Molecular cloning of virB12 gene in pET28a vector
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Asian Pacific Journal of Tropical Medicine (2012)511-513
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Asian Pacific Journal of Tropical Medicine
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*Corresponding author: Nour Amirmozafari, Tehran University of Medical Sciences,
School of Medicine, Microbiology Department, Tehran, Iran. Tel: +982188058649 Fax: +982188058649
E-mail: Amirmozafari@https://www.wendangku.net/doc/e92885452.html,
1. Introduction
B rucellosis is a widespread zoonotic infectious disease that is acquired by humans primarily through contact with infected abortion-related animal tissues and contaminated dairy products. I t can have diverse clinical manifestations with symptoms that overlap with other diseases [1-3]. O wing to the fact that bacteriological methods are not sensitive enough for brocellusis detection [4,5], serological tests are often the preferred method for diagnosis of B rucellosis in both humans and animals [6]. S ince the available serological tests detect circulating antibodies to bacterial lipopolysaccharide, these tests suffer from extensive cross reaction with other G ram-negative bacteria; therefore, interest in finding alternative and more specific bacterial antigen to detect brucellosis is on the rise [7-10].
S everal proteins from Brucella melitensis (B. melitensis) were found to induce an antibody response in infected animals and humans [11-13]. I t was recently reported that V ir B 12 protein, a surface-localized protein of Brucella spp. elicit antibody responses in both experimentally and
naturally infected animals [2,14]. T he aim of this study was cloning of vir B 12 gene in p ET 28a expression vector for production of recombinant protein to be used as antigenic component for future serological test development. 2. Materials and methods 2.1. Bacterial strains, plasmids
B. melitensis 16M strain was procured from P asteur institute of I ran. Escherichia coli (E. coli) strains DH 5α and BL 21 (DE 3) were received from N ovagene C o., C loning vector p JET 1.2 and expression vector p ET 28a were obtained from F ermentas and I nvitrogen C o., respectively.2.2. Culture of bacteria
B. melitensis was cultured in Brucella broth and E. coli was grown in B roth and agar L uria-B ertani medium. W hen antibiotic selection was necessary, the above media were supplemented with appropriate concentrations of antibiotic.2.3. Genomic DNA extraction
G enomic DNA of B. melitensis 16M strain was extracted by B ioneer A ccu P rep ? G enomic DNA E xtraction kit. Q uality
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and purity of the extracted DNA were assessed using agarose gel electrophoresis and spectrophotometerically.
2.4. Primer design
A pair of oligonucleotide was designed based on the vir B12 gene sequence of B. melitensis16M strain obtained from G ene
B ank (A ccession no. AF226278) with B am HI and H ind III restriction site at the 5′ end of the forward and reverse primers, respectively (T able 1).
Table1
2.5. PCR amplification
T he PCR reaction mixture included 2μL of bacterial genomic DNA(containing 100 ng), 150 n M d NTP s, and 1×PCR buffer (containing of M g C l2), 1.25 units of P rim STAR?HS DNA polymerase and 40 picomoles each of the forward and reverse primers in 50μL final volume. PCR amplification was performed by the following parameters: denaturing at 94℃ for 40 s, annealing at 58℃ for 30 s and extension at 72℃ for 30 s in an E ppendorf master gradient thermocycler. PCR product was electrophoresed on 1.5%(w/v) agarose gel, stained with ethidium bromide and visualized under UV transilluminator.
2.6. Gene cloning
DNA band was sliced under long wave UV and recovered by B ioneer A ccu P rep?G el P urification K it. R ecovered DNA was ligated into p JET1.2 cloning vector at 22℃ for 1 h with T4DNA ligase (F ermentas C o.). T he ligation product was transformed into E. coli DH5α strain competent cells and dispersed onto LB agar plates containing 100μg/m L ampicillin.
A fter 16-18 h incubation at 37℃, colonies on the agar plate that contained recombinant plasmids were detected.
F or confirmation, PCR amplifications were performed on these colonies using primers specific for vir B12 gene and p JET vector and colonies containing the recombinant plasmid were selected. R ecombinant plasmid was extracted by B ioneer A ccu P rep?P lasmid E xtraction K it and digested by B am HI and H ind III restriction enzymes (F ermentas C o.). F ollowing electrophoresis, the DNA digested bands were purified by B ioneer A ccu P rep?
G el P urification K it.
F ragments of B am HI and H ind III digestes were subcloned in H ind III and B am HI digested p ET28a (+) expression vector and transformed into E. coli DH5α competent cells and spread onto LB agar plates containing 30μg/m L kanamycin. T hen, the recombinant plasmid p ET28a-vir B12 was confirmed by PCR, restriction enzymes digestion and sequencing which was performed by a commercial company using universal forward and reverse T7 promoter and terminator primers (TA
G C openhage A/S S ymbion, D enmark).
3. Results
B rucella vir B12 gene was amplified from genomic DNA of B. melitensis 16M strain. T he PCR products analyzed on 1.5%(w/v) agarose gel displayed a single band with the correct size (513 bp) pertaining to the amplification of the vir B12 gene (F igure 1).
T he PCR product was cloned in p JET1.2 plasmid. C olonies containing the p JET–vir B12 recombinant plasmid were confirmed by PCR using V ir B12 gene and p JET1.2 primers. R ecombinant plasmid p JET-vir B12 was successfully digested by B am HI and H ind III restriction enzymes. T he digested band (vir B12 gene) was extracted and subcloned into p ET28a expression vector. P resence of the inserted gene was confirmed by PCR method, using primers designed according to the sequence of the p ET28a and vir B12 gene and digestion of p ET28a-vir B12 recombinant plasmid by B am HI and H ind III(F igure 2). N egative control was p ET28a vector alone which displayed a lower molecular weight band relative to the recombinant plasmid. F inally, the integrity and orientation of vir B12 in construct were confirmed by DNA sequencing.
R esults show a 513 bp fragment corresponding to the B. melitensis vir B12 gene was successfully cloned and transformed to the bacterial expression vector p ET28a.
500 bp
1 2 3
Figure 1.Electrophoresis of the amplified virB12 gene on 1.5% (w/ v) agarose gel. Lane 1: 100 bp Plus DNA ladder. Lane 2, 3: Single expected band of virB12 gene (approximately 513 bp).
500 bp
1 2 3 4
Figure 2. Analysis of enzymatic digestion of recombinant plasmid on 1.5% (w/v) agarose gel. Lane 1: DNA ladder. Lane 2: virB12- pET28a recombinant plasmid. Lane 3: Mono digestion of virB12-pET28a recombinant plasmid with BamHI. Lane 4: Double digestion of virB12-pET28a recombinant plasmid with BamHI and HindIII.
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4. Discussion
B rucellosis is an infectious disease that is endemic in most developing countries [15,16]. R apid and accurate diagnosis of B rucellosis has an important role in effective treatment of patients and improvement of public hygiene. T he routine serological tests that are often used are based on detection of anti-lipopolysaccharide antibodies. I n these serological tests, cross reaction occur between Brucella and many other G ram negative bacteria [7].
E lucidation of an antigenic component for diagnosis and vaccination of brucellosis infection serves as a valuable tool. T here are several studies on different proteins of Brucella as antigenic component including the OMP 31 k D a, 28 k D a and 26 k D a periplasmic proteins from B. melitensis [4,9,13].
T he proteins that are located on the surface of bacteria have traditionally been used as useful antigens for diagnostic and vaccine component. F or this reason, in the present study, cloning of the vir B 12 gene of Brucella that is located on bacterial surface was designed.
P revious study indicated that natural hosts infected with Brucella produce an antibody response to the protein encoded by the vir B 12 gene [2]. V ir B 12 protein is a part of the type IV secretion system that is encoded by the vir B locus and is located on the surface of Brucella . Brucella cell surface proteins have shown to elicit an immune response related to the protection of the host which can also potentially be used for diagnostic purpose [2,14].
I n this study, the vir B 12 gene is cloned using DH 5α E. coli as a host which doesn ’t contain the T 7 RNA polymerase and the expression vector p ET 28a was used that is a powerful system for cloning and expression of recombinant proteins in E. coli . T he nucleotide sequence of vir B 12 gene cloned in this study was consistent with the sequence of vir B 12 gene as published in the G ene B ank. C loning site in the p ET 28a also contained H is T ag sequences for detection and purification.
I n conclusion, we were able to clone the vir B 12 gene of B. melitensis in expression vector for protein expression in order to be used in future study as antigenic component.Conflict of interest statement
W e declare that we have no conflict of interest.Acknowledgment
T his study was supported by grant from T ehran U niversity of M edical S ciences.References
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转基因动物与克隆动物的区别
转基因动物与克隆动物的区别：转基因，用人工方法将外源基因导入或整合到其基因组内，并能将此外源基因稳定的遗传给下一代的一类动物[1]。由于转基因动物体系打破了自然繁殖中的种间隔离，使基因能在种系关系很远的机体间流动（有性繁殖）。克隆，通常是一种生物技术，以人工诱导的无性生殖方式或者自然的无性生殖方式（例如：植物），产生与原个体有完全相同基因组之后代的过程。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一种生物完全一样。 基因工程的内容，原理，步骤：是利用DNA重组技术，将目的基因与载体DNA在体外进行重组，然后把这种重组DNA分子引入受体细胞，并使之增殖和表达的技术[1]；取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；构建基因的表达载体；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。基因工程是人类根据一定的目的和设计,对DNA 分子进行体外加工操作,再引入受体生物,以改变后者的某些遗传性状,从而培育生物新类型或治疗遗传疾病的一种现代的、崭新的、分子水平的生物工程技术 现代生物工程：现代生物技术包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等五大工程技；可分为农业生物技术、医学生物技术、植物生物技术、动物生物技术、食品生物技术、环境生物技术等。[1] 生态系统(Ecosystem)是指在一个特定环境内，相互作用的所有生物和此一环境的统称。此特定环境里的非生物因子（例如空气、水及土壤等）与其间的生物之间具交互作用[2]，不断地进行物质的交换和能量的传递，并借由物质流和能量流的连接，而形成一个整体，即称此为生态系统或生态系。 中国的环保策略：科学协调行业间关系，制定持续发展规划；实现森林资源的供需平衡，持续利用；建立自我调节的生态系统；提高人们的“绿色环保”意识；完善相关法律并严格执行；林业的可持续发展，城市的可持续发展 公害public nuisance，凡由于人类活动污染和破坏环境，对公众的健康、安全、生命、公私财产及生活舒适性等造成的危害均为公害，由于大气污染、水体污染、噪声污染、振动、恶臭等所影响和侵害的是不特定的公众，所以由此产生的危害一般均称为公害。
动物克隆与转基因
动物克隆与转基因 一、人工辅助生殖通常都指那些技术？这些技术主要针对何种需求（可以从阐述技术优缺点的视角来分析）？ 人工辅助生殖技术（assisted reproductive technology, ART）主要包括人工授精(artificial insemination, AI)、卵母细胞的体外成熟(in vitro maturation, IVM)、体外受精(in vitrofertilization, IVF)、胚胎体外发育(in vitro production, IVP)、胚胎移植(embryo transfer, ET)和配子冷冻等。这些技术主要可用于改善动物的生殖性能、保护生物多样性和推动基础研究等。在动物方面，可用于商业（如高产）或名贵动物的繁殖及濒危动物的保护研究。此外，还有助于转基因动物克隆和转基因的相关基础研究。 在人类方面，有人工授精、试管婴儿、卵浆内单精子注射技术（ICSI）、种植前遗传学诊断（PGD）及辅助孵化（AH）等，试管婴儿技术（包括体外受精和胚胎移植等）主要解决不孕不育症，自我调控人类的生殖。但是，人工辅助生殖技术还有很多不完善的地方，对于不同的动物研究进展情况不同，主要在超排卵、核移植克隆等方面有待进一步发展。用于人类的辅助生殖技术，也存在一定的弊端，如无法保证妊娠率、多胎率较高、伴随着并发症以及费用风险较高等。此外，用于人类的辅助生殖技术还会引发一些伦理问题。 尽管人工辅助生殖技术尚存在一系列问题，但随着其快速的发展和完善，将有着更加广泛的应用。 三、胚胎分割、胚胎克隆和体细胞克隆在技术方法上有何不同？简单
分析体细胞克隆未来的应用方向和途径。 胚胎分割（Embryo bisection）的理论根据是动物细胞具有全能性，指借助显微操作技术或徒手操作方法切割早期胚胎成二、四等多等份再移植给受体母畜，从而获得同卵双胎或多胎的生物学新技术。来自同一胚胎的后代有相同的遗传物质，因此胚胎分割可看成动物无性繁殖或克隆的方法之一。 胚胎克隆以未分化或处于不同发育阶段的胚胎分裂球或细胞作为核供体，与体外成熟后去核的卵母细胞融合构建成克隆胚胎，或再从克隆胚胎内分离出细胞移入成熟去核卵母细胞融合后即可发育成再克隆胚胎，将这些胚胎移入同期发情的母体得到克隆体和再克隆体。 体细胞克隆则是取出一个双倍体细胞核移入一个去核的卵细胞，并在一定条件下进行核卵重组，再植入代孕母体中发育成新个体的过程。供体细胞均来自高度分化的体细胞，其种类繁多、数量无限。 体细胞克隆技术在动物育种及珍稀动物保护领域具有极其广阔的应用前景，异种克隆则为器官移植提供了一种全新的、可行的方法。体细胞克隆技术在未来将会与基因工程、干细胞技术相互结合，往简单、实用、高效等方向发展。 参考文献： [1]韩堃，石艳春等人类辅助生殖技术研究进展（J）Chinese Journal of Woman and Child Health Research Vo1．19 No．6 2008 [2]刑华犬科动物的生殖生物学与辅助生殖 [3]马利兵，王凤梅等哺乳动物体细胞克隆技术的研究进展（J）生物技术通报，2009，5：51-54
转基因克隆动物技术涉及的生物学问题 生物学转基因
转基因克隆动物技术涉及的生物学问题生物学转基因 1 转基因克隆动物技术简介转基因克隆动物技术是转基因动物技术与克隆动物技术的有机结合，它是以动物体细胞(包括动物成体体细胞、胎儿成纤维细胞等)为受体，将目的基因导入其中，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。这种结合不仅仅是简单的技术叠加，而是技术的重组、综合和优化，它实现了高效率、低成本的转基因动物制作，已成为当前动物生物技术领域研究的新热点。 1.1转基因克隆动物技术的发展历程 Wilmut研究小组在取得克隆绵羊“多利”后，Schnieke等用阳离子脂质体介导外源基因转染到培养的绵羊胎儿成纤维细胞中，然后将细胞融入去核卵母细胞中，经激活后在体外培养至囊胚期，移入同步受体母羊中，最后获得6只转基因绵羊。 Cibelli等用同一方法获得了3只转基因牛。 xx年6月21日，日本静冈县中小家畜实验场宣布，该实验场和北里大学合作，成功克隆出了体内含有水母基因的转基因猪。该实验第一次成功地把转基因技术和体细胞克隆技术有机地结合在一起。
xx年12月24日，我国东北农业大学刘忠华教授的转基因克隆猪获得成功，3头含绿色荧光蛋白的转基因克隆猪自然分娩。 1.2转基因克隆动物培育过程 转基因克隆动物的培育过程如图1所示。 2 转基因克隆动物涉及的生物学问题 2.1生物技术 2.1.1基因工程 图1中过程A表示目的基因的获取，目前常用的方法有以下几种：①从基因文库中获取目的基因；②利用PCR技术扩增目的基因；
③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。得到目的基因后，还要构建基因表达载体，才能导入受体细胞。 图1中过程C表示将目的基因导入受体细胞，常用的方法为显微注射法。目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，还需要对目的基因进行分子水平上的检测。检测方法包括：DNA分子杂交法、DNA-RNA杂交法和抗原一抗体杂交法。 2.1.2细胞工程 图1中过程B表示从供体动物的某一部位取体细胞，在体外进行动物细胞培养，得到能进行传代的体细胞。过程D和E表示采用显微操作技术，用微型吸管吸出供体细胞的细胞核，注入去核的卵母细胞中(也有人将供体细胞注入受体细胞中)。过程F表示从受体动物中获得卵巢，再采集卵母细胞，在体外培养成熟，即培养到减数第二次分裂中期。过程G表示通过电刺激使两个细胞融合，得到重组细胞。 2.1.3胚胎工程
动物转基因技术及其应用
动物转基因技术及其应用 摘自（作者：幸宇云任军江西农业大学来源：《百名专家谈转基因》） 转基因是指利用现代分子生物学技术，将某些生物的基因导入到其他物种中，由于导入基 因的表达，引起这些物种性状发生可遗传的变化。转基因动物就是利用转基因技术获得的、具 有正常表达和可稳定遗传外源基因的动物。自1982年第一只转基因动物——一只因导入大鼠 生长激素基因而使生长速度倍增的转基因鼠诞生以来，各种转基因动物，如鱼、兔、猪、牛、 羊等先后问世，1997年，举世轰动的“多莉”克隆羊的诞生使转基因克隆动物成为现实，转 基因动物研究得到了进一步发展。 生产转基因动物的方法有很多，如：显微注射法、精子载体法、逆转录病毒载体法、胚胎 干细胞介导法、体细胞克隆介导法、人工染色体介导的基因转移法等，这些方法各有其优缺点，在转基因动物生产中有着不同程度的应用。 显微注射法是动物转基因技术中最早使用的方法。1982年，美国人Gordon就是利用这种 方法获得了名噪一时的转基因鼠。其基本原理是在显微镜下直接将目的基因注射到受精卵细胞 的原核内，在目的基因与胚胎基因组融合后进行体外培养，最后移植给受体母畜“借腹怀胎”。这种方法的优点是：可靠性高，重复性好，目的基因的整合效率相对较高，导入基因片段的大 小和类型不受限制，转基因在世代之间可以稳定遗传。该方法也有其缺点，主要体现在导入基 因整合的随机性和不可见性，这样会导致基因表达不稳定及可能出现不希望的插入突变。该方 法成功的范例很多，如：美国科学家Hammer等在1985年获得一批转基因兔、绵羊和猪；荷兰 科学家KrimPenfort等于1991年获得了转基因牛；1985年，我国朱作言院士等成功获得了世 界上首例转基因鱼；由中国农业大学李宁院士领导的课题组于2008年获得了一头导入人CD20 抗体基因的转基因奶牛——贝贝。 有的学者另辟蹊径，创立了精子载体转基因法。该方法是将精子与目的DNA进行预培养后，使精子具有携带目的基因进入卵子的能力，精子与卵子结合后，该基因被整合到受精卵的DNA 中。同显微注射法相比，该方法有几个明显的优点：无需显微注射操作，不会对胚胎造成损伤，整合率高，成本很低，不需要对动物进行胚胎移植手术处理等。但该方法成功率不高、效果不 稳定，有待科研人员进一步探索和改进。与显微注射法相比，该方法成功的例子不多。1989 年意大利Lavitrano等首次报道利用精子载体法获得转基因鼠；1996年意大利Sperandio科 研小组报道了采用该方法生产转基因牛和猪。 谈到病毒，人们往往面容失色，殊不知病毒在科学上有很多妙用。逆转录病毒是一种RNA 病毒，在转基因技术中有着独特的应用。人们将目的基因结合到逆转录病毒上，通过病毒感染 可将目的基因插入到宿主基因组中去。该方法具有可同时感染大量胚胎、不需要昂贵的显微注 射设备等优点，但也存在插入外源DNA大小有限、外源基因易发生重排和丢失、逆转录病毒的 序列可能干扰转基因表达等缺点。应用该方法，美国人Salter等（1987）生产出转基因鸡； 德国学者Hofmann等获得绿色荧光蛋白转基因猪（2003），随后又生产出转基因牛（2005）； 来自冷泉港实验室的Michael获得能够发荧光的山羊（2006）。 胚胎干细胞是生命体中保留的未成熟细胞，具有再分化形成其他细胞和组织器官的潜力， 被称为“万能细胞”。利用胚胎干细胞生产转基因动物的原理是将外源基因导入分离好的胚胎 干细胞，然后将转基因的胚胎干细胞注射于受体动物胚胎后，参与宿主的胚胎融合形成嵌合体，从而得到转基因动物。这一方法的优点是可以对胚胎干细胞进行特定选择。缺点是目前只有小 鼠干细胞系比较成熟，而家畜干细胞系还未完全建立，有不少问题尚待解决。 体细胞克隆介导的转基因是动物转基因技术中的“高级版本”。说到体细胞克隆，很多人都会想到一位“动物明星”——多莉羊，它是于1997年由英国Wilmut等获得的杰作。转基因 克隆技术是转基因技术和动物克隆技术的有机结合，其基本原理是将目的基因导入动物体细胞
动物克隆技术的发展和现状(文献综述)
动物克隆技术的发展和现状 ——动物遗传工程文献综述
动物克隆技术的发展和现状 摘要：本文简要概述了克隆的概念，全面综述了国内外动物克隆技术及其原理、研究进展和现状，并根据当前克隆技术理论和实践，对该技术的应用和价值进行综述和讨论。 关键词：动物克隆；核移植；体细胞克隆 动物克隆技术，又称动物核移植或无性繁殖技术。它是通过特殊的人工手段，对动物特定发育阶段的核供体（如胚胎分裂球或体细胞核）及其相关的核受体（如去核的原核胚或成熟的卵母细胞），不经有性繁殖，进行体外重构，并通过胚胎移植，从而达到扩大同基因型动物种群的目的。 动物克隆技术在畜牧业生产、医药生产和疾病治疗、生物学基础理论研究以及野生濒危动物的拯救和保护等诸多领域发挥着巨大作用。 1 动物克隆技术的发展 1.1 国外克隆技术的发展： 早在1938年，Spemann就通过蝾螈胚胎分割实验证明了自己的核移植设想。 1952年，Briggs和King将青蛙卵进行核移植，获得重组胚并发育形成小蝌蚪，20世纪六七十年代两栖类、鱼类也相继克隆成功[1]。 1996年,Hoppes克隆小鼠成功标志首例哺乳动物克隆成功[2]。随后，他采用显微去核和病毒介导相继获得克隆羊、克隆兔、克隆猪[3,4]。 1996年，美国克隆猴获得成功，这是人类首次灵长类克隆成功，并引发克隆人与伦理争论[5]。 1997年，克隆绵阳“多莉”的诞生，标志体细胞克隆进入了一个新时代。 1998年，Wilmut等利用核移植和转基因技术，成功地获得了转基因克隆绵阳。 1999年，华裔科学家赖良学等通过基因敲除和体细胞克隆技术相结合，成功获得“基因敲除”克隆猪。 2002年，华裔科学家杨向中宣布成功获得具有两种人类凝血因子的“双基因”克隆猪。 1.2 国内克隆技术的发展 我国的动物克隆技术相对发展比较晚，但几年发展速度较快并且受到国际同行的高度肯定和认可。无论是在同种动物的胚胎细胞克隆、同种动物的体细胞克隆还是异种动物的克隆方面都有很大进步。 同种动物胚胎细胞克隆：1972年，童第周利用核移植技术首次获得了克隆黑斑鲤鱼。1990年，张涌等由同一个胚胎经过多代克隆之后，分别移植于几个羊受体内获得了45只克隆羊。1993年，王斌和范必勤等通过胚胎细胞核移植得到了3只克隆兔。1995年，邹贤刚和杜森进行了山羊继代研究，得到了4只克隆羊。1997年，陆长富和卢光秀等供货的了6只核移植仔鼠。1998年，杜森等用羊胎儿成纤维细胞获得2头克隆山羊。 同种动物体细胞克隆：2002年10月16日中午，中国第一头利用玻璃化冷冻技术培育出的体细胞克隆牛在山东省梁山县诞生；2005年，我国第一头体细胞克隆猪诞生。2013年，一胎8头体细胞克隆小猪在南京农业大学诞生，这是江苏省首例利用徒手克隆核移植技术生产的克隆猪；2013年，世界首例体细胞克隆山羊“元元”在杨凌西北农林科技大学诞生，这一重大科技事件的发生，标志着我国在世界克隆技术领域占据领先地位。
基因工程与克隆技术讲义答案复习进程
基因工程与克隆技术 讲义答案
基因工程与克隆技术 考点1 基因工程 1.(2015·浙江10月选考,节选)答案:限制性核酸内切酶 2.(2016·浙江4月选考,节选) 答案:(1)逆转录重组DNA分子农杆菌 B (2)摇床维持渗透压 3.(2018·浙江4月选考,节选)回答与基因工程和植物克隆有关的 问题: (1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切,在切口处形 成。选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI121用DNA连接酶连接,在两个片段相邻处形 成,获得重组质粒。 (2)已知用CaCl2处理细菌,会改变其某些生理状态。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作,使重组质粒进入农杆菌,完成实验。在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,其目的 是 , 从而表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。 解析:(1)EcoRⅠ酶切目的基因和载体,在切口处形成粘性末端;DNA连接酶使具有相同粘性末端的两个片段形成磷酸二酯键,能获得重组 质粒。 (2)目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为转化。经转化的农杆菌,在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,以使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态。 答案:(1)粘性末端磷酸二酯键 (2)转化使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态 1.基因工程的工具 2.基因工程的原理与操作步骤 (1)基因工程的原理 ①基本原理:让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳定和高效地表达。 ②基本要素:多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等。 (2)基因工程的基本操作步骤 3.形成重组DNA分子 (1)单酶切法