生化实验报告 福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度

实验三：福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度

一、实验目的

1．学会制备无蛋白血滤液。

2．掌握Folin－Wu法测定血糖含量的原理和方法。

3．掌握7200型可见分光光度计的使用方法。

二,实验原理

蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。

三.实验仪器

1．试管

2．移液管

3．卵清蛋白片

4．7220分光光度计

四.实验试剂

1、碱性硫酸铜溶液

A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀释定容至1000ml.

B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。

临用时，A液：B液=9：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4℃）。

2、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）

(1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。

(2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。

3、10%钨酸钠溶液：

称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。

4、0.33mol/LH2SO4溶液：

于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。

五.实验步骤

1、无蛋白血滤液的制备：

用奥氏吸管吸取全血（已加抗凝剂）1ml,缓缓放入100ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀.。

再加0.33mol/L H2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置5～15分钟，至沉淀变为暗棕色（如不变色可再加0.33mol/L H2SO41-2滴）。

用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。

2、血糖的定量测定：

取25ml的血糖管3支，编号。第一支血糖管中加入2ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加2ml标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第三支血糖管中。

然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后,勿摇动，各加4ml酸性钼酸盐溶液。

一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用7200分光光度计在420nm波长处比色，以空白管调节零点。

六.数据处理

按下式计算100ml全血中所含血糖的含量

m=A1/A0×C0÷0.1×100

式中: m=100ml全血中含血糖毫克数; C0=标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml）A1=样品液光吸收值; A0=标准液光吸收值

0.1ml无蛋白血溶液相对于0.1ml全血

得出m=134.72mg

七.实验分析

一．提高实验准确度的措施？

1．应尽可能把移取的血液完全放出，即等待挂在壁上的血液滴下后再进行接下来的操作。2．若过滤后滤液浑浊不为无色透明，则应二次过滤。

3．尽量保证三只试管水浴时间相同。

二、实验中，血糖管有什么作用？

由于空气中的氧对Cu2O会产生再氧化作用从而影响测定结果，为减少Cu+与空气的接触，通过血糖管的细颈阻挡空气，防止形成Cu2+。

三.实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱性硫酸铜液反应后的血糖管？

使其尽快降温，防止高温使钼蓝氧化。

细菌生化试验

微生物常规鉴定技术 一.形态结构和培养特性观察 1.微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 2.细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。 2.1细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 琼脂平皿上的生长表现观察并记录不同的菌落：大小、形状、边缘、表面性状、隆起度、颜色、透明度、硬度、溶血等。 观察琼脂斜面上的生长表现：菌苔的颜色及茂盛情况。 观察半固体琼脂的生长现象：绒毛状、线状等。 细菌的培养特征：点状圆形丝状不规则形假根状纺锤状扁平隆起凸起垫状脐状边缘整齐波状裂片状啮蚀状 .丝状卷发状丝线状刺毛状串珠状疏展状树根状假根状丝状串珠状乳头状绒毛状树根状量杯状萝卜状漏斗状囊状层状絮状环状蹼状膜状 2.2霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。

几种测蛋白含量方法的比较

蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定 （一）蛋白质测定方法的比较（原理、优缺点）蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。 1微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010） 1.1原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤 1.3特点准确度较高，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为±2％；操作复杂费时，整个过程需要耗时8~10h，试剂消耗量大。，测得结果为总氮含量，包括蛋白氮和非蛋白氮含量；适用范围广，几乎所有样品均可用此方法。 2 双缩脲比色法 2.1原理双缩脲法是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法。因蛋白质含有两个以上的肽键，所以有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，在一定的实验条件下，未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540~560nm测定，即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。

细菌的生物化学试验

各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。 1.碳水化合物的代谢试验 1.1糖（醇、苷）类发酵试验 1.1.1原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。 1.1.2方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表1。将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。 1.1.3 结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。不分解糖则无变化。 1.1.4 应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。即便是两种细菌均可发

酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。 表 1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类 单糖四碳糖：赤藓糖 ; 五碳糖：核糖、核酮糖、木糖、 阿拉伯糖; 六碳糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖 双糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）、乳糖（葡萄糖＋半乳糖）、 麦芽糖（两分子葡萄糖） 三糖棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖） 多糖菊糖（多分子果糖）、淀粉 醇类侧金盏花醇、卫茅醇、甘露醇、山梨醇 非糖类肌醇 1.2．葡萄糖代谢类型鉴别试验 1.2.1 原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。 1.2.2 方法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种2支HL培养管中，在其中一管加入高度至少为0.5cm的无菌液体石蜡以隔绝空气（作为密封管），另一管不加（作为开放管）。置35℃孵箱孵育48h以上。 1.2.3 结果：两管培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；两管都产酸（变黄）为发酵型；加液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧化型。

食品中蛋白质的测定实验报告

1.目的 掌握凯氏定氮法测蛋白质的原理、操作、条件、注意事项。 2.原理 蛋白质是含氮有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解。分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后在以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量计算含氮量再乘以换算系数，即为蛋白质含量。 3.试剂 3.1浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾，所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制 3.2混合指示液 1份（1g/L）甲基红乙醇溶液与5份1g/L溴甲酚氯乙醇溶液临用时混合。 也可用2份甲基红乙醇溶液与1份1g/L次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 3.3氢氧化钠溶液（400g/L） 3.4标准滴定溶液 硫酸标准溶液［c（1/2H2SO4）=0.0500mol/L］或盐酸标准溶液［c（HCl） 0.0500mol/L］ 3.5硼酸溶液（20g/L） 4.仪器 定氮蒸馏装置 5.样品 全蛋（2.47g） 6.操作 6.1样品处理 准确称取2—5g半固体样品，小心移入干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中，然后加入研细的硫酸铜0.5g，硫酸钾10g和浓硫酸20mL，轻轻摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜放于加有石棉网的电炉上，小火加热，待内容物全部炭化后，泡沫完全消失后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色呈请透明后，再继续加热0.5h，取下放冷，慢慢加入20mL水。 放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。 6.2连接装置 装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水至2/3处，加甲基红指示剂数滴及少量硫酸，以保持水呈酸性，加入数滴玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，

实验三细菌生理生化鉴定-LOPAT试验

菌落圆形，污白色，全缘，微凹，光滑 实验三细菌生理生化鉴定-LOPAT试验 一、实验目的： 1）了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定lopat实验方法 二、实验材料： 猕猴桃溃疡病病原菌（分类地位薄壁菌门Gracilicutes，Proteobacteria纲假单胞菌科Pseudomonadaceae假单胞杆菌属Pseudomonas）、SPA培养基：蔗糖20g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000ml 对照SPA培养基：葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000ml Thornley培养基配方：蛋白胨1g，精氨酸10g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，酚红0.01g，琼脂6g，蒸馏水1000ml 1%二甲基对苯二胺盐酸盐，3×108 /ml的菌液（病原菌），烟草，马铃薯； 灭菌培养皿及培养基（平板）110套、未灭菌培养皿110套，接种针15个，试管110支，接种针55把，滤纸55张，试剂瓶55个，胶头滴管55支，喷壶55个 三、试验方法： 果聚糖试验（Levan formation）： 用细菌悬浮液，在SPA培养基上，再用葡萄糖代替蔗糖培养基平板上分别划线。在25℃条件下培养3–7 d，形成白色、粘稠、圆顶、隆起而有闪光的菌落为阳性反应。 在此条件下，在SPA培养基上可形成前述菌落，果聚糖试验为阳性；而在用葡萄糖代替蔗糖培养基上，不形成前述菌落。 氧化酶试验（oxidase reaction）： 在培养皿内放一张滤纸，滤纸上加3–4滴1%二甲基对苯二胺盐酸盐，使其湿润。用玻棒挑取生长24 h的菌苔涂在滤纸上，若菌苔在10 s内变成紫色，为阳性反应；在60 s以后变色或一直不变色，为阴性反应。 在此条件下，菌苔的氧化酶试验为阴性反应 氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶 马铃薯软腐试验（potato erroring capacity）： 在马铃薯上做刺伤伤口，将细菌接到伤口上，几天后观察，是否出现软腐。 精氨酸双水解酶检验（argine reaction）： 配制Thornley培养基。每试管装3–4 ml培养基灭菌，冷却，针刺接种细菌至培养基底部，立即用凡士林封管，在27℃条件下培养7 d。 在此条件下，精氨酸双水解酶为阴性，颜色不变。 细菌的精氨酸双水解作用是将精氨酸经过两步水解，生成有机胺和无机氨。鉴定细菌的精氨酸试验，无论发酵菌还是非发酵菌，革兰阳性菌还是革兰阴性菌，测的都是精氨酸双水解酶，使用脱羧酶试验培养基。所以，赖氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶用同一种基础培养基，为Moeller配方或Falkow配方，均须加盖石蜡油。对于发酵菌，细菌生长后，培养基变黄为阴性，变紫为阳性；对非发酵菌，培养基颜色不变为阴性，变黄为阳性。另有一种精氨酸双水解酶专用培养基，其中使用的是酚红指示剂。这种配方目前已不使用。细菌生化反应表中的精氨酸双水解酶的阳性百分率也不是在这种培养基上做的，所以，该配方实际已淘汰。 烟草过敏性反应（tobacoo hypersensitivity）：

福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度实验报告完整版

福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度 一、原理 蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。 二、实验仪器 分光光度计,试管,移液管,容量瓶，分析天平，烧杯 三、实验试剂 1.Folin-酚试剂甲：碱性铜溶液 甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中 乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml。 临用时按甲：乙=50：1混合使用。 2.Folin-酚试剂乙：将10g钨酸钠、2.5g钼酸钠、70ml蒸馏水、5ml85%磷酸继10ml浓盐酸置于150ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏1小时，再加入硫酸锂15g，蒸馏水5ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至100ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。 标准蛋白质溶液：称取1g牛（人）血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至1000ml

四、实验步骤 1.标准曲线的绘制 取7支干燥洁净的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。 各管加入1mlFo1in 酚试剂乙后，立即摇匀，放置15分钟后比色，在500nm 处记下各管光密度，以0号管为对照，以吸光度为纵坐标，标准蛋白质溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线 2.样品测定 准确吸取样液于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。 室温放置10分钟后，再各加1毫升Fo1in 酚试剂乙，立即摇匀，放置15分钟，在500nm 处测定光密度值。 五、实验结果 管号 试剂 1 2 样液（ml ） 1.0 1.0 Folin-酚试剂甲 5.0 5.0 （ml ）

蛋白质测定实验报告

蛋白质测定实验报告标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]

蛋白质测定方法——化学报告

蛋白质的检测 酚试剂法灵敏度较高 20~250mg 费时蛋白质在碱性溶 液中其肽键与 Cu2+螯合，形成 蛋白质一铜复合 物，此复合物使 酚试剂的磷钼酸 还原，产生蓝色 化合物 酚类、柠檬 酸、硫酸铵、 tris缓冲液、 甘氨酸、糖 类、甘油等均 有干扰作用 由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以实验的形式进行详细阐述： 1 材料与方法 仪器材料 (1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。 (2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。 实验方法 (1)凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。 (2)紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如,

微生物检验学之细菌的生物化学试验

细菌的生物化学试验 ●考点 碳水化合物的代谢试验 蛋白质和氨基酸的代谢试验 碳源和氮源利用试验 各种酶类试验 抑菌试验 复合生化试验 不同细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又各具有不同的生物化学特性，为此，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。在临床细菌检验工作中，除根据细菌的形态、染色、培养特性进行初步鉴定外，对绝大多数分离的未知菌的属、种鉴定，主要通过这些生物化学试验。 一、碳水化合物的代谢试验 原理：细菌各自具有不同的酶系统，对糖的分解能力不同，有的能分解某些糖产生酸和气体，有的虽能分解糖产生酸，但不产生气体，有的则不分解糖。据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。 1.糖（醇、苷）类发酵试验 原理：由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力各不相同，分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。 培养基：在培养基中加入0.5%～1%的糖类（单糖、双糖或多糖）、醇类（甘露醇、肌醇等）、苷类（水杨苷等）。培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。 方法：接种，培养。结果：产酸：培养基中的指示剂呈酸性反应。 产气：可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体培养基内有裂隙等现象。 不分解：培养基中除有细菌生长外，无任何其他变化。 应用：是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。 2.氧化-发酵试验（O/F试验） （1）原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型。氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖。细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型。发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖而分解蛋白胨的细菌称为产碱型。利用此试验可区分细菌的代谢类型。 （2）培养基HL：Hugh-Leifson培养基。 （3）方法：将待检菌同时穿刺接种于两支HL培养基，其中一支培养基滴加无菌的液状石蜡（或其他矿物油），高度不少于1cm。将培养基于35℃培养48小时或更长。 （4）结果：两支培养基均无变化为产碱型或不分解糖型；两支培养基均产酸为发酵型；若仅不加液状石蜡的培养基产酸为氧化型。 （5）应用：主要用于肠杆菌科细菌与不发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。 3.β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验） （1）原理：有的细菌可产生β-半乳糖苷酶，能分解邻-硝基酚-β-D半乳糖苷（ONPG），而生成黄色的邻-硝基酚。 （2）试剂：0.75M ONPG溶液 （3）方法：从培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃水浴5分钟，加入0.25mlONPG试剂，水浴20分钟～3小时观察结果。 （4）结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30分钟内显色。

实验十二细菌常用生理生化反应实验结果观察.

实验十二细菌常用生理生化反应实验结果观察 结果观察 1 葡萄糖发酵实验直接观察试管，试管变黄者为葡萄糖发酵阳性菌，不变者为阴性菌 左边为恶臭假单胞菌，有气泡并变为黄色；右边为大肠杆菌 2 V. P.反应和甲基红试验： 将培养好的液体培养基分装于两个干净的小试管中，在一管中滴入2-3滴甲基红试剂，溶液 变红的为甲基红阳性菌，不变的为甲基红阴性菌?在另一管中加入V. P.试剂，在37C保温15 分钟，变红者为阳性菌，不变者为阴性菌. VP，图为右边为大肠杆菌，溶液变红，为阳性菌。 3吲哚实验 在培养好的液体培养基中加入1厘米高的乙醚，振荡，静置分层，加入2-4滴吲哚试剂，在掖面交界出现红色者为吲哚反应阳性菌，不变者为阴性菌?

左边为大肠杆菌，出现红色阳性菌；右边为产气杆菌，颜色不变，阴 性菌。 4硝酸盐还原实验 在点滴板上滴入革里斯试剂A液和B液，如过溶液变红说明有亚硝酸盐，为硝酸盐还原阳性菌，如果不变色需要再倒出部分培养基在另外的小孔中再滴如耳苯胺试剂，如果变蓝，说明此菌为阴性菌；如果不变色，说明此菌为硝酸盐还原强阳性菌. 右下方恶臭假单胞菌，加入革里斯试剂A、B后不变色，再加入二苯 胺试剂后变蓝，为阴性菌；左上方大肠杆菌为红色。 5柠檬酸盐实验 直接观察斜面，斜面变兰色者为柠檬酸盐利用阳性菌，不变者为阴性菌.

左边产生蓝色，产气杆菌阳性；右边为大肠杆菌，阴性。 6明胶水解 向培养好的明胶培养基中加入酸性氯化汞或三氯乙酸溶液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为明胶水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌. 左边为大肠杆菌，出现透明圈，阳性；右边为枯草杆菌，阴性菌。 7淀粉水解实验 向培养好的淀粉培养基平板上加入碘液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为淀粉水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌.

福林酚法测蛋白浓度

87 ...“It is flattering to be ‘most cited author,’but I am afraid it does not signify great scientific accomplishment. The truth is that I have written a fair number of methods papers, or at least papers with new methods included. Although method development is usually a pretty pedestrian affair, others doing more creative work have to use methods and feel constrained to give credit for same 1.... Nevertheless, although I really know it is not a great paper (I am much better pleased with a lot of others from our lab), I secretly get a kick out of the response.... “Perhaps you would be interested in a little about the history of the method. Back in 1922, Wu, who worked with Folin,applied the reagent to proteins, without CU 2+, so it was based on the tyrosine and tryptophane contents of the protein. This procedure was used sporadically for some time and had a reputation for erratic results,probably because traces of contaminating CU 2+ would increase the readings. Herriot, in a 1935 footnote to another paper,mentioned that CU 2+ enhanced readings with protein, and in 1941 published a short communication describing the CU 2+ enhancing effect for 7 proteins, and giving convincing evidence that the enhancement was attributable to reaction with peptide bonds. “Before I came to St. Louis we had need of a micro method for protein, studied the reaction some more, and came up with a revised procedure which we felt was an improvement, particularly in regard to application to a variety of situations.Actually, however, we had made few fundamental changes from the method of Herriot, and had never really intended to publish it. “When I came to St. Louis in 1947 Earl Sutherland, who was here then, adopted our procedure, but for several years complained that he had to cite it as ‘personal communication,’ and, he inquired, why didn’t we write it up? So we finally went to work and did the necessary things: studied the reaction more thoroughly, tested it a lot of ways,described its virtues and disadvantages,compared the results with a Kjeldahl procedure, investigated what interfered, etc.“This was a lot of work and the three co-authors helped in various ways. The greatest help was from Miss Nira Rosebrough (now Mrs. Nira R. Roberts) who became one of the best technicians I have ever had. She left us in 1957, worked for awhile with Dr. Rosen in Buffalo, and then quit science to raise a family. Dr. A. Lewis Farr (M.D.) was a post-doctoral student who had an outstanding record in medical school but decided after a year or so to go into private practice in his hometown in Greenville, Mississippi. Mrs.Randall was a technician who stayed at most a year, then left with her husband, and I don’t believe has been in science since, but I have lost track of her. “I...am puzzled why the paper is so often cited, and cited as such. I would like to think it is partly because we studied it pretty thoroughly and it is still applicable in most cases without modification, whereas the original Kjeldahl method, for example, has had innumerable major modifications and microfications, and people cite the particular modification they use. Another reason why our method isn’t simply referred to by name is that it’s quite a mouthful to say ‘Lowry,Rosebrough, Farr, and Randall.’ The method apparently filled a need in the beginning—and a lot of people measure proteins in their work.Once it became established by people like Sutherland and Kornberg, other people may have thought it was the method to use, or at least checked the procedure they were using against it.”2 1.Lowry O H. Personal communication to D.J.D. Price, November 11, 1969. 2.Lowry O H. Personal communication to E. Garfield, August 5, 1976. ...The authors assert that the use of the Folin phenol reagent for the measurement of proteins “has not found great favor for general biochemical purposes.” This study is concerned with modifying the Folin phenol reagent procedure by treating protein solutions “with copper in alkali.” By recording the color change after the copper treatment, and measuring the quantity of protein present with a Beckman spectrophotometer, the authors determined that “measurement of protein with copper and the Folin reagent” is more sensitive and simpler than other procedures. Professor Oliver H. Lowry: Number 1 January 3, 1977 Citation Classics Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A L & Randall R J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265, 1951.

蛋白质含量测定——双缩脲试剂法-实验报告

生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.1.掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作； 1.2.掌握双缩脲试剂的配制； 1.3.熟悉血清总蛋白的临床意义； 1.4.了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。 二、实验原理 2.1.两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。 2.2.蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。 三、材料与方法： 3.1.实验材料： 3.1.1.实验试剂：①小牛血清；②6.0mol/LNaOH溶液；③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L）；⑤0.9%NaCl；⑥蒸馏水。 3.1.2.实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒；⑥1100分光光度计；⑦电子天平；⑧水浴锅。

3.2.实验步骤 四、结果与讨论： 4.1.实验现象： ①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0.5ml，分别命名为B试管、S试管和U试管，再分别向三支试管内加入4ml的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状。

测定次数 1 2 3 平均吸光度 ②将三支试管放入37℃水浴锅中加热20min，取出后，B试管呈淡蓝色，S试管和U 试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。（如图一） 图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数 S 0.185 0.184 0.185 0.1847 U 0.152 0.151 0.152 0.1517 结果计算：代入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L)，得出结果：血清总蛋白=57.493g/L。 4.3.结果讨论 经查阅资料得：正常成人血清总蛋白含量为60～80g/L，而小牛血清总蛋白含量比正常成人血清总蛋白含量略低一点，本次结果得出小牛血清总蛋白含量为57.493g/L，符合情况。 4.3.1.成功原因： ①本次试验的试剂混合水浴后出现了预期效果：B试管呈淡蓝色，S试管和U试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。B试管呈淡蓝色是因为B试管中没有发生任何反应，所以呈现双缩脲试剂本来的淡蓝色，而S试管和U试管呈浅紫色是因为试剂中的蛋白质和双缩脲发生了双缩脲反应而呈浅紫色。 管号

1细菌培养接种、常用生化反应及细菌生长方式

实验报告 课程名称： 医学微生物学 指导老师：________________成绩：__________________ 实验名称： 细菌培养接种、常用生化反应及细菌生长方式 实验类型：_____同组学生姓名：_____ 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、主要仪器设备（必填） 四、操作方法和实验步骤 五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析（必填） 七、讨论、心得 一、实验目的 1. 了解细菌常用培养基 2. 掌握细菌的分离培养技术及纯种移种法 3. 熟悉细菌各种生长现象 4. 熟悉细菌常用生化反应 二、实验材料 生理盐水、大肠杆菌液、白色葡萄球菌液、痢疾杆菌液，接种环、酒精灯以及多种培养基。 三、操作方法 1. 细菌接种法 1) 分离培养法——平板划线法（葡萄球菌/大肠埃希菌） 2) 纯种培养法 ① 斜面培养基接种法（葡萄球菌/大肠埃希菌） a) 用左手握住菌种管和斜面培养基管，右手持接种环或接种针。 b) 用右手小指与手掌、小指与无名指分别拔出两管的棉塞，将管口通过火焰灭菌。 c) 用接种环或接种针伸入菌种管内，挑取用来接种的菌苔。 d) 伸入斜面培养管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上蜿蜒划线。 e) 接种完成之后，用火焰灭菌培养管口，并塞上棉塞，置于37℃培养。 ② 半固体培养基接种法 --- 穿刺接种法（大肠埃希菌/痢疾杆菌） a) 用左手握住菌种管和半固体培养管，右手持接种针 b) c) 用接种针伸入菌种管内，挑取用来接种的菌苔。 d) 垂直刺入半固体中心，至近管底部，然后沿穿刺线退出。 e) 塞回棉塞，接种针重新灭菌。接种完毕，于37℃培养18—24h ③ 液体培养基接种法 （葡萄球菌/大肠埃希菌/痢疾杆菌） a) 用灭菌接种环挑取用来接种的菌苔。 b)

BCA法测蛋白含量

THE BICINCHONINIC ACID (BCA) ASSAY FOR DETERMINATION OFTOTAL PROTEIN Principle原理 Smith et al. (1985) introduced the bicinchoninic acid (BCA) protein assay reagent. Inone sense, it is a modification of the Lowry protein assay reagent. The mechanism ofcolor formation with protein for the BCA protein assay reagent is similar to that ofthe Lowry reagent, but there are several significant differences. The BCA protein assayreagent combines the reduction of Cu2+ to Cu+ by protein in an alkaline medium (i.e., thebiuret reaction) with the highly sensitive and selective colorimetricdetection of the cuprous cation (Cu+) by bicinchoninic acid.The purple-colored reactionproduct of this method is formed by the chelation of two molecules of BCA with onecuprous ion (Fig. A.3H.3). The BCA/copper complex is water-soluble and exhibits astrong linear absorbance at 562 nm with increasing protein concentrations. The primaryadvantageoftheBCAproteinassayreagentisthatmostsurfactants,evenifpresentinthesample at concentrations up to 5% (v/v), are compatible with this method. Table A.3H.2is a brief troubleshooting guide for this technique. 二喹啉甲酸（BCA）法是在福林酚法的基础上改善而来的，即在碱性条件下蛋白质将二价铜离子还原成一价铜离子，然后与BCA试剂反应生成紫色化合物，在562 nm处检测。

细菌生理生化实验

细菌生理生化试验—小木虫 微生物生理生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生理生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区分的微生物。因此微生物生理生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一,微生物鉴定中常用的生理生化反应如下所示： (一) 糖、醇发酵试验 原理： 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+）、产气（符号：○），培养基由紫（蓝）变黄（指示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸变黄的结果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符号：－），培养基仍为紫（蓝）色。 培养基配制： 一般细菌常用休和李夫森二氏培养基： 蛋白胨：2g ，K2HPO4 :0.2g ，NaCl:5g ，糖（醇、糖苷）：1% ，水洗琼脂：5～6g，蒸馏水：1000mL，PH:6.8～7.0，溴百里酚蓝：1%水溶液3mL(先用少量的95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液)。先调PH后再加指示剂。 芽孢杆菌培养基配制： (NH4)2HPO4:1g ，MgSO4:0.2g ，KCl:0.2g ，酵母膏：0.2g ，糖（醇、糖苷）：1%水洗琼脂：5～6g ，蒸馏水：1000mL ，溴甲酚紫：0.4%乙醇液2mL，PH:6.8～7.0。先调PH后再加指示剂。 将以上培养基分装试管，培养基高度约为4～5cm ，115℃灭菌20min。 测定的糖（醇、糖苷）类可以包括：葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖（1.5%）、半乳糖（1.5%）、D-山梨醇、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、水杨苷等。 注意：以上亦可用液体培养基。 接种和观察结果： 用18～24h的幼龄菌种，用穿刺针接种于培养基中，适温培养1d，3d，5d后观察，颜色变黄为阳性，不变为阴性；有气泡产生为产气。 结果记录： 产酸：+，产气：○，不产酸长气：- 。 (二) 淀粉水解试验 原理： 某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。 培养基配制： 牛肉膏5g；NaCl:5g；可溶性淀粉5g；琼脂:20g；蒸馏水1000mL。PH:7.2 121℃灭菌20min。 试验方法： 以18~24h的纯培养物，点接于淀粉琼脂平板（一个平板可分区接种）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1℃培养24～48h，或于20℃培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明圈、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明圈或肉汤呈深蓝色。 淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养

蛋白质测定实验报告

蛋白质测定方法——化学报告

蛋白质的检测 酚试剂法灵敏度较高 20~250mg 费时蛋白质在碱性溶 液中其肽键与 Cu2+螯合，形成 蛋白质一铜复合 物，此复合物使 酚试剂的磷钼酸 还原，产生蓝色 化合物 酚类、柠檬 酸、硫酸铵、 tris缓冲液、 甘氨酸、糖 类、甘油等均 有干扰作用 由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以实验的形式进行详细阐述：

1 材料与方法 1.1 仪器材料 (1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。 (2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、0.12mol/LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。 1.2 实验方法 (1)凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。 (2)紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如, 生化制备中常用的(NH4)2SO4 等和大多数缓冲液不干扰测定,特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。 此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。取待测样品制成蛋白浓度大约在0. 1～1. 0mgPmL的蛋白质溶液,用紫外分光光度计进行比色,对照标准曲线得出样品含氮量。每个样品做3次重复测定,取平均值。 (3)双缩脲法测定蛋白质含量