直接竞争ELISA检测氯霉素残留的方法建立及初步应用
收稿日期:2006201219
基金项目:“十五”国家食品安全重大科技专项基金资助项目
(2001BA804A18201);武汉市科技攻关计划资助项目(20022002062)
作者简介:李晓云(19682),女,在读博士。 3通信作者
直接竞争E LISA 检测氯霉素残留的方法建立及初步应用
李晓云,石德时,王喜亮,熊 宁,刘百红,张道宏,毕丁仁3 (华中农业大学动物医学院,湖北武汉430070)
摘要:用混合酸酐法合成氯霉素的C AP 抗原,用过碘酸钠氧化法合成C AP 酶标记抗原,用E LIS A 方法对合成的C AP 抗原、C AP 酶标记抗原进行鉴定表明其与抗C AP 单克隆抗体具有特异性反应。在此基础上建立了包被二抗的直接竞争E LIS A 方法。特异性试验结果表明,C AP 琥珀酸酯、C AP 琥珀酸钠盐的交叉反应率分别为107%、106.4%;甲砜霉素、氟甲砜霉素与C AP 的交叉反应率小于0.016%;与其他结构类似物间未见交叉反应。该方法对C AP 的检测限可达到0.1μg/L ,IC 50为11.6μg/L ,线性范围0.1～100μg/L ,批内变异系数小于11.5%,批间变异系数小于19.6%。对猪肉、鸡肉、蜂蜜分别添加1.0、3.0、10.0、3010μg/L C AP 标准品,回收率61.0%～102.0%,变异系数为6.6%～
15.8%;对猪肉、鸡肉、蜂蜜中C AP 的最低检测限分别为0.48、0.42、1.20μg/kg 。
关键词:氯霉素;药物残留;酶标抗原;直接竞争E LIS A
中图分类号:S8591796 文献标识码:A 文章编号:100524545(2007)0520723205
Development of an direct competitive E LISA for screening of chloramphenicol residue and preliminary application
LI X iao 2yun ,SHI De 2shi ,W ANG X i 2liang ,XI ONG Ning ,LI U Bai 2hong ,ZH ANG Dao 2hong ,BI Ding 2ren 3
(College o f Animal Science and Veterinary Medicine ,Huazhong Agricultural Univer sity ,Wuhan 430070,China )
Abstract :A sensititive direct competitive enzyme 2linked immunos obent assay (E LIS A )was developed for the detection of the
chloramphenicol (C AP )residues.The succinyl C AP was coupled to bovine serum albumin (BS A )with use of the mixed anhydride reaction.A horseradish peroxidase (HRP )2labeled conjugated antigen was synthesized by the s odium periodate reaction.The direct competitive E LIS A was conducted by simultaneously incubating C AP and C AP 2BS A 2HRP with s olided anti 2C AP m onoclonal anti 2body over a second antibody.The detection limit for C AP was 0.1μg/L.The intra 2and inter 2assay coefficient of variation was <19.6%and <11.5%in the range of 0.1to 100μg/L ,respectively.The cross reactivities with succinyl chloramphenicol and chlo 2ramphenicol s odium succinate was 107%and 106.4%,with thiamphenicol and florphenicol was <0.016%,with L 2phenylalanine and L 2tyrosine was negligible.Recoveries from porcine muscle ,chicken muscle ,honny was in the range of 61.0%2102.0%,the coefficient of variation was in the range of 6.6%215.8%,when 1.0,3.0,10.0,30.0μg/L C AP was spiked ,respectively.The detection limit for C AP from porcine muscle ,chicken muscle ,honny was 0.48,0.42,1.20μg/kg ,respectively.
K ey w ords :chloramphenicol ;drug residue ;enzyme conjugate ;direct competive E LIS A
3Corresponding author
氯霉素(Chloram phenicol ,C AP )是一种广谱抗生素,由于抗菌效果好,价格低廉,曾一度被广泛使用,但C AP 具有严重的毒副作用,在动物性食品中的残留对人类健康构成了巨大威胁。欧盟、美国等发达
国家和地区均规定C AP 残留标准为“零允许量”
(Z e 2ro tolerance ),即不得检出。我国相关法规也规定C AP 禁用于所有食品动物,在所有可食组织中不得
检出。C AP 残留检测方法主要有仪器方法和E LIS A 方法,E LIS A 方法由于其灵敏度高、特异性好、样品
容量大、快速、简便等优点成为兽药残留检测方法研究、相关产品开发使用的热点。目前我国C AP 残留E LIS A 检测主要依赖价格昂贵的进口试剂盒,研制检测灵敏度高、具有自主知识产权的C AP 残留E LIS A 检测试剂盒对该方法推广使用具有重要意义。本研究旨在建立一种基于酶标抗原和单克隆抗体的包被二抗、检测限、灵敏度高的直接竞争E LIS A 方法,为进一步研制C AP 残留直接竞争E LIS A 检测
试剂盒奠定基础;同时对酶标记抗原方法进行探索性研究,以期为同类研究提供参考。
1 材料与方法
111 材料及试剂 BA LB/c鼠购自湖北省预防医学科学院实验动物中心;分泌抗C AP单克隆抗体杂交瘤细胞株由华中农业大学兽医微生物与免疫实验室制备保存[1],经细胞复苏、克隆后筛选阳性杂交瘤细胞腹腔接种BA LB/c小鼠,采集腹水,用辛酸2硫酸法纯化,冻干,2～8℃保存备用。
氯霉素琥珀酸酯(C AP2HS)由华中农业大学兽医微生物与免疫实验室制备保存;猪肉、鸡肉、蜂蜜购自武汉中百超市,经仪器检测不含C AP;C AP标准品购自中国药品生物制品检定所;氟甲砜霉素、甲砜霉素购自Sigma公司;L2苯丙氨酸、L2酪氨酸(含量≥98.0%)、羊抗鼠IgG购自华美生物工程公司;牛血清白蛋白(BS A)、辣根过氧化物酶(HRP,type:Ⅵ2 A)购自Sigma公司;96孔可拆卸酶标板购自深圳金灿华实业有限公司。四甲基联苯胺(T M B)购自上海丽珠东风生物技术有限公司;过氧化氢脲购自Fluka 公司;其它试剂均为AR级。
1.2 CAP酶标记物的合成与鉴定 参考Cam pbell 等[2]和王桂枝等[3]所采用的混合酸酐法,用C AP2HS 琥珀酸酯、牛血清白蛋白合成C AP人工抗原,反应条件略有改动,产物命名为C AP2HS2BS A。用0.01 m ol/L pH7.4的P BS透析5d,用葡聚糖凝胶SephadexG2200层析柱进行纯化,收集的洗脱液用PEG20000浓缩,用蛋白测定仪检测浓度后冻干或直接用于酶标记。用抗C AP单克隆抗体(以下简称C APMcAb)采用包被抗原的间接E LIS A方法鉴定。
采用过碘酸钠氧化法[4]标记C AP抗原,上述合成抗原命名为C AP2HS2BS A2HRP。同C AP2HS2BS A 方法纯化后加等体积甘油混匀放-25℃冷冻保存。同法标记BS A,作为载体对照,产物命名为BS A2 HRP。采用下述的E LIS A方法对合成的C AP2HS2 BS A2HRP进行方阵滴定,同时设BS A载体酶标记物(BS A2HRP)的对照,初步鉴定C AP2HS2BS A2HRP的特异性并测定其工作浓度。
1.3 E LISA检测方法的建立 直接竞争E LIS A基本操作步骤如下:用包被液将羊抗小鼠抗体作一定倍数的稀释,加入96孔酶标板中,100μL/孔,置4℃过夜。洗涤后每孔加入150μL封闭液(0.5%BS A2 P BST),置37℃保温1h。洗涤,用0.5%BS A2P BST 溶液将抗C APMcAb稀释成一定倍数,每孔100μL, 37℃保温30min,洗涤。将C AP标准品稀释成系列浓度,酶标C AP抗原稀释成一定倍数,向各孔中加入50μL标准品溶液或待检样品,再加入50μL酶标抗原溶液,混匀,37℃反应45min,洗涤。每孔加入T M B2过氧化氢尿素溶液100μL,37℃避光反应15 min,加入终止液,50μL/孔,混匀。用酶联免疫检测仪在450nm波长下测定各孔的吸光值,对结果进行分析判定。
直接竞争E LIS A检测方法的建立:将羊抗鼠IgG 作系列浓度稀释,分别包被4个8孔×6孔的方阵,将C APMcAb、酶标抗原作一定倍数稀释,进行方阵滴定。选择适当的羊抗鼠包被浓度、C APMcAb稀释倍数、酶标抗原稀释倍数,C AP标准品用0.01m ol/L pH7.4的P BS稀释成系列浓度进行E LIS A测定。以0标准孔(用空白稀释液代替C AP标准品溶液)的D 值为B0,添加各相应标准品浓度时D值为B,以B/ B0值为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。
1.4 特异性试验 L2苯丙氨酸用0.01m ol/L pH 7.4的P BS溶解,L2酪氨酸用0.2m ol/L的盐酸溶解,C AP、甲砜霉素、氟甲砜霉素、C AP琥珀酸酯、C AP 琥珀酸钠盐用甲醇溶解,均配制成各测试品系列浓度的100倍浓缩液,临用前用0.01m ol/L pH7.4的P BS稀释成应用液,按1.3的方法进行E LIS A测定。按下列公式计算交叉反应率:交叉反应率=Y/Z×100%(Y为C AP取代50%结合率时所对应浓度,Z 为类似物取代50%结合率时所对应浓度)。
1.5 敏感性试验 检测限测定:测定16个空白标准品,求出其B/B0(%)的平均值( x)和标准差(s),从标准曲线上求出 x22s值对应的标准品浓度,为本检测方法的检测限。
用IC50值评价方法的灵敏度。分别测定20次标准曲线的IC50,统计其平均值和标准差,即为该方法的灵敏度。
1.6 重复性试验 每一标准品浓度进行5个批次的测定,同一浓度做5个重复测定,统计测定结果的平均值( x)和标准差(s)。根据下列公式分别计算批间、批内变异系数:C V(%)=s/ x×100%。
1.7 添加回收试验 回收率测定:取3g空白样品(猪肉、鸡肉事先均质,蜂蜜直接取用),添加C AP标准品浓缩液,混匀,使其终质量分数为110、310、1010、3010g/kg,加入6m L乙酸乙酯,上下来回强烈振荡10min,室温2000×g离心10min,取出3m L 上层液体(相当于1g样品)在氮气流下干燥,用1.5 m L异辛烷/三氯甲烷混合物(2∶3混合)溶解干燥的残留物,加入1m L样品稀释液(缓冲液Ⅱ)强烈振荡
1min ,室温3000×g 离心10min ,取上层水相按1.3
的方法进行E LIS A 测定,每个浓度测定3次,每次5个重复。从标准曲线上求出待检样品的C AP 浓度,根据以下公式计算添加回收率:添加回收率(%)=(实测浓度-空白样品浓度)/加入标准品浓度×100%。同时,采用1.5的方法测定空白样品的检测
限。
2 结果
2.1 CAP 抗原的合成与鉴定 对合成的C AP 抗原
进行的E LIS A 鉴定结果见图1。结果表明,不同C AP 抗原包被浓度随着C AP McAb 稀释度变化,D 值均有明显的下降梯度,同时测定的BS A 载体包被孔D 值(0.070),与缓冲液对照孔D 值(约0.05)接近,说明合成的C AP 抗原与C AP McAb
有较强的特异性结合。
图1 合成抗原C AP 2HS 2BS A 的E LIS A 鉴定结果 1
～
6.分别为合成抗原C AP 2HS 2BS A 稀释1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000倍后包
被;7.BS A 载体对照
2.2 CAP 酶标记物的合成与鉴定 酶标记C AP 抗
原的E LIS A 鉴定结果见图2。从方阵滴定结果看出在不同的C APMcAb 稀释度和C AP 2HS 2BS A 2HRP 稀释倍数间,D 值呈明显的梯度变化,而BS A 2HRP 方阵D 值在0.069～0.131,且无梯度变化,说明合成的C AP 2HS 2BS A 2HRP 与C APMcAb 间有抗原抗体特异性。
2.3 CAP 残留E LISA 检测方法
2.3.1 二抗包被浓度、单抗及酶标抗原工作浓度的
确定 二抗包被浓度测定结果见图3。比较4个不同包被浓度方阵对应孔的D 值,看出二抗稀释倍数在1∶8000～1∶16000时,D 值出现明显下降,说明1∶8000的包被浓度已接近饱和浓度,故确定其为本
试验的包被浓度
。
图2 酶标记C AP 抗原的E LIS A 鉴定结果 1～4.分别
为C AP McAb 1:8000、1:16000、1:32000、1:64000
倍稀释
图3 二抗包被浓度测定结果 1.C AP McAb 1∶16000稀
释、C AP 2HS 2BS A 2HRP 1∶100稀释;2.C AP McAb 1∶
16000稀释、C AP 2HS 2BS A 2HRP 1∶200稀释;3.C AP McAb 1∶16000稀释、C AP 2HS 2BS A 2HRP 1∶
400稀释;4.C AP McAb 1∶32000稀释、C AP 2HS 2BS A 2HRP 1∶100稀释;5.C AP McAb 1∶16000稀释、C AP 2HS 2BS A 2HRP 1∶200稀释;6.C AP McAb 1∶32000稀释、C AP 2HS 2BS A 2HRP 1∶400稀释
单抗及酶标抗原工作浓度的测定结果见图4。C APMcAb 的稀释度为1∶64000,C AP 2HS 2BS A 2HRP 的稀释度为1∶400时,对应的D 值为1.294,与其相邻下一浓度孔相比D 值下降较为明显,故选定该孔对应的C APMcAb 和C AP 2HS 2BS A 2HRP 的稀释度作为本试验的工作浓度。2.3.2 直接竞争E LIS A 方法标准曲线的建立 所得标准曲线如图5所示,在0.1～100μg/L ,C AP 标准品浓度与吸光值的百分比之间呈线性关系。2.3.3 特异性试验 交叉反应率测定结果见表1。从表1可知C AP 琥珀酸酯、C AP 琥珀酸钠盐对C AP 的交叉反应率分别为10710%、106.4%,其他几种结构类似物对C AP 的交叉反应率低于0.016%,说明本研究建立的E LIS A 方法特异性良好。
图4 单抗和酶标工作浓度测定结果 1.C AP McAb 1∶
16000;2.C AP McAb 1∶32000;3.C AP McAb 1∶64000;4.C AP McAb 1∶128000,二抗包被质量浓度
均为0.75mg/L
。
图5 C AP 残留标准曲线
表1 几种结构类似物对C AP 的交叉反应率
药剂
IC 50/(μg ?L -1)
交叉反应率/%
CAP
31.1
10010CAP 琥珀酸酯29.110710CAP 琥珀酸钠盐
29.2106.4甲砜霉素>200000a <0.016氟甲砜霉素
>200000a <0.016L 2苯丙氨酸>200000b <0.016L 2酪氨酸
>200000b
<0.016
注:a.在该质量浓度处出现抑制率但不到50%;b.在该质量浓度处未出现抑制率
2.3.4 敏感性试验 统计16个0标准孔B/B0(%)
的平均值和标准差求出 x 22s 值(83.6)在标准曲线
上对应的C AP 质量浓度为0.1μg/L ,表明该方法对标准品的检测限可达到0.1μg/L 。2.3.5 重复性试验 从表2可看出,0.1～30μg/L 6个标准品质量浓度的批内变异系数在2.4%～11.5%;批间变异系数在5.7%～19.6%。批内和批间变异系数符合国内外残留检测要求。
表2 重复性试验结果(n =5)
标准品/(μg ?L -1)
测定值(B/B O )/%批内
批间
变异系数/%批内
批间
0.185.2±9.885.2±9.811.5 5.70.377.4±5.077.4±5.0 6.48.01.071.7±6.071.7±6.08.410.63.062.4±4.662.4±4.6 2.414.010.050.6±2.950.6±2.9 5.516.030.0
36.9±3.0
3619±3.0
8.1
19.6
2.3.6 添加回收试验 猪肉、鸡肉、蜂蜜添加回收
测定结果见表3。猪肉添加回收率在64.1%～91.0%、变异系数为8.2%～15.8%;鸡肉添加回收
率在6110%～91.0%、变异系数为7.6%～14.1%;蜂蜜添加回收率在61.0%～102.0%、变异系数为6.6%～13.8%。经统计分析空白猪肉、鸡肉、蜂蜜
测定结果,从标准曲线上求出本方法对猪肉、鸡肉、蜂蜜中C AP 的最低检测限分别为0.48、0.42、1.20
μg/kg 。
表3 添加回收试验结果(n =5)
样品添加值/
(μg ?L 21)
实测值/
(μg ?L 21)回收率/%
变异系数/%
猪肉
10.66±0.1064.0±10.115.83 2.75±0.3191.0±10.311.3108.65±0.9386.3±9.310.830
24.07±2.180.2±7.08.7鸡肉10.67±0.0967.0±9.414.13 2.58±0.28186.0±9.37410.9109.04±0.8690.4±8.69.530
27.29±2.0791.0±6.97.6蜂蜜10.61±0.0961.0±8.413.83 2.96±0.30798.7±10.310.41010.19±0.754102.0±7.57.430
28.61±1.89
95.4±6.3
6.6
3 讨论
C AP 是欧盟规定的12种主要违禁兽药之一,其
残留限量规定为“不得检出”,这就意味着随着检测方法的灵敏度不断提高,“不得检出”的浓度将越来越低,方法的检出限因而倍受关注。Im pers 等[5]用E LIS A 初筛,用G C 2MS2或LC 2MS2进行确证分析检
测限达0.1μg/kg ;Penney 等[6]用液相色普/质普(LC/MS )联用法检测动物性食品中C AP 残留,检测限达0.2～0.6ng/g ;一些进口商品化C AP 残留直接竞争E LIS A 检测试剂盒检测限在0.1μg/L 左右[7]。国内魏书林等[8]建立了间接竞争E LIS A 方法用于鸡
肉组织中C AP残留的检测。从以上报道看出,目前国外仪器方法、E LIS A方法检测水平较高,国内关于E LIS A检测动物性食品中C AP残留的研究报道较少,尤其有关直接竞争E LIS A检测方法方面研究报道更是少见。
用E LIS A方法检测药物小分子,抗体是决定方法特异性、灵敏度的最关键试剂之一,而制备抗体周期往往需半年到1年的时间,如何最大限度地利用已获得的抗体建立特异性强、灵敏度高的E LIS A方法显得尤为重要。本研究建立的直接竞争E LIS A方法与包被抗原的间接竞争E LIS A方法[9]比较,使用同一单克隆抗体,检测限及灵敏度均有较大提高,尽可能发挥了已有抗体的作用。另外,易于获得纯度及效价高、价格低廉的商品化的第二抗体,这也是本方法的优点之一。
建立直接竞争E LIS A方法的前提是酶标记抗原的制备。本研究曾采用活性酯法[10]、氯甲酸异丁酯法[11]合成了C AP酶标记抗原,与本研究采用的过碘酸钠酶标记抗原方法相比,后者具有快速、简便、酶标记物效价高、酶活性损失小的优点,而且后者用于测定时的检测限、灵敏度等指标亦优于前者。本研究进行酶标抗原制备的方法国内外尚未见报道,在本研究中对于提高检测限、灵敏度起了重要的作用。笔者所在实验室将该方法用于磺胺类残留检测研究也取得较好效果。
E LIS A方法的建立往往需要对条件进行优化,本研究曾对不同的竞争反应时间、抗原抗体的不同体积比等进行比对试验,对提高检测限、灵敏度影响不大。
本研究参考李俊锁等[12]的方法分别进行了标准品和组织样品检测限的测定,标准品检测限可达到0.1μg/L,而组织样品最低检测限较高,猪肉、鸡肉、蜂蜜中分别为0.48、0.42、1.20μg/kg,添加质量浓度低于1μg/L时,标准品的回收率,测定结果的重复性均达不到检测要求。可能由于组织样品中存在基质干扰,另外,方法本身灵敏度、抽提过程中标准品损失也可能是影响低浓度回收率、重复性测定结果的因素。以上问题尚待进一步研究改进。
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海科学技术出版社,2002:219.
多肽检测方法的建立
多肽检测方法的建立 在开始做多肽分析之前要首先了解多肽的构成——氨基酸的性质，两个酸性（Asp、Glu），三个碱性（Arg、His、Lys），以及他们的亲疏水，特别是Val、Ile、Leu三者基团多的肽链要格外注意，以下列出二十种氨基酸疏水比例：Arg（R）-4.5 、Lys（K）-3.9、Asn（N）-3.5 、Asp（D）-3.5 、Gln（Q）-3.5、Glu（E）-3.5、His（H）-3.2、Pro（P）-1.6、Tyr（Y）-1.3、Trp（W） -0.9 、Ser（S）-0.8 、Thr（T）-0.7 、Gly（G）-0.4、 Ala（A）1.8 、Met（M）1.9 、Cys（C）2.5、 Phe（F） 2.8 、Leu（L） 3.8 、Val（V）4.2、 Ile（I）4.5。 肽链构成的不同直接决定检测方法的建立，根据肽链我们再决定该肽的溶解方法以及检测时 所走的梯度。 首先谈液相检测样品的溶解，现在取样量用2mL透明进样瓶作参照，一次取样量碾成粉末后基本上薄薄的铺满瓶底1/3。对于一条肽链来说能否顺利纯化就看关键能不能将它很好的溶解。溶解的原则就是尽量用最少的有机试剂达到最优的溶解效果，这个不是为了节省有机试剂，而是确保样品不会因为有机试剂加多而提前出峰，进而影响判断。 对于一条普通的肽加水和乙腈就可以溶解了，样品溶解先碾成粉末，一般疏水基团数目不超过40%比例的但多于10%的，考虑在样品碾成粉末后先加两滴乙腈，稍微摇晃使样品在乙腈中分散均匀，再一滴一滴加高纯水，先加一滴如果发现水滴下去的位置样品能溶掉可再滴加直至0.5-0.7mL（适当体积）左右，滴加水过程中观察样品有没有析出，如果有就立即停止加水，补滴乙腈，再通过不断调整水与乙腈的比例再将样品体积控制在0.5-0.7mL左右，注意尽量用最少的有机试剂达到最优的溶解效果。体积控制好后观察样品中有没有没能溶解的颗粒或者絮状物，如果有就用超声，仍不能溶解则考虑过滤掉非溶物，样品即可用了。如果当时加完乙腈再滴加水时发现这样并不能让该肽溶解，则再多加乙腈试试，如果可溶就此放大体积至0.5-0.7mL，后面处理同上。若多加乙腈不溶这时就要比对肽链序列的酸碱性，一般碱性很好溶，难溶的多属酸性，如果酸性不强考虑用醋酸铵，如果不行就用稀释至10%的氨水，用碱性助溶试剂时一定要注意该肽链里有没有Cys基团，如果有尽量少用，可以考虑先用纯甲酸溶再用乙腈和水稀释至适当体积，如果纯甲酸不能溶那只好加碱性试剂，不过接下来检测要快，不能让样品不必要的时间滞留，避免样品变质。如果乙腈与水不能溶解，而且该肽不显酸碱性，则考虑加甲酸溶，如果这样不行则用纯甲酸先不加乙腈和水，能溶掉考虑再稀释，溶剂成份加的顺序是有讲究的，不能溶可以考虑用稀氨水，以上都不行的话就考虑放弃，如果非要检测结果的可用DMSO试试助溶。如果一开始疏水基团就大于40%就多加乙腈，谨慎加水，必要时甲酸、氨水；疏水基团少于10%的直接考虑水溶不加有机相。 样品溶解好就要做液相及质谱检测。检测时要分析清楚序列特点，含Trp的样品测前加少许酸（TFA、乙酸，0.1%-1%），再用吹风机对吹2-5min，瓶身发烫为止，Trp会结合不稳定的羧基，含不含该羧基的会各自形成一个峰，所以务必要处理；含至少两个连续的Pro，多个连续Ser的要把柱温箱加热到50度再测，这样的基团在常温下检测会形成假的肩峰，加热可避免；对于整条肽链都是两三个基团重复构成的有可能在C18柱上出峰很小，这时可以考虑用CN柱；对于那些用碱性溶剂溶解的样品尽量用CN柱在4g/L的醋酸铵流动相里测。至于检测时梯度的设定很大程度受经验的影响，不过做久了会发现其中的规律，拿250mm、5um 的C18柱举例，A：0.1%(V/V)TFA in H2O，B：0.1%TFA in 80%(V/V)ACN，以下涉及流动相比例未强调的均是体积比。十个氨基酸左右长度的肽，亲疏 水总和接近0时就用10-70%B in
MMFSCNJ出口肉及肉制品中氯霉素残留量检验方法
5 MM_FS_CNJ_01出口肉 肉制品 氯霉素 残留量 气相色谱法 外标法定量 MM_FS_CNJ_0110 出口肉及肉制品中氯霉素残留量检验方法 1. 适用范围 本方法适用于出口猪肉中氯霉素残留量的检验。 2. 原理概要 用乙酸乙酯提取试样中的氯霉素， 然后将乙酸乙酯蒸发至干， 用正已烷净化， 氯霉素经硅烷化衍生后， 溶解于正已烷中， 用带电子俘获检测器的气相色谱仪进 行测定，外标法定量。 3. 主要试剂和仪器 . 主要试剂 乙酸乙酯：重蒸馏； 甲醇：重蒸馏； 正已烷：重蒸馏； 丙酮：重蒸馏； 硅烷化试剂：3mL 六甲基二硅烷（HMDS 片1mL 三甲基氯硅烷（TMS ）+ 9mL 比啶; 氯化钠水溶液： 1mol/L ； 氯霉素标准品：含量》% 氯霉素标准溶液：准确称取适量的氯霉素标准品，用丙酮配成mL 的贮备液, 根据需要稀释成适当浓度的标准工作液。 . 仪器 气相色谱仪：配有电子俘获检测器 （ECD ）； 快速混匀器； 离心机： 3000r/min ； 多功能微量化学样品处理仪或其他相当的仪器； 具塞离心管： 5mL ； 离心管： 15mL ； 尖嘴吸管； 微量可调移液管：50卩L 、200卩L 、1000卩L ; 微量注射器：10卩L 。 4. 试样的抽取与制备 . 检验批 以不超过 2500 件商品为一检验批。 同一检验批的商品应具有相同特征， 如： 包装、标记、产地、规格和等级等。 . 抽样数量 最低抽样数，件 26? 100 101 ? 250 251?500 501?1000 1001?2500 批量，件 1?25 10 15 17 20
.抽样方法 按规定的抽样件数，随机抽取，逐件开启。从每件内取一袋作为原始样品，其总量不少于2kg，放入清洁容器内，加封后，标明标记，及时送交实验室。 如每件中无小包装或有小包装但每袋重量超过2kg者，则可用锋利刀（用酒精灭菌后）在抽出的包件中，每件割取不少于100g,混合后置于清洁容器内，作为混合原始样。混合原始样的重量不少于2kg。加封后，标明标记，及时送交实验室。 .试样的制备 从原始样品中分取出约1kg，充分绞碎混匀，装入清洁的容器内，作为试样，加圭寸并标明标记。 .试样保存 将试样于—18C以下冷冻保存。 注：在抽样和制样过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 5. 过程简述 .提取与净化 称取均匀试样（精确至于15mL离心管中，加入2mL乙酸乙酯，在混匀器中快速混匀1min,离心3min,用尖嘴吸管将乙酸乙酯提取液转入另一具塞离心管中，再用2mL 乙酸乙酯提取一次残渣。合并乙酸乙酯提取液，于多功能微量化学样品处理仪（60 C ）或其他相当的仪器上通氮气吹干。加入200卩L甲醇溶解残渣，再加入 2mL1mol/LNaCI水溶液和1mL正已烷，快速混匀1min，离心3min，弃去正已烷层。再用2X 1mL正已烷洗涤，弃去正已烷。加入2mL乙酸乙酯，混匀1min, 离心3min。吸取乙酸乙酯溶液于5mL具塞离心管中，在多功能微量化学样品处理仪上（60 °C ）或其他相当的仪器通氮气吹干。 .硅烷化 向盛有残余物的具塞离心管中，力卩200卩L硅烷化试剂，混匀30s，于60C 反应15mi n,用氮气吹干，加正已烷，供气相色谱分析。取氯霉素标准工作液于5mL具塞离心管中，于60C通氮气吹干，按上述步骤硅烷化后，作为标准溶液，供气相色谱测定。.测定色谱条件 色谱柱：农残U #柱，25n X （内径）; 进样口温度：280C； 柱温：240C； 检测器温度：300 C； 氮气：纯度》% 载气流量15mL/min,尾吹气30mL/min。 色谱测定 根据样液中氯霉素含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中硅烷化氯霉素响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定，在上述色谱条件下，硅烷化氯霉素保留时间约为。 .空白试验 除不加试样外，按上述测定步骤进行。 6. 结果计算 用色谱数据处理机或按下列公式计算试样中氯霉素残留量： X= h? c ? V h s ? m 式中：X ----- 试样中硅烷化氯霉素含量，mg/kg ；
二氧化硫残留量测定法
二氧化硫残留量测定法 本法系用酸碱滴定法、气相色谱法、离子色谱法分别作为第一法、第二法、第三法测定经硫黄熏蒸处理过的药材或饮片中二氧化硫的残留量。可根据具体品种情况选择适宜方法进行二氧化硫残留量测定。 第一法(酸碱滴定法) 本方法系将中药材以蒸馏法进行处理，样品中的亚硫酸盐系列物质加酸处理后转化为二氧化硫后，随氮气流带入到含有双氧水的吸收瓶中，双氧水将其氧化为硫酸根离子，采用酸碱滴定法测定，计算药材及饮片中的二氧化硫残留量。 仪器装置如图1。A为1000ml两颈圆底烧瓶；B为竖式回流冷凝管；C为（带刻度)分液漏斗；D为连接氮气流入口；E为二氧化硫气体导出口。另配磁力搅拌器、电热套、氮气源及气体流量计。 测定法取药材或饮片细粉约10g(如二氧化硫残留量较髙，超过1000mg/kg，可适当减少取样量，但应不少于5g)，精密称定，置两颈圆底烧瓶中，加水300～400ml。打开回流冷凝管开关给水，将冷凝管的上端E口处连接
一橡胶导气管置于100ml 锥形瓶底部。锥形瓶内加入3%过氧化氢溶液50ml 作为吸收液（橡胶导气管的末端应在吸收液液面以下）。使用前，在吸收液中加入3滴甲基红乙醇溶液指示剂（ml)，并用L 氢氧化钠滴定液滴定至黄色（即终点；如果超过终点，则应舍弃该吸收溶液）。开通氮气，使用流量计调节气体流量至约min ；打开分液漏斗C 的活塞，使盐酸溶液（6mol/L)10ml 流入蒸馏瓶，立即加热两颈烧瓶内的溶液至沸，并保持微沸；烧瓶内的水沸腾小时后，停止加热。吸收液放冷后，置于磁力搅拌器上不断搅拌，用氢氧化钠滴定液（L)滴定，至黄色持续时间20秒不褪，并将滴定的结果用空白实验校正。 照下式计算： 供试品中一氧化硫残留量(μg/g)=W c B A 6 10032.0???-）（ 式中 A 为供试品溶液消耗氢氧化钠滴定液的体积，ml ； B 为空白消耗氢氧化钠滴定液的体积，ml ； c 为氢氧化钠滴定液摩尔浓度，mol/L ； 为lml 氢氧化钠滴定液（lmol/L)相当的二氧化硫的质量，g ； W 为供试品的重量，g 。 第二法（气相色谱法） 本法系用气相色谱法（通则0521)测定药材及饮片中的二氧化硫残留量。 色谱条件与系统适用性试验采用GS-GasPro 键合硅胶多孔层开口管色谱柱（如GS-GasPro ，柱长30m ，柱内径或等效柱，热导检测器，检测器温度为250℃。程序升温：初始50°C，保持2分钟，以每分钟20℃：升至200°C，保持2分钟。进样口温度为200℃，载气为氦气，流速为每分钟。顶空进样，采用气密针模式（气密针温度为105°C)的顶空进样，顶空瓶的平衡温度为80°C，平衡时间均为10分钟。系统适用性试验应符合气相色谱法要求。 对照品溶液的制备 精密称取亚硫酸钠对照品500mg ，置10ml 量瓶中，加入含%甘露醇和%乙二胺四乙酸二钠的混合溶液溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成每lml 含亚硫酸钠的对照品贮备溶液。分别精密量取对照品贮备溶液、、、lml 、
蜂蜜中的氯霉素的测定
蜂蜜中的氯霉素的测定方法：SPE 基质：蜂制品 应用编 号： 101238 化合物：氯霉素 固定相：ProElut PLS 色谱柱/ 前处理小 柱： ProElut PLS 60mg / 3ml 50/pkg 商品编 号： 68003 样品前处理：1、提取 称取10 g 蜂蜜于50 mL 离心管中，加入10 mL 水，于涡旋混合器上混合3 min，待样品完全溶解后加入20 mL 乙酸乙酯，高速涡旋混合5 min，3000rpm 下离心5 min，上层溶液转入100 mL 烧瓶中。下层溶液再加入20 mL 乙酸乙酯，高速涡旋混合5 min，3000 rpm 下离心5 min，合并两次上层液于同一烧瓶中，减压浓缩至干，用3×1 mL 20% 的甲醇水溶液溶解残渣，待净化。 2、净化 a 活化：依次用3 mL 甲醇和3 mL 水活化ProElut PLS 60 mg/3 mL (Cat.#68003)，流出液弃去； b 上样：将待净化的样品液加入柱中，流出液弃去； c 淋洗：用3 mL 20% 甲醇水溶液淋洗，淋洗液弃去，并将PLS 柱抽干； d 洗脱：用3 mL 甲醇洗脱，收集洗脱液； e 重新溶解：在40 oC 下用氮气将洗脱液吹至近干，然后用1 mL 40% 甲醇水溶液定容，供HPLC 分析 色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18(2) 250 x 4.6 mm ID, 5 μm (Cat. #99603) HPLC应用101320 作者：迪马科技 文章出 处： P109 关键字：蜂蜜，氯霉素，SPE，ProElut PLS 摘要：适用于蜂蜜中氯霉素的测定。
图例： 1. 氯霉素
乙醇残留量方法学研究(测定结果)分析
乙醇残余量 药用辅料中的残留溶剂系指在药用辅料生产过程中残留于成品中的有机溶剂。由于残留溶剂有可能增加药用辅料的毒副作用，甚至会影响药物的稳定性，故所有的有机溶剂应尽可能地除去。由于我公司蔗糖生产工艺中使用乙醇作为溶剂，为了保障药用辅料产品质量，故采用气相色谱仪（顶空法）对药用蔗糖中的乙醇残留量进行了测定。 1、仪器 GC-2014C气相色谱仪，FID检测器，岛津公司生产。顶空进样器DK-3001A，北京中兴汇利科技发展有限公司生产。 2、试药 2.1乙醇 批号：20090108，级别：色谱级 厂家：天津市科密欧化学试剂可发中心 2.2水 生产使用纯化水 2.3正丙醇 批号：T20090521，级别：分析纯 厂家：国药集团化学试剂有限公司 2.4 样品 蔗糖（批号20111101、20111102、20111103），河南鲁尔康药业有限公司生产
3、色谱条件 3.1色谱柱：DB-624[6%氰丙苯基-94%二甲基聚硅氧烷]30m×0.53mm×3.0μm；安捷伦公司。 3.2检测条件：起始温度40℃，以每分钟5℃的速率升温至120℃，维持1分钟，顶空瓶平衡温度为90℃，平衡时间为30分钟。进样体积1ml,载气为N2,FID检测器。 4、检测步骤 4.1溶液配制 4.1.1内标贮备液 精密量取正丙醇0.3125g于250ml容量瓶中，加水稀释至刻度，制成每1ml含正丙醇1.25mg的内标贮备液。 4.1.2对照品贮备溶液 精密称取乙醇250.8mg于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，制成每1ml含乙醇2.508mg的对照品贮备溶液。 4.1.3对照品溶液 依次取0.1ml、0.2 ml、0.3 ml、0.4 mll对照品贮备溶液分别置4个100ml量瓶中，再分别加入1ml的内标贮备液，加水稀释至刻度，制成每1ml含乙醇2.51、5.02、7.52、10.0μg，含正丙醇12.5μg的系列浓度的对照品溶液。 4.1.4供试品溶液 精密称取样品1g置100ml容量瓶中，再精密量取1ml内标贮备液置容量瓶中，加水溶解，加水稀释至刻度，得供试品溶液。
水产品中氯霉素的快速检测 胶体金免疫层析法(KJ201905)
附件5 水产品中氯霉素的快速检测 胶体金免疫层析法 （KJ201905） 1 范围 本方法规定了水产品中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于水产品中氯霉素的快速测定。 2 原理 本方法的测定以竞争抑制免疫层析原理为基础。样品中的氯霉素经有机试剂提取，固相萃取小柱净化，浓缩复溶后，氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和微孔膜检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线颜色深浅比较，对样品中氯霉素含量进行定性判定。 3 试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的二级水。 3.1 试剂 3.1.1 正己烷。 3.1.2 丙酮。 3.1.3 乙酸乙酯。 3.1.4乙腈 3.1.5磷酸二氢钠，NaH2PO4·2H2O。 3.1.6磷酸氢二钠，Na2HPO4·12H2O。 3.1.7 氯化钠 3.1.8 复溶液：称取0.12 g磷酸二氢钠(3.1.5)置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液A；称取磷酸氢二钠7.16 g (3.1.6)置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液B。取溶液A 2.8 mL、溶液B 7.2 mL、氯化钠(3.1.7)0.85 g，用水溶解并稀释至100 mL，得磷酸盐缓冲液，即为复溶液。。 3.1.9丙酮-正己烷（1+9）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比1：9混匀。 3.1.10丙酮-正己烷（6+4）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比6：4混匀。 3.2 标准物质 氯霉素标准物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分之式、相对分子质量见表1，纯度≥98.6%。
猪痘病毒PCR检测方法的建立及应用
江西农业大学学报2012，34（4）：781－785http：//xuebao．jxau．edu．cn Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis E－mail：ndxb7775@sina．com 猪痘病毒PCR检测方法的建立及应用 张文波，蒋新华，冷闯，邓舜洲* （江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045） 摘要：建立猪痘病毒（swinepox virus，SWPV）的PCR检测方法，为SWPV的流行病学调查和临床诊断提供可靠技术支撑。参考GenBank登录的SWPV（AF410153．1）基因组序列，设计合成1对引物，扩增目的片段为975bp。以SWPV江西分离株SWPV－JX01为模板，对反应条件进行优化，建立了SWPV的PCR诊断方法。特异性、敏感性和重复性试验表明，该方法对临床上常见的其它猪病毒检测结果均为阴性；对模板的最低检测量为2．7pg；具有良好的重复性。用此方法检测50份疑似猪痘的临床样品，其中阳性率为80．2%。该方法敏感度高，重复性和特异性良好，可用于猪痘病毒的分子流行病学调查和临床病例的诊断。 关键词：猪痘病毒；PCR；猪痘 中图分类号：S852．65+9．1文献标志码：A文章编号：1000－2286（2012）04－0781－05 Development and Application of a PCR Assay for Detection of Swinepox Virus ZHANG Wen-bo，JIANG Xin-hua，LENG Chuang，DENG Shun-zhou （College of Animal Science and Technology，JAU，Nanchang330045，China） Abstract：A detection method for Swinepox Virus（SWPV）with PCR technique was established as a relia-ble technological means for epidemiological investigation and clinical diagnosis of SWPV．A pair of primers were designed according to the genome of SWPV to develop a PCR assay for detection of SWPV，the length of the product was975bp．The SWPV strain isolated from Jiangxi Province（SWPV－JX01）was taken as tem-plates．The PCR detection method for SWPV was finally established under optimal reaction conditions．The tests for the specificity，sensitivity and repeatability of the PCR assay were conducted，the results indicated that all were negative to the optimal examination method on other pig viruses and the necessary dose of tem-plates of the assay was2．7pg．50clinical samples，which were suspected SWPV syndrome from Jiangxi Prov-ince，were analysed by the method，the result showed that80．2﹪samples（41/50）were SWPV positive．The PCR detection method established in this study has the characteristics of sensitivity，high specificity and good repeatability，may be used in molecular epidemiological investigation and rapid clinical diagnosis of SWPV．Key words：swinepox virus；PCR；swinepox 猪痘病毒（swinepox virus，SWPV）在分类上属于脊椎动物痘病毒亚科猪痘病毒属唯一成员。是引起猪痘（swinepox，SWP）的主要病原，以引起猪的发热、外表皮肤起水泡、形成痘疹和结痂为特征，对3月 收稿日期：2012－05－01修回日期：2012－06－04 基金项目：国家自然科学基金项目（31160498/C1803） 作者简介：张文波（1972—），男，讲师，博士，主要从事动物传染病与免疫学研究，E－mail：hnzwb22@163．com；*通讯作者：邓舜洲，副教授，博士，E－mail：shzhdeng@163．com。
有关物质测定HPLC方法的建立
有关物质测定hplc方法的建立 一、开始之前必须明白： 1、有关物质来源的两种途径： 1）合成过程中的中间体和副产物； 2）储存过程中产生的降解产物； 2、分析你的样品结构，熟悉样品的基本性质； 3、样品中可能含有的中间体； 4、样品的基本稳定性和可能产生的降解产物； 二、准备工作 1、查阅文献，看看是否同行已经做过类似的工作，有的话就简单了，直接奔主题了。 2、没有文献（苦！），那就很是麻烦了。 1）分析结构，看看有无紫外吸收，有就比较简单，选用紫外检测器就行了，没有的话那就麻烦，可以选用蒸发光散射检测器等； 2）分析结构，看看选用何种色谱方式进行分离（正相或者反相色谱）； 3）分析结构，看看流动相该如何选择，要不要选用一些离子对试剂。 4）分析结构。。。。。。 5）与同类产品进行比较； 三、开工（以紫外检测为例） 1、流动相的选择（采用粗品进行选择） 1）、有文献，按文献进行优化。不过我得提醒一下，文献的方法参考是可以的，要想完全按照他的条件做出来是很难的。 2）、没有文献。。。。。。 a、紫外扫描一下，看看哪里有最大吸收。将能得到的中间体、副产物、分解产物、样品配成相同浓度，在紫外扫描分光光度计上扫描一下，选择所有物质具有相同的最大吸收处的波长作为测定波长。要是有pda检测器就不需要这一步了。 b、还是得找一些资料，看看类似的样品的流动相，以它为起始流动相进行选择，如果没有，那就找专业书吧，看看它是怎么教你选择流动相的。 2、最低检测限 3、系统适应性试验 重复进样5次，记录色谱图，给出系统评价报告 4、考察中间体及副产物和样品的分离度。同时定出中间体在色谱图中的出峰位置，为定质量标准提供依据。 5、考察降解产物和样品的分离情况。 这个一般是通过破坏性试验来考察。常用的一般是高温、强光、氧化、强酸、强碱五个因素
食品中氯霉素残留快速检测技术研究进展_张威
食品中氯霉素残留快速检测技术研究进展 张威，赵晓娟*，陈海光 （仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225） 摘要：氯霉素类抗生素残留引起的食品安全问题已引起人们的普遍关注。简述动物源性食品中氯霉素类抗生素残留状况，综述2004年以来氯霉素类抗生素残留常用检测技术的开发应用情况，重点介绍免疫速测、传感器等快速检测技术的最新研究进展及应用，最后对氯霉素类抗生素残留检测技术的发展趋势进行讨论。关键词：食品安全；氯霉素；残留；快速检测 Research Progress in Fast Detection Techniques of Chloramphenicol Residues in Food ZHANG Wei ，ZHAO Xiao-juan *， CHEN Hai-guang （College of Light Industry and Food Sciences ，Zhongkai University of Agriculture and Engineering ，Guangzhou 510225，Guangdong ，China ） Abstract ：Food safety issues caused by the chloramphenicol （CAPs ）residues have brought about increasing concern.In this paper ，the conditions of CAPs residues of animal derived food are introduced.The development and application of detection techniques of CAPs residues was summarized since 2004.In particular ，the fast detection techniques ，such as immunity analysis methods and sensors ，are focused.Finally ，the development trend of detection techniques of CAPs residues is discussed.Key words ：food safety ；chloramphenicol ；residues ；fast detection 基金项目： 国家自然科学基金项目（21005091）；广东省教育厅科技创新项目（2012KJCX0068）；广州市食品安全检测技术重点实验室（[2011]233-44） 作者简介：张威（1986—），男（汉），硕士研究生，研究方向：食品安全。*通信作者：赵晓娟（1980—），女，副教授，博士。 食品研究与开发 F ood Research And Development 2014年2月 第35卷第4期 DOI ：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.030 氯霉素类抗生素 （Chloramphenicols ，CAPs ），是一类包括氯霉素（Chloramphenicol ，CAP ）以及一系列氯霉素衍生物的广谱高效抗菌性药物。1947年，Ehrlich 等[1]首次从委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuela ）中分离得到CAP 。1948年，CAP 的结构被确定并成为第一种完全由人工合成的抗生素[2]。目前，我国常见的药用氯霉素类抗生素有氯霉素、甲砜霉素（Thiampheni －col ）和氟甲砜霉素（Florfenicol ）等。该类抗生素主要通过转换抗生素自身和改变微生物代谢机制[3]对多种病原菌起到较强抑制作用，因而广泛用于动物各种细菌性传染疾病的治疗，对各类家禽、家畜、水产品及蜂蜜制品各种传染性疾病的控制和治疗起重要作用[4]。 医学研究表明，肉、蛋和奶等动物源性食品中的CAPs 残留对人体有严重的副作用，长期微量摄入会使一些致病菌产生耐药性，并且引起机体正常菌群失调，使人们容易感染各种疾病。此外，CAPs 对人的骨髓细胞、肝细胞具有毒性作用，尤其是会引起与计量和疗程无关的不可逆再生障碍性贫血[5]。因此，许多国家已出台了关于氯霉素类药物禁用的相关法律法规和政策。例如，欧美仅允许氯霉素用于非食用动物；我国农业部2002年发布《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》，规定禁止在所有动物源性食品中使用氯霉素。但由于CAPs 价格低廉、抑菌效果好，目前仍被少数厂家违规使用，既对人类的健康造成极大威胁，也大大挫伤了人们对食品安全的信心。食品安全事件的频发和保障食品安全涉及到很多层面，但是无疑分析检测技术是保障食品安全的重要技术支撑，从监督层面对保证食品质量安全、保障人民身体健康等方面起到积极的促进作用。氯霉素类抗生素残留的检测技术主要有微生物检测技术、色谱检测技术、光谱分析技术和免疫速测法等快速检测技术。 专题论述 113
关于原料药有关物质检查方法建立的思考解读
关于原料药有关物质检查方法建立的思考 审评四部七室赵慧玲 【摘要】本文针对审评原料药有关物质检查方法中存在的问题，介绍欧洲和英国药典关于原料药已知杂质的研究现状和有关物质方法建立及质量控制，以供申请人参考。 【关键词】有关物质、方法学、分离度。 笔者审评原料药有关物质检查方法中发现，大多申请人越来越多地认识到控制原料药有关物质的重要性，自行建立方法考察原料药中存在的有关物质。但在研究中往往片面认为样品通过了破坏性试验和1％自身对照法后的系统适用 性试验就符合了要求。因此，忽视对主成分中杂质产生原因的分析，忽视仪器的检测灵敏度的分析、忽略色谱柱（柱效）的选择、流动相及比例的选择、检测波长的选择。忽视主成分和可能产生的杂质分离度的问题。 1、原料药有关物质方法建立应关注的问题： 原料药中的杂质来源于合成的中间体、副产物、以及降解产物，建立方法初期，仅采用破坏性试验的方法考察降解产物的做法是片面的。由于降解产物的量较小，如果选择的方法不好，比如，柱效低，波长选择不合理、流动相及流动相比例不合适，即使有降解产物，也达不到有效的灵敏度和有效的分离。因此，一个好的分析方法的建立首要问题应是围绕主成分和杂质的分离度和检测波长进行。对于生产原料药的企业来讲，由于可以通过工艺得到中间体、副产物，在方法建立初始，首先应该将可能的中间体和副产物作为杂质对待，进行柱效、流动相及流动相比例、波长和分离度等方法学的研究。方法建立成熟后，可根据中间体和副产物的安全性和工艺得到的难易程度决定是否固定为已知杂质。如果工艺中难以得到，且比较安全，可考虑采用杂质校正因子加上相对保留时间的方法。或采用杂质相对保留时间加上自身对照方法。上述三种方法均有好的分离度和响应值（灵敏度）作保证。也是研发和审评中应当提倡的。 如果原料合成中确实得不到副产物，对于有紫外吸收的样品可以用二极管阵列检测器，考察未精制的粗品，并对比已精制过的样品，确定粗品中各成分的分离度和样品中可能杂质的检测波长。方法确立后，可采用自身对照方法或面积归一化法控制杂质。对于后一方法，在研发和审评中应当慎重选用。 如果证明上述四个方法是比较成熟的方法后，如果再加上破坏性试验考察降解产物，其方法就更加完整和适用。 2、介绍欧洲和英国药典控制有关物质关注的问题 欧洲和英国药典的原料药标准后面，大部分都附有可能产生的中间体和副产物的结构，在有关物质质量控制中有些采用已知杂质的方法；有些采用杂质校正因子加上相对保留时间的方法；杂质相对保留时间加上自身对照方法和自身对照方法或面积归一化法。 例如：核黄素磷酸钠的有关物质检查就是采用HPLC的已知杂质－核黄素、其他杂质相对保留时间加上自身对照的方法。 取本品0.1g，用水50ml溶解，并用流动相稀释至100ml，取该溶液8ml，用流动相稀释至50ml，作为供试品溶液。另取核黄素对照品60mg，加盐酸试液1ml
MMFSCNJ出口肉及肉制品中氯霉素残留量检验方法
MM_FS_CNJ_0110出口肉肉制品氯霉素残留量气相色谱法外标法定量 MM_FS_CNJ_0110 出口肉及肉制品中氯霉素残留量检验方法 1.适用范围 本方法适用于出口猪肉中氯霉素残留量的检验。 2.原理概要 用乙酸乙酯提取试样中的氯霉素，然后将乙酸乙酯蒸发至干，用正已烷净化，氯霉素经硅烷化衍生后，溶解于正已烷中，用带电子俘获检测器的气相色谱仪进行测定，外标法定量。 3.主要试剂和仪器 3.1.主要试剂 乙酸乙酯：重蒸馏； 甲醇：重蒸馏； 正已烷：重蒸馏； 丙酮：重蒸馏； 硅烷化试剂：3mL六甲基二硅烷(HMDS)＋1mL三甲基氯硅烷(TMS)＋9mL吡啶； 氯化钠水溶液：1mol/L； 氯霉素标准品：含量≥99.5%； 氯霉素标准溶液：准确称取适量的氯霉素标准品，用丙酮配成0.10mg/mL 的贮备液，根据需要稀释成适当浓度的标准工作液。 3.2.仪器 气相色谱仪：配有电子俘获检测器(ECD)； 快速混匀器； 离心机：3000r/min； 多功能微量化学样品处理仪或其他相当的仪器； 具塞离心管：5mL； 离心管：15mL； 尖嘴吸管； 微量可调移液管：50μL、200μL、1000μL； 微量注射器：10μL。 4.试样的抽取与制备 4.1.检验批 以不超过2500件商品为一检验批。 同一检验批的商品应具有相同特征，如：包装、标记、产地、规格和等级等。 4.2.抽样数量 批量，件最低抽样数，件 1～25 1 26～100 5 101～250 10 251～500 15 501～1000 17 1001～2500 20
4.3.抽样方法 按规定的抽样件数，随机抽取，逐件开启。从每件内取一袋作为原始样品，其总量不少于2kg，放入清洁容器内，加封后，标明标记，及时送交实验室。 如每件中无小包装或有小包装但每袋重量超过2kg者，则可用锋利刀(用酒精灭菌后)在抽出的包件中，每件割取不少于100g，混合后置于清洁容器内，作为混合原始样。混合原始样的重量不少于2kg。加封后，标明标记，及时送交实验室。 4.4.试样的制备 从原始样品中分取出约1kg，充分绞碎混匀，装入清洁的容器内，作为试样，加封并标明标记。 4.5.试样保存 将试样于－18℃以下冷冻保存。 注：在抽样和制样过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 5.过程简述 5.1.提取与净化 称取2.00g均匀试样(精确至0.01g)于15mL离心管中，加入2mL乙酸乙酯，在混匀器中快速混匀1min，离心3min，用尖嘴吸管将乙酸乙酯提取液转入另一具塞离心管中，再用2mL乙酸乙酯提取一次残渣。合并乙酸乙酯提取液，于多功能微量化学样品处理仪(60℃)或其他相当的仪器上通氮气吹干。加入200μL甲醇溶解残渣，再加入2mL1mol/LNaCl水溶液和1mL正已烷，快速混匀1min，离心3min，弃去正已烷层。再用2×1mL正已烷洗涤，弃去正已烷。加入2mL乙酸乙酯，混匀1min，离心3min。吸取乙酸乙酯溶液于5mL具塞离心管中，在多功能微量化学样品处理仪上(60℃)或其他相当的仪器通氮气吹干。 5.2.硅烷化 向盛有残余物(5.1)的具塞离心管中，加200μL硅烷化试剂，混匀30s，于60℃反应15min，用氮气吹干，加1.00mL正已烷，供气相色谱分析。取1.00mL 氯霉素标准工作液于5mL具塞离心管中，于60℃通氮气吹干，按上述步骤硅烷化后，作为标准溶液，供气相色谱测定。 5.3.测定 5.3.1.色谱条件 色谱柱：农残Ⅱ#柱，25m×0.53mm(内径)； 进样口温度：280℃； 柱温：240℃； 检测器温度：300℃； 氮气：纯度≥99.99%，载气流量15mL/min，尾吹气30mL/min。 5.3.2.色谱测定 根据样液中氯霉素含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中硅烷化氯霉素响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定，在上述色谱条件下，硅烷化氯霉素保留时间约为8.7min。 5.4.空白试验 除不加试样外，按上述测定步骤进行。 6.结果计算 用色谱数据处理机或按下列公式计算试样中氯霉素残留量：
果蔬中氨基甲酸酯类农药残留量的检测方法
果蔬中氨基甲酸酯类农药残留量的检测方法 摘要:由于氨基甲酸酯类农药的诸多优点，使其在农业生产过程中得到广泛地应用。但其若进入人体可生成具有致癌作用的亚硝基化合物。所以在果蔬中其残留量的检测有非常重要的意义。只有测定其残留量在允许的范围内，我们的饮食安全才能得到保证。本文简单介绍了几种最常见的检测氨基甲酸酯类农药残留量的方法。 关键词：果蔬氨基甲酸酯类农药残留检测方法 Detection methods of Carbamate pesticide residues in fruits and vegetables Abstract：Due to many advantages of carbamate pesticides, it has been widely used in the process of agricultural production. But if it enters the body, there will generate carcinogenic nitroso compounds. So detection methods of Carbamate pesticide residues in fruits and vegetables are of very important significance. Only by measuring its residue in the allowed range, can our food safety be guaranteed. This article simply introduces several kinds of the most common method of detecting carbamate pesticide residues. Key words: fruits and vegetables Carbamate pesticide residues detection methods
氯霉素试剂盒检测方法
酶标免疫分析定量检测氯霉素残留试剂盒。德国R-Biopharm公司制造(中文翻译件仅供参考,以试剂盒内附的英文原件为准.) 简介 RIDASCREEN Chloramphenicol（产品编号R1501） 竞争酶标免疫法定量测定牛奶，肉类及鸡蛋中的氯霉素残留。试剂盒中包括了所有检测用的试剂。该试剂盒有96个试验孔包括标准试验，如果进行定量分析，必须有微孔板酶标仪。 检测下限: 尿液中50ppt 虾及鱼肉50ppt 牛奶中：150 ppt 肉类中: 100ppt 1. 用途 RIDASCREEN chloramphenicol竞争酶标免疫法定量测定牛奶，尿液，虾肉，鱼肉，肉类及鸡蛋中的氯霉素残留。 2.概要（略） 3.测定原理 测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对兔IgG（氯霉素抗体）的羊抗体。加入氯霉素抗体，氯霉素酶标记物，标准或样品溶液。游离氯霉素与氯霉素酶标记物竞争氯霉素抗体，同时氯霉素抗体与羊抗体连接。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处测量（选择参比波长≥600nm）。吸光度值与样品中的氯霉素浓度成反比。 4.提供的试剂 每一个盒中的试剂足够进行96个测量（包括标准分析孔），盒中的材料如下： 1 X 96孔板（12条X 8孔）包被有抗兔IgG的羊抗体 6 X 浓缩标准液, 300ul/瓶, 为氯霉素溶液 0ppt，500ppt, 1500ppt, 4500ppt, 13500ppt, 40500ppt 1 X 过氧化物酶标记的氯霉素浓缩液…..……..红色帽 1 X 氯霉素抗体浓缩液…………………………..黑色帽 1 X 基质(7ml);含有过氧化尿素…….……….…..绿色帽 1 X 发色剂(7ml);四甲基联苯胺…….….…….….蓝色帽 1 X 反应停止液(14ml)1M硫酸....….……….…..黄色帽 1 X 缓冲液1(100ml)用于标准，酶标记物，抗体，样品 及缓冲液2稀释用 1X 缓冲液2（1ml），测定牛奶样品时的标准稀释用缓冲液 5.需要的材料但盒中不提供 设备
食品中农药残留检测实验方法步骤(精)
实验一粮食、水果和蔬菜中有机磷农药测定的气相色谱法 Experiment 1 Determination of Organophosphorus Pesticide Residues in Foodstuff, Fruits and Vegetables by Gas Chromatographic Method 1. 方法原理 样品中有机磷农药残留在加入无水硫酸钠后，用有乙酸乙酯提取、过滤、浓缩、定容，用气相色谱氮磷检测器(NPD或火焰光度检测器(FPD检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。 2. 方法适用范围 本法规定了粮食(大米、小麦、玉米、水果(苹果、梨、桃等、蔬莱(黄瓜、大白菜、西红柿等中速灭磷(mevinphos、甲拌磷(phorate、二嗪磷(diazinon、异稻瘟净(iprobenfos、甲基对硫磷(parathionmethyl、杀螟硫磷(fenitrothion、溴硫磷(bromophos 、水胺硫磷(isocarbophos、稻丰散(phenthoate、杀扑磷(methidathion等多组分残留量的测定。 3. 仪器与试剂 3.1 试剂 无水硫酸钠：分析纯，650℃灼烧4h ，冷却后贮于密闭容器中备有。丙酮：分析纯，重蒸馏。 乙酸乙酯：分析纯，重蒸馏。 所需有机磷农药标准溶液：纯度≥98.0%。 3.2 仪器与设备 气相色谱仪：配FPD 或NPD 高速组织捣碎机
微量注射器：5μL ，10μL 。 梨形瓶：200mL 具塞刻度试管：10mL 。 鸡心瓶：100mL 。 4. 样品处理步骤 4.1 提取和净化 称取试样25.0g 置于组织捣碎机中，加入25.0g 无水硫酸钠和50.0mL 乙酸乙酯，高速匀浆3min ，提取液经铺有无水硫酸钠的漏斗过滤，残渣用10mL 乙酸乙酯洗涤2次，合并滤液于梨形瓶中，用旋转蒸发器在45℃水浴减压浓缩后定容至5.0mL ，采用GC 测定。在分流/不分流进样口的玻璃衬管中填入0.5cm 高的石英棉，进样70次后，更换石英棉。 4.2 测定 4.2.1 色谱条件 (1 色谱柱：BP-10石英毛细管柱(25m×0.22mm×0.35μm (2 色谱柱温度：60(2min→10/min→200(0.2min →2/min→250℃℃℃℃℃ (3 进样口温度：270℃ (4 检测器温度：270℃ (5 载气和尾吹气：N2≥99.99%，0.5mL/min，尾吹气：35mL/min (6 氢气(FPD：40mL/min；空气(FPD：120mL/min (7 进样方式：不分流进样
溶剂残留量检测方法
溶剂残留量检测方法 气相色谱仪检测器(氢火焰离子检测器) 色谱柱:25%PEG-1500，301有机担体，柱长2m,内径2mm(也可以采用专业的毛细管柱) 条件:柱室温度90℃检测器温度：150℃气化室温度：150℃ 1.包装材料溶剂残留量的检测 采用气相色谱仪或等同原理的仪器，按生产实际使用溶剂的种类配制标准溶剂样品，用微升注射器取0.5μl、1μl、2μl、 3μl和4μl样品，换算成质量。将样品分别注入用硅橡胶密封好的清洁干燥的500ml三角瓶中，送入80±2℃恒温烘箱中放置30 分钟后，用5ml注射器从瓶中取1ml气体，迅速注入色谱仪中测定。以其出峰总面积值分别与对应的样品质量做出标准曲线。 裁取0.2m2样品，将样品迅速裁成10mm×30mm碎片，放入清洁的、在80℃条件下预热的500ml 三角瓶中，用硅胶塞密封，送入80±2℃恒温烘箱中加热30分钟后，用5ml注射器取1ml瓶中气体注入色谱仪中测定。以出峰总面积值在标准曲线上查出对应的溶剂残留量，试验结果以mg/m2表示。 2.油墨溶剂残留量的检测 采用气相色谱仪或等同原理的仪器，按产品标准要求的溶剂种类配制标准溶剂，将每种溶剂用10μl进样器通过密封胶塞向300ml输液瓶中注入1μl标准溶剂，放入80±1℃恒温烘箱中20分钟后取出，隔日再放入50±1℃恒温烘箱中20小时以上，取出后用1ml注射器分别从瓶中抽取0.2、0.6、0.8、1.0ml的气体进行测试，做出标准曲线。 将油墨在双向拉伸聚丙烯薄膜上制成印样，悬空放置2小时，将试样裁切成4条，规格为5cm ×10cm，总面积为200cm2，立即置于300ml输液瓶中塞紧瓶口，置于80±1℃恒温烘箱中30分钟，取出后用1ml注射器抽取气体，注入色谱仪测定，以出峰总面积值在标准曲线上查出对应的溶剂残留量，试验结果以mg/m2表示。 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。