平滑肌细胞原代培养、传代、冻存方法及所需试剂
01年中国现代医学杂志贴壁法原代培养
1.1细胞培养
1.1.1培养液配制DMEM(美国Corning Cellgro公司),Hepes(15mmol/L),青霉素(100u/ml),链霉素
(100mg/ml),优质胎牛血清(原代培养浓度20%,传代培养浓度10%,上海普飞澳洲胎牛血清)。
1.1.2培养器皿25cm2塑料培养瓶(Costar),培养面积25cm2;直径3.5cm培养皿。
1.1.3大鼠血管平滑肌细胞培养动物来源:健康Wistar大鼠,由第三军大学实验动物中心提供,雌雄不拘,体重150~180g。动脉取材:断颈法处死Wis-tar大鼠,无菌条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml的无菌生理盐水中。每次取材2~3只大鼠。贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织,剥除动脉外膜。纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗,去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞,然后将一次取材的2~3条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。滴加少许培养液使组织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1mm×1mm大小的组织块。并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5cm。盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液,于37℃孵箱内放置2~4h使组织块干涸并与瓶壁贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置培养3~5d。待有细胞从组织块周围游出后换液。
1.1.4原代培养动脉VSMC的传代培养当大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代。加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面,室温下大约1~2min,倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶使细胞脱离消化液,吸弃消化液,加入含胎牛血清培养液3~4ml终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁,分散为单细胞悬液。将细胞悬液一分为二接种到新的培养瓶中,补足培养液(每瓶3~4ml)。未消失的组织块会随细胞换液、传代而除去。
1.3培养细胞的鉴定
1.3.1形态学用相差显微镜常规观察细胞生长形态及生长规律,并依常规制作电镜标本进行观察。
1.3.2免疫组织化学鉴定特异性鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(福建迈新生物技术公司),采用SP法对细胞爬片进行免疫组织化学染色。（α-SM-actin免疫组织化学鉴定）
04协和中国动脉硬化杂志胰酶消化法培养平滑肌细胞
1.1试剂和动物
胰酶购自Corning Cellgro公司;α-actin抗体购自中山生物技术有限公司;PBS购自Corning Cellgro;新生小牛血清购自HyClone，DMEM为Corning Cellgro产品。雄性Wistar大鼠(2只,体重175±25 g)购自中国医学科学院实验动物中心。
1.2胰酶消化法原代培养
Wistar大鼠处死,迅速取出胸主动脉,浸泡在含无菌PBS的表面皿中,转移到无菌超净台。在表面皿中漂洗主动脉去除残留的血迹,纵向剪开主动脉,把主动脉铺平并使内膜朝上,用镊子来回刮除内膜层,剥离血管中膜。将剥离的血管中膜用眼科剪
剪碎,碎片大小在1 mm×1 mm左右。装入含0.25%胰酶的玻璃培养瓶中于37℃条件下消化。当在显微镜下观察组织块表面出现大量细胞时应立即加入血清终止消化,一般消化的时间在3.5 h。终止消化后将玻璃培养瓶置于37℃空气摇床振摇10 min,继续用吹打的方法使组织块表面的细胞尽可能脱落。待细胞从组织块脱离后,120目细胞筛过滤,转入离心管内离心,弃上清,用含20%小牛血清的DMEM培养基吹打细胞,最后接种于25 mL培养瓶,放入CO2孵箱培养,48 h后换液。
1.3传代培养
细胞融合后,倒去旧的培养液,加入适量的0.25%胰酶,显微镜下观察,见细胞收缩后去除消化
液,加入适量培养液,吹打细胞,以1∶2接种于新培养瓶中,补足培养液,放入37℃、5%CO2孵箱培养。传代细胞从第三代开始可换用含10%小牛血清的DMEM培养基培养。VSMC至少可以传16代以上,并且从第二代开始平滑肌细胞即可冻存。
1.4动脉平滑肌细胞的鉴定
相差显微镜下,细胞未汇合之前多数呈梭形,至汇合后,部分区域细胞束状排列,呈典型的“峰和谷”状态。将传代获得的平滑肌细胞接种于盖玻片上,3~4天后至亚汇合状态,取出细胞爬片,PBS清洗后用4℃纯丙酮固定15~30 min,自然晾干。采用小鼠抗大鼠α-肌动蛋白抗体免疫组织化学染色鉴定VSMC肌动蛋白。根据S-P 免疫组织化学染色的常规方法,以平滑肌细胞胞浆棕黄色为阳性结果。
05重庆医学/基础医学与临床
1材料与方法
1.1材料9~12d新生健康清洁级KM小鼠,雌雄不限,购自重庆医科大学实验动物中心。RPMI-1640干粉培养基,D-Hanks粉,标准胎牛血清（购自上海普飞生物公司澳洲胎牛血清）,胰蛋白酶粉(1∶250)均购自Corning Cellgro公司;青霉素钠、硫酸链霉素购自华北制药厂;鼠抗兔平滑肌α肌动蛋白单克隆抗体,购自Zymed公司;SP免疫组化试剂盒,DAB显色试剂盒购自北京中山生物技术公司。
1.2细胞培养断颈处死小鼠,75%乙醇浸泡消毒2min,分离取出胸主动脉,D-Hanks液清洗去除血污,获干净光滑的血管段,用眼科镊固定血管段端,刀片轻刮去外膜结缔组织,再用眼科剪小心剖开血管,刮去内膜层细胞,将血管段剪成1mm×1mm大小的组织块,均匀贴放于25ml培养瓶底面,组织块间隙约2~3mm,加入含10%胎牛血清的1640培养液2~3ml,轻晃培养瓶使培养液掠过组织块,翻转静置于37℃、5%CO2培养箱中3~4h,再次翻转培养瓶使组织块浸没于培养液中,半开放式绝对静置培养3d,4~5d时首次换液。当组织块周围外长的细胞相互汇合,逐渐铺满整个瓶底时,需进行首次传代:吸弃旧培养液,D-Hanks液2ml清洗后吸弃,加0.25%(g/L)胰酶液2ml在37℃下消化,2~5min后镜下观察,当细胞回缩、间隙增大时,吸弃胰酶液,加入含10%胎牛血清的1640培养液4~6ml终止消化,反复吹打瓶壁细胞,形成的细胞悬液按1∶2接种(消化后脱落的组织块可一并传入新培养瓶中)。以后的传代方法相同,传代周期为5~7d。
1.3细胞纯化
1.3.1自然纯化法由于进行了前期的血管预处理(去除了大部分内膜和外膜组织),原代培养时虽为多种细胞混杂生长,但平滑肌细胞仍占绝大多数。随着传代次数的增加,平滑肌细胞可排挤其它细胞的生长而优势增殖。
1.3.2机械刮除法虽然去除了大部分内膜组织,但培养中仍可见内皮细胞的小
范围生长。传代前在镜下用记号笔在培养瓶表面划出内皮细胞生长区域,用弯头吸管在该区域内反复推刮、破坏细胞,吸弃培养液后再进行传代。
1.3.3差异贴壁法残留的内膜和外膜组织中含有少量的成纤维细胞,参阅李悦梅等[1]的方法去除:传代时,将消化吹打形成的细胞悬液静置15min,使部分细胞贴壁,转移培养液至下一个培养瓶中,再次静置、贴壁,重复上述步骤1~2次,最后一个培养瓶中可获较纯的平滑肌细胞。（根据不同细胞贴壁的时间差纯化细胞）1.4细胞鉴定
1.4.1形态学观察应用倒置相差显微镜观察细胞大小、形态、生长特点及排列方式等。
1.4.2免疫细胞化学染色将第5代对数生长期的细胞悬液接种到预先放置2张7mm×22mm盖玻片的培养瓶中,培养2~3d后,取出盖玻片,PBS漂洗5min×3次,4%多聚甲醛室温
下固定20~30min,PBS再次漂洗5min×3次,然后按照SP免疫组化试剂盒和DAB 显色试剂盒说明书逐条进行操作(一抗是鼠抗兔平滑肌α肌动蛋白单克隆抗体)。细胞培养的几点技巧:①相同条件下,小龄动物较大龄动物的组织块有更好的增殖潜能,但动物体积过小又存在取材困难,组织量少的问题,采用9~12 d新生小鼠取材,既能对血管进行顺利操作,又能保证约90%的组织块有细胞外长。②细胞生长具有接触抑制和密度依赖性,一般取2~3只小鼠的胸主动脉组织块均匀接种于25 mL培养瓶中,间隙约2~3 mm。当部分组织块周围细胞密集、重叠,停止增殖时,即使整瓶细胞未达到传代标准,仍可用酶消化,吹散密集细胞,1∶1方式传代生长。
③原代培养初期,当部分组织块漂浮未贴壁,可将其重新摆放至瓶底,翻转干涸2~3 h后,再浸没于培养液中,使其重新贴壁。该法不会影响同瓶中其他已萌出细胞的生长。④小鼠主动脉极细,操作时动作一定要轻柔,避免对血管的过度损伤。一般受牵拉少,剪切时边缘整齐圆滑的组织块萌出细胞的概率较大。⑤细胞传代时,酶消化时间不应固定或硬搬他人经验,应在镜下观察,至胞质回缩,间隙增大时及时终止消化。
细胞原代培养的常用方法有酶消化法和组织块法,酶消化法培养周期短,但酶作用时间不易掌握,且消化酶本身对培养细胞有毒性作用,可致培养失败;组织块法虽培养周期相对较长,但操作简便,污染机会小,培养效率高[3,4]。本研究中由于新生小鼠主动脉细小,可供培养的组织量少,于是采用了组织块培养法。
07滨州医学学报改进的脐动脉血管平滑肌贴块培养法
用DMEM培养液反复冲洗,以去掉血管内外的血迹,用眼科镊小心分离下动脉外的结缔组织及血管外膜,然后用眼科剪纵向剪开血管,再用眼科剪将中膜和内膜剪成约1~2 mm2大小的组织块,用弯头吸管将血管小块移入25 cm2塑料培养瓶,并以4~7块/cm2的密度均匀排列于
培养瓶底(培养瓶底提前用培养液湿润),翻转后加入含有青霉素和链霉素及20%胎牛血清的DMEM培养液约3~5 m,l放入37℃、5%CO2培养箱内(湿度100% ),贴壁2~3 h后再轻轻翻转培养瓶,使组织块浸入到培养液中,开放式培养,一周后取出观察并换液。
1.2. 2胎儿脐动脉血管平滑肌细胞的传代培养:细胞生长融合后,用0. 125%的胰蛋白酶消化传代。先将胰蛋白酶放入37℃水浴箱预热。用吸管将组织块从培养
瓶底轻轻吹打下来,可以将组织块重新移入另一培养瓶继续贴块法培养。用无血清的培养液将培养瓶底冲洗两遍,洗掉残留的血清,然后迅速加入预热的胰蛋白酶,放回培养箱,每隔 2 min观察一次,并轻轻拍打培养瓶壁,使细胞从瓶底脱落下来,待镜下观察多数细胞收缩变圆后,向培养瓶中加入含血清的培养液,终止胰蛋白酶的作用,再用吸管轻轻吹打培养瓶底,使细胞脱落,然后将培养瓶中的
液体移入离心管, 500 r/min,离心10 min后,弃上清液,然后加入含有10%胎牛血清的培养液将沉淀制成均匀的细胞悬液,按1∶2的比例将细胞悬液移入培养瓶,放回培养箱继续培养。
1. 2. 3血管平滑肌细胞的鉴定:
取常规传代的细胞,制成均匀的细胞悬液后,移入放有盖玻片的培养皿中培养,待细胞贴壁伸展,生长良好后取出盖玻片,用PBS冲洗2遍,凉干,放入4%的多聚甲醛中固定, 30% H2O21份+纯甲醇50份混合,灭活内源性过氧化物酶,然后热修复抗原,再分别滴加5%BSA封闭液、一抗[即抗平滑肌α-肌动蛋白(α-actin)的单克隆抗体]、生物素化山羊抗小鼠IgG、试剂
SABC,最后DAB显色,苏木素复染,酒精梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察。
2结果
2. 1体外培养的胎儿脐动脉血管平滑肌细胞的形态观察实验中观察到脐动脉组织块贴壁后5~7d可见有细胞以垂直方向从组织块周围游走出来(见图1),但并不是所有的组织块周围都有细胞游出,离组织块较远的区域也可以看到细胞,此为平滑肌细胞的漂移性生长特性(见图2),细胞形态多样,大小不一,多为长梭形、菱形或星形; 9~11 d细胞进入对数生长期,细胞生长加速,部分区域可见“峰-谷”样生长(见图3);约2周左右细胞融合成片,甚至相互交叉生长形成多层可以进行传代培养。细胞用胰蛋白酶消化后呈圆形,传代接种于培养瓶4 h就有细胞贴壁, 24 h后细胞伸展,细胞形态多样,胞浆丰富,仍然呈“峰-谷”样生长特性,细胞生长较快,
5~7 d长满瓶底,可以进行传代。
本实验取材于脐动脉,采用贴块法成功培养出平滑肌细胞。脐动脉是中动脉,中膜中唯一的细胞是平滑肌细胞,内膜中唯一细胞的是内皮细胞,实验中只去除血管外膜,保留中膜和内膜,将中膜和内膜一起培养,摒弃了传统平滑肌细胞培养实验中单纯培养动脉中膜的模式,将平滑肌细胞和内皮细胞联合培养,不但节约了接种时间,而且减轻了对平滑肌细胞的机械损伤,更有利于原代细胞的游出。本实验将去掉内膜的组织块与未去掉内膜的组织块同时培养,比较发现,未去掉内膜的组织块首先游走出细胞,而去掉内膜的组织块生长周期很长,甚至组织块死亡,没有细胞游出。在原代培养时,可以看到内皮细胞从组织块中游走出来,但随着原代培养的进行,内皮细胞不断的被平滑肌细胞所覆盖,又因在传代过程中,内皮细胞处于最底层而不易被消化下来,所以内皮细胞被淘汰,平滑肌细胞得到纯化。另外,脐动脉为中动脉,内膜中的内皮是单层扁平上皮,很薄,只由一层内皮细胞组成,而中膜较厚,由10~40层环行排列的平滑肌细胞组成,显然,平滑肌细胞的数量占有绝对优势;而且参考相关资料和文献[6, 7],发现内皮细胞的培养大多数用酶解法,没有用贴法的,因此,不用担心此方法培养平滑肌细胞会被内皮细胞污染。
[6]鄂征.组织培养[M].北京:北京出版社, 2001: 29-30.
[7] R. I.弗雷谢尼著.章静波,徐存拴译.动物细胞培养———基本技术指南[M].第4版.北京:科学出版社, 2004: 450-451.
实验中发现,平滑肌细胞对温度要求特别严格,培养箱内的温度必须为(37±0. 5)℃,而成纤维细胞在(35±0. 5)℃就可以生长。另外,在原代培养中组织块的密度要尽量大,因为组织块之间可以产生微量的相互作用;而且所用的眼科剪必须锋利,以减少对组织块的机械损伤,还可以保持组织块周围的整齐,利于细胞游走出来。在原代培养换液时,为避免将组织块晃动下来,可以先将培养瓶翻转过来,换液完成后再将培养瓶翻转。在传代时,必须把胰蛋白酶的温度控制在37℃,使其活性最大,保证最大程度地把细胞消化下来。
06江西医药平滑肌细胞培养的综述
2.1平滑肌细胞培养技术
有文献认为组织块+酶消化法,能够缩短培养时间,更易获得大量较纯的原代细胞,方法是:将剪碎的平滑肌组织块用0.1%胶原酶37℃消化0.5～1h后,再接种于培养瓶壁上,37℃培养箱中静置2～4h,待组织块贴壁牢固后,再补加含胎牛血清的培养液,37℃继续静置培养。此种方法细胞游出贴壁时间比传统组织块法短1～2d,可能是由于组织块被胶原酶消化后其细胞间质变得疏松,细胞容易挣脱间质束缚而萌出的缘故[6] （唐槐静,段胜仲,等.胎儿动脉平滑肌细胞培养方法的研究.湖北医科大学学报,1999,20(2):89）
2.2平滑肌细胞的生物学特性
2.2.1平滑肌细胞生长过程:不同种类的平滑肌细胞培养具有相似的生长过程。贴块法培养的平滑肌细胞,3～7d开始以垂直方向从组织块边缘迁移萌出;6～7d细胞进入对数生长期;7～10d当组织块中大部分细胞萌出后,组织块便自行脱离,其周围细胞密度更加增大,部分区域细胞相互接触交替生长,出现“峰-谷”结构(峰:即多层细胞丘,可达8～10层,谷:即稀疏排列的单层细胞处,甚至无细胞处),这是平滑肌细胞的特征性生长表现;10～14d细胞相互融合。传代细胞的生长特性与原代细胞基本相同,细胞传代的间隔期一般为6～9d,传代开始时细胞呈圆形,不透明,边缘清楚,而后逐渐伸展贴壁,透明度增高,周界不清,呈典型“峰-谷”样生长。
酶消化法培养的平滑肌细胞,培养1d后,大部分细胞已贴壁,换液后继续培养3d,贴壁细胞完全伸展,多数呈长梭型,细胞伸出较长的突起相互接触,部分区域可见典型的“峰-谷”结构,培养7～9d细胞铺满瓶底。培养细胞达铺满状态所需时间与细胞活力和细胞接种密度有关,细胞活力愈大,接种密度愈大,达到铺满状态所需时间愈短[7～8]。
2.2.2平滑肌细胞形态学特征:许多研究证实,体外培养的平滑肌细胞具有与体内平滑肌细胞相同的形态学特征。倒置显微镜下观察细胞形态,未贴壁前细胞呈圆形或椭圆形,胞质密度高,不透明,胞核多为卵圆形,有多个核仁,贴壁后细胞胞质透明,彼此融合在一起,细胞呈梭形或多角形,核居中央,呈椭圆形。透射电镜下观察,细胞呈不规则形态,核呈锯齿状,胞浆内含平滑肌细胞特征性结构肌丝和密体,粗面内质网扩张,游离核糖体丰富,基膜下有密斑。扫描电镜下可见细胞呈带状,平行排列,细胞周边常发出许多丝状突起与相邻细胞的丝状突起交织成网状。此外,在细胞表面还可见许多疏密不等的小泡,可能为平滑肌细胞收缩运动时胞浆外突的形态表现[9,10]
02 动脉平滑肌细胞培养的几个问题
组织块大小边缘密度翻面时间观察时间对原代细胞萌发的影响
对于贴块法的原代培养来源,由于细胞并非直接获得,而是从组织块边缘长出,其中有一“突破过程”,且细胞萌发后尚需一定的细胞密度才能使其存活、增殖,故组织块大小、边缘、密度均影响细胞萌出与否及细胞存活、增殖。公认的方法是将血管剪成1 mm2大小组织块[1~3]。张映娜等认为组织块0.5~2 mm2范围内,大小影响不大(可调整翻瓶时间以保证组织块贴壁)[4]。但如组织块超过 2 mm2将增加细胞萌出的阻力。而组织块边缘整齐、光滑、密度
亦对细胞生长起着重要作用。组织块边缘过度受损或毛糙不平及组织块密度过稀或重叠将使细胞很难萌出。作者认为剥除内膜、外膜时用力适中,避免机械拉伤,将镊子夹过处切去,剪切时力求一次剪断。切组织块时不要离开培养液操作,保持边缘湿润,组织块密度以中瓶(100 ml)铺放取自6~8只150~250 g大鼠胸主动脉剪碎组织为宜,而小瓶(70 ml)则以3~4只为佳,且相同重量的大鼠,以月龄较小者为优。翻面时间一般认为3~6 h,具体时间应根据上述影响因素摸索而定。一般5~7 d 后观察可见细胞从组织块边缘呈放射状长出,但5 d内不宜移动,以免贴壁的组织块脱落,脱落的组织块很难有细胞的萌出。
适宜的消化
一般认为细胞传代消化以细胞成片收缩,变圆变亮,细胞间隙增大时为宜。它主要取决于胰蛋白酶的浓度,pH值、温度、作用时间,而各实验室报道不一[5~7]。过高浓度的胰蛋白酶达到适宜标准的时间短,仅数十秒,不易控制,易使消化过度,浓度过低达到适宜标准的时间过长,易严重损伤细胞膜,细胞难以贴壁。通过实践摸索,作者认为加入0.05%胰蛋白酶和0.02%的EDTA混合液在温箱内孵育2~3 min 即可达到合适的消化度,0.03%的胰酶和0.02%的EDTA混合液亦可达到同样效果,需及时取出观察,终止消化。实验中还应根据传代后死细胞多少而做适当调整。作者通过对大鼠主动脉平滑肌细胞培养的长期摸索与实践,优化培养方法,使组织贴块法更经济实用,为研究提供大量遗传性质均一、功能状态良好的细胞。
第一次传代时机
一般的培养方法是选取细胞达亚融合状态时进行传代[1~3]。但贴块法原代培养时细胞生长往往不均匀,经常是一些区域已长成致密细胞层,一些区域仍未见细胞生长,这种情况下,当整瓶细胞达亚融合时,致密细胞层已老化。作者通过摸索,认为当原代培养5~7 d后可移出孵箱观察,如培养液变黄可部分换药继续培养,每隔2 d 观察一次。瓶中若有部分区域达到亚融合状态即可传代,或到10 d左右仍未达到亚融合状态,但达到50%左右融合亦可进行传代,为保证传代细胞密度可将细胞传至小体积培养与封闭培养相结合。
07 中医儿科杂志
1.2细胞培养方法
1.2.1原代培养
Wistar大鼠20只,断颈处死后,浸泡在75%酒精中5 min,移入超净工作台,在无菌盒盖上迅速取
出心肺组织与胸主动脉,在含青霉素100 U/mL、链霉素100μg/mL的无菌PBS液的培养皿中,冲洗2次,迅速分离出主动脉和肺动脉,并仔细剥除纤维层和外膜。更换培养皿,用眼科剪沿纵行剖开,内膜面向上,用眼科弯剪自上而下轻刮2～3遍,以去除内皮细胞。然后再换培养皿,加1滴DMEM,反复剪切成1 mm3小块(剪切10 min左右)。每只大鼠血管组织块可接种3个25 mL培养瓶,瓶内加入3 mL含20%新生牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100μg/mL的DMEM培养液,翻转湿润瓶
底,然后瓶底向上,用尖吸管从培养皿粘吸出小组织块,摆放在培养瓶底,小块相互间距离以0.5 cm为宜。轻翻转培养瓶,令瓶底向上,置于37℃、5%CO2培养箱3～5 h,使小块微干涸;然后轻轻翻转培养瓶,令瓶底向下,让培养液慢慢覆盖于瓶底上的组织小块,置培养箱中静置培养,3 d换1次培养液[1]。
1.2.2传代培养
待原代培养的细胞从组织块长出,数量增加至细胞长满瓶壁或占瓶壁60%～80%时,即可进
行传代培养。吸弃原培养液,向培养瓶中加入PBS液洗净残留培养液,加0.125%胰蛋白酶2 mL,在室温中将培养瓶放于倒置显微镜下观察。待细胞回缩变钝变圆、细胞间隙增大后,立即直立或翻转培养瓶,吸除消化液,用含10%新生牛血清的培养液终止消化,用尖吸管反复吹打瓶壁细胞,使之脱落瓶壁并形成细胞悬液,再分装接种入培养瓶,根据细胞密度按1:2或1:3分装,3 d换液1次,4～6 d再传代。
07中国心血管病研究杂志大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定
1材料与方法
1.1材料SD大鼠体重90～120 g，雌雄不限，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。DMEM高糖培养基、新生牛血清购于上海普飞生物公司澳洲胎牛血清，胰蛋白酶购于美国Corning Cellgro公司，平滑肌肌动蛋白、SP-9000免疫组化染色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，其余试剂均为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1原代培养颈椎脱臼处死大鼠，75%乙醇浸泡5 min，超净工作台内开胸取胸主动脉，置于含有预冷PBS的培养皿中去除血污，获取干净光滑的血管段，去除外膜与内膜。在另一含少量培养液培养皿中，将中膜剪成1 mm2大小的组织块。用吸管将组织块贴于培养瓶底面，组织块间距2～3 mm。加20%新生牛血清的培养液2～3 ml，将培养瓶直立于37℃、5%CO2培养箱中，待4～6 h后组织块与培养瓶黏附后，平置培养瓶，4～5 d后首次换液。
1.2.2换液方法
细胞换液主要根据细胞生长状况及培养液的颜色变化决定。当细胞增殖旺盛，培养液由桃红色变成黄色时，需换液。弃去旧培养液加PBS液2 ml清洗后吸弃，再加入适量新鲜培养液，也可进行半量或2/3量换液。
1.2.3传代方法
弃去旧培养液后，PBS液清洗2次。向瓶内加入适量的0.25%胰蛋白酶液，在倒置显微镜下观察，当胞质回缩、细胞间隙增大时，加含血清的培养液迅速终止消化。弃去瓶内液体，加入含10%新生牛血清的DMEM培养液反复吹打瓶壁细胞，计数后分别接种到新的培养瓶内。
具体货号：
DMEM：http://去掉我https://www.wendangku.net/doc/e52971919.html,/product/info/224980?wenku
1640：http://去掉我https://www.wendangku.net/doc/e52971919.html,/product/info/225004?wenku
PBS：http://去掉我/https://www.wendangku.net/doc/e52971919.html,/product/info/225147?wenku
胰酶：http://去掉我/https://www.wendangku.net/doc/e52971919.html,/product/info/225169?wenku
胎牛血清：http://去掉我https://www.wendangku.net/doc/e52971919.html,/product/info/31022?wenku
双抗（青、链霉素）：http://去掉我https://www.wendangku.net/doc/e52971919.html,/product/info/225203?wenku
细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏
细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。
细胞传代培养
细胞传代培养（胰蛋白酶消化法） 具体操作： 一. 传代前准备： 1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。 6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 二.胰蛋白酶消化； 1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。 2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 三.吹打分散细胞： 1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。 4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 四.分装稀释细胞： 1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 五.继续培养： 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。 传代细胞培养注意事项： 1.严格的无菌操作 2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
RD细胞复苏、传代、冻存
RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞培养操作 1）复苏细胞：将含有1mL 细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL 培养基混合均匀。在1000RPM 条件下离心4 分钟，弃去上清液，加1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm 皿中，加入约8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。 2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。 1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS 润洗细胞1-2 次。 2. 加1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。 3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM 条件下离心4 min，弃去上清液，补加1-2mL 培养液后吹匀。 4. 将细胞悬液按1：2 比例分到新的含8ml 培养基的新皿中或者瓶中。 3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25 瓶为类； 1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入1ml 胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml 细胞悬液，注意冻存管做好标识。 3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，2h以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
细胞冻存和复苏实验
实验步骤一、材料准备 1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。 2. 玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸。 3. 塑料器皿：吸头、枪头、胶塞、移液管（10ml）、15ml离心管、冻存管（1～2ml）。 4. 其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。 5. 试剂：D-Hanks液、小牛血清、培养液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油。 二、细胞冻存 1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液。 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。 3. 离心1 000 rpm，5 min。 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml。 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml。 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。 三、细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。 3. 离心，1 000 rpm，5 min。
实验五 细胞的传代培养
实验5 细胞的传代培养 一、实验目的 熟练掌握动物细胞的传代培养法。 二、实验原理 哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。 三、仪器、材料与试剂 1仪器 CO2培养箱，倒置显微镜，超净台 2材料 培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，细胞。 3试剂 完全培养基（RPMLl640或DMEM），0.25%胰蛋白酶，D-Hanks液。 四、实验步骤 1.入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。 2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。 3.超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净。 4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气。 5.点燃酒精灯,取出无菌试管，刻度吸管；安上橡皮头；插在无菌试管内。 6.打开细胞培养瓶，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 7.倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。 8.加入胰酶消化液，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液。
9.加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7-10mL/大瓶，3-5mL/小瓶）制成细胞悬液，分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。 10.对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。 五、注意事项 1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。培养用液应严格分开。 2.每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。 3.如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。 六、实验报告 1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤？ 2.细胞传代培养的目的是什么？
组织细胞培养技术课程教学大纲
《组织细胞培养技术》课程教学大纲 课程编码：26990214 课程名称：组织细胞培养技术 英文名称：Cell and tissue culture technology 开课学期：第二学期 授课对象：统招硕士 开课院系：基础医学院 开课教研室：病理学与法医学教研室 学时：40 （其中理论学时：20 实验学时：20 ） 学分：0.5 课程类型：公共选修课（公共必修课/选修课/专业课） 选用教材：自编教材《组织细胞培养技术》 主要参考书：⑴鄂征主编. 组织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社，1994。⑵施新猷主编.实验动物学. 北京：人民军医出版社，2000。 大纲编写人员：张宏颖副教授 一、课程目的与任务 组织细胞培养技术是研究组织和细胞的技术方法，被培养的组织和细胞也是实验研究的对象。本课程是医学临床与基础专业硕士研究生的公共选修课程之一，在医学各专业高级人才培养中具有重要地位。本课程系统介绍了组织和细胞培养技术有关的概念、基本原理、操作程序和关键技术，及其在医学研究和临床实践中的应用，该领域的研究历史和最新发展动态；转基因动物技术的概念、研究进展、技术方法、建立方法、应用及前景展望。旨在提升医学专业硕士研究生的知识结构，掌握现代生物技术中的基本实验技能，培养学生开拓创新的能力，适应未来学科发展对人才的需求。 二、教学基本要求 本课程系统地论述了组织细胞培养技术的理论和方法，简要介绍了转基因动物技术及应用。要求学生全面系统地掌握组织细胞培养的操作过程，了解各种操作的基本原理；有判定细胞生长好坏和是否发生污染的能力；熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞的生物学性状和与此有关的基本理论知识，了解国内外细胞培养的最新动态和研究进展，了解转基因动物技术的概念、研究进展、技术方法、建立方法、应用，并能自行根据需要设计实验，运用所学技术解决科研中的实际问题，提高学生综合分析问题，系统利用专业知识的综合素质。 三、各章节内容及学时分配 第一章组织培养技术的基本理论知识（4.5学时） 目的与要求 1、掌握组织培养基本概念；了解对组织培养的评价；熟悉对组织培养工作者的要求和工作方法。 2、了解体内外细胞的差异与分化；掌握培养细胞形态分类及培养细胞的大体形态；熟悉组织培养 细胞的生长和增殖过程。 3、熟悉培养细胞生存环境和条件。
细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP)
细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP) 背景知识： 细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特*都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。 原理： 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透*，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 主体内容（操作步骤）： 一、材料 （一）仪器 1. 净化工作台 2. 离心机 3. 恒温水浴箱 4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃） 5. 倒置相差显微镜 6. 培养箱 7. 液氮冰箱 （二）玻璃器皿 1. 吸管（弯头、直头） 2. 培养瓶 3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 4. 废液缸 （三）塑料器皿 1. 吸头 2. 枪头 3. 胶塞 4. 移液管（10ml） 5. 15ml离心管 6. 冻存管（1～2ml） （四）其他物品 1. 微量加样枪 2. 红血球计数板 3. 记号笔 4. 医用橡皮膏 5. 移液枪 （五）试剂 1. D-Hanks液
2. 小牛血清 3. 培养液 4. 双抗（青霉素、链霉素） 5. 胰蛋白酶（0.08%） 6. 1NHCl 7. 7.4%NaHCO3 8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油 四、操作步骤 （一）细胞冻存 1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液； 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、； 3. 离心1000rpm，5min； 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml； 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml； 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。（二）细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀； 3. 离心，1000rpm，5min； 4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养； 5. 次日更换一次培养液，继续培养。 五、注意事项 1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤； 3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养程序 材料 A、仪器 1. 净化工作台， 2. 离心机， 3. 恒温水浴箱， 4. 冰箱（4℃） 5. 倒置相差显微镜， 6. CO2培养箱， 7. 振荡混合仪 8. 酶联免疫检测仪，9. 移液枪，10. 电磁力搅拌机，11. 微孔滤器 B、玻璃器皿 1. 吸管， 2. 小烧杯（100ml）， 3. 废液缸， C、塑料器皿 1. 吸头， 2. 枪头， 3. 96孔培养板， 4. 15ml离心管， 5. 50ml离心管， 6. 胶塞， D、其他物品 1. 微量加样枪， 2. 红血球计数板， F、试剂 1. D-Hanks液， 2. 小牛血清， 3. RPMI1640， 4. 双抗（青霉素、链霉素）， 5. 0.25%胰酶， 6.0.025% EDTA 7. 二甲基亚砜（DMSO）， 8. MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。 一、原代细胞培养或细胞株（系）复苏培养： （一）细胞原代培养 1.贴壁细胞培养法： 1）、组织块培养法 将所取得的组织用含青霉素、链霉素400U/ml和400ug/ml的生理盐水漂洗2此，5分钟/次。取出组织尽可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加两滴小牛血清，用剪刀尽可能将其剪碎，用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁，倒置于37°、5%CO2条件下30分钟后将培养瓶正置，从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液（小
牛血清15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml），使组织块有培养液与其接触为准，轻轻放置于37°培养。待24小时候补液。 或小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。 其他方法：消化分离法、器官培养略 2.悬浮细胞培养法 对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。 （二）细胞株(系)细胞复苏培养 细胞复苏的主要操作步骤 (1)佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。 (3) 然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。 (4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。 注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生
细胞传代实验报告
细胞传代培养 一.实验目的 初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的 应用打下基础。 二、原理 从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生 长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接 观察 活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可 以与 体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较 经济， 因此成为生物学研究的重要手段。 细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养 为 原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞 分散 后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养， 传 代培养的累积次数就是细胞的代数。 细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受 温度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌 操 作是细胞培养成败的关键。 三、材料和试剂 1、细胞：293细胞株 2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清） 3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml玻璃吸管、酒精 灯等 四、操作步骤 1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。 2、加入1~2ml 0.25％胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。 3、马上吸走胰酶液，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入 培养箱中消化几分钟 4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代 5.根据确定的比例来取需要的量（剩余的细胞拿来做细胞计数），加入4ml左右的培养液 6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱 7.收拾整理超净台 附：消化液配制方法： 称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l，滤器过滤除菌，4℃保存， 用前可在37℃下回温。 10x pbs配方：na2hpo4(14.2g) kh2po4(2.32g) nacl(80g) kcl(2.02g) (调至ph=7.4） 五、实验结果
组织细胞培养
组织细胞培养概述 组织细胞培养一般泛指所有的体外培养，包括组织培养、细胞培养和器官培养。其中，组织培养（Tissue Culture）指从活体内取出组织，模拟体内生理环境，在体外无菌、适当温度和一定培养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能的方法。细胞培养（Cell Culture）则是指离散细胞的培养，这些细胞通过酶学的、机械的或化学方法从来源组织中获得，培养物是单个细胞或细胞群。器官培养（Organ Culture）是指以器官的原基、器官的一部分或整个器官为培养物，应用与组织培养相似的条件，使培养物保持着体内组织部分或全部组织学特征，在体外生存、生长并保持一定的功能。组织培养与细胞培养并无严格区别，组织培养可出现细胞单一化现象，即趋向变成单一类型细胞，最终也变成了细胞培养。细胞在培养过程中的生命活动是互相依存的，呈现着一定的“组织”特性。 （一）体外培养方式的分类 体外培养可分为原代培养和传代培养。原代培养，又称初代培养（Primary Culture），即对从生物体内取出的细胞、组织和器官进行实效培养的过程，这样的细胞称为原代细胞，通常只能培养10-50代左右即退化死亡。传代培养（Passage Culture），是指无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶。原代培养物经首次传代成功后即为细胞系（Cell Line）。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line），而已获无限繁殖能力能够持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞的亚系（Subline）。 （二）体外培养细胞的分型 根据离体细胞在培养皿中生长时是否贴壁，可将体外培养细胞分为贴壁型和悬浮型两类。 1.贴壁型细胞：培养细胞需贴附在支持物上生长，大多数细胞属于此型，也称锚着依赖性细胞（anchorage-dependent cells）。细胞贴壁后，分化现象常变的不显著，易失去原有组织特征，形态上表现单一化。主要包括①上皮细胞
《细胞实验》02 原代细胞培养和传代培养的方法
原代细胞培养和传代培养的方法 原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织
已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。 传代培养法 原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时 也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 原代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 原代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。
细胞传代培养标准操作规程
细胞传代培养（消化法）标准操作规程 一、原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 二、材料和试剂 1. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS) 2. 胰酶-EDTA溶液(0.05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na): 以10ml分装于15 ml无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。 3. 新鲜培养基 4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 三、操作步骤 1. 传代前准备 （1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 （2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 （3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 （4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 （5）准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。 （6）取出预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 （7）从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 （8）打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 2. 胰蛋白酶消化 （1）加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
（2）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 （3）吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 3. 吹打分散细胞 （1）吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 （2）吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 （3）平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8 分钟。 （4）弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 4. 分装稀释细胞 （1）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 （2）分装：将细胞悬液吸出分装至2～3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。（3）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。 5. 悬浮型细胞的传代 （1）吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。 （2）吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。 注意事项： 1.严格的无菌操作。 2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
常规细胞培养方法(原代培养和传代培养)
原代上皮细胞与原代成纤维细胞培养的分离纯化 2010-12-02 10:29 来源：PriCells 点击次数：335 关键词：上皮细胞成纤维细胞培养分离纯化 分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网 PriCells- 原代上皮细胞与原代成纤维细胞培养的分离纯化 原代细胞、传代细胞绝大多数都呈混合生长，既有上皮样细胞又有纤维样细胞，纤维样细胞又包括成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、滑膜细胞等。混杂的细胞会直接影响实验结果。 在体外培养原代细胞时，为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性、和可重复性，要求采用单一种类细胞来进行实验，这样才能对某一细胞的功能、形态等变化进行一系列研究，因而培养细胞的纯化就成为实验研究的重要一步，甚至需要从混杂的细胞群中分离出单个细胞来进行培养和开展实验研究。 一、原代细胞增殖优势纯化方法：
自然纯化是利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺盛的细胞，达到细胞纯化的目的。但这种方法常无法按照需要和实验要求及研究目的来选择细胞。此法花费时间长，留下的往往是成纤维细胞。仅有那些恶变的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过此方法而保留下来的，不断纯化而建立细胞系。 二、原代细胞常用纯化方法： 人工纯化是利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。 1 、细胞时间差酶消化法： 酶消化法是比较常用的纯化方法，不仅对贴壁细胞可行，能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，是两者分开，达到纯化的目的；另外对贴壁细胞与半贴壁细胞及黏附细胞间的分离纯化也是十分有效的。
Hela细胞传代培养
Hela细胞传代培养
Hela细胞传代培养 实验目的：掌握动物细胞培养的基本原理和方法。 实验用具：每组用具（移液枪一把，一盒枪头，长吸管一包（4-6根），培养瓶1个【4－8人为一组，看细胞数量来定，传代比例1；2最多1：3】。 实验药品：0.25％胰酶，D－Hanks，1640培养基 实验原理： HeLa 是Henrietta Lacks的简称，Henrietta Lacks 是一位患有子宫颈癌的美国妇女的名字，在她死后，该细胞走被广泛散发到各研究机构，并无限次地繁殖分裂下去。 实验前的准备: RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素各100单位／毫升加三蒸水至 1000ml, 过滤除菌。调节pH值至7.2临用前加血清（终浓度 10％） 消化液的配置：
胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用灭菌的D－hanks配置。配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌 D－hanks配方: 氯化钠 8.0g 氯化钾 0.4g 磷酸氢二钠（Na2 HPO ·7H2 O） 0.06g 磷酸二氢钾0.06g NaHCO3 0.35 g EDTA二钠 0.2 g 酚红 0.02 g 三蒸水定容到1000毫升。PH调整到8.0。 血清的准备与添加 ●优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀 物，无细菌、支原体、病毒污染。 ●血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃水 浴，30 分钟 培养用具的准备： 所用器具高压灭菌，D-hanks缓冲液。 酶液，培养液。 实验步骤：
1.打开超净台，把实验中所需用具放到超净台上。 2.从冰箱中取出0.25％胰酶、培养基。可以把胰酶和培养基的瓶盖拧松备用。 3.取待传代的细胞，倒掉旧的培养基，移液枪加入胰酶2ml（加入的量以覆盖整个细胞培养面为宜）。轻轻摇动 4. 1-2分钟后迅速将消化液倒掉。 注意：此步消化时间需要根据每次培养的细胞不同状态灵活掌握，没有固定时间。消化时间长短是实验成败的关键，宁可短消化，不能过消化。否则细胞会变死。在倒置显微镜下观察，当细胞质回缩，胞间间隙加大为消化适宜。 5．取培养基5 ml加入培养瓶终止消化，轻轻摇动，如果瓶壁依然有细胞未脱落，用长吸管反复轻轻吹打培养瓶壁，制备细胞细胞悬液。吹打的部位均匀，从上到小，从左到右，顺序进行吹打，保证各个部位的培养细胞均能吹打到，成片的细胞已经分散成小的细胞团或者单细胞便停止吹打。吹打时用力不要过猛，尽量不要出现气泡，以免损伤细胞。 6．至所有细胞从培养瓶壁脱落下来，轻轻摇匀，
BHK-21传代细胞培养
BHK-21 传代细胞培养 BHK 是仓鼠肾细胞 ［原理］ 细胞在培养瓶壁上长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。 ［材料和试剂］ 1、细胞：贴壁BHK-21 细胞株 2、试剂：0.25％胰蛋白酶、配制好的DMEM 培养液、小牛血清、双抗溶液、7.5%碳酸氢钠 3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、胶塞、量筒、注射器、针头、酒精灯、污物缸等［操作步骤］ 1、应需要计算好培养液的总用量，按10%的比例加入血清，按1%的比例加入双抗。用7.5% 的碳酸氢钠调PH 至7.0~7.2 左右。 2、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 3、加入0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中为宜。 4、瓶口塞好胶塞，平放在实验台上。约2~3 分钟会看到贴壁细胞层出现细针孔空隙，赶紧 将胰酶弃去，加入少量培养液终止消化。 5、用注射器将贴壁的细胞反复吹打，使其均匀分散成悬液，再加入足量的培养液，分成两 到三瓶。塞好胶塞，置37 C温箱中继续培养。 细胞培养常用溶液的配制 青、链霉素溶液 青霉素钠盐（80万IU /瓶）5瓶 链霉素（100万IU /瓶）4瓶 将两者溶于400ml0.9 %的无菌生理盐水，分装小瓶，-20C保存。双抗在培养基中
的终浓度为100IU/ml 为宜。 二、7.5%碳酸氢钠溶液的配制 称取碳酸氢钠7.5g ，加入超纯水使总体积为100ml 。高压灭菌，分装于小瓶中，4C 贮存。 三、1%酚红溶液的配制 首先配制1mol/L的NaOH溶液。称取NaOH4.0 g,加入100ml超纯水，使NaOH 完全溶解，在室温或4C贮存（最好现用现配）。配制好NaOH溶液后，再称取1.0 g酚红置研钵中，加1mol/L的NaOH （不多于7.0ml），研磨使酚红完全溶解，加超纯水至100ml,高压消毒，在室温或4 C贮存。 四、0.25%胰蛋白酶溶液的配制 氯化钠8.0g 氯化钾0.2g 柠檬酸钠（Na3C6H5O7?5H2O） 1.12g 磷酸二氢钠（NaH 2PO4?2H2O）0.056g 碳酸氢钠 1.0g 葡萄糖 1.0g 胰蛋白酶（ 1 ：250） 2.5g 超纯水加至1000ml 放4C冰箱过夜，待胰蛋白酶充分溶解后，用0.2um微孔滤膜过滤除菌，分装于小瓶中，-20 C保存。 四、GIBCO 的低糖DMEM 粉剂配制： 1. 将干粉培养基倒入一干净的大容器内，先加入约终体积一半的超纯水；用水洗包装袋面 2 次，倒入培养液中，以保证所有干粉都溶解成培养液。磁力搅拌或人工搅拌使之完全溶解。 2. 根据包装袋上的说明补加所需量的丙酮酸钠、谷氨酰胺。 3. 加水定容到终体积。 4. 用无菌0.2um滤膜过滤除菌，分装于无菌血清瓶中， 4 C冰箱保存。同时将少量滤液装 到无菌瓶或接种细菌培养基，37C培养，48小时以后检查有无细菌生长。