中科院转录组分析

转录组分析

随着高通量测序技术的进步，RNA-seq技术逐渐得到发展与成熟，使我们可以对生物个体在不同发育阶段和生理条件下，更好的了解转录组水平上的变化。RNA-seq技术不仅能测定基因的表达水平，还能检测RNA的结构，对选择性剪切的研究有很大帮助。同时，相比较传统的芯片技术，也有很多独特的优势，比如它不需要设计探针，使我们可以对未知序列或新物种的进行分析；对于低表达量的基因检测，也更加准确。

转录组分析流程中，我们采用的主要软件为：Tophat做序列比对；对于有实验重复的样品，我们采用cuffdiff和DEseq两个软件并行分析，没有实验重复的样品，我们采用cuffdiff和DEGseq两个软件。GO功能富集分析用blast2go 做，差异表达基因的聚类分析使用MeV软件。若用户推荐更好的或更合适的软件，我们将在测试后采用。

分析流程

有参考基因组的转录组生物信息分析

一、生物信息分析流程 获得原始测序序列(Sequenced Reads)后，在有相关物种参考序列或参考基因组的情况下，通过如下流程进行生物信息分析： 二、项目结果说明 1 原始序列数据 高通量测序(如illumina HiSeq TM2000/MiSeq等测序平台)测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，我们称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列(reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。 FASTQ格式文件中每个read由四行描述，如下： @EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG GCTCTTTGCCCTTCTCGTCGAAAATTGTCTCCTCATTCGAAACTTCTCTGT + @@CFFFDEHHHHFIJJJ@FHGIIIEHIIJBHHHIJJEGIIJJIGHIGHCCF 其中第一行以“@”开头，随后为illumina 测序标识符(Sequence Identifiers)和描述文字(选择性部分)；第二行是碱基序列；第三行以“+”开头，随后为illumina 测序标识符(选择性部分)；第四行是对应序列的测序质量(Cock et al.)。 illumina 测序标识符详细信息如下：

第四行中每个字符对应的ASCII值减去33，即为对应第二行碱基的测序质量值。如果测序错误率用e表示，illumina HiSeq TM2000/MiSeq的碱基质量值用Q phred 表示，则有下列关系： 公式一：Q phred = -10log 10 (e) illumina Casava 1.8版本测序错误率与测序质量值简明对应关系如下： 2 测序数据质量评估 2.1 测序错误率分布检查 每个碱基测序错误率是通过测序Phred数值(Phred score, Q phred )通过公式1转化得到，而Phred 数值是在碱基识别(Base Calling)过程中通过一种预测碱基判别发生错误概率模型计算得到的，对应关系如下表所显示： illumina Casava 1.8版本碱基识别与Phred分值之间的简明对应关系 测序错误率与碱基质量有关，受测序仪本身、测序试剂、样品等多个因素共同影响。对于RNA-seq技术，测序错误率分布具有两个特点： (1)测序错误率会随着测序序列(Sequenced Reads)的长度的增加而升高，这是由于测序过程中化学试剂的消耗而导致的，并且为illumina高通量测序平台都具有的特征(Erlich and Mitra, 2008; Jiang et al.)。 (2)前6个碱基的位置也会发生较高的测序错误率，而这个长度也正好等于在RNA-seq 建库过程中反转录所需要的随机引物的长度。所以推测前6个碱基测序错误率较高的原因为随机引物和RNA模版的不完全结合(Jiang et al.)。测序错误率分布检查用于检测在测序长度范围内，有无异常的碱基位置存在高错误率，比如中间位置的碱基测序错误率显着高于其他位置。一般情况下，每个碱基位置的测序错误率都应该低于0.5%。 图2.1 测序错误率分布图

转录组测序(RNA-seq)技术

转录组测序（RNA-seq）技术 转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。基于Illumina高通量测序平台的转录组测序技术使能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），提供最全面的转录组信息。相对于传统的芯片杂交平台，转录组测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。 技术优势： ?数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。 ?高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。 ?任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析。同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。 ?更广的检测范围：高于6个数量级的动态检测范围，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本。 应用领域：转录本结构研究（基因边界鉴定、可变剪切研究等），转录本变异研究（如基因融合、编码区SNP研究），非编码区域功能研究（Non-coding RNA研究、microRNA前体研究等），基因表达水平研究以及全新转录本发现。 图1 RNA-seq获得的数据能够进行全面的数据挖掘，既能够进行基因结构分析，鉴定UTR、可变剪切位点，也能够发现新的转录本及非编码RNA，比较样本间的表达水平差异

转录组RNAseq术语解释

RNA-Seq名词解释 1.index 测序的标签，用于测定混合样本，通过每个样本添加的不同标签进行数据区分，鉴别测序样品。 2.碱基质量值 （Quality Score或Q-score）是碱基识别（Base Calling）出错的概率的整数映射。碱基质量值越高 表明碱基识别越可靠，碱基测错的可能性越小。 3.Q30 碱基质量值为Q30代表碱基的精确度在99.9%。 4.FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped） 每1百万个map上的reads中map到外显子的每1K个碱基上的fragment个数。计算公式为 公式中，cDNA Fragments 表示比对到某一转录本上的片段数目，即双端Reads数目；Mapped Reads(Millions)表示Mapped Reads总数， 以10为单位；Transcript Length(kb)：转录本长度，以kb个碱基为单位。 5.FC（Fold Change） 即差异表达倍数。 6.FDR（False Discovery Rate） 即错误发现率，定义为在多重假设检验过程中，错误拒绝(拒绝真的原(零)假设)的个数占所有被拒绝 的原假设个数的比例的期望值。通过控制FDR来决定P值的阈值。 7.P值（P-value） 即概率，反映某一事件发生的可能性大小。统计学根据显著性检验方法所得到的P 值，一般以P<0.05 为显著，P<0.01为非常显著，其含义是样本间的差异由抽样误差所致的概率小于0.05或0.01。 8.可变剪接（Alternative splicing）

转录组测序结题报告

转录组测序结题报告 1．mRNA纯化： 抽提得到的总RNA首先利用10U的DNaseI（Ambion，美国）在37℃消化1小时；然后利用Micropoly(A)PuristTM mRNA purification kit（Ambion，美国），进行mRNA纯化：把RNA稀释到250μl的体积，按照Kit的操作步骤（Cat.No:

1919）进行；最后得到的mRNA用100μl预热的THE缓冲液洗脱，利用NanoDrop 进行定量。 2．cDNA合成： cDNA合成是在Ng等2005年发表的方法基础上改进而成（文献1，图1）。第一链cDNA合成利用GsuI-oligo dT作为反转录引物，10μg的mRNA作为模板，用1000 单位的Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen，美国)在42℃作用1小时完成；随后利用NaIO4（Sigma，美国）氧化mRNA的5’帽子结构，并连接生物素；通过Dynal M280磁珠（Invitrogen，美国）筛选连接了生物素的mRNA/cDNA，并通过碱裂解释放第一链cDNA；然后通过DNA ligase（TaKaRa，日本）在第一链cDNA的5’末端加上接头，然后通过Ex Taq polymerase (TaKaRa，日本)合成第二链cDNA。最后通过GsuI酶切去除polyA和5’端接头。 图1. 全长cDNA合成示意图 3．cDNA测序： 合成的cDNA利用超声仪（Fisher）打断到300-500bp的范围，利用Ampure beads（Agencourt，美国）进行纯化。随后纯化的cDNA利用TruSeq TM DNA XXmple Prep Kit – Set A (illumina，美国)制备文库，并利用TruSeq PE Cluster Kit (illumina，美国)进行扩增。最后在illumina机器上进行测序反应。 测序得到的数据统计见表1. 表1. Solexa测序统计 样品对照 1 2

一步一步教你做转录组分析(HISAT, StringTie and Ballgown)

一步一步教你做转录组分析（HISAT, StringTie and Ballgown） 该分析流程主要根据2016年发表在Nature Protocols 上的一篇名为Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown 的文章撰写的，主要用到以下三个软件：HISAT (https://www.wendangku.net/doc/d615297972.html,/software/hisat/index.shtml)利用大量FM 索引，以覆盖整个基因组，能够将RNA-Seq的读取与基因组进行快速比对，相较于STAR、Tophat，该软件比对速度快，占用内存少。 StringTie(https://www.wendangku.net/doc/d615297972.html,/software/stringtie/)能够应用流神经网络算法和可选的de novo组装进行转录本组装并预计表达水平。与Cufflinks等程序相比，StringTie实现了更完整、更准确的基因重建，并更好地预测了表达水平。Ballgown (https://https://www.wendangku.net/doc/d615297972.html,/alyssafrazee/ballgown)是R语言中基因差异表达分析的工具，能利用RNA-Seq实验的数据(StringTie, RSEM, Cufflinks)的结果预测基因、转录本的差异表达。然而Ballgown并没有不能很好地检测差异外显子，而DEXseq、rMATS和MISO可以很好解决该问题。 一、数据下载Linux系统下常用的下载工具是wget，但该工具是单线程下载，当使用它下载较大数据时比较慢，所以选

华大转录组测序内部培训资料

（内部资料，请勿外传） 动植物转录组 （Transcriptome ） 产品说明书 科技服务体系 动植物研究方向

版本信息： 2011年07月08日

目录 1产品概述 (1) 1.1 什么是转录组测序 (1) 1.2 转录组测序的产品功能 (1) 1.3 转录组测序产品优势 (1) 1.4 转录组测序产品发展史 (1) 1.5 项目执行时间 (3) 1.6 产品交付结果 (3) 2转录组测序研究方法 (4) 2.1 产品策略 (4) 2.2 样品准备 (5) 2.2.1 RNA样品要求 (5) 2.2.2 RNA样品送样标准 (6) 2.2.3 RNA提取的组织用量建议 (6) 2.3 样品运输要求 (7) 2.3.1 样品包装 (7) 2.3.2 样品标识 (8) 2.3.3 样品运输条件 (8) 2.4 文库的构建及测序 (9) 2.4.1 实验流程 (9) 2.4.2 测序及数据处理 (10) 2.5 转录组生物信息学分析 (10) 2.5.1 没有参考序列的转录组De novo (10) 2.5.2 有参考序列的转录组Re-sequencing (18) 2.5.3 参考文献 (24) 3成功案例 (25)

3.1 华大成功案例 (25) 3.2 相关文献解读 (26)

1产品概述 1.1什么是转录组测序？ 转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA。转录组测序是指用新一代高通量测序技术对物种或者组织的转录本进行测序并得到相关的转录本信息。 1.2转录组测序的产品功能 1.获得物种或者组织的转录本信息； 2.得到转录本上基因的相关信息，如：基因结构，功能等； 3.发现新的基因； 4.基因结构优化； 5.发现可变剪切； 6.发现基因融合； 7.基因表达差异分析。 1.3转录组测序产品优势 覆盖度高：检测信号是数字信号，几乎覆盖所有转录本； 检测精度高：几十到数十万个拷贝精确计数； 分辨率高：可以检测到单碱基差异，基因家族中相似基因及可变剪切造成的不同转录本的表达； 完成速度快：整个项目周期只需要50个工作日时间； 成本低：基本上每个实验室可以承担相关研究经费。 1.4转录组测序产品发展史 转录组的研究手段大体包括：EST序列构建及研究，芯片研究，运用第二代测序技术研究等。EST是从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次sanger测序获得的短的cDNA 部分序列,代表一个完整基因的一小部分,在

转录组ref流程工作手册

转录组ref流程工作手册 一、Reference 流程生物学原理 1.1 实验流程 图一：转录组实验流程 当我们得到样品时，必须对其测序，才能得到分析所需的数据。测序基本过程：提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA（若为原核生物，则用试剂盒去除rRNA后进入下一步）。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I 合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，使用建好的测序文库进行测序。 得到RNA的序列后，又可以找到它的参考序列（物种本身的基因、基因组）

时，可以用reference流程对数据进行详细的分析。Reference后面所有的流程都是基于参考序列进行的，所以选择正确的参考序列十分重要。 1.2信息分析流程 得到测序序列后，即可利用比对软件，将所测序列比对到参考基因或基因组上，并进行后续分析，信息分析流程图如下： 图二：转录组信息流程 1.2.1原始fq序列简介 测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，我们称之为raw data或raw reads，结果以fastq文件格式存储，fastq文件为用户得到的最原始文件，里面存储reads的序列以及reads的测序质量。在fastq格式文件中每个read 由四行描述： @read ID TGGCGGAGGGATTTGAACCC

转录组ref流程工作手册

转录组ref流程工作手册

转录组ref流程工作手册 一、Reference 流程生物学原理 1.1 实验流程 图一：转录组实验流程 当我们得到样品时，必须对其测序，才能得到分析所需的数据。测序基本过程：提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA（若为原核生物，则用试剂盒去除rRNA后进入下一步）。加入fragmentation buffer 将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB 缓冲液洗脱之后做末端修复并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，使用建好的测序文库进行测序。 得到RNA的序列后，又可以找到它的参考序列（物种本身的基因、基因组）

时，可以用reference流程对数据进行详细的分析。Reference后面所有的流程都是基于参考序列进行的，所以选择正确的参考序列十分重要。 1.2信息分析流程 得到测序序列后，即可利用比对软件，将所测序列比对到参考基因或基因组上，并进行后续分析，信息分析流程图如下： 图二：转录组信息流程 1.2.1原始fq序列简介 测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，我们称之为raw data或raw reads，结果以fastq文件格式存储，fastq文件为用户得到的最原始文件，里面存储reads的序列以及reads的测序质量。在fastq格式文件中每个read由四行描述： @read ID TGGCGGAGGGATTTGAACCC

转录组学的一些概念

Gene Ontology可分为分子功能（Molecular Function），生物过程（biological process）和细胞组成（cellular component）三个部分。蛋白质或者基因可以通过ID对应或者序列 注释的方法找到与之对应的GO号，而GO号可对于到Term，即功能类别或者细胞定位。 功能富集分析: 功能富集需要有一个参考数据集，通过该项分析可以找出在统计上显 著富集的GO Term。该功能或者定位有可能与研究的目前有关。 GO功能分类是在某一功能层次上统计蛋白或者基因的数目或组成，往往是在GO 的第二层次。此外也有研究都挑选一些Term，而后统计直接对应到该Term的基因或蛋白数。结果一般以柱状图或者饼图表示。 1.GO分析 根据挑选出的差异基因，计算这些差异基因同GO 分类中某（几）个特定的分支的超 几何分布关系，GO 分析会对每个有差异基因存在的GO 返回一个p-value，小的p 值表示差异基因在该GO 中出现了富集。 GO 分析对实验结果有提示的作用，通过差异基因的GO 分析，可以找到富集差异 基因的GO分类条目，寻找不同样品的差异基因可能和哪些基因功能的改变有关。 2.Pathway分析 根据挑选出的差异基因，计算这些差异基因同Pathway 的超几何分布关系， Pathway 分析会对每个有差异基因存在的pathway 返回一个p-value，小的p 值表示差异 基因在该pathway 中出现了富集。 Pathway 分析对实验结果有提示的作用，通过差异基因的Pathway 分析，可以找到 富集差异基因的Pathway 条目，寻找不同样品的差异基因可能和哪些细胞通路的改变有关。与GO 分析不同，pathway 分析的结果更显得间接，这是因为，pathway 是蛋白质之间的 相互作用，pathway 的变化可以由参与这条pathway 途径的蛋白的表达量或者蛋白的活性 改变而引起。而通过芯片结果得到的是编码这些蛋白质的mRNA 表达量的变化。从 mRNA 到蛋白表达还要经过microRNA 调控，翻译调控，翻译后修饰（如糖基化，磷酸化），蛋白运输等一系列的调控过程，mRNA 表达量和蛋白表达量之间往往不具有线性关系，因此mRNA 的改变不一定意味着蛋白表达量的改变。同时也应注意到，在某些pathway 中，如EGF/EGFR 通路，细胞可以在维持蛋白量不变的情况下，通过蛋白磷酸 化程度的改变（调节蛋白的活性）来调节这条通路。所以芯片数据pathway 分析的结果需 要有后期蛋白质功能实验的支持，如Western blot/ELISA，IHC（免疫组化），over expression（过表达），RNAi（RNA 干扰），knockout（基因敲除），trans gene（转基因）等。 3.基因网络分析 目的：根据文献，数据库和已知的pathway 寻找基因编码的蛋白之间的相互关系(不超过1000 个基因)。

illumina 转录组测序简明实验流程(PE-oligodT NEB)

illumina 转录组测序简明实验流程一、实验基本流程图 mRNA Library Construction

二、mRNA建库流程 1.材料准备 1.2. 1.3.

2.样品准备和QC 选择质量合格的Total RNA作为mRNA测序的建库起始样品，其质量要求通过Agilent 2100 BioAnalyzer检测结果RIN≥7，28S和18S的RNA 的比值大于或等于1.5：1，起始量的要求范围是0.1∽1ug。用QUBIT RNA ASSAY KIT对起始的Total RNA进行准确定量。 3.建库实验步骤 3.1.mRNA纯化和片段化 3.1.1.mRNA纯化 纯化原理是用带有Oligod(T)的Beads对Total RNA中mRNA进行纯化。 3.1.2.mRNA片段化 3.2.1st Strand cDNA 合成 3.3.2nd Strand cDNA 合成 根据下表制备反应体系，然后在PCR仪上运行Program3，然后将第2链cDNA合成产物用144uL AMPure XP Beads进行纯化，最后用60μL的Nuclease free water进行重悬，取出 55.5μL以备下一步使用;

3.4.Perform End Repair/dA-tail 3.5.Adaptor Ligation 根据下表制备反应体系，然后在PCR仪上运行Program5、Program6，然后100uL AMPure XP Beads进行纯化后用52.5μL的Resuspension Buffer进行重悬，再用50uL AMPure XP Beads 3.6.PCR扩增 根据下表制备反应体系，然后在PCR仪上运行Program7，然后再45μL用AMPure XP Beads 进行纯化，最后用23μL的Resuspension Buffer进行重悬，取出20μL以备下一步使用；

真核转录组讲解及数据解读PPT

转录组结果解读 转录调控研究部 北京诺禾致源科技股份有限公司

OUTLINE 简介 实验部分 生物信息分析

概述 1 转录组是指特定组织或细胞在某个时间或某个状态下转录出来的所有RNA的总和，主要包括mRNA和非编码RNA。 转录组研究是研究基因功能和结构的基础，对生物体的发育和疾病的发生具有重要作用。 RNA-seq技术流程主要包含两个部分，建库测序和数据分析。

2 实验部分（RNA检测、建库、测序)） ?琼脂糖凝胶电泳：分析样品RNA 完整性及是否存在杂质污染。 ?NanoPhotometer spectrophotometer：检测RNA 纯度（OD260/280及 OD260/230比值）。 ?Agilent 2100 bioanalyzer：精 确检测RNA完整性。 链特异性文库优势： 相同数据量下可获取更多有效 信息；能获得更精准的基因定 量、定位与注释信息

5 ?1、一般动物样品会有三条带：28S 、18S 、5S ，如果提取过程经过过柱处理或者 利用CTAB+LiCl 方法提取，5S 可能较暗或者没有。 ?昆虫或者软体动物等样品只有1条比较明显的带，例如：牡蛎、果蝇、螨虫、蝗 虫、蚊、蚕等 ?2、植物样品有三条带：25S 、18S 、5S ，有些特殊物种或部位可能本身含条带比 较多，如果条带清晰，也可初步判定合格 ?3.原核生物中主要有5S 、16S 、23S rRNA 叶片小 鼠蚊动物植物原核

RIN 5RIN 7RIN 8RIN 9RIN 4RIN 6RIN 10RIN 2RIN 1 RIN 值范围示意图

诺禾致源有参转录组结题报告

NHXXXXXX_species转录组生物信息分析结题报告建库测序流程 Total RNA样品检测 文库构建 库检 上机测序 生物信息分析流程 结果展示及说明 原始序列数据 测序数据质量评估 参考序列比对分析 可变剪切分析 新转录本预测 SNP和InDel分析 基因表达水平分析 RNA-seq整体质量评估 基因差异表达分析 差异基因GO富集分析 差异基因KEGG富集分析 差异基因蛋白互作网络分析 参考文献 附录 文件目录列表 软件列表 Methods英文版 备注

一、建库测序流程 从RNA样品到最终数据获得，样品检测、建库、测序每一个环节都会对数据质量和数量产生影响，而数据质量又会直接影响后续信息分析的结果。为了从源头上保证测序数据的准确性、可靠性，诺禾致源对样品检测、建库、测序每一个生产步骤都严格把控，从根本上确保了高质量数据的产出。流程图如下：

1 Total RNA样品检测 诺禾致源对RNA样品的检测主要包括4种方法： (1) 琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染 (2) Nanodrop检测RNA的纯度（OD260/280比值） (3) Qubit对RNA浓度进行精确定量 (4) Agilent 2100精确检测RNA的完整性 2 文库构建 样品检测合格后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA（若为原核生物，则通过试剂盒去除rRNA来富集mRNA）。随后加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase I合成二链cDNA，随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库。构建原理图如下： 3 库检 文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度＞2nM），以保证文库质量。 4 上机测序 库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行HiSeq/MiSeq测序。

转录组测序

转录组分析 研究背景： RNA-Seq是通过结合实验和计算方法来鉴定生物样品中RNA序列的种类和丰度的一种技术。通过RNA-seq，我们就能够确定单链RNA分子中ATCG的顺序。整个过程主要包括：从细胞或组织中提取RNA分子、文库的构建以及后继的生物信息学数据分析。RNA-Seq技术具有许多早期研究方法（如：微阵列）所不具备的优点，如：RNA-Seq平台的高通量、新技术所带来的高灵敏度、发现新转录本、新基因模型以及非编码RNA的能力等。 RNA-Seq技术的到来，使人们认识到，无论是单细胞模式生物还是人类，我们对其转录组的认知异常匮乏。而RNA-Seq产生的新的数据，则可以帮助我们发现基因结构上的巨大差异、鉴定出新的转录本以及能够对small non-coding RNA和lncRNAs有着更好的了解。而且随着测序花费的降低，RNA-Seq的优势体现的更加明显。 服务流程： 样品选取

mRNA片段化 cDNA合成 末端修复、加polyA、加接头，PCR扩增 数据分析 测序方案： 内容：TotalRNA检测，普通转录组文库构建及测序及信息分析。测序方式：HiseqPE125。 项目周期：有参45天，无参50天。 分析内容： 无参考基因组： 1.1质量控制 1.11评估碱基质量 1.12过滤低质量reads 1.13 去掉低质量碱基和接头序列 1.14 统计N比例和reads长度 1.15 统计GC含量和reads重复度 1.2 Reads的从头比对组装

1.4基因表达差异分析 1.41 统计基因在不同条件下的差异表达情况 1.5差异基因富集分析 1.51 通过GO、KEGG对差异基因进行功能富集分析 1.6差异表达基因的蛋白质互作网络分析 1.7SNV/Indel分析 1.8样本间相关性分析 有参考基因组： 2.1质量控制（同无参） 2.2 Reads比对组装 2.22 统计reads与参考基因组比对情况 2.22 分析对插入、删除和连接体情况 2.23 统计转录本在参考基因组上位置、长度和覆盖度情况 2.3基因表达差异分析 2.4差异基因富集分析 2.5差异表达基因的蛋白质互作网络分析 2.6新转录本预测 2.7 SNV/Indel分析 2.8 UTR分析 2.9可变剪接分析 3.0 Non-coding RNA分析 3.1样本相关性分析 案例解读： 案例：通过poly(A)+ RNA-Seq分析Drosophila melanogaster转录组的动态性 本项研究通过poly(A)+ RNA-Seq技术对果蝇的细胞系进行测序，鉴定出一批通过替换启动子和RNA剪接来转录出大量转录本的神经特异性基因。通过后继分析还发现，对于RNA剪接变化，组织间的差异要远远大于发育阶段间的差异。另外，发现性腺表达了成百上千的未知的蛋白编码和lncRNAs，其中一些甚至是反义转录的。显示了果蝇转录组的动态性和多样性。 小部分的基因（0.2%）编码出大部分的转录本。

转录组测序结题报告

转录组测序结题报告 篇一：转录组测序问题集锦 转录组测序问题集锦 转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合，转录组测序(RNA-seq) 是最近发展起来的利用深度测序技术进行转录分析的方法,可以对全转录组进行系统的研究。 Roche GS FLX Titanium 、Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID 4均可以对转录组进行测序， Roche GS FLX Titanium与Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID 4相比，拥有更长的读长和较小的数据量，适用于表达量较高基因的RNA全长测序。但是对低表达丰度的基因，可能需要多次测序才能得到足够的数据，成本比较高，而Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID 4数据读取量大，能够得到较高的覆盖率，可以较好的降低成本。若是位置基因组序列的物种，则Roche GS FLX Titanium测序更有优势，其较长的读长便于拼接，获得更好的转录本数据。 转录组测序可以供研究者在转录本结构研究（基因边界鉴定、可变剪切研究等），转录本变异研究（如基因融合、编码区 SNP研究），非编码区域功能研究（Non-coding RNA

研究、miRNA前体研究等），基因表达水平研究以及全新转录本发现等方面进行深入研究。 研究转录组的方法有哪些？ 目前研究转录组的方法主要三种，基于杂交技术的cDNA 芯片和寡聚核苷酸芯片，基于sanger测序法的SAGE (serial analysis of gene expression)、LongSAGE和MPSS(massively parallel signature sequencing)，基于第二代测序技术的转录组测序，又称为RNA-Seq。 转录组测序比其他研究方法有哪些优势? （1）可以直接测定每个转录本片段序列、单核苷酸分辨率的准确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题； （2）灵敏度高，可以检测细胞中少至几个拷贝的稀有转录本； （3）可以对任意物种进行全基因组分析，无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析，同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并准确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。 （4）检测范围广，高于6个数量级的动态检测范围，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本。