酶活性的测定方法
生物样品预处理
预冷解剖用具，采用颈后断头的方法将鱼杀死，立即取肝脏、腮、脑，操作均在4℃下进行，用预冷的0.15 mol/L KCl 溶液洗去血丝，用滤纸吸干后称重。
将肝、脑组织放入预冷的Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol/L KCl)匀浆（匀浆比（W/V）1:5），腮组织放入组织匀浆（匀浆缓冲液含40mmol/L咪唑，250mmol/L蔗糖，5mmol/L EDTA，pH7.0），匀浆比为1:40，匀浆速率为10000g，以15s为周期，重复3次。
分别取1ml匀浆液放入1.5ml离心管进行离心，4℃下离心(9000g，20min)，取上清液-80℃下保存，待测。
（1）250mL 0.15 mol/L KCl：取2.7956g
（2）Tris-HCl缓冲液：125mL 0.1 mol/L Tris（1.5143g）+ 105mL 0.1 mol/L HCl+ KCl（0.15*0.23*74.55=2.5720g）
（Na+＋K+）－ATPase活性的测定
1、试剂
（1）匀浆液（250ml）：40mmol/L咪唑0.6808g+250mmol/L蔗糖21.3931g +5mmol/LEDTA 0.3653g
（2）反应缓冲液（250ml）：80mmol/L咪唑 1.3616g+4mmol/LMgCl2 0.2033 g+40mmol/LKCl 0.7455g
（3）16mmol/L Na2ATP（10ml）：0.0988g
（4）30%三氯乙酸（TCA）9g TCA+21mlH2O
（5）定磷试剂（硫酸亚铁-钼酸胺试剂100ml）：10ml 5mol/LH2SO4+1.3556 g钼酸铵+90mlH2O
每10ml加入FeS040.5g（FeS04·7H2O 0.0941g），25ml加入FeSO4·7H2 O 0.2353g，临用前配制。5mol/LH2SO4：2.7ml H2SO4+7.3mlH2O （6）1mmol/L乌本苷（100ml）：0.0767g
（7）50μg/mL磷标准溶液（1000ml）：0.2195gKH2PO4
2、无机磷标准曲线的绘制：各试管分别加磷标准溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00m1及蒸馏水1.00、0.80 、0.60、0.40、0.20、0 m1，混匀后各吸取0. 08ml加入酶标板，同时加入0.08mlTCA，0.08ml定磷试剂，混匀后650nm处比色测吸光值。
3、酶活性测定
ATPase制剂：匀浆比（W/V）为1:40，离心10min（9000r/min）取上清液得到。
总酶活：酶液10μ1+反应缓冲液40μl+H2O 20μ1+ Na2ATP 10μ1（空白用H O代替Na2ATP，空白仍需加入酶液）。25℃保温15min后加入冷的30%TCA80 2
μ1终止反应+定磷试剂80μ1，静置5min后读数。
Mg2+-ATP酶活：酶液10μ1+反应缓冲液40μl+H2O 10μ1+乌本苷10μ1+ Na2 ATP 10μ1，其余同总酶活性测定。
4、蛋白质含量测定
1:40匀浆后1:5稀释测蛋白。
5、计算
10μl蛋白质含量：X*5*10 μg
Pi浓度计算：有标准曲线得Y μg/ml
10μl酶液的量：m= X*0.08 ml
Pi的物质的量：n=m/M=m*103/31 nmol
ATP活性：n*4/蛋白质含量= X*0.08*103*4/31 μmol/mg pro/h
SOD酶活性测定
1、试剂
（1）Tris-HCl 缓冲液
0.1mol/l的盐酸：取浓盐酸（密度为1.18，36%）8.4ml，加双蒸水稀释至1000ml。
0.1mol/l 的Tris 溶液：取6.057 克Tris，加水溶解，配成500ml。Tris-HCl 缓冲液（pH 为8.4，浓度0.1mol/l）：取86ml 0.1mol/l 盐酸，取250ml 0.1mol/l 的Tris 溶液，加双蒸水稀释至500ml。
（2）10mmol/l HCl：取0.1mol/l的盐酸10ml,加双蒸水稀释至100ml。
（3）6mmol/l 邻苯三酚(精确)：用10mmol/l HCl 配制。0.07567 g+100ml
10mmol/l HCl。
2、邻苯三酚自氧化速率的测定
邻苯三酚自氧化速率的测定：在酶标板孔中加入300μL Tris-HCl缓冲液，放置酶标仪中25℃恒温10min，加入预热的邻苯三酚及10μL双蒸水，在420nm处每30s 测定一次吸光值，自氧化速率在3 分钟内有效。调整邻苯三酚用量，使线性范围内吸光度值的变化速率控制在0.020OD/分。(注：实验时要确定邻苯三酚的用量，可先做8、9、10μL各两个)
3、酶活性测定
SOD活性测定与步骤2相同，只是将双蒸水换成同体积酶液。在420nm 下，每隔30 秒钟测吸光度值一次，计算平均每分钟的吸光度变化值△A420/分。控制SOD 样品液的稀释倍数，使稀释后的样品加入测定体系后，使邻苯三酚自氧化速率的吸光度值逐渐下降，即联苯三酚自氧化速率被抑制50%左右。注：取组织匀浆时，可先做1、3、5 倍稀释管各两只，以确定稀释倍数。（参考：将1:9匀浆液再稀释20倍用以测定鱼肝酶活。
（3）计算）
SOD 活力单位定义：在规定条件下，1ml反应液中，每分钟抑制联苯三酚420nm下自氧化速率达50%时的酶活力单位（U）或称Marklund 单位。样品液中每mg蛋白的总SOD活性单位数称为样品液的SOD 比活。
SOD活力(U/ml)= (0.020-△A420)/0.020×100% /50%×V总/ （V 定义·V 样）×样品稀释倍数
V 总：反应总体积3（ml）
V 样：加入样品液的体积3（ml）
V 定义：酶活力单位定义体积1（ml）
GST酶活性测定
1、试剂
（1）0.1mmol/L磷酸缓冲液母液：
0.2mol/LNa2HPO4（取Na2HPO4·7H2O 53.65g；Na2HPO4·2H2O 35.61g；N a2HPO4·12H2O 71.64g加蒸馏水定容至1000mL）。0.2mol/LNaH2PO4（取Na2HP O4·H2O 27.6g；Na2HPO4·2H2O 31.21g加蒸馏水定容至1000mL）（母液浓度为0. 2mol/L，配时注意浓度稀释倍数）
PH A(mL) B(mL)
6.5 31.5 68.5
7.0 61.0 39.0
7.4 81.0 19.0
8.0 94.7 5.3
0.1mol/LNa2HPO4·12H2O 500mL：取17.907g；
0.1mol/LNaH2PO4·2H2O 1000mL：取15.601g；
（2）1.0mmol/LCDNB100m：取0.0202g（巨毒，先用无水乙醇溶解，再加水）（3）1.0mmol/LGSH（现配）10mL：取0.0031g
（4）反应体系：100μL0.1mmol/L磷酸缓冲液+10μL1.0mmol/LCDNB+10μL1.0m mol/LGSH+880μL双蒸水（共1mL）
2、活性测定
10μL酶液+170μL反应体系，340nm读数，20s间隔一次，读3分钟。GST 活性定义为每毫克蛋白质，每分钟扣除非酶促反应，使GSH浓度降低1 nmol/L 为一个酶活力单位（nmol/mg protein/min）。
3、计算
R=180μL，ε=9.6mmol-1cm-1，P=0.54cm
GST活性=(OD*R*106)/( ε*W)
EROD酶活性测定
1、试剂
（1）0.1mol/L pH8.0Tris缓冲液100mL：50mLTris（0.1mol/L）+29.2mLHCl （0.1mol/L）
PH 0.1mol/LTris(mL) 0.1mol/LHCl(mL)
7.1 50 45.7
7.4 50 42.0
8.0 50 29.2
0.1mol/LTris100 mL：1.2114g
（2）2. 5 mmol/L NADPH 1mL：0.0021g（药品较贵，且每次配量少，不易取，所以应配在锥形容量瓶中，配药时不用称量勺，拿着小瓶直接往称量纸上倒）
（3）40μmol/L乙氧基试卤灵100mL：0.001g
2、活性测定
10μL酶液+140μL缓冲液+40μL NADPH+10μL乙氧基试卤灵，空白不加NADPH ，25℃保温30min，572nm读数。
3、计算
蛋白质浓度：x=(y-0.0269)/0.806 mg/ml
ε=73mmol-1cm-1
EROD活性=(OD*230*106)/(73*10*W*0.685*30)（W为蛋白质含量）
GSH含量的测定
1、试剂
（1）10%TCA：1g +10ml H2O
（2）0.4mol/L pH8.9Tris缓冲液100mL：50mL Tris（0.4mol/L）+7mLHCl（0.4mol/L）（3）2.5mM DTNB：0.004g DTNB +2 mL缓冲液（现配，时间长了会变色）（4）25μM GSH储备液：；
2、活性测定
10μL酶液+10μLTCA+ 200μL Tris缓冲液（0.4M pH 8.9）混匀，25℃或室温孵育5分钟+20μL 2.5mM DTNB，反应总体积240μL，混匀后25分钟，415nm 测吸光值。
3、标准曲线绘制：
各试管分别加25μM GSH储备液（零下4℃可放置1个月）0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00m1及蒸馏水1.00、0.80 、0.60、0.40、0.20、0 m1，混匀后各吸取10μl加入酶标板，10μLTCA，同时加入200μLTris缓冲液，25℃或室温孵育5分钟后加入20μLDTNB，混匀后25分钟，415nm测吸光值。
4、计算
CAT活性测定
1、试剂
匀浆后用生理盐水稀释10倍，制得粗酶液。
（1）pH 7.4 60mmol/L磷酸盐缓冲液：
（2）基质液：65μmol/mL H
2O
2
，以pH 7.4 60mmol/L磷酸盐缓冲液稀释100
mL：24.3ml 0.2mol/L Na2HPO4（100 mL用 1.7406g）+5.7ml 0.2mol/L
NaH2PO4（100 mL用0.1778g） +670μl 30% H2O2，稀释至100 mL。
30% H2O2（W/V）：密度1.11g/cm3。
（2）钼酸铵：32.4mmol/L（用四水合钼酸铵1235.86，4.0042g/100mL）2、活性测定
试剂测定管标准管1 对照管标准管2
缓冲液- 0.1 - 0.6
基质液0.5 0.5 0.5 -
粗酶液0.1 - 0.1 -
钼酸铵0.5 0.5 0.5 0.5
加入基质液后置于37℃水浴5min，加入酶液后将所加过试剂的试管在37℃水浴1min（对照管不加热），然后立即加入钼酸铵500μl，混匀10 min后在405nm处以去离子水调零比色（汲取200μl加入酶标板）。试剂液不够可根据比例适当增加1倍。
3、计算
Uc=( A对-A测)/A标×65×0.5/0.1=( A对-A测)/A标×325
65为基质液浓度，0.5为500μl基质液体积，0.1为酶液用量。
Uc单位：μmol/(min·L) （每分钟分解1μmol过氧化氢为一个酶活力单位）
A标=∣A标1- A标2∣
MDA含量的测定
1、试剂
（1）TBA水溶液：
O
（2）10% TCA：1g TCA +10ml H
2
（3）丙二醛标准溶液：称取0.315g 1，1，3，3-四乙氧基丙烷，溶解后稀释至1000ml，此溶液每ml相当于丙二醛100μg，置于冰箱内保存。准确吸取10ml，稀释至100ml，此溶液每ml相当于丙二醛10μg，备用。
2、操作步骤
（1）标准曲线的绘制
准确吸取每ml相当于丙二醛10μg的标准溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml置于纳氏比色管中，加水至总体积为5ml，加入5mlTBA溶液，然后按样品测定步骤进行，测得光密度绘制标准曲线。
（2）样品制备与检测
100μL酶液，加入500μLTCA10%，在沸水中水浴15min，自来水冷却后1000g 离心10min，取上清液500μL，加入250μL TBA（6.7g/L）混匀，在沸水中水浴15min，自来水冷却后各孔吸取170μL ，532 nm测吸光值。
3、计算
GPx含量的测定
1、试剂
（1）50mmol/L 磷酸缓冲液，pH=7.4
（2）1mmol/L GSH50mL：0.0157g
（3）0.1mmol/L NADPH50m L：0.0042g
（4）2mmol/L 叠氮化钠50mL：0.0065g
（5）0.5μ/ mL GR50mL：取A28μL。（20μL GR液加磷酸缓冲液稀释至10 mL瓶中）
（6）1mmol/LEDTA50mL：0.0146g
（7）2.5mmol/L双氧水100m L：取30%双氧水26μL
2、活性测定
20μL酶液+160μL反应体系（反应6min）+20μL双氧水（迅速）。340nm，20s一次，3min。反应体系：（2）（3）（4）（5）（6）
3、计算
ε=6.22mM-1cm-1
2.3.1 AChE活性的测定
AChE活性的测定根据Ellman等的方法[52]并有所改进。取96孔酶标板，每孔按次序分别加入195 μL 8 mmol/L 5,5'-二硫双基-2-硝基苯甲酸（DTNB），5 μL 粗酶液和20 μL 20 mmol/L碘化硫代乙酰胆碱（ATChI）。对照用H2O代替粗酶液。温度30 ℃，波长405 nm下立即读数，20 s为周期连续读数3 min。每个样品测3个平行。摩尔消光系数E405=13.6 L/mmol/cm，酶活性的单位为nmol/min/mg。2.3.2 EROD活性的测定
取96孔酶标板，每孔加140 μL100 mmol/L Tris缓冲液（pH8.0），40 μL2.5 mmol/L NADPH，10 μL 40 μmol/L 7-乙氧基异吩唑酮和10 μ粗酶液加入96孔酶标板中，对照以H2O取代NADPH，25 ℃保温30 min，用酶标仪在57 2nm下测吸光值[53]。
反应产物异吩唑酮的摩尔消光系数E572=73 L/mmol/cm。酶活性单位为pmol/min/mg。
2.3.3 GST活性的测定
GST活性的测定根据Habig方法[54]，Frasco和Guilhermino对实验方法进行改进，使之适用于酶标仪测定[55]。
将0.1mmol/L 磷酸缓冲液（pH为6.5）100 μL，1.0 mmol/L 1-氯-2,4-二硝苯基（CDNB）10 μL，1.0 mmol/L还原型谷胱甘肽（GSH）10 μL和880 μL超纯水混匀后组成反应体系。取96孔的酶标板，每孔加170 μL反应体系和10 μL粗酶液（对照用H2O代替GSH），波长340 nm下立即读数，20 s为周期连续读数2 min。每个待测样品做3个平行。
反应产物2,4-二硝基苯-谷胱甘肽的摩尔消光系数E340 =9.6 L /mmol/cm。
GST活性定义为每毫克蛋白质，每分钟扣除非酶促反应，使GSH浓度降低1 nmol/L为一个酶活力单位（nmol/min/mg）。
SOD 活性的测定根据参考Marklund [56]，稍加改动以适用于酶标仪。取96孔酶标板，每孔加300 μL 0.1 mol/L Tris -HCl 缓冲液（pH 为8.4）和10 μL 粗酶，放置酶标仪中25 ℃恒温10 min ，加入6 μL 25 ℃水浴预热的6 mmol/l 邻苯三酚开始反应，波长420 nm 下立即读数，30 s 为周期连续读数3 min ，每个待测样品做3个平行。对照不加酶液，加入6 μL 邻苯三酚用于自氧化速度的确定，调整邻苯三酚用量，使线性范围内吸光度值的变化速率控制在0.070 OD/分。
SOD 活力单位定义：在规定条件下，1 mL 反应液中，每分钟每毫克蛋白质抑制联苯三酚420 nm 下自氧化速率达50%时为一个酶活力单位（U/mg ）。
2.3.5 CAT 活性的测定
CAT 酶活性的测定依据徐镜波[57]、周丹丹[58]等的方法稍作改进。取50 μL 粗酶液，用Tris-HCl 缓冲液稀释10倍待用。试剂用量见表2.2。
表2.2 CAT 所需试剂加样量
试剂
样品管（mL ） 对照管（mL ） 标准管1（mL ） 标准管2（mL ） 缓冲液
-- -- 0.1 0.6 基质液
0.5 0.5 0.5 -- 稀释后酶液
0.1 0.1 -- -- 钼酸铵 0.5 0.5 0.5 0.5 基质液：60 mmol/L 磷酸缓冲液（pH=7.4，含65 μmol/mL H 2O 2）。钼酸铵：32.4 mmol/L 钼酸铵溶液。缓冲液：0.1 mol/L Tris-Hcl, pH 7.4, 含0.15 mol/L KCl 。
按表2-4要求依次加入各试剂，加入基质液后置于37 ℃水浴5 min ，加入酶液后将所加过试剂的试管在37 ℃水浴60 s ，然后立即加入钼酸铵0.5 mL 摇匀。对照管先加基质液，再加钼酸铵，最后加酶液，其它按顺序加。10 min 后，取96孔酶标板，每孔加200 μL 混合液，空白用H 2O 代替，405 nm 测吸光值。 2
A -1A A -A 325CAT 标准标准测定）对照（活性?= 其中，A 为吸光值，CAT 活性单位为：μmol/mg/min 。
蛋白质含量采用Bradford的方法测定[59]，周传江等对实验方法进行改进，使之适用于酶标仪测定[60]，具体方法如下：
配制标准蛋白质溶液（1 mg/mL）：称取100 mg牛血清蛋白质，定容于100 ml 去离子蒸馏水。
配制蛋白试剂：称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL95%乙醇，加入100 mL85%（W/V）磷酸，用去离子蒸馏水稀释到1000 mL。棕色瓶中4 ℃保存。
样品吸光值测定：取各样品液10 μL，以3个重复分别加入酶标板孔中，加入200 μL蛋白试剂（操作迅速，注意气泡），小心充分振荡均匀。静置10 min后于595 nm下读数，以10 μL去离子蒸馏水（加入200 μL蛋白试剂）作为空白对照，测定吸光值。
标准曲线：取0（空白）、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL标准蛋白溶液，用水补足到1 mL，按步骤3，测定吸光值，重复测定取平均值。以浓度和吸光值为坐标绘制曲线。
计算：查标准曲线得出待测样品的蛋白质含量
标准曲线按上表加样操作。
图2.1 蛋白质含量测定标准曲线
（4）CAT 活性测定
CAT 分解过氧化氢的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的过氧化氢与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405 nm 处测定其生成量，可计算出CAT 的活力。组织匀浆中CAT 活力定义：每毫克组织蛋白每秒钟分解1 μmol 的过化
氢的量为一个活力单位（U）。计算公式详细资料可以参考南京建成生物工程研究所CAT 活性测定试剂盒使用说明。
（7）蛋白质浓度测定
采用Bradford 的方法[125]测定蛋白质浓度，具体方法如下：称取100 mg 牛血
清蛋白质，定容于100 ml 去离子蒸馏水，配制成1 mg/ml 标准蛋白质溶液。称取
100 mg 考马斯亮蓝G-250 溶于50 ml 95%乙醇，加入100 ml 85%（W/V）磷酸，充分混匀后用去离子蒸馏水定容至1000 ml，配制成蛋白试剂于4 ℃棕色瓶中保存。蛋白质分析：取测试上清液10 μl，以3 个重复分别加入酶标板孔中，加入200 μl 蛋白试剂，充分振荡均匀。静置10 min 后于595 nm 处读数，以10 μl 去离子蒸
馏水作为空白对照，测定吸光值。标准曲线制作：取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1 ml 标准蛋白溶液，用水补足到1 ml，按步骤3，测定吸光值，重复测定取平均值，以
浓度和吸光值为坐标绘制曲线。计算：查标准曲线得出待测样品的蛋白质浓度，标准曲线按上表加样操作。