同时小鼠体内并没有出现T G 的积累,其细胞和组织中反而有
大量甘油二酯(DG)的积累[2]。当体内AT GL 基因超量表达时,脂肪细胞中脂解作用增加;反之,抑制AT GL 基因的表达时,脂肪细胞的酰基水解酶活性急剧下降[1]。还有研究表明,超量表达野生型AT GL 时,脂肪滴(LD)的体积大幅度缩小;如果用RNA 干扰的方法抑制AT GL 表达时,LD 的体积又增大[4]。另外,小鼠A TGL 通过遗传失活处理后,其体重和体内脂肪的总重量都大幅度增加,包括肌肉和心脏在内的多种组织中明显沉积了大量的脂肪[2]
。后来,对人类A TGL 基因突变的研究发现,AT GL 基因突变会引起中性脂肪贮存紊乱(neutral lipid stor ag e disorder)。这类疾病患者纤维原细胞(fibroblasts)中TG 的分解代谢出现问题,并在肝脏、肌肉和其他内脏中积累大量TG [6]。上述研究充分说明,ATGL 是哺乳动物体内T G 水解最重要的酶类。
因此可以推测,A T GL 基因也很可能是影响猪体内脂肪沉积的重要基因。本课题开始之初,国内外还没有猪A TG L 基因的信息,也没有猪AT GL 基因相关的研究和报道。本研究的目的是首先克隆香猪AT GL 基因,并在此基础上比较不同猪品种A T-GL 基因编码区的序列,为今后进一步研究A TGL 基因以及猪肉品质的分子育种奠定基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料
选择成年贵州小香猪(由中国农业大学动物科技学院香猪繁育基地饲养)、大白猪和PIC 猪(中国农业大学动物科技学院动物遗传与繁殖实验室提供)各一头,分别在屠宰后迅速取皮下脂肪若干,样品立即放入液氮中临时存放。随后所有脂肪样品置于-80e 低温冰箱贮藏。1.2 试剂、药品和设备1.2.1 主要试剂和药品
RNA 提取试剂:TRIzol 试剂和DN ase ?(In -v itro gen,美国);DEPC(Sango n,上海)。
PCR 及逆转录试剂:普通T aq DNA 聚合酶、dNT P 、PCR Buffer 等套装(TIANGEN,北京);L A Taq 及GC Buffer (T aKaRa,大连);T he Super -Script TM óFirst -Strand Sy nthesis Sy stem for RT -PCR 逆转录试剂盒(Invitr ogen,美国);PCR 扩增引物(Sangon,上海)。
琼脂糖电泳试剂:琼脂糖(Biow est,西班牙);
EB(Sigm a,美国)和T ris(Sang on,上海)。
凝胶回收试剂:普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒(离心柱型)(TIANGEN,北京)。
DNA 连接、转化与菌体PCR 鉴定试剂:pMD18-T 载体及DH 5A 感受态细胞等(TaKaRa,大连);胰蛋白胨与酵母抽提物(Megazy me,爱尔兰);琼脂以及氨苄青霉素(Sango n,上海)。其他国产分析纯试剂:氯仿、异丙醇、无水乙醇、EDT A 、硼酸、冰醋酸等。1.2.2 主要仪器设备
梯度PCR 仪(M astercy cler g radient,Eppen -do rf);PCR 扩增仪(GeneAmp System 9700,ABI);成像系统(A lphaim ager TM 2200,A alpha In -notech);超纯水系统(M ILLI -Q ,M illipo re);-80e 超低温冰箱(For ma -86C,Thermo );冷冻离心机(5417R/5804R/5415R,Eppendor f);高速离心机(5424/5415D,Eppendo rf);高压自动灭菌锅(H I -CLAV E H VE -50,H IRAYA MA);高通量组织研磨器(Tissuely ser ò,QIAGEN );涡旋振荡器(Vo r -tex -Genie 2,Scientific Industries);电热恒温培养箱(DPX -9082B -1,上海);电热恒温水浴槽(DK -80,上海);超净工作台(YT -CT -2,北京);摇振培养箱(SH K -99-ò,北京);水平电泳仪及电泳槽(DYY -6C/DYCP -31D,北京)。
1.3 实验方法
1.3.1 A TGL 基因的cDNA 克隆
采用电子克隆(in silico cloning)的方法[7-9]克隆香猪A T GL 基因(PNPLA2)的cDNA 序列。首先,在基因GenBank 中找到人类A TG L 基因的cD -NA 序列(GenBank accessio n No.:BC017280),通过BLAST n 程序(使用默认参数),在GenBank 的/dbEST 0数据库中搜索与人类A T GL 基因相似性高的猪的表达序列标签(ex pressed sequence tags,ESTs)。将相似性高且有重叠区域的几条EST s 在SeqM an
TM
ò(DNAStar 软件包)上进行拼接和延
伸,形成一条新的DNA 序列。接着用拼接出的序列再次通过BLAST 程序去搜索猪的ESTs 数据库,这样又会得到一些新的ESTs,并将新得到的ESTs 再进行拼接。按照这种方法不断搜索和拼接,直到不能找出新的EST s 为止。本研究中,通过电子克隆的方法初步得到到了猪的cDNA 拼接序列,该序列总长度为2102bp,需要对此进行验证。1.3.2 脂肪组织总RNA 的提取
总RNA 的提取方法按照Trizo l 试剂的操作说明进行。RNA 的提取质量检测采用018%的琼脂
254 四川农业大学学报 第29卷
糖凝胶电泳检测。另外,为了防止基因组DNA 的污染,逆转录之前用DNase ?处理RNA 样品,以去
掉残留DNA 。1.3.3 逆转录
逆转录过程按照试剂盒的操作说明进行。逆转录产物经简单离心收集后,每管加RN ase H 1L L,在37e 保温20m in 除去体系中残余RNA 。新合成的cDNA 可以立即进行PCR 反应,或者置于-20e 贮藏备用。
1.3.4 PCR 反应
为了验证猪AT GL 基因的cDNA 是否正确,使用Prim er Premier 5.0设计了4对引物扩增基因的不同区域(表1)。这些引物的扩增产物之间都有部分重叠区域,引物pn4能扩增包括整个编码区在内的序列(图1)
。
图1 香猪ATGL 基因cDNA 的PC R 扩增示意图
Figure 1 Schematic diagram of the RT -PC R strategy for pig ATGL gene cDNA cloning
在4对引物中,只有pn3这对引物可以使用普通Taq 酶进行PCR 扩增,其余引物必须有L A T aq 酶和GC Buffer ò的条件下完成扩增。PCR 反应体系的组成如下:
L A T aq PCR 反应体系的组成(50L L):2@GC Buffer ò,2510L L;上游引物(20L mo l/L),1L L;下游引物(20L m ol/L ),1L L;dNTP mix (各215mmo l/L),8L L;cDNA 模版,210L L;L A Taq 酶(5U/L L),015L L;无菌去离子水,1215L L 。
普通PCR 反应体系的组成(50L L):10@PCR
Buffer,510L L;上游引物(20L m ol/L ),110L L;下游引物(20L mo l/L),110L L;dNT P mix (各215m mol/L),410L L;cDNA 模版,210L L;T aq 酶(5U /L L),013L L;无菌去离子水,3617L L 。
PCR 扩增反应的条件如下:94e ,3min;然后进行39个PCR 循环,循环条件:94e 变性30s,60e (pn2和pn4为63e )退火40s,72e 延伸1min (pn4为2m in);72e 延伸8m in 。1.3.5 PCR 产物的检测与回收
上述逆转录PCR 产物采用115%琼脂糖凝胶电泳(1@TA E 缓冲液;电压5V/cm)和溴化乙啶溶液染色,然后使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的DNA 片段,并放入4e 冰箱保存。1.3.6 DNA 的连接、转化、鉴定及测序
回收的DNA 片段使用试剂盒连接与转化。DNA 的连接:离心管加入4L L 回收DNA y 加1L L pM18-T 载体y 将Solutio n ?在冰上溶解y 取5L L Solution ?加入离心管(共10L L)y PCR 仪上16e 反应215h 。
转化与培养:取连接液10L L y 加到100L L 感受态细胞DH 5A 中y 轻轻混匀y 冰上放置30min y 42e 水浴中静置90s y 立即置于冰上冷却3m in y 向离心管中加入500L L 不含氨苄青霉素的LB 液体培养基混匀y 37e 摇床振荡培养1h y 3000r/min 离心1min y 吸取200L L 上清液y 涂布于LB 固体平板(含氨苄青霉素100L g/mL)y 平板倒置y 37e 培养12~16h 。
鉴定与扩大培养:DNA 片段是否连接到载体,采用菌体PCR 的方法进行鉴定。根据鉴定结果,挑取相应菌体,用含氨苄青霉素的LB 液体培养基扩大培养(37e ,10~12h)。
将上述经过鉴定并扩大培养的菌液分别送上海英骏、上海生工和北京优博3个专业公司测序。此
表1 PCR 反应使用的引物
Table 1 Primer pairs used for PC R
引物名称N ame of primer s 引物序列(从5c 端到3c 端)Nucleot ide sequence o f pr imer s
(fr om 5c to 3c )位置P osition/bp 预计PCR 产物长度Speculat ed leng th o f P CR pr oducts/bp
pn1Fo rw ard:CT CCA GA GCGA GCG GCGA G Rever se:G A ACCGCT T CCGG GCCT C
66~84367~384319pn2Fo rw ard:G GCT T CCT CGG CG T CT A CCAC
Rever se:
CT G CCT G T CT G CT CCT T T A T CCAC
190~2101251~
1274
1085pn3Fo rw ard:T CCGCT T GCT G GA GT GGCT
Rever se:CG AT GT G GA GG GA A GA GCA GG T 1208~12261960~1981774pn4
Fo rw ard:CT G CCG CG A T GT T CCCCA AA G
137~1571918
255第2期杨 勇(等):香猪A T GL 基因的克隆、验证及其在不同猪品种的编码区序列比较
外,为了保证基因序列的正确性,对每个目的片段从PCR 扩增、回收、连接、转化到最终测序都进行重复实验(n =3)。
1.3.7 序列的比较与分析
对电子克隆最后得到的cDNA 序列使用Edit -SeqT M(DNAStar 软件包)分析其开放阅读框(open reading frame,ORF)和预测蛋白质的序列。DNA 测序结果、多序列分析与比对使用DN AStar 软件包和DNAM AN 4.0软件进行处理。根据已经预测出的不同物种ATGL 的氨基酸序列,用软件CLU ST -A L W1.83和MEGA4构建遗传进化树。本研究构建AT GL 遗传进化树使用人(NM 020376)、鼠(NM 025802)、猪(EU 009401)、牛(NM 001046005)、狗(XM 849071)以及鸡(XM 428618)的序列。此外,后来注册到GenBank 中的AT GL 序列(ABS58651和ABY76306)也用于不同品种猪的AT GL 蛋白质的比较。
2 结果与讨论
2.1 ATGL 基因cDNA 克隆与验证
通过GenBank 的BLAST 搜索,在猪的表达序列标签数据库总共找到了41条EST s 与人类AT GL 基因的cDNA 相似性较高。将这些ESTs 进行拼接时,可以形成2条没有重叠区域的序列。借助人类AT GL 基因的cDN A 序列信息,发现两条序列分布于人类A T GL 基因cDNA 的两侧,两条序列之间有8bp 的空缺。因此,将这8bp 的空缺暂时用人类的编码区序列(CDS)代替,最终拼接得到了总长度为2102bp 的猪cDNA 序列。
从琼脂糖电泳检测结果可以看出,设计的4对引物都能在特定的反应条件下产生明亮的PCR 扩增产物(图2),且所有目标条带的分子量都与预期相符,初步表明克隆的序列就是香猪A TGL 基因的cDNA 序列。
从pn1、pn2和pn3这3对引物扩增基因的区域看,它们PCR 产物之间有部分可以重叠的DNA 片段(图1)。而pn4引物扩增产物的长度为1918bp,其中包括了整个编码区的序列。每对引物进行的3次重复PCR 扩增以及3个公司对其测序的结果都完全相符,说明在本研究中PCR 反应没有出现碱基错误配对的现象。将上述扩增产物的测序结果进行比较发现,克隆的序列与当初拼接的序列完全一致,说明AT GL 基因电子克隆的序列正确,而通
过RT-PCR 扩增并测出的序列就是香猪A T GL 基
图中A 、B 、C 和D 分别代表引物pn1、pn2、pn3和pn4的PCR 扩增产物。
P anel A ,B,C and D in the fig ur e represent four different amplification by pn1,pn2,pn3and pn4respec -tiv ely.
图2 香猪ATGL 基因逆转录PCR 的电泳结果Figure 2 Electrophoresis of RT -PC R products
from ATGL gene of min-i pig
因的cDNA 序列。
本研究克隆到的香猪A T GL 基因cDNA 序列长度为2102bp,其中编码区序列长度为1461bp (GenBank accession No:EU009401)。另外,该基因cDNA 的5c 端非翻译区长度为144bp;3c 端非翻译区为497bp,且带有规则的多聚腺嘌呤信号序列(AA TAAA)和poly A 尾。通过软件分析表明,香猪A T GL 基因编码486个氨基酸,AT GL 的分子量为53116kDa,理论上蛋白质的等电点为7170。因此,从本研究克隆香猪A T GL 基因的cDNA 序列来看,电子克隆方法可以快速获得目的基因的cDNA 序列。但是,电子克隆的前提是猪的EST s 数据库必须有足够数量并含有目的基因片段的序列,同时,这些不同的EST s 最好能够互相重叠,并能尽量延伸。当然,电子克隆有时也会遇到一些问题,比如有时难以获得基因完整的5c 端序列,因为基因的5c 端保守性一般比较低,在以基因组序列为基础的电子克隆中尤其难以确定。另外,对于通过基因组结构预测获得的基因,有时候难以确定其表达的时期,给RT -PCR 验证带来困难[8,10]。如果某个基因在物种之间的保守性差,或者基因的外显子数目多并且长度较短,这种方法就难以实施[11]
。
早在上世纪90年代初,M.D.Adam s 等首先使用人脑的表达序列标签,发现了337个新基因,其中包括与其他物种高度相似的基因48个,证明了电子克隆技术是快速克隆新基因经济且有效的方法[7]。从此以后,国内外都有大量新的功能基因通过这种方法克隆并最终在染色体上定位。近年来,随着人类基因组计划的完成和分子生物学研究的不断深
256 四川农业大学学报 第29卷
入,EST s 及在此基础上进行的电子克隆技术必将在研究人和动物功能基因组中将发挥举足轻重的作
用[8-12]。
2.2 ATGL 基因的同源性分析
将GenBank 中不同物种A TGL 基因进行对比发现,猪A TGL 基因的CDS 序列与牛、人、狗、小鼠和鸡的A T GL 基因编码区的相似性分别为8816%、8218%、8011%、7211%和6519%。预测出的猪ATGL 蛋白质序列与牛、人、狗、小鼠和鸡的相似性
也分别达到8712%、7914%、8113%、7617%和6510%(图2~3)。不同物种间ATGL 蛋白质的相
似性较高,而patatin 结构域的相似性极高,这充分说明ATGL 的功能在物种进化过程中是高度保守的。从序列对比图中还可以看出,AT GL 的patatin 结构域中具有规则的富含甘氨酸的结构(GXGXXG)以及含丝氨酸活性位点的水解酶结构(GXSXG)(图3)
。
1圆点代表与猪的序列相同,框中的序列表示与猪不相同;o阴影部分表示AT GL 蛋白质的patatin 区域;?G XG XXG 表示富含甘氨酸的结构;GXSXG 表示patatin 结构域中含丝氨酸活性位点的水解酶结构。
1residues that match pig ex act ly w ere indicated by do t,and box ed r esidues show that t he sequence differ fro m pig ;othe shadow ed section of t he alignments r epr esents t he patatin domain of A T G L pro tein;?GXG XXG r epr esents the g ly cine -r ich mo tif,and GXSXG sho ws the active sit e o f serine hydro lase motif wit hin the patatin do main.
图3 猪ATGL 蛋白质序列与其他物种ATGL 蛋白质序列的比较
Figure 3 Multiple alignments of the protein sequence of pig ATGL with other ATGLs from dif ferent species
257第2期杨 勇(等):香猪A T GL 基因的克隆、验证及其在不同猪品种的编码区序列比较
通过不同物种ATGL 氨基酸序列构建的遗传进化树见图4。从图中可以看出,从遗传进化的角度来看,香猪的ATGL 与牛的更为接近。另外,从遗传距离上看,鸡的AT GL 与其他4个物种的相差较远,所以,鸡在进化树上属于截然不同的类群。另外,根据AT GL 的序列,猪、牛、人聚类在一起,而进化树上小鼠和狗的AT GL 更为接近。本研究构建的遗传进化树所显示出的物种进化关系与传统分类学上的物种关系相符合,这也进一步说明克隆的基
因序列正确。
1进化树的构建方法采用邻接法;oBoo tst rap test 的重复次数选择500;?进化距离的计算模型使用Pois -so n M o del;?其他参数的设置选择M EGA 4的默认值。
1phy log enet ic t ree was co nstr ucted by using the Neighbor -Jo ining metho d;o"500"replicates w ere se -lected in the bootstr ap t est;?the evolutionar y distances wer e computed using the Po isso n M odel;?the rema-i
ning par amet ers w ere cho sen acco rding to the default set -t ing s of M EG A4.
图4 根据不同物种A TGL 蛋白质序列构建的遗传进化树
Figure 4 Phylogenetic tree based on protein sequences of ATGL from different species
2.3 不同品种猪ATGL 基因编码区序列比较
为了分析同种动物不同品种之间A TGL 基因的是否存在差异,本研究对3个不同猪品种之间AT GL 基因的编码区序列进行了独立的测序和分析比较。从表2可以看出,3个猪品种A T GL 基因的编码区有4个潜在的多态性位点,但是,这些位点核苷酸的变化并没有导致香猪、大白猪和PIC 猪AT GL 氨基酸序列的改变。此外,将这3条序列与后来注册到GenBank 中的其他猪品种A T GL 序列(ABS58651和ABY76306)进行比较,发现A TGL 基因的编码区cDNA 序列及蛋白质序列在猪品种之间高度保守(此处未显示比较结果)。
不久前,A TGL 被确认为是人类和小鼠(A T-GL )
[1]
、昆虫(Dr osop hila melanogaster ,Br um -
mer)[13]、植物(Ar abidop sis thaliana,S UGA R -DE -PEN DE NT 1)[14]以及酵母(S accharomy ces cer ev i -siae,Tg l 4)
[15]
脂肪分解代谢的关键酶类,同时,从
酵母到哺乳动物AT GL (或A TGL 的同源基因)在
功能上具有保守性。
表2 不同猪品种间ATGL 基因编码区潜在的多态性位点Table 2 Potential polymorphism sites detected in the coding sequence of ATGL gene from dif ferent pig breeds 猪品种P orcine breeds 编码区中潜在多态性位点的位置P ositions o f the po tential polymo rphism
site in coding sequence/bp 891103813291374香猪G G A C 大白猪A G G T P IC 猪
G
T
A
C
在许多物种上,A TGL 基因突变或基因敲除的生物都表现出严重的脂肪代谢疾病或功能障碍。据报道,编码人类AT GL 的基因存在一种突变形式,AT GL 蛋白质在含有丝氨酸活性位点的patatin 结
构域不会受到影响,但是蛋白质的疏水结构域存在缺陷,这样也会出现中性脂肪贮存症(NLSD),并且有鱼鳞癣和中度肌病症状[6]。随后,M.Akiyama 等[16]
研究发现了A T GL 基因异常的突变纯合子,患者不仅表现为N LSD,而且出现了严重的肌病。与此相类似,将小鼠的A TGL 基因进行遗传失活,小鼠体内多数组织中由于T G 的大量堆积使脂肪重量增加,同时,AT GL 缺失小鼠的心脏中也积聚了大量脂肪,最后导致小鼠心脏功能紊乱和提前死亡[2]。在果蝇的研究中发现,AT GL 的同源酶类Brummer 在遗传失活之后也会出现脂肪动员受限和脂肪过度积累[17]。如果将酵母的同源基因T gl 4敲除,生长细胞就不能正常降解T G 而出现/肥大酵母0(fat yeast)[15]。因此,AT GL(及同源蛋白质)在正常脂肪代谢中有着极其重要的作用,如果生物体的A T GL 基因(及同源基因)突变则会出现严重的脂肪代谢障碍和异常。
本研究之初,我们希望或许能从肌内脂肪含量明显较高(香猪去势公猪背最长肌的平均值为2121g /100g)[18]和含量较低(大白猪去势公猪背最长肌的平均值为1138g/100g )[19]的猪品种中寻找A T GL 基因编码区的多态性位点,尤其是可以使蛋白质序列发生改变的多态性位点。实验结果表明,A T GL 的氨基酸序列在性状表现明显不同的猪品种之间没有差异。因此,在同一物种内正常动物个体之间的ATGL 可能完全相同。
3 结论
采用电子克隆及逆转录PCR 的方法克隆并验证了香猪A TGL 基因的cDN A 序列。香猪A T GL
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基因的cDNA 序列全长2102bp,其中编码区长度为1461bp,编码486个氨基酸;AT GL 预测分子量
为53116kDa,理论上蛋白质的等电点为7170。
香猪A T GL 基因编码区序列与牛、人、狗、小鼠和鸡A T GL 基因CDS 的相似性分别为8816%、8218%、8011%、7211%和6519%。香猪A TGL 的预测蛋白质序列与牛、人、狗、小鼠和鸡的相似性也分别达到8712%、7914%、8113%、7617%和6510%。不同物种间ATGL 蛋白质的相似性较高,而patatin 结构域的相似性极高。构建的遗传进化树所显示出的物种进化关系与传统分类学上的物种关系相符合。
不同猪品种之间A T GL 基因的编码区有4个多态性位点,但A T GL 的氨基酸序列在不同品种之间完全相同,表明A TGL 基因的编码区cDNA 序列及蛋白质序列在猪品种之间高度保守。
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(本文审稿:曾先文;责任编辑:秦碧雯;英文编辑:刘益平)
259第2期杨 勇(等):香猪A T GL 基因的克隆、验证及其在不同猪品种的编码区序列比较
转基因动物与克隆动物的区别
转基因动物与克隆动物的区别：转基因，用人工方法将外源基因导入或整合到其基因组内，并能将此外源基因稳定的遗传给下一代的一类动物[1]。由于转基因动物体系打破了自然繁殖中的种间隔离，使基因能在种系关系很远的机体间流动（有性繁殖）。克隆，通常是一种生物技术，以人工诱导的无性生殖方式或者自然的无性生殖方式（例如：植物），产生与原个体有完全相同基因组之后代的过程。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一种生物完全一样。 基因工程的内容，原理，步骤：是利用DNA重组技术，将目的基因与载体DNA在体外进行重组，然后把这种重组DNA分子引入受体细胞，并使之增殖和表达的技术[1]；取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；构建基因的表达载体；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。基因工程是人类根据一定的目的和设计,对DNA 分子进行体外加工操作,再引入受体生物,以改变后者的某些遗传性状,从而培育生物新类型或治疗遗传疾病的一种现代的、崭新的、分子水平的生物工程技术 现代生物工程：现代生物技术包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等五大工程技；可分为农业生物技术、医学生物技术、植物生物技术、动物生物技术、食品生物技术、环境生物技术等。[1] 生态系统(Ecosystem)是指在一个特定环境内，相互作用的所有生物和此一环境的统称。此特定环境里的非生物因子（例如空气、水及土壤等）与其间的生物之间具交互作用[2]，不断地进行物质的交换和能量的传递，并借由物质流和能量流的连接，而形成一个整体，即称此为生态系统或生态系。 中国的环保策略：科学协调行业间关系，制定持续发展规划；实现森林资源的供需平衡，持续利用；建立自我调节的生态系统；提高人们的“绿色环保”意识；完善相关法律并严格执行；林业的可持续发展，城市的可持续发展 公害public nuisance，凡由于人类活动污染和破坏环境，对公众的健康、安全、生命、公私财产及生活舒适性等造成的危害均为公害，由于大气污染、水体污染、噪声污染、振动、恶臭等所影响和侵害的是不特定的公众，所以由此产生的危害一般均称为公害。
【高中生物】功能基因的克隆及生物信息学分析
（生物科技行业）功能基因的克隆及生物信息学分析
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structuralgenomics）转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多
控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因 首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法 结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸
2019年高考生物考前提分仿真试题五含答案
2019届高考名校考前提分仿真卷 生物（五） 注意事项： 1、本试卷分第Ⅰ卷（选择题）和第Ⅱ卷（非选择题）两部分。答题前，考生务必将自己的姓名、考生号填写在答题卡上。 2、回答第Ⅰ卷时，选出每小题的答案后，用铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑，如需改动，用橡皮擦干净后，再选涂其他答案标号。写在试卷上无效。 3、回答第Ⅱ卷时，将答案填写在答题卡上，写在试卷上无效。 4、考试结束，将本试卷和答题卡一并交回。 一、选择题（共6小题，每题6分，共36分，在每小题的四个选项中，只有一个选项是符合题目要求的） 1．下列有关细胞结构和功能的叙述，正确的是（） A．原核细胞中不存在既含有蛋白质又含有核酸的结构 B．真核细胞的细胞骨架与细胞运动以及物质运输等生命活动有关 C．真核生物与原核生物的细胞呼吸过程完全不同 D．真核细胞既有DNA又有RNA，而原核细胞只有DNA构成的拟核 2．基因I和基因Ⅱ在某动物染色体DNA上的相对位置如图所示，下列说法错误的是（） A．基因I和基因Ⅱ可能决定动物的同一性状 B．基因I的表达产物可能影响基因II的表达 C．基因I和基因Ⅱ可能在多种细胞中都表达 D．基因I和基因Ⅱ在转录时不存在A和T配对 3．下列关于细胞呼吸的叙述，错误的是（） A．细胞呼吸是一系列有控制的氧化还原反应 B．无论是木材的燃烧还是细胞呼吸，反应的本质都是纤维素或葡萄糖中的碳氧化为二氧化碳，氢被氧化成水 C．当你用手长时间举着一个重物时，手臂会感觉酸软乏力，这时你的肌肉细胞主要进行厌氧呼吸 D．食品包装上的“胀袋勿食”与微生物的酒精发酵有关 4．如图为生长素（IAA）对豌豆幼苗茎内赤霉索生物合成影响的示意图。图中GA1、GA8、GA20、GA29是四种不同的赤霉素，只有GA1能促进豌豆茎的伸长。若图中酶1或酶2的基因发生突变，会导致相应的生化反应受阻。据图分析，下列叙述正确的是（） A．酶2基因突变的豌豆，其植株较正常植株矮 B．对酶1基因突变的豌豆幼苗施用GA20，该植株可恢复正常植株高度 C．用生长素极性运输抑制剂处理豌豆幼苗的顶芽，该植株较正常植株高 D．对去顶芽豌豆幼苗外施适宜浓度IAA，该植株茎内GA1的合成可恢复正常 5．在基因型为AaX B X b、AaX B Y的果蝇产生正常配子过程中，下列叙述错误的是（） A．次级卵母细胞在分裂后期含有2条X染色体 B．卵巢中某卵原细胞可产生aX B、A、AX b X b三个极体 C．一个精原细胞经减数分裂可直接产生AX B、aY两种精子 D．雄果蝇的X B与X B、Y与Y分离发生在减数第二次分裂后期 6．假设某草原上散养的某种家畜种群呈S型增长，该种群的增长(速)率随种群数量的变化趋势如图所示。下列说法正确的是（） A．如果把横轴含义换为“时间”，曲线图的变化趋势会有改变 B．丙丁两点种群数量相等 C．若丙点对应的种群数量为200只，则该种群在此环境中负荷量应超过400只 D．若要持续尽可能多地收获该种家禽，则应在种群数量丙丁之间纵坐标最高点对应的种群数量时捕获 二、非选择题（共4小题，除特别说明外，每空2分，共39分） 29．（9分）马拉松是典型的耐力型运动项目，有氧供能是马拉松运动供能的主要方式。改善运动肌利用氧是马拉松项目首要解决的问题之一。下图是两个运动员在不同运动强度下进行测试，测得血液中乳酸含量与摄氧量之间的变化关系。 回答下列问题：
基因克隆及转基因方法
基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.wendangku.net/doc/d28275516.html,sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul；
红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
转基因猪的研究进展
遗传育种 GENETICS?AND?BREEDING 猪业科学 SWINE INDUSTRY SCIENCE 2009年 第9期823 讨论 本次试验结果表明，经过近5年的选优提纯，目前杜洛克、长白、大白猪的生长和肉用性能已达到较高水平，生长肥育猪的平均日增重都在800 g 以上，料肉比在2.9以下，背膘较薄，眼肌面积和后腿比例大，瘦肉率达68%左右，肉质完全正常，无PSE 肉、DFD 肉，取得了较理想效果。这些品种生产的杜×长大日增重达926 g，料肉比2.53，而且杂优率十分明显，分别达13.1%和-7.66%。文中胴体和肉质性状的杂优率大多较低，这符合一般规律。至于失水率、肉色及大理石纹等级及贮存损失的杂优率出现偏高、偏低现象，可能主要原因在于抽样误差。 主要参考文献： [1]施启顺, 柳小春主编. 养猪业中的杂种优势利用[M].长沙: 湖南科技出版社, 1997. [2]施启顺, 柳小春，陈斌，等.杜洛克、长白、大白猪肉的杂交效果分析[J].上海畜牧兽医通讯,2005,(1):28-29. [3]施启顺，柳小春，陈斌 等. 杜洛克、长白、大白猪间的二元、三元杂交效果分析[J].养猪,2005,(5):17-18. [4] 施启顺，柳小春，吴晓林. 杜洛克、长白、大约克猪生长和肉用性状的杂交参数估计[J]. 中国农业科学，1998，31（4）：65-69.[5] Moeller S.J., R.N. Goodwin, R.K. Johnson et al. The nationa l pork producers council maternal line national genetic evaluatio n program: a comparison of six maternal genetic lines for female productivity measures over four parities[J]. J. Anim. Sci., 2004,82(1):41-53. [6]Rothschild M F, Runvinsky A. The Genetics of The Pigs[M]. CA B INTERNATIONAL,1998,21-34,488-491. (收稿日期：2008-09-17) 转基因猪的研究进展 杜金芳，王 慧* （山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018） 摘 要：自80年代转基因动物模型建立以来，转基因动物已应用于生命科学的各个领域，尤其在生物反应器、异种 器官移植和提高动物生产性能等方面得到了广泛的应用。转基因动物越来越受到人们的重视，由于猪在解剖、组织、生理和营养代谢等方面均与人类最接近，又是一种重要家畜，所以转基因猪的研究越来越受重视。本文综述了转基因猪的常用技术方法，尤其是显微注射法、核移植法等几种主要方法，评价了转基因的研究概况和转基因猪的热点应用领域等。 关键词：转基因猪；核移植；显微注射法 转基因技术就是用实验方法将外源基因导入猪的基因组，使外源基因与猪的基因组进行整合并在猪体内表达的技术。猪是与人类生活关系最为密切的家畜之一，由于猪具有妊娠期短、繁殖力高和后代生长快等特点，使猪成为常用的实验动物；又由于猪在解剖、组织、生理和营养代谢等方面均与人类最接近，所以随着转基因技术的发展和人民生活水平的提高，转基因猪成为不可替代的研究模型，因而，吸引了众多科学家的极大热情。目前，随着分子生物学技术的不断发展和新的精子介导法等转基因方法的不断完善，使转基因猪的研究和应用前景更加诱人。 1 转基因猪的研究方法 1.1 显微注射法 显微注射法是在显微镜下将外源基因注入到原核期或经重构发育至原核期的受精卵细胞的胚胎原核中，注射的外源 基因与胚胎基因组融合，然后进行体外培养，最后移植到受体母畜子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有新的DNA 片段，此即转基因后代。 显微注射法的缺点是：效率较低，位置效应(外源基因插入位点随机性)造成表达结果的不稳定性，动物利用率低。由于需要注射进核内，所以会有机械损伤而影响细胞的正常生长。其优点是外源基因的转移率和整合效率都较高。猪的转移率和整合效率为0.98%。世界上首次报道的转基因猪就是Hammer 等(1985)用原核注射技术得到的。 1.2 核移植转基因法 细胞核移植一般分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。体细胞核移植转基因猪的研究进展飞速。具体的技术方法是，先把外源基因与供体细胞在培养基中培养，使外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞的细胞核移植到去核卵母细
基因克隆技术的研究进展_钟军
第6卷第4期(专辑) 2002年12月 生命科学研究 Life Science Research Vol.6No.4(Suppl.) Dec.2002基因克隆技术的研究进展X 钟军,李,官春云 (湖南农业大学油料作物研究所,中国湖南长沙410128) 摘要:为能快速而准确地克隆目的基因,综述了一些基因克隆常用技术,包括差异表达基因分离技术、转座子标签技术、图位克隆技术、同源序列技术、表达序列标签技术的原理、应用及应用潜力,并对其作了简要的评价. 这些技术有利有弊,应根据不同的实验目的和水平来选择相应的技术. 关键词:基因;克隆;差异表达基因分离技术;转座子标签技术;图位克隆技术;同源序列技术;表达序列标签技术 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1007-7847(2002)S1-0148-05 Advances in Gene Cloning Technique ZHONG Jun,LI Xun,GUAN Chun-yun (T he Oil Crop Institute of H unan Agriculture University,Chan gsha410128,H unan,China) Abstract:To clone candidate gene quickly and correctly,advances about gene cloning included map-based cloning, transposon tagging,homology-based candidate gene method,expressed sequence tagging methods and some differen-tially expressed gene clone method are introduced and appraised.Because of the advantages and disadvanta ges of those techniques,various technique should be selected according special purpose and level. Key words:gene;clone;differentially e xpressed gene clone method;transposon tagging;map-based cloning;ho-mology-based candidate gene method;e xpressed sequence ta gging method (Li f e Science Research,2002,6(Suppl):148~152) 克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行.近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术:差异表达基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序列技术等. 1差异表达基因分离技术 1.1扣除杂交技术 扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取mRNA经逆转录形成cDNA探针,与无特异性表达基因的参照样的过量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样mRNA或cD-NA,将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标样cDNA纯化富集、扩增,建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库.此技术最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DNA;将两者一起变性、复性,再将产物克隆入表达载体的Bam H I位点中,只有那些两端有GATC序列的基因才能被克隆入载体,这样就达到了扣除两者共有序列的目的,并得到雄性小鼠 X收稿日期:2002-06-11;修回日期:2002-10-14 作者简介:钟军(1973-),女,湖南沅江人,博士研究生,从事分子遗传学研究.Tel:+86-0731-*******,E-mail:zhhjp@s https://www.wendangku.net/doc/d28275516.html,
功能基因的克隆及生物信息学分析
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。
基因工程原理讲义：目的基因的克隆
第九讲目的基因的克隆 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月
目录 一、基因克隆的一般概念 1．基因克隆定义 2．“克隆”的不同含义 3．基因克隆的过程 4．DNA片段的产生与分离 5．基因文库 二、基因克隆与分离的实验策略 1．物理策略 2．生物策略 3．克隆样品的选择 4．基因文库库容测算 三、cDNA基因克隆 1．概述 2．cDNA文库的构建 3．低丰度mRNA之cDNA克隆 4．稀少mRNA的cDNA克隆 5．全长cDNA的合成 6．cDNA克隆的优越性 四、基因组DNA克隆
1．cDNA克隆的局限性 2．基因组DNA克隆的优越性 3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆 1．基因定位克隆概述 2．RFLP分子标记 3．RFLP作图原理与步骤 4．染色体步移 5．大尺度物理图谱的构建
目的基因的克隆 一、基因克隆的概念 1．基因克隆的定义 基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。 *要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。 *有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：
绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
转基因克隆技术
转基因克隆技术研究进展 摘要：转基因克隆技术是最近发展起来的利用细胞核移植技术生产转基因动物的方法，它是以动物体细胞为受体，将目的基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。与传统转基因方法相比具有明显的优势。本文概述了传统转基因技术的缺陷、转基因克隆技术的优越性、研究概况以及目前存在的问题等。 关键词：转基因动物克隆转基因克隆 引言： 转基因动物( transgenic animal)是指用人工方法将外源基因导入动物受精卵或早期胚胎细胞，使外源基因与动物本身的基因组整合，并随细胞的分裂而增殖，从而将外源基因稳定地遗传给下一代的工程化动物。[ 1 ]在转基因动物作为当今生命科学中一个发展最快、最热门的领域正在改变着生物医药、农业生产、环境保护、生物材料，甚至是整个生命科学的研究与发展面貌的时代背景下，如何高效率低成本的生产出所期望的转基因动物已成为科学界甚至商界关注的热点。 克隆(cloning)是英语“clone”音译，来源于希腊语“klon”[2]，原意是扦插枝条，即无性繁殖。动物克隆指不通过精子和卵子受精过程而获得与亲本具有相同遗传物质后代的过程。由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，所以在一般情况下人们往往把它称为动物克隆技术。克隆技术的发展为转基因动物的研究应用带来了契机，两者的结合既有迫切性又有必然性。而且，这种结合不仅仅是简单的技术叠加，而是技术的重组、综合和优化[3]。 转基因克隆动物技术是转基因动物技术与克隆动物技术的有机结合，它是以动物体细胞(包括动物成体体细胞、胎儿成纤维细胞等)为受体，将目的基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。[3]转基因技术与克隆技术结合，创建转基因克隆动物，已经成为本世纪培育遗传工程动物的主导性技术途径。转基因克隆技术作为一种高效而低成本生产转基因动物的技术已经为转基因动物的生产带来了新的契机。本文概述了传统转基因技术的缺陷、转基因克隆技术的优越性、研究概况以及目前存在的问题等。 1.动物传统的转基因技术概述 现代转基因动物研究始于20 世纪80年代初。1980年， Gordon等首次报道用显微注射法获得转基因小鼠。1982年， Palmiter等将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵的雄性原核中，获得了个体比对照鼠增大一倍的“超级小鼠”，从此揭开了转基因动物研究的新篇章[1，4]。先后出现了显微注射法、反转录病毒载体法、胚胎干细胞介导法、精子载体法等转
基因克隆的技术
基因克隆技术 摘要：基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA 片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。本论文主要从以下几个方面来介绍基因克隆技术：目的基因的获得、目的基因和载体的连接、重组分子的扩增和鉴定。 关键词：目的基因；限制性内切酶；克隆；重组分子 ABSTRACT：Gene cloning technology is the core of molecular biology technology, its purpose is obtain a gene or DNA fragments of the copy, used for in-depth analysis the structure and function of genes, and may achieve human cells and the transformation of the species genetics purpose.This thesis mainly from the following several aspects to introduce gene cloning technology: the purpose of the gene for the purpose, genes and carrier, restructuring of the molecules connected amplification and identification. Keywords：purpose gene;restriction endonuclease;clone;restructuring molecules 基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。“分”是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 1. 目的基因的获得 目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,。所需目的基因的来源, 不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR 法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选[1] 1.1 PCR方法
基因克隆和表达
Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.wendangku.net/doc/d28275516.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006
第五章基因克隆技术
第五章基因克隆技术 基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。 基因克隆的一般程序为： 一、获取目的基因 目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。 2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。 3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。 4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。 二、选择适当的载体 按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。理想的载体应该是：(1)分子量较小，能在细胞内自主复制的环状或线状DNA分子；(2)具有特异的限制性酶切位点，便于外源DNA片段的插入，且有明显的遗传筛选标志，如抗药性或插入失活等，以利于阳性克隆的筛选；(4)具有生物安全性。常用的克隆载体可分为三类，即质粒、噬菌体及病毒。由于天然载体用于基因克隆存在许多缺点，现用载体实际上是在天然载体基础上进行改造而成。 1、质粒载体质粒是细菌染色体外小型环状DNA复制子，质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。质粒载体具有如下特点：分子相对较小(3~10kb)；含松弛型复制子因而在