基因工程讲义2015
《基因工程实验》讲义指导教师林陈水
浙江工业大学药学院
2015年11月
目录
实验一、质粒DNA的碱裂解法提取与纯化
实验二、DNA分子的限制性内切酶消化
实验三、聚合酶链式反应(PCR)扩增目的DNA
实验四、大肠杆菌感受态细胞制备及质粒DNA转化实验五、重组外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
实验六、表达蛋白的SDS-PAGE分析
实验一、质粒DNA的碱裂解法提取与纯化
一、实验目的与内容
1、细菌培养及菌体的收集、裂解。
2、碱裂解法提取质粒DNA。
二、实验原理
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，其重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
目前大部分实验室采用柱层析法纯化质粒DNA。操作步骤及注意事项详见试剂盒产品说明书。
三、试剂准备
1．溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5 mL，0.5M EDTA(pH 8.0)10 mL，葡萄糖4.730 g，加ddH2O至500 mL。在10 lbf/in2高压灭菌15 min ，贮存于4℃。
2．溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1 mL，10%SDS 1 mL，加ddH2O 至10 mL。使用前临时配置。
3．溶液Ⅲ：醋酸钾(KAc)缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300 mL，冰醋酸57.5 mL，加ddH2O至500 mL。4℃保存备用。
4．TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)1 mL，0.5M EDTA(pH 8.0)0.2 mL，加ddH2O至100 mL。高压湿热灭菌30 min，4℃保存备用。
5．苯酚(Tris-HCl(pH 8.0)平衡)、氯仿/异戊醇(24：1)
6．乙醇(无水乙醇、70%乙醇)
7．10×TAE缓冲液(pH8.0)：Tris 48.48 g，冰乙酸11.42 mL，EDTA3.72 g，定容至1000 mL。
8．溴化乙锭(EB)：10m g/ mL。本实验采用新型无致癌性的DNA染料代替。
9．RNase A(RNA酶A)：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10m g/ mL，TE配制，沸水加热15 min，分装后贮存于-20℃。
10．6×loading buffer(上样缓冲液)：0.25%溴酚蓝，40%(m/V)蔗糖水溶液。
11．0.8%琼脂糖凝胶：称取1.2 g琼脂糖于三角烧瓶中，加150 mL 0.5×TAE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右(不烫手)，加EB母液(10 mg/mL)至终浓度0.5 ug/mL(注意：EB为强诱变剂，操作时带手套)，轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30 min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中(电泳缓冲液0.5×TAE)，即可上样。
四、操作步骤
1．挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于3 mL LB(含相应抗生素)液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜(约12-14hr)。
2．取1.2 mL培养物入离心管中，室温离心10000 g×0.5 min，弃上清，将离心管倒置，用真空泵将上清液小心吸尽。
3．将细菌沉淀重悬于100 μL预冷的溶液Ⅰ中，涡旋振荡，使菌体分散混匀。
4．加200 μL新鲜配制的溶液Ⅱ，温柔颠倒6~8次混匀(切勿剧烈振荡)，使细胞膜裂解，冰浴3~5 min(溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)。
5．加入150 μL预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒6~8次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5 min(放置时间不可过长，为什么？)。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
6．4℃离心12000 g×5 min，小心移出上清于一新微量离心管中，加入200 μL 的苯酚和200 μL氯仿/异戊醇，振荡1 min混匀。
7．4℃离心12000 g×5 min，小心移出上清于一新微量离心管中，加入400 μL 氯仿/异戊醇，振荡混匀。
8．4℃离心12000 g×5 min，小心移出上清于一新微量离心管中(吸上清时注意估算体积)，加入2倍体积无水乙醇(为什么?)，混匀，室温放置2-5 min。
9．4℃离心12000 g×10 min，弃上清，1 mL预冷的70%乙醇洗涤沉淀1~2次，4℃离心12000 g×10 min，弃上清，将沉淀用滤纸或真空吸干。
10．沉淀溶于30 μL TE或水(含RNase A 20u g/ mL)，37℃水浴30 min以降解RNA分子，-20℃保存备用。
五、质粒DNA的电泳检测
观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。
取制备的质粒DNA 5~10 μL，加1/5体积的6×Loading Buffer混匀上样，采
用1~5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。
六、注意事项
本裂解法小量制备质粒DNA重复性好一般不影响进一步实验操作。若所提取质粒DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。
七、讨论
1．加入溶液Ⅱ后，为什么不能剧烈振荡？
2．为什么质粒DNA电泳呈现多条带？
实验二、DNA分子的限制性内切酶消化及电泳鉴定
一、实验目的
1．掌握限制性内切酶的作用。
2．学习琼脂糖凝胶电泳的方法。
二、实验原理
限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端(即粘端)的DNA 片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50 μL体积1小时内完全切开1 ugλ噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液(Buffer，10×、5×)和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。
三、实验准备
1．待消化的DNA片段：实验一制备得到的DNA
2．限制性内切酶及其缓冲液
3．琼脂糖
4．溴化乙锭EB(10m g/ mL贮藏液)
5．10×TAE缓冲液(pH8.0)：Tris 48.48 g，冰乙酸11.42 mL，EDTA3.72 g，定容至1000 mL。
6．加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%(m/V)蔗糖水溶液，4℃保存。
四、操作步骤
(一)、质粒DNA的酶解
1．将实验一纯化的并经过RNase A消化的质粒DNA作为DNA样品。
2．将清洁、干净、灭菌的Ep管编号，用微量加样器按表所示将各种试剂分别加入每个Ep管内。
3
或过夜)。
(二)、琼脂糖凝胶板的制备
1．琼脂糖凝胶的制备：准确称取琼脂糖，置于锥形瓶中，加入TAE稀释液。
2
的两端边缘封好，将有机玻璃内槽置于一水平位置，放好样品模板(梳子)。
3．将冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，使整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置，待完全凝固后，轻轻拔出样品槽模板。
(三)、加样
在一次性手套上用微量取液器将样品与1/5体积的6×Loadin g Buffer混匀，将上述样品分别加入胶板的样品小槽内。每槽加样量约10~30 μL。
(四)、电泳
加完样品后的凝胶板应立即通电进行电泳。样品进胶前，应使电流控制在5mA左右，样品进胶后电流为10mA左右(70~100V)，当溴酚兰染料移到距离胶板下沿约1~2cm处停止电泳。
(五)、取出电泳后的胶片，在紫外灯下进行观察、摄片，记录电泳结果。
五、注意事项
1．浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释以免酶变性。(思考原因？)
2．购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。
3．尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。
4．通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。
5．溴乙锭是强烈的诱变剂，并有中度毒性，使用时应带手套，电泳废弃物专门放置或处理，避免溴乙锭污染实验台，溴乙锭贮存液应避光保存。
六、讨论
1．影响限制性内切酶效率的因素有哪些？
2．琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子的原理是什么？
3．样品应放正极还是负极？为什么？
实验三、聚合酶链式反应(PCR)扩增目的DNA
一、实验目的
1．学习通过聚合酶链式反应(PCR)在体外大量扩增位于两段已知序列间的双链DNA区段。
2．掌握PCR仪的一般操作方法和步骤。
二、实验原理
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是体外酶促合成特异DNA 片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由高温变性模板→低温下引物与模板退火→适温下引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下(通常为93℃-94℃)使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶(Taq酶等)在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5′→3′方向延伸，合成DNA的新互补链。
PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA 片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：
(1)、生成双链DNA中的特异序列作为探针；
(2)、由少量mRNA生成cDNA文库；
(3)、从cDNA中克隆某些基因；
(4)、生成大量DNA以进行序列测定；
(5)、突变的分析；
(6)、染色体步移；
(7)、RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。
三、试剂准备
1．DNA模版
2．对应目的基因的特异引物
3．10×PCR Buffer
4．2.5 mM dNTPs：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5 mM
5．DNA聚合酶
四、操作步骤
1．在冰浴中，按下表将各成分加入一灭菌的PCR管中，混匀。视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．
一般：在94℃预变性3~5 min，进入循环扩增阶段：94 ℃30 s →℃30 s →72 ℃s，循环30，最后在72 ℃保温10 min,14℃保温2 min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：直接取5~10 μL电泳检测。
五、PCR反应体系的组成与反应条件的优化
PCR反应体系由反应缓冲液(10×PCR Buffer)、脱氧核苷三磷酸底物(dNTPmix)、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、寡聚核苷酸引物(Primer1，Primer2)、靶序列(DNA模板)五部分组成。各个组份都能影响PCR结果的好坏。
1．反应缓冲液：一般随Pfu DNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3室温)，1.5mM M gCl2。M g2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200μM时，M g2+为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加M g2+的浓度。在高浓度DNA及dNTPs条件下进行反应时，也必须相应调节M g2+的浓度。据经验，一般以1.5~2mM(终浓度)较好。
2．dNTP：高浓度dNTPs易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50~400μM的dNTPs。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTPs能与M g2+结合，使游离的M g2+浓度降低。因此，dNTPs 的浓度直接影响到反应中起重要作用的M g2+浓度。
3．DNA聚合酶：在100 μL反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR 反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时(如20 μL或50 μL)，一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。
4．引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：
(1)、引物的长度以15-30bp为宜，一般( G+C)的含量在40-60%，Tm值高于55℃［Tm=4n( G+C)+ 2n(A+T)］。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。
(2)、引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大
程度上影响着Taq酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。
(3)、人工合成的寡聚核苷酸引物需经PA GE或离子交换HPLC进行纯化。
(4)、引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体(primer-dimer)，二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25~0.5pM/ μL较好。
(5)、引物一般用TE配制成较高浓度的母液(约100μM)，保存于-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。
5．模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。虽然PCR可以用极微量的样品(甚至是来自单一细胞的DNA)作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用u g水平的基因组DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。
6．PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。
六、注意事项
1．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。
2．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
3．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
4．PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μM滤膜过滤除菌或高压灭菌。
5．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
6．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
7．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
七、讨论
1．步骤2中，为什么第一次变性要3~5 min？为什么循环结束后要在72℃下保温10 min？
2．新扩增出的DNA的量与哪个因素关系最大？
3．为什么[M g2+]对反应的特异性及产量有着显著影响？
实验四、大肠杆菌感受态细胞制备及质粒DNA转化
一、实验目的
1．学习感受态细胞的制备。
2．学习将外源基因导入细胞的方法。
二、实验原理
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-，M-)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。
本实验以E.coli JF1125菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pET质粒共保温，实现转化。由于pET质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Amp r)，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pET，则在含Amp 的培养基上不能生长。能在含Amp的培养基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了pET。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
三、实验准备
1．材料：E.coli JF1125菌株；pET质粒DNA(购买或实验室自制)；离心管(EP，eppendorf)。
2．设备：恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，分光光度计，微量移液枪。
3．LB液体培养基：胰化蛋白胨(细菌培养用)10 g，酵母提取物(细菌培养用)5 g，NaCl 10 g，加ddH2O至1000 mL，完全溶解，分装小瓶，湿热高压灭菌20~30 min。
4．1.5%琼脂LB固体培养基：称取1.5 g琼脂粉放入300 mL锥形瓶，加100 mL LB，高压灭菌20 min，稍冷却，制备平皿。
5．抗生素(Amp或Kan)母液：100m g/ mL。
6．含抗生素的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入抗生素母液，使终浓度为100u g/ mL，摇匀后铺板。
7．0.1mol/L CaCl2溶液：称取1.11 g CaCl2(无水，AR)，溶于适量去离子水中，定容至100 mL，高压灭菌。
8．含15%甘油的0.1mol/L CaCl2：称取1.11 g CaCl2(无水，AR)，溶于适量去离子水中，加入15 mL甘油，定容至100 mL，高压灭菌。
四、操作步骤
(一)、受体菌的培养
从LB平板上挑取新活化的E.coli JF1125单菌落，接种于3 mL LB液体培养基(不含抗生素)中，37℃200rpm振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100 mL LB液体培养基(不含抗生素)中，37℃，250rpm振荡培养2~3小时至OD600＝0.3~0.5左右(细胞数<108/ mL)。
(二)、感受态细胞的制备(CaCl2法)
1．取1 mL菌液于1.5 mL EP管中，3000 g离心5 min，弃上清(可用加样器将残余液体尽量除去)；重复一次。
2．用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液360 μL轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟后，4℃下1600 g离心10分钟。
3．弃去上清，再加入360 μL预冷的0.05mol/L的CaCl2，重悬细胞，于冰上放置15分钟，4℃下1600 g离心10分钟，弃上清，200 μL预冷的0.05mol/L 的CaCl2，重悬细胞，即制成感受态细胞(可于冰上保存一周)。
4．或弃去上清，加入200 μL预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，制成感受态细胞悬液，贮存于-70℃可保存半年。
(三)、转化
1．从-70℃冰箱中取200 μL感受态细胞悬液，冰浴中解冻。或直接用上述步骤3的感受态细胞悬液。
2．加入pET质粒DNA溶液2 μL(含量30~50n g)，轻轻摇匀，冰上放置30分钟。
3．42℃水浴中精确热击90秒或37℃水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却3~5 min。
4．向管中加入800 μL LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养1hr，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amp r)。
5．将上述菌液于1600 g下，离心10 min，弃去大部分上清液，留下约100 μL，重悬后涂布于含抗生素的筛选平板上，正面向上放置1~5 min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16~24hr。
同时做两个对照：
对照组1、以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5 μL 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
五、注意事项
1．实验所用的溶液最好用3次蒸馏的水配制，尽量在冰上操作。
2．所有与细菌接触的物品和液体都应是无菌的，重悬细胞时操作要轻。
六、思考与讨论
1．本实验成功的关键是什么？
2．制备感受态细胞及转化外源基因的机理是什么？
3．本实验中，抗生素的作用是什么？
实验五、重组外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
一、实验目的
1．学习构建重组基因工程菌的方法。
2．学习重组转化子的筛选及培养转化子细胞并诱导外源基因表达的方法。
二、实验原理
将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：
(1)选择标志的编码序列；
(2)可控转录的启动子；
(3)转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；
(4)一个多限制酶切位点接头；
(5)宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：
获得目的基因→准备表达载体→将目的基因插入表达载体中(测序验证)→转化表达宿主菌→诱导靶蛋白的表达→表达蛋白的分析→扩增、纯化、进一步检测。
三、试剂准备
1．LB培养基。
2．100mM IPT G(异丙基-巯基-β-D-半乳糖苷)：2.38 g IPT G溶于100 mL ddH2O中，0.22μM滤膜抽滤，-20℃保存。
四、操作步骤
(一)获得目的基因
1．通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点)，PCR循环获得所需基因片
段。
2．通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
(二)构建重组表达载体
1．载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳后，用胶回收试剂盒或冻融法回收载体大片段。
2．PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。
(三)获得含重组表达质粒的表达菌种
1．将连接产物转化大肠杆菌JM1125，根据重组载体的标志(Amp抗性或蓝白斑)作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
2．测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
3．以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
(四)诱导表达
1．挑取含重组质粒的菌体单斑至 3 mL LB(含Amp50u g/ mL)中37℃200r/m，过夜培养。
2．分别将100 μL菌液加入到2-5支含3 mLLB培养基的试管中，37℃200rmp 震荡培养至OD≌0.4~1.0(最好0.6，大约需3hr)。
3．取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养3hr。
4．分别取菌液1 mL，12000 g，30s收获沉淀，用50-100 μL水重悬菌体，待做SDS-PA GE等分析。
五、注意事项
1．选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。
2．融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。
六、讨论
诱导表达的步骤中为什么要在将菌体培养至OD≌0.4~1.0？
实验六、表达蛋白的SDS-PA GE分析
一、实验目的
学习应用SDS-PA GE技术检测蛋白质的方法。
二、实验原理
细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷、形状和分子量。强阴离子去污
剂SDS与还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，并使蛋白质折叠成类似“雪茄”的圆棒状。消除了待电泳粒子的电荷差异及形状差异。从而，在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PA GE)上，不同蛋白质的迁移率仅取决于粒子的分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
三、试剂准备
1．30%储备胶溶液：丙烯酰胺(Acr)29.1 g，亚甲双丙烯酰胺(Bis)0.9 g，混匀后加ddH2O，37℃溶解，定容至100 mL，过滤后，棕色瓶存于室温。
2．1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：Tris 18.17 g加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至8.0，定容至100 mL。
3．1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至6.8，定容至100 mL。
4．10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶，浓盐酸调至pH 7.2，定容至100 mL。
5．10×电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 20.86 g，甘氨酸100 g，SDS6.94 g加ddH2O 溶解，定容至694 mL。
6．10%过硫酸铵(AP)：0.1 g AP加ddH2O至1.0 mL，使用时临时配制。
7．6×SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)3.75 mL，SDS 0.6 g，甘油3.0 mL，溴酚兰12m g，补ddH2O 至10.0 mL。
8．考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，95%乙醇200 mL，冰醋酸50 mL，ddH2O 250 mL。
9、脱色液：乙醇、冰醋酸、ddH2O以4∶1∶5(V/V/V)配制而成。
四、操作步骤
采用垂直式电泳槽装置。
(一)、聚丙烯酰胺凝胶的配制
使液面平。(凝胶聚合时间取决于环境温度)。
2．积层胶(4%)的配制：
将分离胶上的水倒去，并用滤纸吸干水珠，用进样器加入上述混合液(注意
min，离心12000 g×1 min，取上清作SDS-PA GE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。
(三)、上样：取10 μL诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中，并加入
20 μL低分子量蛋白标准品作对照。
(四)、电泳：在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压60～80V，分离胶电压160V，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止(约需1.5～2hr)。
(五)、染色：将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温0.5-6hr。
(六)、脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至背景透明无色蛋白带清晰。
(七)、凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中，用数码相机拍摄结果，储存于电脑中。
五、注意事项
1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。
2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确。室温较低时，TEMED 的量可加倍。
3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。
六、思考与讨论
1．注意分析实验中出现的一些现象。
2．影响丙烯酰胺聚合快慢的因素有哪些？
基因工程习题及答案
第二章习题 一、单选题 1.在基因操作中所用的限制性核酸内切酶是指（ B ） A．I类限制酶 B. II类限制酶 C. III类限制酶 D.核酸内切酶 E. RNAase 2.下列关于同裂酶的叙述错误的是( B ) A. 是从不同菌种分离到的不同的酶,也称异源同工酶。 B. 它们的识别序列完全相同。 C. 它们的切割方式可以相同，也可以不同。 D. 有些同裂酶识别的完整序列不完全一样，但切割位点间的序列一样。 E. 两种同裂酶的切割产物连接后，可能会丢失这两个同裂酶的识别位点。 3. 多数限制酶消化DNA的最佳温度是（ A ） A. 37℃ B.30℃ C.25℃ D.16℃ E.33℃ 4. 下列关于限制酶的叙述错误的是( B ) A. I类限制酶反应需要 Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸。 B. II类限制酶反应需要Mg2+、ATP。 C. III类限制酶反应需要Mg2+、ATP，S-腺苷蛋氨酸能促进反应，但不是绝对需要。 D. I、III类限制酶对DNA有切割和甲基化活性，II类限制酶对DNA只有切割活性而无甲基化活性。 E. II类限制酶要求严格的识别序列和切割点，具有高度精确性。 5. 如果一个限制酶识别长度为6bp ,则其在DNA上识别6bp的切割概率为( D ) A. 1/44 B. 1/66 C. 1/64 D.1/46 E. 1/106 6. 多数II类限制酶反应最适PH是 ( C ) A. PH:2-4 B. PH:4-6 C. PH:6-8 D. PH:8-10 E. PH:4-10 7. 下列关于限制酶反应的说法错误的是 ( D ) A. 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，可能会阻碍限制酶的酶解活性。 B. 许多限制酶对线性DNA和超螺旋DNA底物的切割活性是有明显差异的。 C. 有些限制酶对同一DNA底物上不同酶切位点的切割速率会有差异。 D. 限制酶反应缓冲系统一般不用磷酸缓冲液，是由于磷酸根会抑制限制酶反应。 E. BSA对许多限制酶的切割活性都有促进作用，所以酶切反应中常加入一定量的BSA。 8. II类限制酶反应中必须的阳离子是（ C ）
2015年《会计基础》机考题及答案-01
2015年《会计基础》机考题及答案-01
2014年下《会计基础》模拟考试题-01 1、留存收益，主要包括计提的（）和（）。(本题分数：1.0分) A、盈余公积、资本公积 B、盈余公积、利润总额 C、盈余公积、利润分配 D、盈余公积、未分配利润 正确答案：D 答题解析：留存收益是企业历年实现的净利润留存于企业的部分，主要包括盈余公积和未分配利润。 2、某企业资产总额100万元，本期发生下列经济业务：(1)用银行存款购买原材料20万元，(2)用银行存款偿还企业的贷款10万元，(3)实际收到前期赊销款15万元。期末企业资产总额是（）。(本题分数：1.0分) A、90万元 B、55万元 C、85万元 D、105万元 正确答案：A 答题解析：本题考核会计等式“资产＝负债+所有者权益”。期末企业资产总额＝100－20+20－10+15－15=90万元。 3、以生产或销售商品为主要业务的企业，销售商品产生的收入应计入的科目是（）(本题分数：1.0分) A、投资收益 B、其他业务收入 C、主营业务收入 D、营业外收入 正确答案：C 答题解析：“主营业务收入”账户用来核算企业确认的销售商品、提供劳务等主营业务的收入。
4、应收账款的入账价值不包括（）。(本题分数：1.0分) A、销售货物的价款 B、代为垫付的运杂费 C、增值税(销项税额) D、商业折扣 正确答案：D 答题解析：本题考核应收账款的入账价值。应收账款的入账价值包括：销售货物或提供劳务的价款、增值税以及代购货方垫付的包装费、运杂费等。 5、某企业部分账户的期末余额如下：“应付账款”总账和明细账都是贷方余额60万元，“预付账款”总账借方余额20万元，其明细账中有借方余额28万元．贷方余额8万元，“预收账款”明细账借方余额为2万元，贷方余额10万元。则资产负债表中的“应付账款”项目应填列的金额为（）万元。(本题分数：1.0分) A、78 B、70 C、60 D、68 正确答案：D 答题解析：资产负债表中，“应付账款”项目应根据“应付账款”账户和“预付账款”账户所属明细账户的期末贷方余额合计数填列。本题中，应付账款=60+8=68(万元)。 6、企业发生的下列各项支出中，属于收益性支出的是（）。(本题分数：1.0分) A、购建固定资产支出 B、在建工程人员工资支出 C、购买办公用品支出 D、购置工程所用物资的支出 正确答案：C 答题解析：购建固定资产支出、在建工程人员工资支出、购置工程所用物资的支出均属于固定资产支出，构成固定资产的成本。购买办公用品支出是管理费用，属于当期损益，是收益性支出。
有关基因工程的看法
有关转基因植物争论的看法摘要与前言：植物转基因工程是指通过基因枪等基因工程手段,将一种或几种外源基因转移到原本不具有这些基因的植物体内,并使之有效表达,产生相应性状,这种具有相应性状的植物称之为转基因植物。植物转基因工程的目的旨在通过导入有用的外源基因,获得转基因植物,用于植物的改良和有效成分的生产。目前在抗除草剂、抗虫、抗病、控制果实成熟以及植物生物反应器等方面已获得了一系令列人鼓舞的成果。毫无疑问,能够按照人类意愿来“创造”优良作物新品种的植物基因工程近年来所取得的长足进展是激动人心的,它必将为未来农业的发展和满足人类日益增长的器要发挥巨大的作用。但是.在给人们带来明显经济效益和社会效益的同时,植物基因工程也可能带来一些重大的潜在危险。所以.必须从利弊两方面来考虑转基因植物的最终应用，并要对其做出正确的安全性评价。
目录 一：什么是转基因植物。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。3 二：转基因植物的发展方向。。。。。。。。。。。。。。。。。。。4 三：转基因安全性评价。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。5 四：对转基因争论的看法。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。6
一：什么是转基因 转基因植物是经过遗传改良进天然物种不具有基因序列的植物。这些基因序列来自不同的物种，并通过引入改变植物的一些基本特性。农作物是最经常实施转基因工程的植物，能通过引入新遗传材料提高产量和品质。 其中一些能培育进这些转基因植物的优良品质包括抗病虫害，提高产量，更高品质的水果、蔬菜或花卉，以及天气条件耐受性增加等。在发明人工插入新遗传材料之前，植物只是简单的在同一物种中找出最好的种子加以培育以期获得更高产量和品质。而转基因能让这一过程变的更有效。 首先要做的是确定需要替代的基因。DNA的每一个部分都管辖不同的植物部位。遗传专家必须确定用哪些基因控制每一个特定过程，并确定要被替代的植物部分。在本土环境中，植物通过授粉过程获得新遗传材料。转基因植物可以通过多种方式在这一过程中人工插入新信息。例如，基因枪是一个把新DNA通过细胞壁直接注射进植物细胞的新技术。这种方法在单子叶植物植入过程中很受欢迎。 在创造转基因双子叶植物时，农杆菌介导法最成功。该过程把基于土壤的农杆菌当做载体。在注入新的DNA后，细菌被导入植物根茎附近的土壤。这种独特的菌株会侵入植物并用植物自己的细胞再生，然后引入新的遗传品系。
2015年会计基础知识重点高频考点
2015年会计基础知识重点高频考点 第一章总论 1、会计是以货币为主要计量单位，反映和监督一个单位经济活动的一种经济管 理工作。 2、会计按报告对象不同，分为财（国家）务会计（侧重于外部、过去信息）与 管理会计（侧重于内部、未来信息） 3、会计的基本职能包括核算（基础）和监督（质保）会计还有反映经济状 况、监督经济活动、控制经济过程、分析经济效益、预测经济前景、参于经济决策的六大职能。 4、会计的对象是价值运动或资金运动（投入—运用—退出<偿债、交税、分配利 润>） 5、会计核算的基本前提是会计主体（空间范围，法人可以作为会计主体，但会 计主体不一定是法人）、持续经营（核算基础）、会计分期、货币计量（必要手段） 6、会计核算方法：设置账户、复式记账、填制审核凭证、登记账簿、成本计算、 财产清查、编制财务会计报告。 第二章会计要素与会计等式 1、六大会计要素： 资产是指由过去的交易或事项形成的，由企业拥有或控制，预期会给企业带来经济利益的资源。 【如：应付及预付账款、{流动资产、非流动资产（长期投资、固定资产、无形资产）}】 负债是由过去的交易或事项形成的、预期会导致经济利益流出企业的现时义务。 【流动负债（应付及预收账款）、非流动性负债（长期借款、应付债券、长期应付款）】 收入是指日常活动中所形成的经济利益的总流入。 【主营业务收入、其他业务收入、投资收益】 所有者权益是指资产扣除负债后由所有者享有的剩余权益。 【实收资本、资本公积、盈余公积、未分配利润】 利润指企业在一定会计时间的经营成果，包括收入减去费用后的净额、直接
计入当期利润的利得和损失。 【营业利润、利润总额、净利润。】 费用是指日常活动所发生的经济利益的总流出。 【包括成本和费用（营业（销售）税费、期间费用（销售、管理、财务）、资产减值损失）。】 2、财务成果的计算和处理一般包括：利润的计算、所得税的计算和交纳、利润 分配或亏损弥补 4、会计记录的文字应当使用中文。在民族自治地区，会计记录可以同时使用当地通用的一种民族文字。在中华人民共和国境内的外商投资企业、外国企业和其他外国组织的会计记录，可以同时使用一种外国文字。 5、会计要素是对会计对象的具体化、基本分类，分为资产、负债、所有者权益、收入、费用、利润六大会计要素。 7、会计等式是设置账户、进行复式记账和编制会计报表的理论依据。 资产=权益（金额不变：资产一增一减、权益一增一减金额变华：资产权益同增、资产权益同减） 资产=负债+所有者权益（第一会计等式也是基本等式，静态要素，反映财务状况，设置账户、复式记账及编制资产负债表依据） 收入-费用=利润（第二会计等式，动态要素，反映经营成果，编制利润债表（损益表）依据） 取得收入表现为资产增加或负债减少发生费用表现为资产减少或负债增加。 资产=负债+所有者权益+利润（扩展的会计等式，） 第三章会计核算基础 1、会计科目是对会计要素的具体内容进行分类 2、会计科目的设置原则是合法性、相关性、实用性。 3、账户根据会计科目设置的，具有一定格式和结构，用于记录经济业务的。 4、会计科目（账户）按反映业务详细程度分为总账和明细账。 按会计要素不同可分为资产、负债、所有者权益、成本、损益。 5、账户的四个金额要素及关系：期末余额＝期初余额+本期增加发生额-本期减 少发生额。 6、账户的基本结构包括账户名称（会计科目）、记录业务的日期、凭证号数、经 济业务摘要、增减金额、余额等。 7、账户分为左右两方，哪方增加，哪方减少取决于账户性质和记录的经济业务， 账户余额一般在增加方。 8、会计科目和账户是对会计对象的具体内容分类，两者口径一致、性质相同； 会计科目是账户名称、开设依据；账户是会计科目载体和具体运用。无科目，账户无依据，无自由式户，科目无作用；科目无结构，账户有一定格式和结构。实际工作中，科目和账户不加以严格区分，相互通用。 9、会计核算的对象是资金运动。会计主体，是会计工作为其服务的特定单位或 组织。法律主体必然是会计主体，会计主体可以使企业、销售部门、分公司母公司。
基因工程知识点 超全资料
基因工程 一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 二、基因工程的基本工具 1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀” 2、DNA连接酶-----“分子缝合针” 3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车” 1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）存在：主要存在于原核生物中。 （2）特性：特异性，一种限制酶只能 识别一种特定的核苷酸序列，并且能在 特定的切点上切割DNA分子。 （3）切割部位：磷酸二酯键 （4）作用：能够识别双链DNA分子的 某种特定核苷酸序列，并且使每一条链 中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸 二酯键断开。
（5）识别序列的特点： （6）切割后末端的种类：DNA 分子经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA 的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。
2．“分子缝合针”——DNA连接酶 （1）作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。 （2）类型 相同点：都连接磷酸二酯键 3．“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 (4)载体的作用: ①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的
东财2015秋(会计基础)期末作业及答案
一、单选题（共15道试题，共30分。）V 1.根据账簿记录的结果对某些特定事项加以归类、整理重新编制的原始凭证是（D）。 A.一次凭证 B.累计凭证 C.汇总原始凭证 D.记账编制凭证 满分：2分 2.下列各项原则中，也可称为真实性原则的是（C）。 A.相关性原则 B.可比性原则 C.客观性原则 D.谨慎性原则 满分：2分 3.从银行提取现金时，"库存现金日记账"上的"对方科目"栏应填写（B）。 A.实收资本 B.银行存款 C.固定资产 D.预提费用 满分：2分 4.账簿的更换时间一般是在（C）。
A.每月终了 B.每季度终了 C.每年度终了 D.每半年度终了 满分：2分 5.进行账账核对所采用的基本方法是（C）。 A.直接核对 B.清查盘点核对 C.编制试算表核对 D.与对账单核对 满分：2分 6.什么叫账项调整？在权责发生制下为什么要进行期末会计账项的调整？（A）A.会计账项调整是指在权责发生制下，企业于会计期末时采用一定的会计处理方法，将应当属于本期的收入和应当由本期负担的费用，确认为本期收入或费用的过程。在权责发生制下，企业日常的账簿记录并不能够完整的反映本期的全部收入和费用，因此，在会计期末应当进行有关收入和费用的调整，并在此基础上正确计算收入和费用所发生期间的经营成果B.会计账项调整是指在权责发生制下，企业于会计期末时采用一定的会计处理方法，将应当属于本期的收入和应当由本期负担的费用，确认为本期经营成果的过程。在权责发生制下，企业日常的账簿记录并不能够完整的反映本期的全部收入和费用，因此，在会计期末应当进行有关收入和费用的调整，并在此基础上正确计算收入和费用所发生期间的经营成果C.会计账项调整是指在权责发生制下，企业于会计期末时采用一定的会计处理方法，将应当属于本期的收入和应当由本期负担的费用，确认为本期收入或费用的过程。在权责发生制下，企业日常的账簿记录并不能够完整的反映本期的全部资产和负债，因此，在会计期末应当进行有关收入和费用的调整，并在此基础上正确计算收入和费用所发生期间的经营成果D.
基因工程知识点超全资料
基因工程 一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生 物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 DNA 分子水平上进行设计和施工的额，因此又叫做 DNA 重组技术。 二、基因工程的基本工具 限制性核酸内切酶-----“分子手术刀” DNA 连接酶-----“分子缝合针” 基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车” 限制性核酸内切酶 (限制酶) (2 )特性：特异性，一种限制酶只能 中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸 二酯键断开。 1、 2 、 分子手术刀 (1 )存在：主要存在于 原核生物 .中。 识别一种特定的核苷酸序列，— 并且能在 特定的切点上切割 DNA 分子。 (3 )切割部位: 磷酸二酯键 (4)作用: 能够识别双链 DNA 分子的 某种特定核苷酸序列, 并且使每一条链
条链分别切开时, 产生的是黏性末端, 时，产生的则是平末端。 黏性末躺 中轴线 OOO il, cue 中铀线 切害UDNA 分于时产生 M 两种木同末:躺 ＜饰头表示酶旳切刚位宣) (5)识别序列的特点: 呈现碱基互补对弑无论是奇数个碱基还是偶数个碱基, 都可以找到一条中心轴线创图冲轴线两侧的双链DNA 上的裁基是反向对称重复排列亂如(X GCIGC CG 以中心线为 CCAGG A 轴、两?碱基互补对称； 以为轴?两侧碱基互 补 GGTCC T 中轴线 对称。 (6 )切割后末端的种类: DNA 分子经限 制酶切割产生的 DNA 片段末端通常有两 种形式 黏性末端 和平末端 。当限制酶 在它识别序列的 中轴线两侧 将 DNA 的两 当限制酶在它识别序列的 中轴线处 切开 cec GGGr GGG 珂 K I G 快A (A CZTT 之冋切書u > ST'C AAG t CTTAA AAT*rC G 平木端
2015年会计基础知识重点
2015年会计基础知识重点
深圳会计培训深圳会计培训 深圳会计培训深圳会计培训 第一章总论 1、会计是以货币为主要计量单位，反映和监督一个单位经济活动的一种经济管理工作。 2、会计按报告对象不同，分为财（国家）务会计（侧重于外部、过去信息）与管理会计（侧重于 内部、未来信息） 3、会计的基本职能包括核算（基础）和监督（质保）会计还有反映经济状况、监督经济活动、 控制经济过程、分析经济效益、预测经济前景、参于经济决策的六大职能。 4、会计的对象是价值运动或资金运动（投入—运用—退出<偿债、交税、分配利润>） 5、会计核算的基本前提是会计主体（空间范围，法人可以作为会计主体，但会计主体不一定是法 人）、持续经营（核算基础）、会计分期、货币计量（必要手段） 6、会计核算方法：设置账户、复式记账、填制审核凭证、登记账簿、成本计算、财产清查、编制 财务会计报告。 第二章会计要素与会计等式 1、六大会计要素： 资产是指由过去的交易或事项形成的，由企业拥有或控制，预期会给企业带来经济利益的资源。【如：应付及预付账款、{流动资产、非流动资产（长期投资、固定资产、无形资产）}】负债是由过去的交易或事项形成的、预期会导致经济利益流出企业的现时义务。 【流动负债（应付及预收账款）、非流动性负债（长期借款、应付债券、长期应付款）】收入是指日常活动中所形成的经济利益的总流入。 【主营业务收入、其他业务收入、投资收益】 所有者权益是指资产扣除负债后由所有者享有的剩余权益。 【实收资本、资本公积、盈余公积、未分配利润】 利润指企业在一定会计时间的经营成果，包括收入减去费用后的净额、直接计入当期利润的利得和损失。 【营业利润、利润总额、净利润。】 费用是指日常活动所发生的经济利益的总流出。 【包括成本和费用（营业（销售）税费、期间费用（销售、管理、财务）、资产减值损失）。】 2、财务成果的计算和处理一般包括：利润的计算、所得税的计算和交纳、利润分配或亏损弥补4、会计记录的文字应当使用中文。在民族自治地区，会计记录可以同时使用当地通用的一种民族文字。在中华人民共和国境内的外商投资企业、外国企业和其他外国组织的会计记录，可以同时使用一种外国文字。 5、会计要素是对会计对象的具体化、基本分类，分为资产、负债、所有者权益、收入、费用、利润六大会计要素。 7、会计等式是设置账户、进行复式记账和编制会计报表的理论依据。 资产=权益（金额不变：资产一增一减、权益一增一减金额变华：资产权益同增、资产权益同减） 资产=负债+所有者权益（第一会计等式也是基本等式，静态要素，反映财务状况，设置账户、复式记账及编制资产负债表依据）
2015年最新会计基础讲义(通用版)
会计从业、初级、中级题库下载：https://www.wendangku.net/doc/e13330610.html,/1158589484/blog/1421119204 2015年最新会计基础讲义(通用版) 第一章总论 第一节会计的概述 一、会计概念 会计是以货币为主要计量单位，运用一系列专门方法，核算和监督一个单位经济活动的经济管理工作。 二、会计的基本特征 1.会计以货币作为主要计量单位(还有：实物计量和劳动计量) ★ 2.会计拥有一系列专门方法：证—账—表(基本环节，七种方法要记)★ 设置会计科目 复式记账 填制和审核会计凭证 登记账簿 成本计算 财产清查 编制财务报告 3.会计具有核算和监督的基本职能★ 4.会计的本质就是管理活动★ 会计按其报告的对象不同分为：财务会计－是面对过去的对外提供数据 管理会计－是面对未来的对内提供数据三、会计的职能 （一）会计的基本职能━━财务会计应具备的职能 1、核算（反映职能）①三个重要环节：★★
会计从业、初级、中级题库下载：https://www.wendangku.net/doc/e13330610.html,/1158589484/blog/1421119204 确认（初始确认和后续确认）－解决的是定性 计量 (计录和计算)－解决的是定量★ 保证基础报告 - 解决的是结果 ②核算职能特点： 为经济管理提供可靠依据 为经济决策和管理控制提供依据 会计信息应具有完整性，连续性和系统性。 2、监督（控制职能）：是对合法性和合理性所实施的审查。★ ①特征： 利用核算职能进行货币监督。 事前监督，事中监督和事后监督 3、两者关系：核算是监督的基础，监督是核算的保证 (二)会计的其它职能━━管理会计具备的职能★ 预测经济前景 参与经济决策 进行经济控制 评价经营业绩 四、会计对象和会计核算的具体内容★★ (一) 会计对象(凡特定主体能够以货币表现的经济活动) 1、资金运动 资金的投入(起点) —资金的周转——资金的退出★(终点) | | | 所有者投入供应过程—生产过程—销售过程上交税费 债权人投入偿还债务 利润分配 货币资金储备资金生产资金成品资金结算资金货币资金生产经营活动三个重要环节：供应 - 生产 - 销售★ 资金运动①会计对象②会计要素③会计科目★★ (二) 会计核算的具体内容 1、款项和有价证券的收付 库存现金银行本票存款–定额和不定额–同城使用①款项(3种)银行存款银行汇票存款–不定额–可跨省使用 其他货币资金信用卡存款
基因工程应用
第3节基因工程的应用 【本节重难点】 重点：1.基因工程在农业和医疗等方面的应用 难点：1.基因治疗 【知识精讲】 教材梳理 知识点一植物基因工程的应用 植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力（如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等）以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。 1.提高抗逆性 （1）常用抗虫基因：用于抗虫（杀虫）的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。 （2）常用抗病基因：a.抗病毒基因有：病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因；b.抗真菌基因有：几丁质酶基因和抗毒素合成基因 （3）其他抗逆基因：环境条件对农作物的生产会造成很大影响，并且这些影响是多方面的，因此，抗逆性基因也有多种多样，如：抗盐碱和干旱的调节细胞渗透压基因、抗冻基因、抗除草剂基因等等。 2.改良植物品质 由于人们的食品含有的营养不平衡，不能满足人们对食品的要求，这样，可以通过转基因技术，使植物能够合成某些本来不能合成的物质。如科学家将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，或者改变这些氨基酸合成途径中某种关键酶的活性，以提高氨基酸的含量。 3.生产药物 基因工程不但促进了传统技术的变革，也为人类提供了传统产业难以得到的许多昂贵药品，并已形成基因工程制药业的雏形。目前诸如人胰岛素、人生长激素、人脑激素、 α－干扰素、乙肝疫苗、蛋白C、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂等数十种基因工程药物已实现商品化。此外，还有促红细胞生成素、白细胞介素－2、肾素、心钠素等一大批珍贵药品正处于试用或临床试验阶段。 知识点二动物基因工程的应用 1.用于提高动物生长速度：由于外援生长激素基因的表达可以使转基因动物生长得更快，将这类基因导入动物体内，以提高动物的生长速率。如：转基因绵羊和转基因鲤鱼。 2.用于改善畜产品的品质：基因工程可用于改善畜产品的品质。如：有些人对牛奶中的乳糖不能完全消化或食用后会出现过敏、腹泻、恶心等不适症状，科学家将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，这样所获得的牛奶其成分不受影响，但乳糖的含量大大减低。 3.用转基因动物做器官移植的供体：目前，人体移植器官短缺是一个世界性的难题，用其它动物的器官替代，又会出现免疫排斥现象，现在，科学家正试图利用基因工程方法对一些动物的器官进行改造，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆器官。 知识点三基因治疗 1.概念：基因治疗是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。 2.方法：体外基因治疗和体内基因治疗 体外基因治疗：先从病人体内获得某种相关细胞，进行培养，然后在体外完成基因转移，再
高中生物基因工程试题
阶段质量检测（一）基因工程 （时间：45分钟，满分：100分） 一、选择题（每小题3分，共45分） 1 ?下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（） A. 重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体 B. 所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列 C. 只要是细菌中的质粒都可以直接作为基因工程中的载体 D. 载体必须具备的条件之一是有多个限制酶切割位点，以便与外源基因进行连接 2. （浙江高考）天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B,而 开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确 的是（） A. 提取矮牵牛蓝色花的mRNA经逆转录获得互补的DNA再扩增基因B B. 利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B C. 利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞 D. 将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞 3. 日本下村修、美国沙尔菲和钱永健因在发现绿色荧光蛋白（GFP）等研究方面做出突出贡献，获得2008年度诺贝尔化学奖。GFP在紫外光的照射下会发出绿色荧光。依据GFP的特性，你认为该蛋白在生物工程中的应用价值是（） A. 作为标记基因，研究基因的表达 B. 作为标记蛋白，研究细胞的转移 C. 注入肌肉细胞，繁殖发光小白鼠 D. 标记噬菌体外壳，示踪DNA路径 4. 下列有关质粒的叙述，正确的是（） A. 质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 B. 质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状 DNA C. 质粒只有在侵入宿主细胞后，才能在宿主细胞内复制 D. 基因工程中常用的载体除了质粒外，还有核 DNA动植物病毒以及入噬菌体的衍生物
2015会计基础知识重点讲解
【第一章】总论 1.会计的基本职能：会计核算、会计监督。会计核算的环节：确认、计量、记录、报告。 2.会计核算的工作：记账、算账、报账。 3.会计核算与会计监督的关系：会计核算职能和会计监督职能是相辅相成、辩证统一的关 系。会计核算是会计监督的基础，没有核算所提供的各种信息，监督就失去了依据；而会计监督又是会计核算质量的保障，只有核算、没有监督，就难以保证核算所提供信息的真实性、可靠性。 4.会计核算的基本前提：会计主体、持续经营、会计分期和货币计量。 5.会计核算四项基本前提之间的关系：会计核算的四项基本前提，具有相互依存、相互补 充的关系。具体地说：会计主体确立了会计核算的空间范围，持续经营与会计分期确立了会计核算的时间长度，而货币计量则为会计核算提供了必要手段。没有会计主体就不会有持续经营；没有持续经营就不会有会计分期；没有货币计量就不会有现代会计。6.会计要素共计有六项，分为两大类。第一类会计要素表现资金运动的静止状态，反映企 业的财务状况，包括资产、负债和所有者权益三项。第二类会计要素表现资金运动的显著变动状态，反映企业的经营成果，包括收入、费用和利润三项。 7.所有者权益包括实收资本（或者股本）、资本公积、盈余公积和未分配利润等。其中，前 两者是由企业所有者直接投入的（例如溢价发行股票），而盈余公积和未分配利润是企业在生产过程当中所实现的利润留存企业所形成的部分，因此，盈余公积和未分配利润又统称为留存收益。所以，也可以表述为：所有者权益包括实收资本（或股本）、资本公积和留存收益等。 8.收入与资产、负债和所有者权益的关系：收入表现为企业资产的增加或负债的减少，或 两者兼而有之（部分收入还债），最终导致企业所有者权益的增加。 9.费用与资产、负债和所有者权益的关系：费用表现为企业资产的减少或负债的增加，或 者两者兼而有之（广告费，部分欠款）最终导致企业所有者权益的减少。 10.资产=负债+所有者权益或：资产=债权人权益+所有者权益或：资产=权益
基因工程复习资料
基因工程复习资料 生物技术在制药行业的应用：基因工程制药、细胞工程制药、酶工程制药、发酵工程制药。 基因工程：基因工程是在分子水平上进行的遗传操作，是指将一种或多种生物体的基因分离出来或人工合成基因，按照人们的愿望，进行严密的设计和体外加工重组，转移到另一种生物体的细胞内，使之能在受体细胞中遗传表达并获得新的遗传性状而形成新的生物类型的生物技术。（又称遗传工程） 基因工程流程：分、切、接、转、筛、表。 基因工程的四大要素(或基本条件)：目的基因、载体、工具酶、受体。 基因工程的突出特点：打破物种间基因交流的界限。 连接酶：T4连接酶(辅助因子为ATP，高等生物，实验采用)和大肠杆菌连接酶(辅助因子为NAD+，低等生物)。 基因工程诞生的理论基础：证明生物的遗传物质是DNA（20世纪40年代）、明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制机制（20世纪50年代）、明确了遗传信息的传递方式（20世纪60年代）。 基因工程诞生的技术突破：工具酶(限制性内切酶和DNA连接酶)的发现与应用（基因操作的剪刀，针线）、载体的发现（发现了运载工具）、逆转录酶的发现（便于真核生物基因的获取，因其常有内含子，不便于操作）。 基因工程诞生的元年：1973年的DNA体外重组和大肠杆菌转化实验。 基因工程制药：利用重组DNA技术，结合发酵工程、细胞工程、酶工程等现代生物技术研制预防和治疗人类、动物重大疾病的蛋白质药物、核酸药物，以及生物制品的一门技术。 工具酶：工具酶是指基因工程操作中所使用的核酸酶类。 核酸酶：核酸酶是指对核酸片段可以进行操作（核酸的扩增、核酸的切割、核酸的连接）的一类酶。 工具酶：限制性内切酶、连接酶、聚合酶、修饰酶。 胰蛋白酶：动物细胞消散需要胰蛋白酶。 限制性核酸内切酶的限制作用：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制；这是维护宿主遗传稳定的保护机制。 限制性核酸内切酶的修饰作用：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏；这是宿主细胞识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用
生物选修三基因工程习题(打印)
生物选修3专题一基因工程习题 一．单选题： 1．下列有关基因工程的叙述，正确的是：（ ） A ．DNA 连接酶的作用是将两个黏性末端的碱基连接起来 B ．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变 C ．目的基因与运载体结合的过程发生在细胞外 D ．常使用的运载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等 2．下列关于基因工程的叙述，正确的是：（ ） A ．基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因 B ．细菌质粒是基因工程常用的运载体 C ．通常用一种限制性内切酶处理含目的基因的DNA ，用另一种处理运载体DNA D ．为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体 3．下列四条DNA 分子，彼此间具有粘性末端的一组 （ ） ① ② ③ ④ A ．①② B ．②③ C ．③④ D ．②④ 4．下面图中a 、b 、c 、d 代表的结构正确的是：（ ） A ．a —质粒RNA B ．b —限制性外切酶 C ．c —RNA 聚合酶 D ．d —外源基因 5．目的基因与运载体结合所需的条件是：（ ） ①同一种限制酶 ②具有标记基因的质粒 ③RNA 聚合酶 ④目的基因 ⑤DNA 连接酶 ⑥四种脱氧核苷酸 ⑦ATP A ．①②③④⑤⑥⑦ B ．①②④⑤⑥⑦ C ．①②③④⑤⑦ D ．①②④⑤⑦ 6．科学家用纳米技术制造出一种“生物导弹”，可以携带DNA 分子。把它注射入组织中，可以通过细胞的内吞作用的方式进入细胞内，DNA 被释放出来，进入到细胞核内，最终整合到细胞染色体中，成为细胞基因组的一部分，DNA 整合到细胞染色体中的过程，属于( ) A ．基因突变 B ．基因重组 C ．基因互换 D ．染色体变异 7．人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是 A . 提高受体细胞在自然环境中的耐药性 ( ) B. 有利于对目的基因是否导入进行检测 C. 增加质粒分子的分子量 D ．便于与外源基因连接 8．下列不可作为基因工程中的标记基因的是：（ ） A ．抗性基因 B ．发光基因 C ．产物具有颜色反应的基因 D ．贮藏蛋白的基因 9．如果科学家通过转基因工程，成功地把一名女性血友病患者的造血干细胞进行改造，使其凝血功能恢复正常。那么，她后来所生的儿子中：（ ） A ．全部正常 B ．一半正常 C ．全部有病 D ．不能确定 10．下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是：（ ） 11．1987年，美国科学家将萤火虫的萤光素基因转入烟草植物细胞，获得高水平的表达。长成的植物通体光亮，堪称自然界的奇迹。这一研究成果表明：（ ） ①萤火虫与烟草植物的DNA 结构基本相同 ②萤火虫与烟草植物共用一套遗传密码 ③烟草植物体内合成了萤光素 ④萤火虫和烟草植物合成蛋白质的方式基本相同 A ．①和③ B ．②和③ C ．①和④ D ．①②③④ 12．人们常用DNA 进行亲子鉴定。其原理是：从被测试者的血滴或口腔上皮提取DNA ，用限制性内切酶将DNA 样本切成特定的小片段，放进凝胶内，用电泳推动DNA 小片段分离，再使用特别的DNA “探针”去寻找特定的目的基因。DNA “探针”与相应的基因凝聚在一起，然后，利用特别的染料在X 光下，便会显示由DNA 探针凝聚于一起的黑色条码。被测试者这种肉眼可见的条码很特别，一半与母亲的吻合，一半与父亲的吻合。反复几次过程，每一种探针用于寻找DNA 的不同部位形成独特的条码，用几组不同的探针，可得到超过99.9%的父系分辨率。请问，DNA “探针”是指：（ ） A ．某一个完整的目的基因 B ．目的基因片段的特定DNA C ．与目的基因相同的特定双链DNA D ．与目的基因互补的特定单链DNA 13．2003年我国科学工作者用基因工程迅速研制出“非典”诊断盒。其作用及机理是：（ ） A ．治疗“非典”,利用的是抗原抗体反应 B ．诊断“非典”,利用的是DNA 分子杂交原理 C ．诊断“非典”，利用的是抗原抗体反应 D ．治疗“非典”，利用的是DNA 分子杂交原理 T A G G C C A T T A C C G G T A
2015会计学基础复习题与答案
第1章绪论 一、单项选择题 1．近代会计是以（）为标志。 A．官厅会计 B. 复式簿记 C. 注册会计师协会 D. 成本会计2．古代会计是以（）为主的。 A．官厅会计 B. 民间会计 C. 单式记账 D. 复式记账3．会计最基本的职能是（）。 A. 反映 B. 控制 C. 监督 D. 预测 4．下列不属于会计信息质量基本要求的是（）。 A. 可靠性原则 B. 谨慎性原则 C. 货币计量原则 D. 可比性原则 5．“四柱清册”产生于（）。 A. 西周 B.唐代 C. 宋代 D. 清代 6．计提坏账准备是体现（）要求。 A. 可靠性原则 B. 谨慎性原则 C. 配比原则 D. 相关性原则 7．会计的本质是（）。 A. 提供会计信息 B. 经济管理 C. 认定受托责任 D. 决策8．下列不能构成会计主体的是 A. 业主个人 B. 子公司 C. 分公司 D. 某一车间 9．会计循环的最后环节是（）。 A. 对账 B. 结账 C. 编制报表 D. 登记账簿 10．会计计量属性目前应用最多的是（）。 A. 历史成本 B. 重置成本 C. 可变现净值 D. 公允价值 二、多项选择题 1．会计学的发展阶段包括（）。 A. 古代会计 B. 近代会计 C. 现代会计 D. 管理会计 2．现代会计的两个重要标志是（）。 A. 注册会计师 B. 会计电算化 C. 财务会计与管理会计分离 D. 复式簿记系统 3．下列属于会计信息质量要求的是（）。 A.可靠性 B.准确性 C.可理解性 D. 实质重于形式
4．会计信息的基本载体是（）。 A. 会计凭证 B. 会计账簿 C. 会计报表 D. 复式记账 5.会计前提包括（）。 A.会计主体 B. 持续经营 C.会计分期 D.货币计量 6.会计基础包括（）。 A.复式记账 B.权责发生制 C.收付实现制 D.资金运动 7.我国《会计法》明确提出会计具有（）基本职能。 A.管理 B.计划 C.核算 D.监督 8.会计核算方法包括（）等。 A.会计主体 B.设置账户 C.复式记账 D.财产清查 9、会计确认的标准包括（）。 A.可定义性 B.可计量性 C.相关性 D.可靠性 三、判断题 1．财务会计的对象与管理会计的对象都是企业经营资金运动，它们在时间和空间上是统一的。（）2．会计主体与法律主体是一致的。（）3．会计主体是假定了会计工作空间，会计分期是假定会计工作时间。（）4．我国规定会计核算只能以人民币为记账本位币。（）5．一贯性也称可比性原则，只是强调同一企业前后不同时期（纵向）之间的可比。（）6．明晰性原则要求会计信息越简单越好。（）7．权责发生制与配比原则是以会计分期为前提而存在的。（）8．会计主体一定是法律主体，而法律主体不一定是会计主体。（）9．相关性的要求使得会计信息可靠性受到一定影响。（）10．可比性原则就是指一个企业会计处理方法不得改变。（） 参考答案 一、单项选择题 1.B 2.A 3.A 4.C 5.C 6.B 7.C 8.A 9.C 10.A 二、多项选择题 1.ABC 2.BC 3.ACD 4.ABC 5.ABCD 6.BC 7.CD 8.BCD 9. ABCD 三、判断题 1×2.×3.√4.×5.√6.×7.√8.×9.√10.× 第2章会计要素与会计等式 一、单项选择题
基因工程复习资料
细菌的限制—修饰作用 核酸限制性内切酶的类型及主要特性
一个单位的限制性核酸内切酶定义为：在合适的温度和缓冲液中，在50uL反应体系中，1h完全降解1ug底物DNA所需要的酶量。 星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，内切酶出现切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称为星号（*）活性。 同位酶：识别位点相同，但切点不同。 同裂酶：识别位点和切点均相同，但来源不同。 同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端 两种DNA连接酶 （1）大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端。分子质量为68ku （2）T4噬菌体DNA连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接平齐末端。分子质量为75ku
p35页表2-4 简述DNA连接酶的作用机制及其特点 说明使用切口位移法进行DNA标记的原理及其步骤 基因工程载体根据来源和性质不同可分为质粒载体，噬菌体载体，黏粒载体，噬菌粒载体，病毒载体，人工染色体等 质粒的概念：质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型环状（线型质粒DNA 分子—眼虫、衣藻等）双链DNA 分子（酵母的“杀伤质粒”是RNA），可自身复制和表达。 共价闭合环状DNA（SC构型）开环DNA（oc构型）线形DNA （L构型） 同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同： SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。 理想质粒载体的必备条件： A、具有较小的分子质量和较高的拷贝数 B、具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点（多克隆位点） C、具有两种以上的选择标记基因 D、缺失mob基因（载体的安全性：质粒不能随便转移、条件致死突变） E、插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达（复制起点）、较小的宿主范围蓝白班筛选原理 穿梭质粒载体(shuttle vector) ：由人工构建的具有两种不同复制子起点和选择性标记基因 黏粒载体也称柯斯质粒载体：它是一类含有λ噬菌体的cos序列的质粒载体 噬菌体载体的优越性p69
基因工程专题测试题.docx
扬州大学附属中学东部分校2015 寒假高二生物选修 《基因工程》专题测试题 班级学号姓名 一、选择题 1．有关蛋白质合成的叙述，不正确的是 A．终止密码子不编码氨基酸 B．每种 tRNA 只运转一种氨基酸 C． tRNA 的反密码子携带了氨基酸序列的遗传信息 D．核糖体可在mRNA上移动 2．酶 A、 B、 C 是大肠杆菌的三种酶，每种酶只能催化下列反应链中的一个步骤，其中任意一种酶的缺失均能导致该菌因缺少化合物丁而不能在基本培养基上生长。 现有三种营养缺陷型突变体，在添加不同化合物的基本培养基上的生长情况如下表： 由上可知：酶A、 B、 C 在该反应链中的作用顺序依次是 A．酶 A、酶 B、酶 C B．酶C．酶 B、酶 C、酶 A D．酶A、酶C、 酶 C、酶B、 酶 B A 3．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的 基因完成了在受体细胞中表达的是 A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因 B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列 D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白 4．已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有 3 个酶切位点，如图中箭头所指，如果该 线性 DNA分子在 3 个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、 c、 d 四种不同长度的 DNA 片段。现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA 分子上至少有 1 个酶切位点被该酶切断，则从理论 上讲，经该酶切后，这些线性DNA分子最多能产生 长度不同的 DNA片段种类数是 线性 DNA分子的酶切示意A． 3B． 4C．9D． 12 5．现有一长度为 1000 碱基对（ bp）的 DNA分子，用限制性核酸内切酶EcoRI 酶切后得到的DNA分子仍是 1000bp，用 KpnI 单独酶切得到 400bp 和 600bp 两种长度的 DNA分子，用 EcoRI 、KpnI 同时酶切后得到 200bp 和 600bp 两种长度的 DNA分子。该 DNA分子的酶切图谱正确的 是 6．已知基因表达载体中的复制原点处比较容易打开双链，可以推断该处 A． A+T的比例较高B．C+G的比例较高 C．位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位 D．位于基因的尾端，是转录停止的信号 7．下列有关基因工程中限制性内切酶的描述，错误的是 A．在特定的切点上切割B．活性受温度的影响 C．能识别和切割RNA D．可从原核生物中提取 8．下列有关基因结构的叙述，正确的是 A． . 真核细胞的基因中，编码区也含有不能编码蛋白质的序列 B．原核细胞的基因中，编码区的外显子是连续的 C．非编码区是两个基因之间没有遗传效应的区段 D．终止密码子的作用是阻碍RNA聚合酶的移动