刺糖多胞菌合成多杀菌素的基因研究
刺糖多胞菌合成多杀菌素的基因研究
叶丽娟，王辂*
（中国医药集团四川抗菌素工业研究所，成都 610052）
摘 要：多杀菌素是由刺糖多孢菌产生的一种新型大环内酯类混合次级代谢产物，为新型、高效、安全的生物杀虫剂。该类化合物由一个12元大环内酯以及一个中性糖和一个胺糖构成。多杀菌素生物合成基因大部分聚集在刺糖多孢菌基因组上约80kb大小的区域中。该区域DNA已被完全测序，并通过破坏目的基因的方法，对这一区域DNA的特性和功能进行了深入研究。多杀菌素生物合成基因簇包括5个编码I型聚酮合成酶的基因和14个与大环内酯结构修饰有关的基因，另外还有4个编码鼠李糖的基因未包含在上述基因簇中。
关键词：多杀菌素；刺糖多胞菌；生物合成；基因；聚酮合成酶；大环内酯
中图分类号：R978.1+9；Q939.9 文献标识码：A 文章编号：10001-8751(2009)04-0164-07 Study on Spinosad Synthetic Genes in Saccharopolyspora spinosa
YE Li-juan, WANG Lu
(Department of Pharmaceutical Chemistry, Sichuan Industrial Institute of Antibiotics, China National Pharmaceutical Group
Corporation, Chengdu 610052, China)
Abstract：As a serial of novel, efficient and safe bio-insecticides, spinosad are produced by Saccharopolyspora spinosa and are catalogued into macrolide secondary metabolites. These compounds are composed by one neutral sugar (rhamnose), an amino sugar (forosamine), and a 5,6,5-tricyclic ring system fused to a 12-membered macrocyclic lactone. In the bacteria producing these compounds, most of the macrolide biosynthetic genes clustered together in a 70~80kb region of the genome. DNA in this region has been sequenced and the character and function of it has been intensively studied by interrupting target gene. The gene clusters in charge of spinosad biosynthesis include 5 genes encoding polyketide synthase typeⅠ(PKS-Ⅰ), 14 genes required for modi?cation of macrolide. Another 4 genes encoding for rhamnose are not included in the above-mentioned gene clusters.
Key words: spinosad; Saccharopolyspora spinosa ; biosynthesis; gene; PKS; macrolide
杀虫剂在人类日常生活中起着重要的作用，它们不仅对农作物有保护作用，还可以有效阻止蚊虫对疾病的传播，如疟疾。然而，过去几十年对高毒性杀虫剂的使用未进行严格控制，造成环境破坏，许多非靶标生物也遭到毒杀。所以，开发具有高选择性和低毒性的新型杀虫剂迫在眉睫[1]。
1997年美国陶氏益农公司推出的多杀菌素(商品名：菜喜)即是一类新型高效的生物杀虫剂。多杀菌素因具有低毒、低残留、自然分解快、对已知杀虫剂无交叉耐药性等特点，1999年荣获美国“总统绿色化学品挑战奖”。而多杀菌素最初是由美国礼来公司科研人员于1989年从维尔群岛土壤中分离的刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵液中分离得到[2]，随后经NMR和X-射线晶体衍射鉴定为大环内酯类物质[3]，目前已鉴定出34种结构类似物[4]，其中以多杀菌素A和D(化学结构见图1)活性最高。
天然产生的多杀菌素类化合物由一个与5,6,5-三环系统相联的12元大环内酯，以及一个中性糖(鼠李糖)和一个胺糖(福乐糖)构成[5]。同时还存在两类不含糖基的化合物：拟甙元类化合物(不含胺糖)和反拟甙元类化合物(不含中性糖)。这些化合物均可由S. spinosa发酵产生，且不同菌株所产多杀菌素比例
收稿日期：2009-01-19
作者简介：叶丽娟，硕士，主要从事微生物遗传育种及培养过程优化的研究。
通讯作者：王辂，硕士，主要从事微生物天然药物的研究，Tel: 028-********, E-mail: L.Wang@https://www.wendangku.net/doc/da13129388.html,.
不同，如NRRL 18395、18537、18538、18539主要合成多杀菌素A-J ，NRRL18823主要合成多杀菌素Q-T ，NRRL18743主要合成多杀菌素K 、O 、P 、U 、 V 、W 、Y 。然而这些原始菌株在发酵生产多杀菌素A 、D 时转化率太低，往往需要大量的发酵液才能提取少量多杀菌素。因此礼来和陶氏益农的研究员开始着手对S. spinosa 的基因研究，并通过克隆多杀菌素合成途径中关键酶的基因成功地提高了多杀菌素的产量[6]。这也为生产新的具有不同杀虫谱的多杀菌素衍生物提供了可行方法。本文将阐述多杀菌素生物合成途径和合成途径中关键酶的基因簇功能。1 多杀菌素的生物合成1.1 合成途径
13
C 放射性标记和生物转化研究以及现代基因序列分析[7]发现S.spinosa 是按聚酮合成途径合成多杀菌素的内酯环，再在C9和C17上分别与鼠李糖和福乐糖胺结合。因此多杀菌素的合成可分2个不同阶段。
首先2~3个碳的羧酸类前体(如：丙酰辅酶A)在酶作用下通过逐步缩合和修饰合成线形的聚酮链，再通过硫酯酶催化成环，接着在spnF , spnJ , spnL 和spnM 基因编码的酶作用下，于大环内酯分子的C3~C14、C4~C12和C7~C11之间形成交联桥，生成4元环甙元中间体[8](图2)。这一过程与其他大环内酯类药物(如：红霉素、阿维菌素和雷帕霉素)的合成过程相似[9]。
多杀菌素合成的第二阶段是在酶促作用下将由D -葡萄糖-1-磷酸合成的NDP-鼠李糖结合到甙元中间体上，再通过甲基化修饰酶形成拟甙元，在特异的糖基转移酶作用下将NDP-二甲基-福乐糖胺结合在拟甙元上，形成终产物多杀菌素[8]。有趣的是只有在鼠李糖与甙元中间体结合后，才能与福乐糖胺结合。1.2 关键酶
S .spinosa 与其他合成大环内酯的细菌一样，其
生物合成基因聚集成簇，长度约70~80kb ，在这段基因序列的中央有3~5个高度保守的基因负责编码合成多杀菌素内酯环的关键酶——I 型聚酮合成酶(PKS)。PKS 是一个结构和功能复杂的多酶体系，由一个起始组件和多个延伸组件构成，每一延伸组件都可向聚酮链上添加一个特异的乙酰辅酶A 前体，同时还能对β-酮基进行特异的修饰。因此，PKS 中延伸组件的组成及其次序决定着聚酮链的结构。而这些组件又由多个具有不同功能的催化区域构成。其中起始组件由乙酰转移酶(AT)区域构成，该区域可将前体的乙酰基转移到酰基载体蛋白(ACP)上。延伸组件由β-酮合成酶(KS)、β-酮还原酶(KR)、脱水酶(DH)、烯酰还原酶(ER)和硫酯酶(TE)区域构成，各具不同催化功能[4]。
多杀菌素内酯环的修饰包括甲基化以及非常见糖基的掺入。催化这些反应的酶基因多数聚集在PKS 基因周围，编码脱氧糖合成酶系[10]和特异的糖基转移酶。其中脱氧糖合成酶系包括葡萄糖核苷转移酶、脱水酶、差向异构酶、酮还原酶、转氨酶等，分别催化葡萄糖的活化、脱水、变构、还原、转氨等反应[11]，再由特异的糖基转移酶——鼠李糖转移酶、O-甲基转移酶和福乐糖胺转移酶催化结合在内酯环分子上。
2 多杀菌素生物合成基因簇
Waldron 等报道通过分子探针，营养缺陷型菌株的回复突变以及染色体步查法测定S .spinosa 多杀菌素生物合成基因和相关的可读框(ORF)的序列(共80 ku ，详细核苷酸序列参见US Pat 0023343 A1)，包括spnA-spnS 、ORFL15、ORFL16、ORFL1、ORFL2、S .spinosa gtt 、S .spinosa gdh 、S .spinosa epi 和S .spinosa kre [12]。这些基因在多杀菌素生物合成途径中的大致功能可参看图2，下文对其具体功能进行细致探讨。2.1 PKS 基因
多杀菌素PKS 基因序列包括5个具有框内终止子的可读框：spnA-spnE ，相互之间头尾紧密相接 (图3)，中间无任何非PKS 功能基因。这5个多杀菌素PKS 基因的核苷酸序列和相应编码的多肽已全部鉴定[4](表1)。
spnA 编码起始组件(碱基序:21126-24041)和延伸组件1(碱基序:24102-28649)。起始组件和延伸组件1中各功能域的核苷酸序列和相应的氨基酸序见表2。
spnB 编码延伸组件2(碱基序:29024-35125)。延伸组件2
中各功能域的核苷酸序列和相应的氨基酸序
图 1 多杀菌素A 和D 的化学结构
Figure 1 Chemical structure of spinosad A and D
见表3。
spnC 编码延伸组件3(碱基序: 35518-40035)和延伸组件4(碱基序: 40102-44676)。延伸组件3和延伸组件4中各功能域核苷酸序列和相应氨基酸序见表4。
spnD 编码延伸组件5(碱基序: 45077-50254)、延伸组件6(碱基序:50318-54883)和延伸组件7(碱基序: 54947-59494)。延伸组件5、6和7中各功能域的核苷酸序列和相应的氨基酸序见表5。
spnE 编码延伸组件8(碱基序:59902-65079)、延伸组件9(碱基序:65146-70401)和延伸组件10(碱基序:70471-76566)。延伸组件8, 9和10中各功能域的核苷
酸序列和相应的氨基酸序见表6。
在上述表2~6的50个功能域中，起始组件氨基末端的KSi 区域是非功能区，因为β-酮合成酶所必需的172位上的半胱氨酸被谷氨酰胺取代[13]。Bradley 等在泰乐菌素PKS 起始组件中同样发现了一个类似的非功能KS 区域[14]。除此外，其他多杀菌素PKS 区域为功能区域。
表 1 多杀菌素PKS 基因的核苷酸序列和相应多肽大小
Table 1 The nucleotide sequence for each of the ?ve spinosyn PKS
genes, and the size of corresponding polypeptides
基因
碱基序相应多肽大小
spnA 21111-288982595spnB 28916-353742152
spnC 35419-449313170
spnD 44966-597524928spnE
59803-76569
5588
图 2 多杀菌素A 生物合成途径
Figure 2 The biosynthetic pathways of spinosad A
表 2 spnA 编码的起始组件和延伸组件1中各功能域的
核苷酸序列和相应的氨基酸序
Table 2 The nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence in each functional domain within the initiator module and
extender module 1 encoded by spnA
功能域碱基序氨基酸序KSi
21126-223796-423ATi 22692-23669528-853ACPi 23793-24041895-977KS124102-25349998-1413AT125683-266841525-1858KR127582-281212158-2337
ACP1
28404-28649
2432-2513
为了进一步研究PKS 基因对S .spinosa 合成多杀菌素的影响，Matsushima 等在1994年构建了一个源于E.coli 的pOJ260质粒。该质粒不能在S . spinosa 中独立复制，但可以通过与S . spinosa 染色体的整合稳定地存在于S . spinosa 的PKS 基因簇中。由于pOJ260的插入，使PKS 基因簇中相应可读框遭到破坏，对重组子代谢产物进行分析发现spnA ORF 中的BamH1片段V 、N 或K(相应基因序列:21365-22052、22052-24338、24338-26227)，spnD ORF 中的BamH1片段G 、E 或K(相应基因序列:48848-50578、50578-52467、55207-55888)，spnE ORF 中的BamH1片段J 、I 、D 、H 或F(相应基因序列:63219-63989、65406-66733、66733-68997、69369-70731、70731-72675)被外源基因破坏后会使S . spinosa 合成多杀菌素受阻[15]。
表 3 spnB 编码的延伸组件2中各功能域的核苷酸序列和
相应的氨基酸序
Table 3 The nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence in each functional domain within the extender module 2
encoded by spnB
功能域碱基序氨基酸序KS2
29024-302951-424AT2
30629-31621536-866DH2
31697-32254892-1077ER233035-340721338-1683KR234082-346211687-1866
ACP2
34886-35125
1955-2034
表 4 spnC 编码的延伸组件3和4中各功能域的核苷酸序列和
相应的氨基酸序
Table 4 The nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence in each functional domain within the extender module 3
and 4 encoded by spnC
功能域碱基序氨基酸序KS3
35518-367861-423AT337108-38097531-860KR338992-395281159-1337ACP339790-400351425-1506KS440102-413731529-1952AT441713-427052066-2396KR443615-441572700-2880
ACP4
44431-44676
2972-3053
表 5 spnD 编码的延伸组件5，6和7中各功能域的
核苷酸序列和相应的氨基酸序
Table 5 The nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence in each functional domain within the extender module 5,
6 and
7 encoded by spnD
功能域碱基序氨基酸序KS5
45077-463481-424AT546691-47674539-866DH547753-48310893-1078KR549226-497711384-1565ACP550009-502541645-1726KS6
50318-515921748-2172AT6
51923-529152283-2613KR653822-543612916-3095ACP654638-548833188-3269KS754947-562153291-3713AT756549-575353825-4153KR758106-589904344-4638ACP7
59249-59494
4725-4806
表 6 spnE 编码的延伸组件8，9和10中各功能域的
核苷酸序列和相应的氨基酸序
Table 6 The nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence in each functional domain within the extender module 8,
9and 10 encoded by spnE
功能域碱基序氨基酸序KS8
59902-611731-424AT861489-62445530-848DH862548-63111883-1070KR864006-645571369-1552ACP864843-650791648-1726KS965146-664201749-2173AT966760-677432287-2614DH967819-683012640-2800KR969370-699243157-3341ACP970165-704013422-3500KS1070471-717453534-3948AT10
72079-730714060-4390DH10
73138-736924413-4597KR1074599-751354900-5078ACP1075415-756605172-5253
TE10
75805-76566
5302-5555
2.2 与PKS 基因簇毗邻的修饰基因(含福乐糖胺合成基因)
在PKS 基因簇的上游有16个可读框，每一读码框至少含有100个密码子[16]，在PKS 基因簇的下游有2个可读框(图3)，这18个可读框编码修饰多杀菌素大环内酯结构的蛋白质或多肽[17]。表7列出了这18个可读框的基因序列、编码的氨基酸数量以及相关功能，其中ORFR1和ORFR2为下游读码框。
采用上述插入破坏基因的方法，分别对上述17个可读框进行了分析，同时对生物转化也作了研究，结果见表8。其中R1因序列太短，无插入位点，未作研究，spnQ-S 与脱氧糖的合成有关，所以也未作研究。
PKS 上游的11个可读框与多杀菌素的生物合成直接相关，当受到破坏时多杀菌素主成分A 和D 无法
累积(见表8)。上游的另外2个基因(L15，L16)与下游基因R2受到破坏时不影响多杀菌素的积累。
当spnF, spnJ, spnL, spnM 受到破坏时，菌株几乎不产生任何多杀菌素，却可以将外源甙元(AGL)转化成多杀菌素A ，说明这些基因肯定与甙元的合成有关。Fish 等研究发现，这些基因编码的多肽可促使多杀菌素大环内酯母核中形成碳-碳交联桥，而这些基因发生突变的菌株则会产生出不稳定的化合物[18]。
当spnG 受到破坏时，菌株同样不会产生多杀菌素，但也不能对外源甙元(AGL)进行转化。进一步研究发现，该基因编码鼠李糖转移酶。另外spnG 被破坏的突变株亦无4'-O-甲基转移酶活性，因此表现出可将3', 4'-二脱甲基多杀菌素(P)转化成4'-脱甲基多杀菌素(K)，但是不能转化成完全甲基化的多杀菌素A 的活性。而在spnG 下游的spnH 基因受到破坏时，同样不会具有4'-O-甲基转移酶活性，因为破坏序列在同一操纵子中。不过spnH 受破坏后还会失去
3'-O-图 3 多杀菌素生物合成基因簇
Figure 3 The biosynthetic gene clusters of spinosads
表 8 在修饰基因的17个可读框中插入破坏基因后的分析结果Table 8 The analytical results after inserting the interrupting gene
in ORF 17 of modi ?cation gene
破坏基因插入片段基序多杀菌素生物转化产物
AGL →
P →
K →
PSA →
无
无A+D spnF 20325-20924无A A A spnG 18818-19426无AGL K
A
spnG-H 18511-19559P K A
spnI 16699-17400无J
A A
spnJ 14866-15470无A
A
spnK 13785-14574无spnL 12791-13428无A A
A spnM 11705-123713% A A A
spnN 10636-11369PSA spnO 9262-10226PSA spnP 7391-8159PSA PSA L 152145-2719A+D L 161226-1852A+D R 2
79321-79855
A+D
AGL ：多杀菌素A 甙元；P 、K 分别为多杀菌素P 和K ；PSA 代表多杀菌素A 9-Psa
表 7 修饰基因的基因序列，编码的氨基酸数量及相关功能Table 7 The nucleotide sequence, number of amino acids and corresponding function of 16 ORF in modi ?cation gene
基因
碱基序氨基酸数量
功能spnF 20168-20995275C 端甲基化spnG 18541-19713390加糖spnH 17749-18501250糖甲基化spnI 16556-17743395未知spnJ 14799-16418539氧化还原spnK 13592-14785397未知spnL 12696-13547283C 端甲基化spnM 11530-12492320未知spnN 10436-11434332未知spnO 8967-10427486脱氧糖合成spnP 7083-8450455加糖spnQ 5363-6751462双脱氧糖合成spnR 4168-5325385糖胺基化spnS 3416-4165249氨基糖甲基化L 152024-2791255氧化还原L 161135-1971278转录调控R 176932-77528198未知R 2
77729-79984
751
DNA 复制
甲基转移酶活性，因此菌株表现出积累多杀菌素P 的现象。spnI基因可能编码3'-O-甲基转移酶，因为spnI与Streptomyces nogalator的ORF Y基因同源性极高。虽然ORF Y的产物还不清楚，但是Streptomyces nogalator却可以合成一种少见的四甲基脱氧糖(诺加糖)，这与多杀菌素A中的三甲基脱氧糖(鼠李糖)相似，所以推测这2种基因都与糖的甲基化有关。同时对spnI的破坏发现，突变菌株仅能将多杀菌素P转化成3'-脱甲基多杀菌素(J)，而非多杀菌素A。spnK具有和spnI以及ORF Y相似的基因序列，推测可能编码2'-O-甲基转移酶。对它的破坏发现不能累积任何多杀菌素。
当spnN、spnO和spnP受到破坏时，突变菌株会积累拟甙元。因此这些基因与福乐糖胺的生物合成或添加有关。通过基因比对发现spnP和spnO分别与糖基转移酶，2, 3-脱水酶的基因相近，因此推测spnP可能编码福乐糖胺转移酶，spnO则可能参与福乐糖胺合成过程中的2'-脱氧作用。
2.3 鼠李糖合成基因
鼠李糖合成的第一个酶是葡萄糖胸苷转移酶(gtt)，该酶可将二磷酸核苷酸(NDP)加入葡萄糖。第二个酶是葡萄糖脱氢酶(gdh)，可以催化合成脱氧糖中间代谢产物：NDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖。另外的差相异构酶(epi)和酮还原酶(kre)则是鼠李糖合成代谢中的特异酶，它们可将中间代谢产物NDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖转化成鼠李糖转移酶的作用底物：NDP-L-鼠李糖。这些酶的编码基因目前已被全部克隆，它们与PKS基因簇不在一起[19]。通过外源基因插入研究发现，这些基因被破坏后，突变菌株仅能生长在渗透压稳定的培养基中。而且即便在这种培养基下，其生长速率也明显慢于野生型菌株。进一步研究发现鼠李糖是S. spinosa细胞壁的组成成分，通过Southern杂交显示S. spinosa细胞中无其他基因与上述4个基因同源，因此S. spinosa细胞壁中鼠李糖的合成和多杀菌素合成共用一套基因。
3讨论
对多杀菌素生物合成基因的深入研究，可以有效地指导研究人员提高S. spinosa发酵生产多杀菌素的产量以及利用基因工程技术生产新型多杀菌素类化合物。但由于多杀菌素仍在专利保护期内，所以对其结构改造的研究受到了一定的阻碍。Hahn等报道了从另一种刺糖多孢菌S. pogona中分离获得的30种丁烯多杀菌素类化合物[20]，这类化合物仅在C-21位上与多杀菌素不同。进一步的基因研究发现，S.pogona生物合成基因簇与S. spinosa的基因簇相似度高达91%~94%，可谓是天然基因重组的杰作。这也向我们展示了通过基因工程技术获得新型多杀菌素衍生物的可行性。
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逆的抑制剂将通过永久抑制激酶活性而体现出其优越性。这一原则正愈来愈多地应用于设计抗肿瘤药物即蛋白激酶抑制剂之中。
使用如同迈克尔反应受体这样的活性化合物时所面临的挑战是，寻找反应性足够低即不会不加选择地与所有亲核基团反应但却与一个亲核的催化基团强有力地特异性结合以至于高度选择性地烷基化该基团的化合物。这也是目前正在进展中的对蛋白剪接抑制剂进行优化的首要目标。一项研究是利用已知的结核分支杆菌RecA内含肽的晶体结构来优化在HTS中鉴定出的蛋白剪接抑制剂的结合能力和选择性。