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高通量的基因克隆

高通量的基因克隆
高通量的基因克隆

动物医学进展,2008,29(1):1002103

Progress in Veterinary Medicine

专论与讲座

高通量的基因克隆3

余 钗1,史 惠2,赖汉漳3

(1.福清出入境检验检疫局,福建福清350300;2.福建省动物疫病预防控制中心,福建福州350003;

3.华南农业大学兽医学院,广东广州510642)

摘 要:大规模基因测序已经完成了多个重要物种的基因组序列分析,功能基因组学研究进入了一个新时代。随着基因克隆和表达的发展,对使用简便、成本低廉、保真度高和易于在不同体系中穿梭的高通量克隆体系的了解、评价和使用已经成为基因组水平研究的重要问题。因此,高通量克隆技术成为功能基因组学研究中不可或缺的有力工具,且由此也带动了基因功能研究的发展。为此,该文对目前存在的多种高通量克隆方法原理和特性进行了介绍。

关键词:高通量克隆;基因克隆;重组克隆;不需要连接的克隆

中图分类号:Q78文献标识码:B文章编号:100725038(2008)0120100204

随着大规模基因组测序技术的进步,各个物种的基因测序也相继完成[125],对基因及其产物的功能研究和阐明也开始成为当今生物医学和制药领域研究的热点,基因的大规模克隆和表达给后基因组学时代的基因功能研究带来了巨大的挑战,这就需要更加有利于自动化操作的方法进行技术支持。不少较新的技术,如蛋白质在体内的超量表达、干涉表达、蛋白质定位分析和酵母双杂交等需要将全长或部分的开放阅读框亚克隆到载体中[527]。传统的克隆基于限制性内切酶和连接酶的方法需要经过酶切、连接等过程,操作繁琐,若按此法完成全基因组的开放阅读框的克隆将花费大量的时间和资金,而且,存在于基因内部的酶切位点将阻碍这种克隆体系的顺利实施。另外,在很多情况下,如在启动子和外显子的研究、蛋白质的表达中要求在克隆时不能添加进多余的外源序列或改变目的片段的内部碱基序列,否则会改变DNA各元件间的间距、引入额外的氨基酸残基、改变蛋白质的结构和活性,从而干扰对基因的精确研究。因此,高效准确的克隆系统显得尤为重要。

高通量的克隆系统具有操作方便、适用于克隆不同大小目的片段、保真度高和费用低等特点,如韩光亮等[6]的酪氨酸蛋白激酶抑制剂的高通量筛选模型的应用。高通量克隆法目前主要有重组法克隆与不需要连接的克隆(ligation independent cloning,L IC)[7],下面将分别对其原理和特性进行介绍。

1 重组法克隆

重组克隆可分为同源重组克隆和位点特异性重组克隆两大类。

1.1 同源重组克隆

同源重组可以使具有同源序列的两个分子间的遗传物质发生交换,而且,同源重组的位点可以自由地选择,这使得基因克隆得以容易地实现。目前的同源重组克隆法包括酵母同源重组克隆和细菌同源重组克隆。

1.1.1 酵母同源重组克隆 利用酵母具有的双链损伤修复机制使体内的线性双链分子发生同源重组[829]。利用特异的引物对目的基因片段进行扩增,其引物的一端是与线性载体的末端同源的序列,将目的片段与线性载体转入酵母细胞,利用酵母体内的重组系统便可使其在体内进行同源重组。

1.1.2 细菌同源重组克隆 大肠埃希菌内的同源重组克隆可以通过Red/ET依赖性的机制来实现。Recd/ET系统仅要求线性载体片段和插入片段之间有30个~50个碱基的同源区域即可在大肠埃希菌中高效地同源重组。原理是将λ噬菌体中Red系统的编码基因整合到大肠埃希菌的基因组中,其利用的是λ噬菌体RedE蛋白和Red T蛋白的作用。RedE蛋白是一种核酸外切酶,具有以5′→3′的方向降解双链DNA的活性,可在双链DNA的两端各留

3收稿日期:2007209228

作者简介:余 钗(1976-),男,福建福州人,助理兽医师,主要从事进出口食品检验检疫。

下一段单链;Red T蛋白则具有单链结合活性,可保护单链DNA免受降解。在recBC sbcA突变株中,具有降解线性双链DNA的RecBCD和Sbc2CD蛋白失活,这样线性双链DNA就可以利用重组酶在大肠埃希菌体内发生类似酵母中的重组反应[10211]。

1.2 位点特异性重组克隆

λ噬菌体编码λ整合酶能指导噬菌体DNA插入大肠埃希菌染色体中。这种插入作用是通过两个DNA分子的特异位点进行重组,将两个环状DNA 分子变成一个大环。在噬菌体感染的早期即有大量整合酶产生,故几乎所有被感染的细胞都发生整合作用[10]。基于这一原理建立了位点特异性同源重组技术。以Gateway 克隆技术为例,其利用的是λ噬菌体与大肠埃希菌染色体之间发生的位点特异性的重组整合与切出反应。整合反应是由Int(inte2 grase)和IH F(integration host factor)催化的。attB和att P之间的重组整合的噬菌体基因组DNA 的5′和3′端含有attL和att R位点。切出的重组反应需要IHF、Int和Xis蛋白的参与。在插入大肠埃希菌基因组DNA的噬菌体基因组DNA的5′和3′端的attL和att R位点发生位点特异性的重组,重新形成lambda DNA的att P位点和大肠埃希菌基因组DNA的attB位点。该方法只需一步生化反应,而且操作方便、快捷,摆脱了传统的需要DNA限制性内切酶、DNA连接酶、凝胶电泳和DNA片段纯化等多个步骤的单调乏味的的亚克隆方法,节省了大量的时间和劳力,而且重组反应非常保守,所以在反应过程中不会有碱基对的添加或缺失,因而高度特异[12]。

2 不需要连接的克隆

常规的克隆方法靠连接酶把DNA片段与载体DNA连接起来,而不需要连接的克隆(L IC)则不需要连接酶。L IC法主要有非限制酶修饰的克隆与PCR诱导的克隆两种类型。

2.1 非限制酶修饰的克隆

主要有T4DNA聚合酶法、外切酶Ⅲ法、Enase: Eam11041法、噬菌体T7Gene6外切酶法和尿嘧啶DNA糖基化酶(UD G)等方法。

2.1.1 T4DNA聚合酶法 Josep h等利用T4 DNA聚合酶具有3′→5′外切酶活性和5′→3′聚合酶活性的特性。T4DNA聚合酶在一定浓度dN TP 存在下,如果模板为带有3′突出末端的双链,且反应体系中只有一种dN TP,那么它将沿双链DNA底物3′→5′方向外切,直到它遇到模板上与反应体系中存在那种dN TP相同的核苷酸。此时聚合酶活性与外切酶活性保持平衡,产生5′端突出的黏性末端。因此,如果在引物末端引入一段序列,它的互补链在某一位置缺少某个碱基,同时,在载体的多克隆位点上也设计相应引物,它包含两个区域,即3′侧区域能扩增出整个载体、5′侧区域与插入片段引物5′端互补,它们互补链缺少的碱基也互补。这样,两对引物的扩增产物用T4DNA聚合酶和相应的dN TP处理后,混合,退火,就可以转化了。为保证退火的黏性末端足够稳定,载体和插入片段引物的5′端至少要有12个碱基互补。这种方法效率很高,每微克载体可以产生2×105~5×105个重组子。

2.1.2 外切酶Ⅲ法 Stefan等及Ku2chuan等利用外切酶Ⅲ来产生黏性末端。外切酶Ⅲ的3′→5′外切酶活性没有序列特异性,它可以降解线性双链DNA 3′端羟基,于是,在两个引物的5′端加入不同的限制性内切酶识别序列,并由激酶在5′端加上磷酸基团。PCR反应后,产物用外切酶Ⅲ消化一段时间,就可以与经相应的双酶消化好的载体连接了。该方法效率可高达90%,但实际操作中外切酶消化时间较不容易掌握,因此后来有人利用外切酶Ⅲ裂解磷硫酰速度慢的特性,在PCR阶段引入硫化核苷酸来控制外切酶Ⅲ消化的程度[13]。

2.1.3 Enase:Eam11041法 Kerstien等根据这种酶在它的识别序列5′2C TCT TC的外侧切割双链DNA,并对甲基化敏感。设计5′端带有Eam11041识别序列的引物分别扩增目的片段和载体,产物用Eam11041消化后就可以连接了。如果担心目的片段和载体内有Eam11041的识别序列,用m5dCTP 代替dC TP作PCR反应,目的片段和载体内部的识别序列受甲基化保护,但引物上的识别序列由于互补链中没有dC而不受影响。适当设计目的片段和载体引物的5′端引入序列,便可以做到定向连接。2.1.4 噬菌体T7Gene6外切酶法 这种酶对线性双链DNA有5′→3′外切酶活性,而不论5′端是羟基还是磷酸基,对磷酸二酯键的活性大大高于磷硫键。由此,设计含两个结构域的引物,5′端的结构域与载体多克隆位点上所选用内切酶的切点一侧的序列互补;3′端的结构域是目的片段特异的引物。两个结构域之间由磷硫键连接。这样,PCR产物与处理好的载体用此酶消化后就可以退火、转化了。这种方法同样要求配对区域有10多个碱基,也可以做到定向连接,效率也很高。对几千个碱基对长的PCR产物,转化效率也可高达103~104重组子每微克DNA[14]。

2.1.5 尿嘧啶DNA糖基化酶(UD G)法 Rash2

101

余 钗等:高通量的基因克隆

tchian等利用UD G能选择性降解DNA中dUM P 的性质,在引物的5′端加入一端长为12个碱基的序列,其中d T被dU代替。由它扩增出的PCR产物,经UD G消化,能产生12个碱基长的黏性末端。载体线性化,加上与上面序列相互补的接头后,PCR 产物和载体就可以退火、转化。UD G在Taq DNA 聚合酶的反应缓冲体系中仍有相当活力,因此不用更换离心管,UD G消化、PCR产物与载体退火可同时在PCR反应管中完成,并能直接转化感受态细胞。这种方法的效率较T/A策略高50倍~100倍,几乎所有转化子都有插入片段。

2.2 PCR诱导的克隆

主要有T2A克隆、Hetero stagger克隆、ROC和DOC克隆、RF克隆和In2Fusion TM PCR克隆等。2.2.1 T2A克隆 Taq聚合酶具有末端转移酶活性,可在PCR产物的3′端优先加一个脱氧腺苷(dA),形成两端带有单个3′2dA突出的DNA片段,可与两端带有32d T突出的线状载体进行有效连接。T2A克隆应用方便,重复性好,克隆效率也比较高。实际上T2A克隆是一种应用最广泛的PCR产物的克隆方法。T2A克隆也可直接用于克隆RA PD、A FL P等扩增产物[15216],即使由V ent、Pf u等DNA 聚合酶产生的平端DNA,经Taq加尾后也可进行T2A克隆。但不足的是,T2A克隆是非定向克隆、要购买T载体而不能自由使用自己需要的载体,挑出正确的重组子后还必须要再多一次亚克隆将DNA 片段转移到自己需要的载体上。

2.2.2 Hetero stagger克隆 Felfoldi F等首先利用两对引物分别对目的基因进行PCR。第1对的上游引物(COF)5′端含有4个碱基突出,可以与用Hi n dⅢ限制酶切后载体上的一黏性端完全互补,而其下游引物(CN R)则无突出端;第2对引物则相反,在下游引物(COR)5′端含有4个碱基突出,可以与用XhoⅠ限制酶切后载体上的的一黏性端完全互补,而其上游引物(CN F)无突出端。在凝胶电泳纯化后,两种产物进行混合、变性、退火。这样就可以得到两端为黏性末端的目的基因片段,可与用Hi n d Ⅲ和XhoⅠ限制酶切后的载体进行克隆。好处是不会引入多余的碱基,特别适合于将目的基因直接克隆到仅有很少克隆位点的表达质粒上。

2.2.3 ROC和DOC克隆(RNA overhang cloning and DNA overhang cloning,RNA和DNA悬突克隆) ROC和DOC方法用的是一种DNA和RNA 嵌合的引物,在引物的3′端含有4个脱氧核苷酸。ROC方法中使用一种不能复制RNA的聚合酶进行PCR,这样在PCR产物的两端就会各产生4个脱氧核苷酸序列,将扩增后的目的片段和载体混合后进行连接,利用体内的聚合酶将RNA序列降解,就可以得到需要的重组质粒。与ROC方法相类似, DOC方法利用同样的引物,但使用一种可以复制RNA的聚合酶,产生平末端的产物,然后用NaO H 处理使RNA成分水解,就得到含有DNA突出侧翼序列的产物[17]。

2.2.4 RF克隆 该法由QuickChang TM的寡核苷酸指导的位点特异性诱变方法改进而来。RF克隆首先用一对特殊引物对目的基因进行PCR扩增。其上游引物末端是24个与插入位点的5′端区域重叠的碱基,下游引物也类似地可以与载体发生退火互补。将PCR产物与一种从甲基化大肠埃希菌中提取而来的环化质粒混合,在Pf u T urbo TM DNA聚合酶的作用下以质粒载体为模板进行线性扩增,之后,反应混合体系中加入Dp nⅠ对亲本质粒进行降解,留下的便是新生成的带目的片段的产物。由于PCR产物两个末端序列不同,这种类似重组的反应是精确定向的,不需要检验插入片段的方向。该方法操作简单方便,只需从dam+E.coli中获取的环状质粒即可使用,反应产物可以直接转化大肠埃希菌进行蛋白质表达,省去了亚克隆这一步骤,避免了可能带来的突变。同时由于RF克隆不会在目的片段两端引入多余的碱基对,该法对于结构基因组学的研究是非常有吸引力的[18]。

2.2.5 In2Fusion TM PCR克隆 与RF克隆类似,该法在合成引物时两端对应加入了线性化载体两端的15个碱基,PCR得到的产物两端就分别带上了15个和线性化载体两端重复的碱基序列。由于PCR产物和线性化载体的末端同源,加入In2Fu2 sion TM重组酶就可以实现类似同源重组的反应,将PCR产物“置换”到目标载体上,该方法操作更加简单方便,只需线性化载体(任何自备的载体都可以使用),经过30min孵育就可以将PCR产物片段定向克隆到自备载体上[19]。因此可以为使用者节约不少时间和精力。In2Fusion TM PCR克隆是目前最为简捷的克隆PCR产物的方法,有助于实现PCR克隆的自动化操作。

通过以上的介绍可以看出,这些方法为基因的高通量克隆提供了十分有效的途径。当然,每一种克隆方法在发挥其自身的优势的同时也存在或多或少的不足,例如,需要对插入片段/载体事先进行特别的设计,或通过PCR的方法对插入片段和/或载体片段两端进行加工以便下一步的克隆,这也使得

201动物医学进展 2008年 第29卷 第1期(总第173期)

对聚合酶的高保真性依赖性提高;由于免除了可操

作区域引入,例如限制酶切位点等,克隆一旦构建好之后,目的片段就被固定在一种载体中,需要在其他载体中表达时必须重新构建,这与传统的“酶切2连接”方法反差显著。因此,设计试验时必须综合灵活利用不同的方法以达到快速高效的目的。另外,还存在个别方法的试剂材料来源较少、价格较贵和操作步骤多等问题。如果上面的问题能够得到进一步的解决,那么,凭借着精确的高通量克隆,加上便利的基因转移系统,人们对DNA 和基因进行操作的能力将得到增强,如哈佛研究人员应用高通量克隆方法构建人类激酶基因库。同样,在基因组、蛋白质组学及高通量技术的推动下,癌症靶分子和治疗方法正快速发展[20]。这无疑也加速了功能基因组学、蛋白质组学和生物医学,以及药物研究开发领域的发展。总之,高通量克隆系统具有重要的应用意义,期盼在未来几年中出现革新性的方法,加速功能基因组研究的发展。参考文献:

[1] Griffit hs 2Jones S ,Grocock R J ,van Dongen S ,et al.miRBase :

microRNA sequences ,target s and gene nomenclature [J ].Nu 2cleic Acids Res ,2006,34:1402144.

[2] Hinrichs A S ,Karolchik D ,Baert sch R ,et al.The UCSC Ge 2

nome Browser Database :update 2006[J ].Nucleic Acids Res ,2006,34(Database issue ):D5902598.

[3] 周 铭,梁 钢.高通量分析技术在肿瘤MDR 中的研究进展

[J ].国际肿瘤学杂志,2006,33(12):9092912.

[4] 孙 健,刘国振.基因功能研究的加速器:高通量克隆表达系

统[J ].生物技术通报,2006,(4):6211.

[5] Park J Y ,Hwang E M ,Park N ,et al.Gateway RFP 2fusion vec 2

tors for high t hroughput functional analysis of genes [J ].Mol Cells ,2007,23(3):3572362.

[6] 韩光亮,尚念勇,杜冠华.酪氨酸蛋白激酶抑制剂的高通量筛选

模型[N ].中国药理学通报,2005,21(5):6282631.

[7] Geert sma E R ,Poolman B.High 2t hroughput cloning and ex 2

pression in recalcit rant bacteria [J ].Nat Met hods ,2007,4(9):7052707.

[8] 汪宗桂,郑文岭,马文丽.通路克隆系统:DNA 重组技术的新进

展[J ].中国生物工程杂志,2003,23(7):24227.

[9] Zhu H ,Bilgin M ,Bangham R ,et al.Science [J ].2001,293

(5537):210122105.

[10] Muyrers J P ,Zhang Y ,Stewart A F.Techniques :recombi 2

nogenic engineering 2new options for cloning and manipulating DNA[J ].Trends Biochem Sci ,2001,26(5):3252331.

[11] Court D L ,Sawitzke J A ,Thomason L C.Genetic engineer 2

ing using homologous recombination [J ].Annu Rev Genet ,2002,36:3612388.

[12] J ames L Hartley ,Gary F Temple ,Michael A Brasch.Con 2

certed assembly and cloning of multiple DNA segment s using in vitro site 2specific recombination :functional analysis of multi 2segment expression clones[J ].Genome research ,2000,10(11):178821795.

[13] 陆云华,马立新,蒋思婧.一种通用高效的复杂载体构建的新

方法[J ].遗传,2006,28(2):2122218.

[14] Y in J ,St raight P D ,Hrvatin S ,et al.Genome 2wide high 2

t hroughput mining of natural 2product biosynt hetic gene clus 2ters by phage display[J ].Chem Biol ,2007,14(3):3032312.

[15] Hermosa M R ,Grondona I ,D íaz 2M ínguez J M ,et al.Devel 2

opment of a strain 2specific SCAR marker for t he detection of Trichoderma atroviride 11,a biological control agent against soilborne fungal plant pat hogens [J ].Curr Genet ,2001,38:3432350.

[16] Xu M.Development of sequence 2characterized amplified re 2

gions (SCARs )from amplified fragment lengt h polymorphism (A FL P )markers tightly linked to t he Vf gene in apple [J ].Genome ,2001,44:63270.

[17] Coljee V W ,Murray H L ,Donahue W F ,et al.Seamless

gene engineering using RNA 2and DNA overhang cloning[J ].Nature ,2000,18(7):7892791.

[18] van den Ent F.RF cloning :A restriction 2free met hod for in 2

serting target genes into plasmids[J ].Biochem Biophys Met h 2ods ,2006,67(1):67274.

[19] 黄淑华,彭芝兰,王 和.一种简单的PCR 产物克隆方法[J ].

华西医学,2006,21(2):3312332.

[20] 陈兆聪,梁勋厂.癌症的分子靶向治疗[J ].Herald of Medi 2

cine ,2006,25(7):6042606.

作者声明

本人在《动物医学进展》2005,26(3):75-77所发文章《化学发光检测苯甲酸钠对DNA 损作的保护作用》,通讯作者为河南农业大学李宏基副教授,e -mail :atozss @https://www.wendangku.net/doc/d517737860.html, ,特此声明。

作者:黄 进

作者声明

本人在《动物医学进展》2005,26(3):26-28所发文章《抗菌肽的作用特点及应用前景》,通讯作者为河

南农业大学李宏基副教授,e -mail :atozss @https://www.wendangku.net/doc/d517737860.html, ,特此声明。

作者:布冠好

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01余 钗等:高通量的基因克隆

【高中生物】功能基因的克隆及生物信息学分析

(生物科技行业)功能基因的克隆及生物信息学分析

功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要:随着多种生物全基因组序列的获得,基因组研究正从结构基因组学(structuralgenomics)转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等),其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1],它代表了基因分析的新阶段,已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物,发展和应用新的实验手段,通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能,使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究,是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因,也成为我们面临的一个课题,本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词:功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆,它是根据目标基因在染色体上确切位置,寻找与其紧密连锁的分子标记,筛选BCA克隆,通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域,根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因,得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息,从突变体开始,逐步找到基因,最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多

控制质量性状的单基因得以克隆,最近也有报道某些控制数量性状的主效基因(控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等)也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因 首先根据已知的基因序列设计PCR引物,在已知材料中扩增到该片段,并经克隆测序验证,利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针,与待研究材料的cDNA文库杂交,就可以获得该基因cDNA克隆,利用克隆进一步筛选基因组文库,挑选阳性克隆,亚克隆并测序,从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法 结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸

引物设计大全

引物设计和Primer-BLAST的应用 Lv Peng 2015.11.18

CONTENT 1.PCR-引物设计目的 2.引物设计原则 3.设计引物软件 4.在线设计工具 5.probeBase 简介

1.1PCR(Polymerase Chain Reaction) 聚合酶链式反应 1971 Khorana 提出设想 1985 Kary Mullis 发明了PCR 1986年5月 Mullis在冷 泉港实验室 做专题报告 冷泉港实验室(The Cold Spring Harbor Laboratory,缩写CSHL),又译为科尔德斯普林实验室。

几不同的PCR技术 1.扩增已知序列两侧DNA的PCR:反向PCR(Inverse PCR,IPCR)、锚定PCR(anchored PCR)、RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)、连接介导的PCR(ligation-mediated PCR,LM-PCR); 2.检测有限量稀有靶序列,即一对引物扩增产物不足以以通过凝胶电泳观察到的时:巢式PCR(nested PCR); 3.快速、灵敏、特异而准确定量的PCR:实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR,RQ-PCR)。

特性 优化 碱基组成 (G+C )含量应在40%-60%,4种碱基要分布均匀;长度 一般为18-27个核苷酸长度。上下游引物长度差别不能大于3bp ;重复和自身互补序列 不能有大于3bp 的反向重复序列或自身互补序列存在;上下游引物互补性一个引物的3’末端序列不能结合到另一个引物的任何位点上; 解链温度(Tm ) 两个引物的Tm 值相差不能大于5℃,扩增产物与引物的Tm 值相差不能大于10℃3’末端 引物3’末端碱基尽量为G 或C ,不能使3’末端有NNGC 或NNCG 序列引物序列不要有局部的GC rich 或AT rich (特别是3’端),避开T/C 或A/G 的连续结构 1.2引物设计原则 引物特性及优化设计

植物基因克隆实验指导

植物基因克隆实验规则 一、植物基因克隆实验课的目标 根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程,实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验,注重科研成果在教学中的应用,我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学,这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。 整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进 行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性,让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。 我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科 研基础。 二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节,必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解,让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外,一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作,仔细观察,作好记录。有关基本技能的训练,要按操作程序反复练习,以达到一定的熟练程度。

4、演示每次的实验都备有演示内容,其目的是帮助学生了解某些实验中的难点,扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写,必须强调科学性,实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后,由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。 三、实验规则和注意事项 1、每次上课前,必须认真阅读实验指导,明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项,熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律,听从教师指导,保持肃静。有问题时举手提问,严禁彼此谈笑喧或随意走动,也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程,严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细,边做、边看、边想,认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备,注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后,应清理实验台面,认真清理好仪器、药品及其他用品,放回原处,放好凳子,方可离开实验室。值日生要负责清扫地面,收拾实验用品,处理垃圾,关好水、电、门窗后再离开。

植物基因克隆技术的研究进展

植物基因克隆技术的研究进展 随着科学技术的不断发展,人类基因组计划的不断实施,世界生命科技工作者对于植物基因克隆技术的研究不断进步,近年来,我国在基因克隆技术领域也有了长足的进步,在玉米,小麦,大豆,水稻,拟南芥等植物中,已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。文章主要从基因芯片技术,功能克隆、定位克隆、同源序列克隆、PCR擴增技术分别介绍基因克隆技术的现状以及研究进展。 标签:植物;基因克隆技术;研究 植物基因克隆技术在生命科学技术中扮演着越来越重要的角色,而植物基因克隆技术从传统意义上来讲可分为两种不同的方式。正向以及反向的遗传学方式,正向遗传学途径是一种很早的经典的克隆方法,通过研究突变表型性状进行克隆,包括了功能以及表型克隆等较为基本的克隆的方式;反向遗传学途径和正向遗传学途径截然不同,它是通过一些特殊的方法,获得遗传基因片段,然后经过一系列的定位,将之后所研究的基因逆向研究。如定位克隆,同源序列克隆等。除了这两种克隆技术外,随着社会发展,也有一些新的克隆技术产生。 1 基因芯片技术 基因芯片技术是电子克隆技术的典型代表,基因芯片又称DNA芯片、DNA 微阵列,是以预先设计的方式将大量的基因探针固定在玻片、硅片等固相载体上组成的密集分子阵列。基因芯片技术类似于计算机的电子芯片技术,其具有高通量、微型化、连续化、自动化、快速和准确等特点。是一种随着人类基因组计划的进行而发展出的产物,这一发展使得人类对越来越多的微生物和动植物基因组取得了更长远的认识,对其的研究,是全人类对于基因组认识做出的不断地努力的成果,其中不乏许多典型的实例,用cDNA芯片技术对草莓、矮牵牛其基因是如何进行表达的进行研究,进而实现对转基因植物进行形状的观察及控制,可以更好的获悉分子对于基因表达是如何作用以及影响的也有利于获得更为优异更为良好的作物[1]。 基因芯片技术是一种新型的克隆技术,是科技创新和生命科学的很好的结合,代表着人类在基因的克隆方面进展和成就,解决了很多传统克隆不能解决的问题,也讲基因克隆技术引向一种新的思维模式。 2 功能克隆 功能克隆是人类采用最早的基因克隆策略,功能克隆技术从已知蛋白质的功能着手进行研究,其方法原理是先测知基因的编码蛋白质,利用它的信使RNA 进行反转录成cRNA,再利用cDNA做探针,从基因组中获取基因本身,进而完成克隆。

植物基因转化常用方法

一. 植物遗传转化的方法 植物遗传转化技术可分为两大类:一类是直接基因转移技术,包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等,其中基因枪转化法是代表。另一类是生物介导的转化方法,主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法,其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高,广泛应用于双子叶植物的遗传转化。 二.农杆菌介导的基因转化方法 (一)农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制 几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染,而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌(A. tumefaciens)。其致瘤特性是由Ti(tumor-inducing)质粒介导的。农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香 酮和羟基乙酰丁香酮,这些酚类物质可以诱导Vir(Virulence region)基因的启动表达,Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T-DNA单链切下,而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T-DNA结合,形成复合物,转化植物根部细胞。T-DNA上有三套基因,其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素,促使植物创伤组织无限制地生长与分裂,形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱,冠瘿碱有四种类型:章鱼碱(octopine)、胭脂碱(nopaline)、农杆碱(agropine)、琥珀碱(succinamopine),使农杆菌生长必需的物质。 1. Ti质粒的结构 在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti质粒后,Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。 Ti质粒大约在160~240kB之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb 左右。除此之外,Ti质粒上还存在Con区(region encoding conjugation)和Ori区(origin of replication)。 T-DNA上共有三套基因和左右两个边界,LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序,在切除及整合过程具有重要意义。 tms由两个基因组成:tms1(iaaM)和tms2(iaaH) tmr由一个基因组成iptz: tmt由若干基因构成,合成稀有氨基酸衍生物,称为opines。它有三个成员: octopine=精氨酸与丙酮酸的缩合物 Napaline=精氨酸与-酮戊二酸的缩合物 Agropine=谷氨酸与二环糖的缩合物 据此可将Ti质粒分为三大类,感染的植物诱导合成这些有机碱,但不能利用它们,其分解酶基因在Ti质粒上,分解产物为氨基酸和糖类,供根癌农杆菌使用作为氮源及碳源。

lamp引物设计实例

核酸环介导等温扩增技术(LAMP)引物设计与实例Time:2009-12-07 PM 14:52 Author:bioer Hits: 1459 times 烟头整理 LAMP的特点 LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点: (1)操作简单 LAMP核酸扩增是在等温条件下进行,对于中小医院只需要水浴锅即可,产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT-LAMP),不需要特殊的试剂及仪器。 (2)快速高效 因为不需要预先的双链DNA热变性,避免了温度循环而造成的时间损失。核酸扩增在l h内均可完成,添加环状引物后时间可以节省1/2,多数情况在20-30 rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍,达0.5 mg/mL。应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。 (3)高特异性 由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。 (4)高灵敏度 对于病毒扩增模板可达几个拷贝,比PCR高出数量级的差异。 缺点: 由于LAMP扩增是链置换合成,靶序列长度最好在300 bp以内。>500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高。极易受到污染而产生假阳性结果。故要特别注意严谨操作,以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR 方法。 引物设计实例 LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/),只要导入靶基因就能自动生成成组引物。 以某一微生物的鞭毛基因为例讲解一下LAMP引物设计的过程: 首先单击浏览按钮选择靶基因序列文件,靶序列默认的是小于22 kbp。支持三个类型的文件,普通文本格式(仅含序列), FASTA格式和GenBank 格式文件。

红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯

毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校

华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告

癌活性,对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素,高纯度紫杉醇价格昂贵,每公斤200万元人民币左右。因此,近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成,尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率,克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法,但是紫杉醇的合成途径非常复杂,涉及到多种酶以及很多分支途径,单纯依靠转化一、两种限速酶基因,只能保证转入的限速酶表达量提高,使之不再是限速因素,但其它阶段对于最终产量的限制依然存在,而且同时转入多种基因的可行性非常低,这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成,如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇,为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破,目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇,能够利用真菌生长速度快的优势,但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求,而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌,其紫杉醇含量极微,并且这些真菌的培养和大规模发酵困难,菌株衰退也是一个难题。 另外,红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一,是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段,如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前,在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因,它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域,是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因,之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。

引物设计1

1-2890(引物1) #1: Product of length 640 (rating: 171) Contains region of the molecule from 1 to 640 Tm: 72.1 C TaOpt: 48.8 C GC: 32.3 Sense Primer: CCTGGTTAATCCAAATCAC Similarity: 100.0% Length: 19 Tm: 44.1 C GC: 42.1 dH: -142.0 kcal/mol dS: -372.4 cal/mol dG: -29.2 kcal/mol Antisense Primer: GACAGGCCCTAATTAAGTT Similarity: 100.0% Length: 20 Tm: 45.0 C GC: 42.1 dH: -158.0 kcal/mol dS: -418.4 cal/mol dG: -31.5 kcal/mol Tm Difference: 0.9 GC Difference: 0 #1: Product of length 540 (rating: 171) Contains region of the molecule from 1 to 540 Tm: 72.2 C TaOpt: 49.4 C GC: 33.1 Sense Primer: CCTGGTTAATCCAAATCACT Similarity: 100.0% Length: 20 Tm: 45.8 C GC: 40.0 dH: -149.8 kcal/mol dS: -393.2 cal/mol dG: -30.8 kcal/mol Antisense Primer: ATAAGATTTGAGGTCAGCCA Similarity: 100.0% Length: 20 Tm: 46.4 C GC: 40.0 dH: -147.7 kcal/mol dS: -386.3 cal/mol dG: -30.7 kcal/mol Tm Difference: 0.6 GC Difference: 0.0 1-2890(引物2) #1: Product of length 603 (rating: 171) Contains region of the molecule from 514 to 1116 Tm: 73.9 C TaOpt: 50.3 C GC: 37.0 Sense Primer: TTGAAGATGGCTGACCT Similarity: 100.0% Length: 18 Tm: 42 C GC: 47.1 dH: -129.6 kcal/mol dS: -335.0 cal/mol dG: -27.9 kcal/mol Antisense Primer: GGAGGCCCTTTAACTTAA

植物基因的克隆|植物基因克隆的基本步骤

植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介 克隆(clone)是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段(或基因)的扩增,主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。 关键词 植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means

based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能 基因(gene)是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说,植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。 (一)植物基因的启动子 启动子(promoter)是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域,植物积阴德启动子包括三个较重要的区域,一时转录起始位点,而是转录起始位点上游25~40bp的区域,三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。 (二)植物基因的增强子序列

DNA测序结果分析比对(实例)

DNA测序结果分析比对(实例) 关键词:dna测序结果2013-08-22 11:59来源:互联网点击次数:14423 从测序公司得到的一份DNA测序结果通常包含.seq格式的测序结果序列文本和.ab1格式的测序图两个文件,下面是一份测序结果的实例: CYP3A4-E1-1-1(E1B).ab1 CYP3A4-E1-1-1(E1B).seq .seq文件可以用系统自带的记事本程序打开,.ab1文件需要用专门的软件打开。软件名称:Chromas 软件Chromas下载 .seq文件打开后如下图: .ab1文件打开后如下图: 通常一份测序结果图由红、黑、绿和蓝色测序峰组成,代表不同的碱基序列。测序图的两端(下图原图的后半段被剪切掉了)大约50个碱

基的测序图部分通常杂质的干扰较大,无法判读,这是正常现象。这也提醒我们在做引物设计时,要避免将所研究的位点离PCR序列的两端太近(通常要大于50个碱基距离),以免测序后难以分析比对。 我的课题是研究基因多态性的,因此下面要介绍的内容也主要以判读测序图中的等位基因突变位点为主。 实际上,要在一份测序图中找到真正确实的等位基因多态位点并不是一件容易的事情。一般认为等位基因位点假如在测序图上出现像套叠的两个峰,就是杂合子位点。实际比对后才知道,情况并非那么简单,下面测序图中标出的两个套峰均不是杂合子位点,如图并说明如下:

说明: 第一组套峰,两峰的轴线并不在同一位置,左侧的T峰是干扰峰;第二组套峰,虽两峰轴线位置相同,但两峰的位置太靠近了,不是杂合子峰,蓝色的C峰是干扰峰通常的杂合子峰由一高一略低的两个轴线相同的峰组成,此处的序列被机器误判为“C”,实际的序列应为“A”,通常一个高大碱基峰的前面 1~2个位点很容易产生一个相同碱基的干扰峰,峰的高度大约是高大碱基峰的1/2,离得越近受干扰越大。 一个摸索出来的规律是:主峰通常在干扰峰的右侧,干扰峰并不一定比主峰低。最关键的一点是一定要拿疑似为杂合子峰的测序图位点与测序结果的文本序列和基因库中的比对结果相比较;一个位点的多个样本相比较;你得出的该位点的突变率与权威文献或数据库中的突变率相比较。 通常,对于一个疑似突变位点来说,即使是国际上权威组织大样本的测序结果中都没有报道的话,那么单纯通过测序结果就判定它是突变点,是并不严谨的,因一份 PCR产物中各个碱基的实际含量并不相同,很难避免不产生误差的。对于一个未知突变位点的发现,通常还需要用到更精确的酶切技术。 (责任编辑:大汉昆仑王)

植物基因克隆

来自dxy 22003luocong 植物基因全长克隆几种方法的比较 基因是遗传物质基本的功能单位,分离和克隆目的基因是研究基因结构、揭示基因功能及表达的基础,因此,克隆某个功能基因是生物工程及分子生物学研究的一个重点。经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病, 即实验操作繁琐, 周期较长、工作量繁重,且不易得到全长序列。又由于在不同植物中目的基因mRNA丰度不同,所以获得目的基因的难易程度又不一样,特别是对于丰度比较低的目的基因即使使用不用的方法也不一定能获得成功。近年来随着PCR技术的快速发展和成熟.已经有多种方法可以获得基因的全长序列, 比如经典的RACE技术,染色体步移法和同源克隆法等,本文主要综述几种重要的克隆方法的原理和运用,并且比较分析这几种方法的优缺点,为你的实验节约时间和成本。 1 RACE技术 1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Mulis等[1]发明的PCR技术使生命科学得到了飞跃性的发展。1988年Frohman等[2] 在PCR技术的基础上发明了一项新技术, 即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends, RACE), 其实质是长距PCR( long distance, PCR)。通过PCR由已知的部分cDNA 序列, 获得5′端和3′端完整的cDNA, 该方法也被称为锚定PCR ( anchored PCR) [3] 和单边PCR( one-sidePCR) [4]。RACE技术又分为3?RACE和5?端RACE。3′RACE 的原理是利用mRNA 的3′端天然的poly(A) 尾巴作为一个引物结合位点进行PCR, 以Oligo( dT) 和一个接头组成的接头引物( adaptor primer, AP)反转录mRNA得到加接头的第一链cDNA。然后用一个正向的基因特异性引物( gene-specific primer, GSP) 和一个含有接头序列的引物分别与已知序列区和poly(A) 尾区退火, 经PCR扩增位于已知序列区域和poly( A) 尾区之间的未知序列,若为了防止非特异性条带的产生, 可采用巢式引物( nested primer) 进行第二轮扩增, 即巢式PCR( nested PCR) [5,6]。5?RACE 跟3?RACE原理基本一样,但是相对于3?RACE来说难度较大。 5'-RACE受到诸多因素的影响而常常不能获取全长,因此研究者都着手改进它。这些措施主要是通过逆转录酶、5'接头引物等的改变来实现的,因此出现了包括基于“模板跳转反转录”的SMART RACE技术( switching mechanism at 5′ end of RNA transcript) [7] , 基于5′脱帽和RNA酶连接技术的RLM-RACE技术(RNA ligase mediated RACE)[8], 利用RNA连接酶为cDNA第一链接上寡聚核苷酸接头的SLC RACE技术(single strand ligation to single-stranded cDNA)[9] , 以及以内部环化的cDNA第一链为模板进行扩增的自连接或环化RACE技术(self-ligation RACE or circular RACE)[10],和通过末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾后引入锚定引物的锚定RACE技术( anchored RACE)[11]。 笔者主要介绍两种比较新的RACE技术,基于…模板跳转?的SMART RACE 技术和末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾技术。 1.1基于‘模板跳转’的SMART RACE技术[7,12]

功能基因的克隆及生物信息学分析

功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要:随着多种生物全基因组序列的获得,基因组研究正从结构基因组学(structural genomics)转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等),其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1],它代表了基因分析的新阶段,已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物,发展和应用新的实验手段,通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能,使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究,是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因,也成为我们面临的一个课题,本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词:功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆,它是根据目标基因在染色体上确切位置,寻找与其紧密连锁的分子标记,筛选BCA克隆,通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域,根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因,得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息,从突变体开始,逐步找到基因,最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆,最近也有报道某些控制数量性状的主效基因(控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等)也通过图位克隆法获得。

绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析

3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后,进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果,如图一所示,3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带,说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果,如图二所示,电泳会得到两条带,说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带,证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞,用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒

受态细胞。转化重组质粒后涂平板,进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因,所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落,说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长,说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落,证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后,由于倒平板速度太慢,导致 培养基凝固,影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中,离心后,弃 上清的过程中,将沉淀和上清混在了一起,影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后,进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功,得到电泳结果如图 四所示,结果表明,1、2泳道的条带约为700bp,说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果

植物基因克隆的策略与方法

植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1 功能克隆(functional Cloning) 功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此

什么是克隆植物的克隆教案-浙科版高中生物选修3

第一节什么是克隆第二节植物的克隆 课标解读 重点难点 1.比较有性繁殖与无性繁殖,简述克隆的含义。 2.通过举例,概述克隆的基本条件。 3.结合单细胞培养成完整植株的示意图,理解细胞的全能性 及简述植物组织培养的程序。 4.联系植物克隆的实例,阐明植物克隆的概念、成就及应用 前景。 1.克隆的定义及其基本条 件。(重点) 2.植物细胞的全能性的含 义。(重点) 3.植物组织培养。(重难点) 无性繁殖与克隆 1.克隆就是无性繁殖,即只要不通过两个分子、两个细胞或两个个体的结合,只由一个模板分子、母细胞或母体直接形成新一代分子、细胞或个体。 2.在分子水平上,基因克隆是指某种目的基因的复制、分离过程。 3.在细胞水平上,细胞克隆技术应用在杂交瘤制备单克隆抗体的操作中。 4.在个体水平上,植物可由母体的特定部位或结构产生新个体,而动物的克隆较复杂,经历了由胚胎细胞克隆到体细胞克隆的发展过程。 5.克隆的基本条件:具有完整基因组的细胞核的活细胞;能有效调控细胞核发育的细胞质物质;完成胚胎发育的必要的环境条件。 1.克隆技术的发展经历了哪几个阶段?请尝试举例加以说明。 【提示】微生物克隆,如菌落的形成;遗传工程克隆,如DNA克隆或基因克隆;个体水平上克隆,如克隆动物。 植物细胞的全能性 1.基本含义:植物体的每一个生活细胞,都具有发育成完整植株的潜能。 2.全能性的原因:每个细胞都含有本物种所特有的全套遗传物质。 3.特点:不同植物或同种植物不同基因型个体间,细胞全能性的表达程度大不相同。 2.有人说只要找到秋海棠的一个细胞,就能再生出秋海棠,这依据的生物学原理是什么? 【提示】能让一个细胞发育成一个个体,依据的是细胞的全能性。

植物基因克隆技术及其发展方向

植物基因克隆技术及其发展方向 摘要:基因是染色体上具有一定座位的遗传单位,是DNA分子中一定长度的核苷酸序列。植物的生长发育是在多种代谢和生理过程基础上所发生的基因在时空上表达的综合现象,开发和分离潜在的各种有价值的基因并深入研究其表达机理,对作物品种的改良具有重要意义。因此对植物基因的克隆并发展与之相关的技术已引起人们的日益关注和投入,近年来其研究方法不断改进,新技术不断涌现,这为进一步研究诸如各种调节植物生长发育的基因、逆境与防御反应的基因、植物细胞凋亡的基因等提供了新的途径。 关键词:植物基因克隆基因植物基因转化 正文: 植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分,是现代生命科学技术中最核心的内容,它是随着20世纪70年代初DNA体外重组技术的发明而发展起来的,其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列,确定其在染色体上的位置,阐明其生化功能,并利用生物工程手段应用到生产实践中。 一、常用的目的基因克隆技术 1、1、通过已知基因产物的分析和鉴定 这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物,并对蛋白质氨基酸顺序进行分析,推断出编码该蛋白质的基因序列,然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因(Bt基因)、豇豆胰蛋白酶抑制基因(CpTI 基因)、病毒外壳蛋白基因(CP基因)等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时,也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选,也可分离到未知的新基因。 2、通过遗传表型分析 (1)基因标鉴法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体,然后用相应转座子或T-DNA 对突变体文库进行筛选,以选到的阳性克隆片段为探针,再筛选野生型植物因文库分离目的基因。如将一株带有功能的转位因子系统的植物与另一株在遗传上有差异的同种植物杂交,在杂交后代中筛选由于转位因子插入到某一特定基因序列中导致表型破坏或改变的突变株,用该纯合突变株构建基因文库,然后将转位因子用同位素标记作探针,从该文库中筛选出带有同源转位因子的目的基因。该法主要限于

第五章基因克隆技术

第五章基因克隆技术 基因克隆技术是分子生物学的核心技术,其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝,用于深入分析基因的结构与功能,并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术,它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割,重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增,形成大量的子代分子,此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术,人为操作改造基因,改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。 基因克隆的一般程序为: 一、获取目的基因 目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。获取目的基因的主要方法: 1、用限制性内切酶酶解染色体DNA,构建基因组文库,再从基因组文库中筛选目的基因。该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同,在结构基因中也含有内含子序列,但是也正因为这一点构成了该法最大缺点,即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子),因而也不能表达出正确的基因产物。 2、分离纯化细胞中的mRNA,以mRNA为模板,在反转录酶作用下生成cDNA第一链,再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库,从中筛选所需的目的基因。此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列,具有完整的阅读框架,可在原核细胞中正确表达。 3、人工体外合成基因:由于当前人工体外合成DNA的长度有限,此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。在基因较大情况下,常需先合成多个DNA片段,然后拼接成完整的基因,此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。 4、PCR法扩增基因:PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展,为目的基因的寻找提供了有力技术工具。用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段,或用反向PCR技术,先将特定mRNA反转录为cDNA第一链,然后再进行扩增。用PCR法筛选基因,需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。 二、选择适当的载体 按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助,很难进入受体细胞,即使能进入,往往也不能进行复制和表达,因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆,必须将它们与适当的载体连接。理想的载体应该是:(1)分子量较小,能在细胞内自主复制的环状或线状DNA分子;(2)具有特异的限制性酶切位点,便于外源DNA片段的插入,且有明显的遗传筛选标志,如抗药性或插入失活等,以利于阳性克隆的筛选;(4)具有生物安全性。常用的克隆载体可分为三类,即质粒、噬菌体及病毒。由于天然载体用于基因克隆存在许多缺点,现用载体实际上是在天然载体基础上进行改造而成。 1、质粒载体质粒是细菌染色体外小型环状DNA复制子,质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。质粒载体具有如下特点:分子相对较小(3~10kb);含松弛型复制子因而在

生物信息学分析实例

ORF预测的可靠性检验 设计引物:Primer Premier 5.0 评估引物质量:Oligo 6.65 或Oligonucleotide Properties Calculator NCBI的BLAST 2 SEQUENCES程序 https://www.wendangku.net/doc/d517737860.html,/blast/bl2seq/wblast2.cgi 核苷酸序列=>氨基酸序列 制作密码子用法表 蛋白质理化性质分析 在线分析 ExPasy服务器上的ProtParam https://www.wendangku.net/doc/d517737860.html,/tools/protparam.html 生物学软件 BioEdit-氨基酸成分 Seqtools-亲、疏水性残基,蛋白溶解度 蛋白质功能性区域分析 疏水性分析 在线的ProtScale 程序 https://www.wendangku.net/doc/d517737860.html,/cgi-bin/protscale.pl 使用生物学软件BioEdit7.05 采用Kyte-Doolittle的TGRESE算法 调整计算窗口大小n=9 附:该参数用于估计每种氨基酸残基的平均显示尺度,有助于对数据进行平滑。 跨膜区分析 在线分析 TMHMM Server v. 2.0 http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ TMpred https://www.wendangku.net/doc/d517737860.html,/software/TMPRED_form.html TMP http://www.mbb.ki.se/tmap/ 信号肽预测 SignalP 3.0 Server 几种人工神经网络法的组合 G+、G-、真核生物为训练集 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

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