宝生物工程(大连)有限公司 One Step PrimeScript® miRNA cDNA Synthesis Kit 说明书

TaKaRa Code ：D350A

One Step PrimeScript ?

miRNA cDNA Synthesis Kit (Perfect Real Time)

（20次量）

宝生物工程(大连)有限公司

目录

内容页码

●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存 1 ●需要准备的其他试剂 1 ●试剂盒原理 1 ●特长 3 ●RNA样品制备 3 ●操作注意 4 ●操作方法 4 1．Poly(A)加尾反应和反转录反应 4 2．Real Time PCR反应 5

◆应用Thermal Cycler Dice Real Time System扩增仪的操作方法 5

◆应用ABI PRISM 7000/7700/7900 HT， 6

7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System的操作方法

◆应用LightCycler Real Time PCR扩增仪的操作方法7 ●实验条件的选择8 ●实验例9 ●引物设计说明10 ●问答11

●制品说明

本制品中含有合成Poly(A)多聚尾和合成cDNA所需的全部试剂，可以将样品中的miRNA（起始样品可以是Total RNA、small RNA fragments等任何包含miRNA的样品）经过一次反应合成为1st Strand cDNA（样品中的mRNA、snoRNA等其它形式的RNA也会同时被反转录成cDNA）。本试剂盒经过特别的优化，将Poly(A)加尾反应和cDNA合成反应同步进行，在1小时内即可完成miRNA 1st Strand cDNA合成，且产物无需进行纯化，可直接使用PCR反应试剂SYBR Premix Ex Taq II（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：DRR081）进行Real Time PCR定量检测，从而准确简便地对miRNA（或mRNA、snoRNA等其它RNA分子）进行表达量分析。由于本试剂盒对反应样品进行的Poly(A)加尾以及cDNA合成不具有特异性，所以经过一次反转录得到的产物可以用于多种miRNA以及mRNA、snoRNA等的定量分析。

本制品可以从10 pg~5 μg Total RNA反转录合成miRNAs、mRNAs和snoRNA等的1st Strand cDNA，再通过Real Time PCR反应，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。

●制品内容（20 μl反应×20次）

1. 2×miRNA Reaction Buffer Mix（for Real Time）*1 200 μl

2. miRNA PrimeScript? RT Enzyme Mix 40 μl

3. 0.1% BSA 40 μl

4. Uni-miR qPCR Primer（10 μM）200 μl

5. RNase free dH2O 1 ml×2

6. Easy Dilution（for Real Time PCR）*2 1 ml

*1 含有dNTP Mixture、Mg2+和反转录用的Universal Adaptor Primer。

*2 制作标准曲线时梯度稀释DNA或RNA标准品的稀释液。模板DNA或模板RNA如果用水或TE 稀释时，由于受Microtube的吸附作用等原因的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果

精度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准

确定量的标准曲线。EASY Dilution也可以单独购买（TaKaRa Code：D9160）。

EASY Dilution请与本公司Real Time PCR试剂组合使用，对于其他公司同类制品的适用性本公

司尚未进行确认。

●保存：-20℃。

●需要准备的其他试剂

SYBR Premix Ex Taq II（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：DRR081）

●试剂盒原理

1. 反转录反应

试剂盒中的miRNA PrimeScript? RT Enzyme Mix中包含Poly(A) Polymerase和反转录酶PrimeScript?RTase，两种酶经过优化达到最佳比例。试剂盒中的2×miRNA Reaction Buffer Mix中包含反应所需的dNTP Mixture、Mg2+和反转录用的Universal Adaptor Primer等，其组份也是根据miRNA PrimeScript?RT Enzyme Mix进行了优化调整，使上述两种酶都可以达到最佳活力。

如原理图1所示，与mRNA不同，miRNA不具有Poly(A)结构，但在本试剂盒的反转录反应中，可以同时对样品中的miRNA以及其它small noncoding RNA进行Poly(A)加尾反应，然后利用Universal Adaptor Primer（含有oligo-dT）将经过Poly(A)加尾的RNA以及mRNA进行反转录反应得到cDNA，并引入了Uni-miR qPCR Primer的结合位点，利用这一位置可以对样品中任何cDNA进行定量PCR 反应。

-1-

2. 定量PCR反应

反转录结束后，采用SYBR Green I嵌合荧光法对合成的cDNA进行定量分析。Real Time PCR扩增反应可以采用如图2显示的SYBR Green I嵌合荧光法，即在反应体系中加入与双链DNA结合便可发出荧光的荧光染料SYBR Green I，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解温度。客户可以使用试剂盒中提供的Uni-miR qPCR Primer及自行设计的miRNA Specific Forward Primer对miRNA进行定量解析，且使用一次合成的cDNA就可以同时对多个miRNA或者snoRNA、mRNA等分子进行检测。

图1. miRNA定量原理图

图2. 嵌合荧光法原理图

-2- 荧光物质

Primer

2．引物退火

Polymerase 3．延伸反应

1．热变性

●特长

1. Poly(A)加尾反应和反转录反应在同一Tube中同时进行，在较短的时间内高效合成miRNA Real Time

PCR用的cDNA，可以快速、准确地对miRNA进行表达分析，是进行miRNA Real Time RT-PCR反应的最佳试剂。

2. 使用一次合成的cDNA就可以同时对多个miRNA或者snoRNA、mRNA等分子进行检测。

3. 制品中附加了标准曲线制作用稀释液EASY Dilution（for Real Time PCR），将Total RNA或cDNA稀

释至低浓度也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。

●RNA样品制备

本制品是将RNA反转录成cDNA的专用试剂。RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。

【使用器具】

尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列（1）或者（2）方法进行处理。

（1）干热灭菌（180℃，60 min）

（2）用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。

RNA实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。

【试剂配制】

用于RNA实验的试剂，需使用干热灭菌（180℃，60 min）或用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水需用0.1%的DEPC处理后进行高温高压灭菌。

RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。

【制备方法】

使用如RNAiso Plus（TaKaRa Code: D9108）等传统的RNA纯化方法即可获得满足于本试剂盒反应的miRNA（只需少量的miRNA便可进行RT-PCR反应），或者可以使用其它任何可以保障small RNA在提取过程中不会丢失的方法。为了提高反应的灵敏度，也可以使用其它small RNA富集、纯化等方法。【Total RNA中混有基因组DNA的对策】

提取的Total RNA中常常混有基因组DNA，而基因组DNA可以直接作为PCR模板进行扩增，造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生，必须使用DNase I除去基因组DNA。

方法如下：使用常规方法提取Total RNA后，再使用DNase I分解混入的基因组DNA，最后进行苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等纯化Total RNA。

◆操作流程

①按下列组份配制反应液。

②37℃反应20 min。

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③使用以下两种方法使DNase I失活。

A．热处理

（1）加入2.5 μl 0.5 M EDTA 80℃2 min。

（2）用RNase Free dH2O定容至100 μl。

B．苯酚/氯仿抽提

（1）用50 μl RNase Free dH2O定容至100 μl后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25 ：24 ：1）混匀。

（2）室温，13,500 rpm 5 min离心，取上清。

（3）加入等体积的氯仿/异戊醇（24 ：1）混匀。

（4）室温，13,500 rpm 5 min离心，取上清。

④加入10 μl 3 M醋酸钠，250 μl冷乙醇，冰上放置10 min。

⑤4℃，13,500 rpm离心15 min，弃上清。

⑥加入500 μl 70%冷乙醇洗净，4℃，13,500 rpm离心5 min，弃上清。

⑦沉淀干燥。

⑧加入适量RNase Free dH2O溶解。

【基因组DNA确认方法】

不进行反转录反应，通过Real Time PCR确认基因组DNA混入量。

●操作注意

以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。

1）当同时需要进行多个反转录反应时，应先配制各种试剂的混合液（Master Mix；其中包括RNase Free dH2O、Buffer、酶等），然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验样品之间产生的误差。

2）miRNA PrimeScript? RT Enzyme Mix是酶的混合制剂，使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。

3）本制品使用前请于-20℃保存，融解后的制品请于冰上放置，使用后也请立即保存于-20℃。

4）反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube等，尽量避免污染。

●操作方法

1. Poly(A)加尾反应和反转录反应。

1）按下列组份配制反应液（反应液配制请在冰上进行）。

*1 反应体系可按需求相应放大，20 μl反应体系可最多使用5 μg的Total RNA。

2）反应条件如下：

37℃60 min*2 （Poly(A)加尾和反转录反应）

85℃ 5 sec （酶的失活反应）

*2 PCR反应有非特异性扩增时，可将温度升到50℃会有所改善。

3）向得到的RT反应液中添加RNase Free dH2O补足至100 μl。取2 μl稀释液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中，进行定量检测。建议在25 μl PCR反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模板。

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2. Real Time PCR反应。

以下是使用本制品进行反转录反应后，选择SYBR Premix Ex Taq TM II（Perfect Real Time）（TaKaRa Code: DRR081）进行Real Time PCR反应的操作方法。

◆应用Thermal Cycler Dice? Real Time System扩增仪的操作方法

请按照Thermal Cycler Dice? Real Time System（TaKaRa Code：TP800）的使用说明书要求进行实验操作。

①按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0 μM 范围内调整引物浓度。

*2 建议在25 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模板。

反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。

*3 建议反应液体积为25 μl。

②进行Real Time PCR反应。

建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。退火/延伸时间可在20～30秒范围内进行调整，推荐使用30秒的条件。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Repeat：1

95℃ 10秒

Stage 2：PCR反应

Repeat：40

95℃ 5秒

60℃ 20秒

Stage 3：Dissociation

◆特别提示：

本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。

③实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。

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◆应用ABI PRISM? 7000/7700/7900HT，7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System的操作方法请按照Applied Biosystems公司的仪器使用说明书要求进行实验操作。

①按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0 μM 范围内调整引物浓度。

*2 建议在20 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模板。反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。

*3 R OX Reference Dye II（50×）比ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用7500 Real-Time PCR System 和7500 Fast Real-Time PCR System时，请使用ROX

Reference Dye II（50×）。与使用ROX Reference Dye（50×）相比，校正后的荧光信

号值高，但解析结果完全相同。使用ABI PRISM7000/7700/7900HT及7300 Real-Time

PCR System时，请使用ROX Reference Dye（50×）。

*4 96孔板、Single-T ube、8联Tube采用50 μl反应体系，384孔板、96-well Fast Thermal Cycling plate采用20 μl反应体系。

②进行Real Time PCR反应。

建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR 条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。

< ABI PRISM 7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System >

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Reps：1

95℃ 30秒

Stage 2：PCR反应

Reps：40

95℃ 5秒

60℃ 30～34秒*

Dissociation Stage

* 使用7700和7900HT时请设定在30秒。

使用7000和7300时请设定在31秒。

使用7500时请设定在34秒。

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< 7500 Fast Real-Time PCR System >

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Reps：1

95℃ 30秒

Stage 2：PCR反应

Reps：40

95℃ 3秒

60℃ 30秒

Dissociation Stage

◆特别提示：

本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。

③实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。

◆应用LightCycler? Real Time PCR扩增仪的操作方法

请按照LightCycler?（Roche Diagnostics公司）的使用说明书要求进行实验操作。

①按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～

1.0 μM范围内调整引物浓度。

*2 建议在20 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为

模板。反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。

②进行Real Time PCR反应。

PCR反应用毛细管请用离心机轻轻离心后放入LightCycler中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。

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两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

95℃30秒20℃/秒

1 Cycle

Stage 2：PCR反应

95℃5秒20℃/秒

60℃20秒20℃/秒

40 Cycles

Stage 3：融解曲线分析

95℃0秒20℃/秒

65℃15秒20℃/秒

95℃0秒0.1℃/秒

◆特别提示：

本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。

③实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。

●实验条件的选择

如果按照推荐的两步法条件进行反应，反应性能不好时，请按照下面的方法进行引物和PCR反应条件的研讨。实验条件选择时，请从反应特异性与扩增效率两方面进行综合考虑。要求能同时满足这两个条件的反应体系，并可以在较大浓度范围内进行很好的定量。

○反应特异性高的实验体系应具备以下条件：

?No Template Control 时不产生引物二聚体等非特异性扩增。

?不产生目的片段以外的扩增。

○扩增效率高的实验体系应具备以下条件：

?扩增产物起峰更早（Ct值小）。

?PCR扩增效率高（接近理论值100％）。

1. Primer浓度与反应性能间的关系如下：

降低Primer浓度有助于提高特异性；提高Primer浓度有助于提高扩增效率。图示如下：

2. PCR条件与反应性能间的关系如下：

①要提高反应特异性，可以提高退火温度或变为2 Step PCR反应。

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2×101 Copies

2×108 Copies

RSq:0.999 Eff=100.3%

Y=-3.314 × log(x) + 39.25

② 要提高扩增效率，可以增加延伸时间或变为3 Step PCR 反应。

③ 预变性。

预变性条件通常设定为95℃ 30 sec ，使用此条件对于难变性的环状质粒DNA 和基因组DNA 模板也能够很好的变性。如果想改变变性条件，可以延长至1～2分钟。但是时间过长酶容易失活，不推荐使用2分钟以上的变性条件。

● 实验例：miR-70检测实验

1. 反转录反应。

试剂：One Step PrimeScript ? miRNA cDNA Synthesis Kit （Perfect Real Time ） 模板：检测不同模板含量的miR-70（1×103 ~1×1010 Copies ） 反应体积：20 μl

反应条件：37℃ 60 min 反应后85℃ 5 sec 2. Real Time PCR 反应。

试剂：SYBR Premix Ex Taq TM II （Perfect Real Time ）

（TaKaRa Code ：DRR081） 模板：上述RT 反应液，添加RNase Free dH 2O 补足至100 μl ，取2 μl 进行定量PCR 检测 反应体积：25 μl Target Gene ：miR-70

Primer ：使用Perfect Real Time Support System 设计的引物 反应条件：Thermal Cycler Dice ? Real Time System 标准反应条件 3. Real Time PCR 反应结果。

Real Time PCR 扩增曲线图及标准曲线图如下：

4. 结果分析。

本实验检测到了miR-70 microRNA 2×101 Copies ～2×108 Copies 相当量的cDNA 。分析融解曲线可知，无论哪一种浓度的模板都能够得到单一的PCR 扩增产物。同时标准曲线的线性关系良好，在实验浓度范围内能够进行准确定量。

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●引物设计说明

进行Real Time PCR反应时，设计反应性能良好的PCR引物非常重要。本制品中包含qPCR检测需要的Reverse Primer（即Uni-miR qPCR Primer），而Forward Primer需要客户自行设计。其中，Forward Primer决定了qPCR检测的特异性，其设计方法可参照如下原则进行：

设计引物基本要求如下：

*1 OLIGO: Primer Analysis Software。

*2 Primer3: （https://www.wendangku.net/doc/da18435359.html,/ftp/distribution/software/）

*3 https://www.wendangku.net/doc/da18435359.html,/BLAST/

除此之外，对于miRNA qPCR检测用Primer的设计原则还有：

1. 通常情况下，Forward Primer序列与待测miRNA序列基本一致，只要将原有的U替换成T即可。

例如：

miRNA-70 S equence UAAUACGUCGUUGGUGUUUCCAU

F Primer Sequence TAATACGTCGTTGGTGTTTCCAT

2. 在特殊情况下，例如当miRNA分子中GC含量偏高时，可在miRNA序列3’端减少3~4个碱基，从而

降低引物的Tm值；相反，如果miRNA分子中GC含量偏低时，可在miRNA序列5’端添加几个GC 碱基，从而提高引物的Tm值。例如：

let-7a Sequence UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU

F Primer Sequence CGGTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT

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●问答

Q1. RNA添加量多少合适？

A1. 一般情况下，20 μl体系可添加10 pg~1 μg Total RNA，当miRNA表达丰度很低时，可适当增加Total RNA添加量。本公司的实验表明，最高可添加5 μg Total RNA，这主要取决于待检测的miRNA的表达丰度，也可以选择直接添加分离好的small RNA片段进行实验。

Q2. 定量PCR试剂是否只能使用SYBR Premix Ex Taq II（TaKaRa Code：DRR081）？

A2. 本试剂盒的反应体系经过特别优化，配合SYBR Premix Ex Taq II（TaKaRa Code：DRR081）使用效果最佳，其它公司的相关定量试剂未进行评价实验，不能保证使用效果。

Q3. 使用SYBR Premix Ex Taq II时，是否需要对Mg2+浓度进行研讨？

A3. 使用SYBR Premix Ex Taq II时，不需要对Mg2+浓度进行研讨。实验时请首先使用本公司说明书推荐的PCR反应条件，如果得不到良好实验结果时，再研讨PCR反应条件，改变使用的PCR引物等。

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MEMO

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宝生物工程（大连）有限公司

TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., Ltd.

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