质粒构建流程

质粒构建流程

一、引物设计

1)取得目的基因序列,可选用数据库NCBI

2)软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点,即为可用没切位点。

3)选择载体。根据转染细胞和实验室资源,选择合适载体。如pcDNA3.1(+),

4)选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点,选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上,选实验室常用酶切位点。

5)使用primer5设计目的基因引物,目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。

6)根据选择的酶切位点,查找对应的酶切位点保护碱基,将对应片段添加到设计的引物两端,注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。

7)引物设计完成,送公司合成。

二、目的片段获取

1. RNA提取

试剂盒:Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型(裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存)

准备:冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套

操作步骤:

1)将1000μl裂解液RL加入细胞中,混合5min。

2)加200μl氯仿混合,震荡15s,室温孵育3min。

3)4℃,12000rpm离心10min。

4)最上层水相转移至新EP管中(体积约550μl)

5)加入1倍体积(550μl)70%乙醇,混匀

6)全部转移到套收集管的吸附柱RA中,4℃,10000rpm离心45s

7)弃废液,重套收集管,加500μl去蛋白液RE,12000rpm离心45s

8)弃废液,重套收集管,加700μl去漂洗液RW,12000rpm离心60s

9)弃废液,重套收集管,加500μl去漂洗液RW,12000rpm离心60s

10)弃废液,重套收集管,12000rpm空离2min

11)吸附柱放入新EP管,加50μl RNase free water于膜上,室温放置2min

12)4℃,12000rpm离心60s

13)点样:5μl RNA+ 1μl 10×buffer,1.5%琼脂糖凝胶电泳,100V,3min,可见3条亮带。14)-20℃保存

2.RNA反转录

试剂盒:TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser(-20℃保存)

准备:冰盒,②④⑤⑥取出解冻,①③为酶不可取出,预冷离心管

操作步骤:

1)基因组DNA去除(10μl体系)

② 5×gDNA eraser buffer 2μl

① gDNA eraser 1μl

Total RNA 4μl(可根据RNA浓度调整)

⑥ RNase free water 3μl

PCR 仪中进行,程序:42℃,2min →4℃

注:RNA 的量可根据浓度调整,混合液冰上配制,酶最后加入

2)反转录反应(20μl 体系)

④ 5×primerScript buffer 2 4μl

③ primerScript RT enzyme mix I 1μl

⑤ RT primer mix 1μl

⑥ RNase free water 4μl

1)反应液 10μl

PCR 仪:37℃,15min →85℃,5s →4℃

注:可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中

3)1.5mlEP 管收集,-20℃长期保存

3. PCR 扩增

高保真酶primerstar 扩增,50μl 体系如下:

5×PS buffer 10μl

dNTP 4μl

dH2O 32.5μl

Primerstar 0.5μl

cDNA 1μl(可变)

R-primer 1μl

F-primer 1μl

点样:5μl PCR 产物+ 1μl 6×buffer ,1.5%琼脂糖凝胶电泳,100V ,15min

4. PCR 产物纯化

1)液相纯化(产物电泳结果只含目的条带)

试剂盒:Microelute cycle-pure spin protocol(OMEGA bio-tek) D6293-01

① 将PCR 产物加入1.5mlEP 管,加入5倍体积buffer CP ,混匀。

② 转移至HiBind MicroElution DNA 柱(套收集管),室温离心10000g ,1min 。

③ 弃废液,加700μl DNA wash buffer (含乙醇)到柱子,室温离心10000g ,1min 。 ④ 弃废液,重复③

⑤ 弃废液,空管离心13000g ,1min

⑥ 柱子放入新EP 管,加10-20μl Elution buffer 到膜上,室温孵育3-5min ,离心10000g ,1min ⑦ 电泳检测

2)割胶回收(产物电泳结果含杂带)

① 将含目的条带的琼脂糖凝胶切下(切得尽量小),放入1.5ml EP 管。

② 加等体积(1g=1ml )binding buffer (XP2),60℃金属浴7min 左右至胶溶解(溶液为淡黄色),混匀2min

③ 溶液加入离心柱,离心10000g ,1min ,废液倒回再离一次

④ 弃废液,加300μl binding buffer (XP2),离心10000g ,1min

⑤ 弃废液,加700μl SPW washing buffer ,离心10000g ,1min

⑥ 重复⑤

⑦ 空管离心13000g ,2min ,弃废液,柱子转移到新EP 管

⑧加入30-50μl elution buffer 于膜上,室温孵育1min ,离心13000g ,1min

⑨ 电泳检测

PCR 程序: 95℃ 5min 95℃ 30s 56℃ 30s 35cycle 72℃ 1min 72℃ 10min 注:可根据不同基因调节退货温度,延伸时间,循环数。

三、双酶切

30μl 反应体系如下:

PCR 纯化产物 15μl

10×M/L/K buffer 3μl

3dH2O 10μl

酶A 1μl

酶B 1μl

反应条件:takara 酶30℃水浴1h →65℃金属浴10min 终止反应

注:buffer 类别依使用的酶具体选择,见附表

四、连接

1)双酶切后,可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2μl

2)酶切产物液相纯化

3)20μl 连接体系(皆可)

PCR 产物 5μl

pcDNA3.1 2μl

10×T4buffer 2μl

T4 ligase 1μl

3dH2O 10μl

PCR 仪中进行:22℃,30min →4℃冰箱过夜

注:连接产物-20℃可长期保存

五、转化

准备:碎冰,灭菌EP 管、LB 空液体培养基,带抗性培养板,超净工作台,移液枪,水浴锅加热42℃

1)将感受态细胞置于冰上,待其融化

2)超净工作台中,将连接产物10μl 加入100μl 感受态细胞,或质粒1-3μl 加入100μl 感受态细胞

3)轻混匀,冰浴30min

4)热击水浴42℃,45s ,冰浴1min

5)加900μl LB 空培养基,摇菌150rpm ,37℃,1h

6)浓缩离心13000rpm ,1min ,上清液留约200μl 重悬菌体,部分涂板(50-100μl )

7)完全吸收后,37℃倒置培养12-16h

六、菌落PCR

1)以rTaq 酶50μl 体系配制PCR 反应液,每个PCR 管分装15μl ,体系如下:

3dH2O 35.7μl 10×buffer 5μl MgCl2 3μl dNTP 4μl rTaq 0.3μl R-primer 1μl F-primer 1μl Vector 12μl 10×M/L/K buffer 3μl 3dH2O 13μl 酶A 1μl 酶B 1μl PCR 产物 6.3μl pcDNA3.1 0.7μl 10×T4buffer 2μl T4 ligase 1μl 3dH2O 10μl PCR 程序:

95℃ 5min

95℃ 30s

56℃ 30s 35cycle

72℃ 1min

72℃ 10min

注:程序与DNA 扩增一样

2)灭菌牙签挑单菌落放入PCR体系中搅一下,再在新板划板(注意编号),每板挑10个菌。新划的板37℃倒置培养12-16h。

3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,记录含目的条带的菌落号备用。

七、测序

1.摇菌

1)PCR检测有目的条带的菌落,挑选2-3个较好的以供摇菌

2)三角瓶中分装10ml LB抗性液体培养基

3)用10μl 枪头挑起选择的菌落打到培养基中

4)37℃。250rpm摇菌12-16h

2.送样

每瓶取1ml箘液,送华大基因测序

3.比对

将测序结果与基因序列进行比对,比对正确则构建成功,比对错误则重新构建。

(注:数据库中基因序列可能有误,若出现少数突变,可换其他数据库比对试试)

八、菌种保存

菌种比对成功,则可保存菌种备用。

1)超净工作台中取1.5mlEP管,加200μl 80%灭菌甘油。

2)再加入800μl 箘液,轻混匀。

3)液氮冻存。(一个基因冻2管即可)

九、质粒提取

菌种比对成功,冻存菌种后,箘液用于提取质粒。

试剂盒:AXYGEN axyprep plasmid miniprep kit 250-prep

操作步骤:

1)取3-5ml箘液,室温下离心10000g,1min

2)弃上清,加250μl solution I/ RNase A 重悬菌落,混匀

3)加250μl solution II,倒置轻混匀,孵育2min。(整个裂解反应不超过5min)

4)加入250μl solution III,立即倒置混匀,直到生成白色絮状沉淀。

5)室温离心13000g,10min

6)上清液小心转入HiBind miniprep column(有套管),室温离心10000g,1min

7)弃废液,加500μl buffer HB,室温离心10000g,1min

8)选择性步骤:重复第7步

9)弃废液,空管室温离心13000g,2min

10)柱子转入新EP管,加30-50μl elution buffer或3dH2O到膜上,室温孵育1-2min

11)室温离心13000g,1min

12)提取的质粒-20℃保存备用

附:

感受态制备方法(皆采用LB空白培养基):

1. 菌种活化

1)用接种环直接取冻存的E.coli/ DH5α菌种,在LB平板上划线,37℃倒置培养16h

2)挑单菌落转到2-10ml LB液体培养基中,摇菌37℃,250rpm,12-16h

3)取1ml箘液加入到100ml LB液体培养基,摇菌37℃,250rpm,3h

4)检测箘液OD600≤ 0.5(0.3-0.4)

2.感受态制备

准备:0.1M CaCl2灭菌,50ml离心管灭菌,冰水,1.5ml离心管冰上预冷,离心机4℃预冷。步骤:

1)将箘液用50ml离心管分装,调平,4℃离心3000rpm,8min

2)弃上清,0.1M CaCl2 10ml重悬(冰水中进行,动作轻),两管合成一管

3)冰上放置一段时间,4℃离心2500rpm,8min

4)弃上清,0.1M CaCl2 10ml重悬,4℃冰箱过夜沉淀

5)上清液取出8ml,剩2ml,加670μl 80%甘油(箘液:80%甘油=3:1),轻混匀

6)1.5mlEP管分装,每管分装100μl ,液氮冻存。

试剂配制:

1.琼脂糖凝胶(1.2%)

琼脂糖粉0.6g

1×TAE 50ml

微波炉加热溶解,冷却一会儿后加入1μl gold view核酸染料,混匀,倒板

2.电泳缓冲液TAE(50×)

2mol/L tris-碱242g

1mol/L 冰醋酸57.1ml

EDTA(pH8.0) 18.622g

二蒸水至1L

用NaOH调节pH至8.6,常温储存。用时稀释成1×溶液使用。

3.LB培养基

Yeast extract(酵母提取物)1g

Tryptone 2g

NaCl 2g

Agar powder(琼脂粉)3g(配1.5%固体培养基时加入)

二蒸水200ml

灭菌20min,冷却后加入抗生素。

4.CaCl2(0.1M)

CaCl2 1.47g

H2O 100ml

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