肌酸激酶同工酶CK-MB快速检测试剂的研制

第43卷第7期2017年7月

北京工业大学学报

JO U R N A L OF B E IJIN G U N IV E R S IT Y O F T E C H N O L O G Y

V o l.43N o.7

Jul. 2017

肌酸激酶同工酶CK-M B快速检测试剂的研制

曾毅\马群超\刘利朋2,张亚杰3,周志祥\肖飞4,张晓光2,常宇1

(1.北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京100124 ; 2.中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京102206;

3.北京润博福得生物科技发展有限公司，北京101200;

4.卫生部北京医院，北京100005)

摘要：为了实现心血管疾病的早期诊断，减少死亡率，建立一种基于近红外荧光免疫层析技术的肌酸激酶同工酶

C K-M B快速检测技术.该检测方法使用激发光和发射光分别为777、792 n m的

D y lig h t800作为荧光标记物，通过测

量T线峰面积与C线峰面积的比值计算样品中C K-M B的浓度，实现了低成本、快速定量检测.通过25例临床标本 检测并将结果与生化仪检测结果进行比对发现，本研究中建立的方法具有良好的相关性，R2=0.98.建立的C K- M B检测试剂可以满足急诊病人急性心肌梗死（A M I)快速检测的需求.

关键词：急性心肌梗死（A M I);肌酸激酶同工酶C K-M B;近红外荧光；床旁检测（P O C T)

中图分类号：R446. 61 文献标志码：A文章编号：0254 -0037(2017)07-1068-05

d o i：10.11936/b ju txb2016120013

Development of Rapid Detection Reagent for Creatine

Kinase Isoenzyme CK-MB

ZENG Y i1，MA Qunchao1，LIU Lipeng2，ZHANG Yajie3，ZHOU Zhixiang1，

XIAO Fei4，ZHANG Xiaoguang2，CHANG Yu1

(1. College o f L ife Science and B io te ch n o lo g y，B e ijin g U n iv e rs ity o f T e chno lo gy，B e ijin g100124，C h in a；

2. N ation al In s titu te fo r V ira l Disease C ontrol and P re ve n tio n，B e ijin g102206，C h in a;

3. B e ijin g R un Bofo B iotechnology D evelopm ent C o.，L t d.，B e ijin g101200，C h in a;

4. B e ijin g H o sp ita l o f M in is try o f H e a lth，B e ijin g100005，C hina)

A b stra ct：Early diagnosis of acute myocardial infarction(A M I)is critical to saving lives.Creatine

kinase isoenzyme (CK-M B)is an important biomarker for detecting A M I.A rapid detection technology was established based on near infrared fluorescence lateral chromatography.Dylight800 with777 and792 nm excitation light and fluorescence was used as the fluorescence marker.The concentration of CK-MB in the sample can be accurately calculated by measuring the ratio of the peak area of the T-line to the C-line.The CK-MB test method established in this study has the characteristics of low cost，fast and accurate quantification.The results of25 cases of clinical specimens and Beckman biochemical analysis were compared，the two detection methods have a good correlation，R2 =0. 98. The CK-MB test reagent established in this study can meet the rapid detection of AMI in emergency patients.

Key words：acute myocardial infarction(A M I) ;creatine kinase isoenzyme CK-M B;near infrared fluorescence;point-of-care testing (POCT)

急性心肌梗死[1](acute myocardial infarction,A M I)是由于冠状动脉急性、持续性缺血导致心肌坏 收稿日期：2016-12-04

基金项目：国家自然科学基金资助项目（21677006);北京工业大学“智能制造领域大科研推进计划”资助项目

作者简介：曾毅（1929—)，男，教授，中国科学院院士，主要从事分子生物学方面的研究，E-m a il: zen gyicdc@sina. com

肌酸激酶同工酶——MB评估

肌酸激酶同工酶——MB评估 上海仁济医院检验科 肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）是由M和B亚基构成的杂化型二聚体，主要存在于心肌细胞的外浆层，是心肌酶谱中最有特异性的酶，从80年代起公认为心肌酶学诊断的“金标准”，应用于急性心肌梗塞（AMI）的早期诊断[1，2]1979年Gerhardt[3]等人首次报道用免疫抑制原理测定CK同工酶，免疫抑制法以其快速、灵敏、定量且可进行自动分析等优点适合常规检测，随着方法与试剂不断改进与完善，1986年国外已有试剂盒供应，但价格昂贵；最近国内研制成功免疫抑制法测CK-MB的试剂盒，本文旨在对该试剂盒的特性作一评估。 材料和方法 一、标本来源 分正常组，AMI组和非AMI组，非常人血清来自体检健康人员，计30例，AMI 组53例，系仁济医院心内科病房已确诊为AMI者，非AMI组系心内科及其它科门诊病人，因胸痛、心率失常等初诊疑拟AMI，后经系列观察和酶学检查证实不是AMI患者，共20例。 血标本留取后及时分离血清检测或将检测血清置于-20度冰箱保存至测定。 二、试剂 1. 免疫抑制法检测CK-MB试剂盒：上海北加生化试剂有限公司产品 （1）R1：含CK-MB抗体的咪唑缓冲液 （羊抗人CK-M多克隆抗体抑制剂>2000U/L，100mmol/L的咪唑缓冲液成 pH6.7内含葡萄糖20mmol/L，醋酸镁10mmol/L，EDTA 2mmol/L）（2）R2(A)：酶干粉。 （AMP 5mmol/L，磷酸肌酸30mmol/L，五磷酸二腺苷10mmol/L，NADP 2mmol/L，V-乙腺半胱氨酸20mmol/L，已糖激酶≥2500U/L，G6PDH≥ 500U/L，ADP 2mmol/L）。

血清肌酸激酶MB同工酶测定

血清肌酸激酶MB同工酶测定 1 检验目的 指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。 2 实验原理 使用CK-M 多克隆抗体对肌酸激酶（CK）中CK-M同工酶的活性进行抑制后，采用德国临床化学会（DGKC）和国际临床化学会（IFCC）推荐的连续监测法测定余下的肌酸激酶（CK）活性。其反应原理如下： ⑴CK-MM 型同工酶 + CK-M抗体→ CK-MM型同工酶的活性被抑制；CK-MB 型同工酶+ CK-M 抗体→ 50%的CK-MB 型同工酶的活性被抑制； ⑵剩余的50%无活性的CK-MB型同工酶 + N-乙酰半胱氨酸→有活性的CK-B型同工酶 CK同工酶 ⑶磷酸肌酸 + ADP 肌酸 + ATP 己糖激酶(HK)

ATP + 葡萄糖 ADP + 葡萄糖-6-磷酸 (G6P-DH) 葡萄糖-6-磷酸+NADP+6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+ 式中：ADP为二磷酸腺苷；ATP为三磷酸腺苷；NADP+为氧化型辅酶II；NADPH+H+为还原型辅酶II。 在上述反应中，NADPH+H+ 的生成速率与样本中肌酸激酶B 型同工酶（CK-B）的活性成正比。通过在波长340nm 处监测吸光度值的上升速率，即可测得样本中肌 酸激酶B 型同工酶（CK-B）的活性。肌酸激酶B 型同工酶（CK-B）活性相当于1/2肌酸激酶MB型同工酶的活性，将所测得的肌酸激酶B型同工酶（CK-B）的活性乘以2，即为肌酸激酶MB 型同工酶（CK-MB）的活性。 3 标本： 3.1 病人准备：无特殊。 3.2 类型：血清或肝素血浆。

3.3 标本存放：稳定性：-20℃保存稳定4周（避光保存）。 活性损失：2～8℃保存24小时或18～22℃保存1小时至少 损失10%。 3.4 标本运输：常温条件下保存运输。血标本应尽快送往化 验室,室温下放置30―45分钟,后离心,放置时间不得超过3h. 血清必须吸出,转移至有盖的试管中. 3.5 标本拒收标准：细菌污染的标本。 4 实验材料 4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司CK-MB试剂盒（沪 食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014） 4.1.1 试剂组成 试剂1（R1）： D-葡萄糖27mmol/L 咪唑缓冲液 60mmol/L 乙酸镁14mmol/L NADP 2.7mmol/L

肌酸激酶同工酶——MB

a-L-岩藻糖苷底物测定AFU酶活的评估 元升生物科技技术研发部 1概述 a-L-岩藻糖苷酶(a-L-Fucosidase，AFU)的分类名为a-L-岩藻糖苷酶水解酶(EC3．2．1．51），催化岩藻糖苷键水解，参与含岩藻糖的低聚糖、糖肽、糖蛋白和糖脂的分解代谢。AFU合成于细胞内，定位于溶酶体，是一种酸性水解酶，它的本质是糖蛋白。广泛分布于人体肝、肾、胰、脑和胎盘等组织以及血清、尿液、唾液和泪液中。AFU在人体内呈多形性，在等电聚焦电泳中AFU 可分出5～9条区带，血清中AFU除含有PI为4．68和4．84两种主要成分以外，还可见到5个次要成分。AFU具有3型同工酶，即AFU1、AFU2和AFU3，是由1个位于第一号染色体短臂（1p34）上基因位点的2个等位基因所表达，由于不同人所表达的同工酶类型不同，所以正常人群AFU活性也有所不同，大约有10%左右的正常人血浆AFU呈低活性。测定a-L-岩藻糖苷酶(a-L-Fucosidase,AFU)对诊断原发性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)具有重要临床意义。它是PHC的特异性标志物,可用于PHC的早期诊断. 2 原理 底物CNP-AFU在血清样本中a-L-岩藻糖苷酶酶作用下，生成产物CPNP，而产物CPNP的生成量与样本中AFU的酶活性成正比，通过测定黄色产物在405nm波长的生成速率，即可计算出样本中AFU的活性。 3 实验方法 3.1 样本瑞安市人民医院临床新鲜血清样品。 3.2 仪器和试剂CNP-AFU元升生物科技生物科技有限公司生产，批号 1213M05QH。进口底物购自美国sigma公司，批号1013C07QH；仪器为日立7080全自动生化分析仪、抗坏血酸、胆红素、人胎盘a-L-岩藻糖苷酶均购自sigma公司，血红蛋白标准品购自上海血液中心。 3.3 试剂配制方法按常法配制，所用原料均为分析纯。 3.4 测定方法HITACHI 7080自动分析仪参数反应类型：Rate-A法；反应温

肌酸激酶同工酶MB测定试剂盒说明书

肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）测定试剂盒（化学发光免疫分析法） 说明书 【产品名称】 通用名称：肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）测定试剂盒（化学发光免疫分析法） 英文名称：Creatine kinase MB（CLIA） 【包装规格】 2×30 人份/盒、2×50 人份/盒、2×100 人份/盒 【预期用途】 用于体外定量测定人体血清或（和）血浆中肌酸激酶同工酶MB 的含量。 肌酸激酶主要催化高能磷酸键从ATP 转移到肌酸，生成磷酸肌酸。肌酸激酶是二聚体酶，包括骨骼肌CK-MM，脑组织CK-BB，心肌CK-MB 和线粒体肌酸激酶等四种同工酶形式。CK-MB 分子量80,000，由两个亚单位组成(每个亚基MW= 40000)：亚单位M 表示肌肉型，亚单位B 表示脑型。CK-MB 主要存在于心肌组织，占CK 总活性的20%，骨骼肌中也有微量分布。 血清中CK-MB 含量对诊断急性心肌梗死、心肌炎等心肌缺血性疾病有重要意义。CK-MB 在心肌损伤早期即可出现于循环血中，于心肌损伤后2-6 小时开始升高，在12-24 小时内达到峰值，之后降至正常水平(36–72 小时)， CK-MB 测值的升降伴随ECG 演变和胸痛病史。CK-MB 含量和时间变化，对评估心肌损伤发病时间、梗死体积 以及再灌注后损伤有重要意义。此外，骨骼肌损伤、横纹肌溶解症及中风等疾病中，也伴随有CK-MB 含量升高。 临床诊断上，CK-MB 经常与肌红蛋白和肌钙蛋白I 联合检测。在心肌损伤相关疾病诊断上，肌钙蛋白I 特异 性强，肌红蛋白和CK-MB 早期敏感性高，三者联合检测可以提高诊断的特异性、敏感性。 【检验原理】 肌酸激酶同工酶MB 测定采用双位点夹心化学发光免疫分析法，其采用的技术原理如下： 第一步：将样本与包被着CK-MB 单克隆抗体的超顺磁性磁微粒（磁珠）以及CK-MB 单克隆抗体-碱性磷酸酶标记物添加到反应管中，经过孵育，样本中的CK-MB 和包被在磁珠上的CK-MB 单克隆抗体结合，同时CK-MB 单克隆抗体-碱性磷酸酶标记物与样本中CK-MB 另一位点结合。反应完成后，磁场吸住磁珠，洗去未结合的物质。 第二步：将化学发光底物（3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷，AMPPD）添加到反应管内，发光底物AMPPD 能有效地被碱性磷酸酶所分解, 脱去一个磷酸根基团，生成不稳定的中间产物，该中间产物通过分子内电子转移产生间氧苯甲酸甲酯阴离子，处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子从激发态返回基态时，产生化学发光，由光电倍增管对反应所产生的光子数进行测量，所产生的光子数与样本内CK-MB 的浓度成正比。样本内分析物的量由定标曲线来确定。 【主要组成成分】 注：不同批号试剂盒中各组分不能互换。

肌酸激酶与肌酸激酶同工酶的结果解读

肌酸激酶与肌酸激酶同工酶的结果解读 摘要：在当前肌钙蛋白在绝大多数县级以上医院普及的情况下，依然有相当多 的基层医院在评价心肌损伤标记物时会选择心肌酶谱。目前这些指标已整合到生 化全套检测中，其中CK-MB在临床诊断中的敏感性和特异性最高，至今仍然可以 作为心肌损害的重要的诊断指标。 关键词：肌酸激酶；同工酶 The results of creatine kinase and creatine kinase were interpreted Xu ying.（Anhui huainan east hospital group xiesan hospital，Anhui Huainan 232052，China） [Abstract] In the current troponin in the vast majority of the popularization of the hospital at or above the county level cases，there are still quite a lot of basic-level hospitals in evaluating myocardial injury markers will choose myocardial enzyme spectrum. At present，these indexes have been integrated into the biointegration test，and the sensitivity and specificity of ck-mb in clinical diagnosis can still be regarded as an important diagnostic index for myocardial damage. [Key words] Creatine kinase；isozyme 20世纪90年代前，肌钙蛋白还未广泛在临床应用，血清心肌酶谱是诊断心肌损伤的一 类重要指标，即使在当前肌钙蛋白在绝大多数县级以上医院普及的情况下，依然有相当多的 基层医院在评价心肌损伤标记物时会选择心肌酶谱，包括肌酸激酶CK及肌酸激酶同工酶CK-MB、乳酸脱氢酶LDH、谷草转氨酶AST和α羟丁酸脱氢酶α-HBDH。目前这些指标已整合到 生化全套检测中，其中CK-MB在临床诊断中的敏感性和特异性最高，至今仍然可以作为心肌 损害的重要的诊断指标。临床也经常能碰到患者拿化验单咨询的情况，护理人员对此应该有 所了解。CK广泛存在于机体组织中，至少有3种主要的同工酶：CK-MM、CK-MB、CK-BB。 CK-MM 主要存在于骨骼肌细胞中；CK-MB主要存在于心肌细胞中；CK-BB主要存在于脑组织中。心肌细胞损伤主要以CK-MB升高为主，总CK也会随之升高。解读CK-MB应该注意： 1药物原因 他汀是最常见的引起CK-MB升高的药物，主要与他汀肌溶解有关，故CK升高水平更为 明显。除此之外，某些麻醉药、镇静药、催眠药、乙醇、秋水仙碱等均可引起CK和CK-MB 升高。 2运动影响 一般生化检查要求检查者前两天尽可能避免剧烈的运动和锻炼，尤其平常比较少参加锻 炼的检查者，即便检查前不很剧烈的活动也可能会引起CK明显升高，同时伴有CK-MB不同 程度的升高。 3发热 尤其是高热可以引起肌肉损伤，所以对于感染发热患者，如果CK轻度升高并不用特别处理。 4手术或挤压创伤 有时手术后1-2个月CK仍然会不同程度升高，这种患者如果因其他原因再次住院，如没 有仔细询问患者近期手术史，往往会因不清楚CK或CK-MB升高的原因而进行很多不必要的 检查。 5年龄因素 14岁以下儿童的CK-MB无论是绝对活性或相对活性，一般要比成人高出2-3倍，由于不 同年龄CK-MB正常值范围不同，建议有怀疑心肌炎的儿童，以肌钙蛋白作为主要血清学参考 指标。另外，妊娠3个月左右CK和CK-MB水平也明显高于正常人。 6其他系统疾病 肿瘤、脑部疾病、甲状腺功能减退、多发性肌炎、横纹肌溶解、低钾血症等病变也会引 起CK和CK-MB增高，其中肿瘤、脑部疾病可引起CK-BB增高，但由于CK-BB不能直接检测，

人肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)说明书

人肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，组织及相关液体样本中肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)的活性。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)水平。用纯化的人肌酸激酶同工酶MB抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入CK-MB，再与HRP标记的CK-MB抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的CK-MB呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)浓度。 试剂盒组成： 试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份 封板膜2片（48）2片（96） 密封袋1个1个 酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：135U/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存 样本处理及要求： 1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

肌酸激酶同工酶肌酸激酶大于30%分析

肌酸激酶同工酶/肌酸激酶大于30%分析 申学红 [摘要] CK主要存在于骨骼肌、心肌和脑组织中，临床上主要用于诊断心肌损伤的疾病，一般情况下CK-MB不超过总CK的5%，但在临床标本中经常发现CK-MB/CK超过30%甚至超过总CK的现象，现分析其原因。 [关键词] 肌酸激酶同工酶；肌酸激酶 肌酸激酶（creatine kinase，CK）是心肌中重要的能量调节酶，[1]广泛存在于细胞浆和线粒体中，和肌酸激酶同工酶作为诊断心肌梗死或心肌坏死的特异性指标，已经广为使用，其特异性和敏感性已经得到公认。如果血清中肌酸激酶（CK）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）同时升高，则应考虑心肌梗死的可能性。且肌酸激酶同工酶（CK-MB）不会高于肌酸激酶（CK），但由于测定方法的原因，临床上难免会出现CK-MB/CK大于30%甚至超过总CK 的现象，就会给临床医生和检验人员造成一定的困惑。现总结我院2014年全年的检测结果，并对其原因进行分析。 病历资料 2014年1月至2014年12月来我院检测该项目共1210例，采用上海丰汇FH-400生化全自动分析仪，厦门英科新创的原装试剂，以及配套校准品。其中CK-MB/CK大于30%的有56例，占总数的4.6%；CK-MB超过总CK的有5例，占总数的0.4%。标本均无溶血。且该部分患者经检查后排除了心肌损伤的情况。由此可看出，此种现象在临床并非个例，该现象的出现提醒我们方法学的局限性值得临床参考。 分析 CK广泛分布于全身，在骨骼肌含量最高，其次是心肌和脑，由M和B两类亚基组成CK-MM、CK-MB、CK-BB三种同工酶。[1]骨骼肌里几乎都是CK-MM，胎儿肌肉组织和富含平滑肌的器官如胃肠道、膀胱、子宫也含有一定量的CK，但CK-BB含量相对颇高，脑组织中CK-BB的含量明显高于其他组织；心肌中CK-MB含量较高。 讨论 这种情况大多是由于测定方法所导致的。目前我国常规工作中测定CK-MB主要使用免疫抑制法，其原理是：试剂中加入CK-M抗体，它能完全抑制CK-M亚基的活性，而不影响CK-B亚基的活性，将结果乘以2即为CK-MB的活性。由于健康人和心脏、肌肉疾病患者血清中CK-BB的含量极少甚至没有，一般忽略不计。[2]如果血清中含有的CK-BB较多或者有巨CK出现时，再用免疫抑制法测定CK-MB时，就会出现CK-MB>总CK的现象。究其原因有二。 第一种情况是由于脑损伤、肠坏死、子宫肌损伤、前列腺炎等原因导致被忽略的CK-BB 异常增高[3]，这时测得的B亚基为CK-MB中的B亚基加上CK-BB中的B亚基之和，再乘以2，就可能出现CK-MB/CK大于30%甚至大于总CK活力的情况。这些含CK-BB较多的组织发生病变时，组织中的CK-BB可能会释放入血，使得在测定时把BB亚基误认为是MB 亚基中的B亚基的活性，从而导致CK-MB的活性升高，甚至超过总CK的活性。