小鼠miR-125a超表达载体的构建
第39卷第4期2018年4月
家畜生态学报
Acta Ecologiae Animalis Domastici
Vol.39 No.4
Apr.2018
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小鼠miR-125a超表达载体的构建
宋峰峰，张恺阳，安俊辉，覃金洲，田秀娥，曾文先*
(西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100)
[摘要]为了探明miR-125a在精子发生中的功能，以小鼠基因组D N A为模板扩增miR-125a的前体片段（pre-miR-125a)，经过双酶切后连接入质粒pcDNA3. 1(+)，构建miR-125a 超表达载体（PcDNA3. 1( +)-miR-125a);将 PcDNA3. 1( +)-miR-125a 转染至 GC-1sPg 细胞 系，通过qRTT-P C R和W esternB lot验证其超表达效果。结果表明：P C R扩增得到约290 bp 的miR-125a前体片段，成功构建了 PcDNA3. 1( +)-miR-125a过表达载体，在GC-1s P g生殖 细胞系中约有3. 5倍的超表达效果，为深入研究m iR N A s在精子发生过程的功能及其机制奠 定基T。
[关键词]小鼠雄性生殖细胞；miR-12 5a;qRTT-P C R;载体
[中图分类号]S811.6 [文献标识码] A [文章编号]1005-5228(2018)04-0011-05
精子发生是指精子在睾丸内产生的全过程，包 括精细管上皮的生精细胞由精原细胞经过精母细胞 到精子细胞的増殖分化过程和精子形成过程。哺乳 动物中，雄性生殖细胞发育成为精子的过程受到外因和内因的调控[1]。据估计大约有1000个基因参 与人精子发生的过程，其中仅有351个在生殖细胞中表达，这些基因在转录水平以及翻译水平调控精子发生[2]。这些基因功能的发挥需要大量的m- croR N A s对其在转录水平和翻译水平上进行调控。
microRNAs (m iRNAs)是一类长度约为22个 核苷酸、在进化上高度保守的非编码单链R N A分 子。在人类基因组中有2%?3%的基因编码rn R-N A s[]。目前已经有大量报道m iR N A s的表达具有组织特异性，并且已经证明m iR N A s在调节细胞 的增殖和分化过程中起重要作用[6]。同时，越来越 多的研究表明m R N A s对于调节精子发生及维持雄性生育是必需的；如缺乏形成m iR N A s必需的D c e r酶小鼠，产生异常伸长的精子，并且呈现雄性 不育[7];生殖干细胞的分裂及干细胞通过G1/S关 卡需要 miRNAs 的参与[8]。Mmu-miR-125a35P(后 文统称为miR-125a)位于小鼠基因组第17号染色 体上，与mmu-miR-99b和mmu-le--7e成簇分布。研究发现通过抑制m R-125a的表达能够促进人胚胎干 细胞向神经前体细胞的转变[]，然而关于miR-125a 在哺乳动物雄性生殖细胞中的研究还未见报道。
为了探明m R-125a在精子发生中的功能，本研 究构建了 miR-125a的超表达载体，并初步验证其超 表达效果，为进一步研究m R-125a的功能及其作用 机制奠定了基础。
1材料与方法
1.1试验动物与主要试剂
7曰龄和7周龄公猪采购于陕西杨凌某猪场；GC-1sP g细胞系由上海交通大学何祖平教授惠赠，由本试验室传代冻存；大肠杆菌DH5a及质粒载体P C DNA3.1( +)为本试验室保存；D M E M高糖培养 基、胎牛血清和0. 25%胰酶购于G b c o公司；反转 录试剂盒（R R047A)、荧光定量检测试剂盒(D RR820S)、T a q D N A聚合酶、D N A限制性内切酶（Hmd U a m H I )和了4D N A连接酶购于大连宝生物工程有限公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于OMEGA 公司；Trizol，Lipofectamine 2000 Reagent，oPti-MEM 购于 Invitrogen 公司；小 鼠抗G A P D H和山羊抗C-K I T多克隆抗体购于
* [收稿日期]2016-05-20
[基金项目]国家自然科学基金项目（31072029,31272439)
[作者简介]宋峰峰（1987-)，男，河南新乡人，硕士研究生，主要从事m iR N A s调控雄性生殖细胞自我更新的研究。
E-mail ： songfengfeng@nwsuaf. edu. cn
* [通讯作者]曾文先（1962-)，男，四川新都人，教授，主要从事猪雄性生殖细胞自我更新与分化的调控研究。
E-mail ： zengwnxian@ hotmail. com
pCambia1391Z 植物表达载体
北京华越洋?生物?首页关于我们新闻中?心产品展?示在线留?言加?入我们 联系我们 pCambia1391Z pCambia1391Z 产品编号载体名称北京华越洋?生物VECT0010 pCambia1391Z pCambia 1391Z 载体基本信息 出品公司:Cambia 载体名称: pCambia1391Z, pCambia 1391Z 质粒类型: 植物表达载体?高拷贝/低拷贝:低拷贝启动?子:CAMV 35S 克隆?方法 :多克隆位点，限制性内切酶 载体?大?小: 11227 bp 5' 测序引物及序列:M13-F: TGTAAAACGACGGCCAGT 3' 测序引物及序列 : M13-R: CAGGAAACAGCTATGAC 载体标签: GusA 载体抗性: 卡那和潮霉素筛选标记: HPTII 详情产品分类 ?生化试剂 精细化学品 中间体/标准品 病理实验试剂 其他关键词： 热线电话：400-818-1148150 1148 1284
备注:-- 产品?目录号:1391Z 稳定性:稳定表达 组成型:?非组成型 病毒/?非病毒:?非病毒 pCambia 1391Z载体质粒图谱和多克隆位点信息 pCambia 1391Z载体序列 LOCUS pCAMBIA1391Z 11227 bp ds-DNA circular SYN DEFINITION Agrobacterium binary vector for plant transformation, with hygromycin- and kanamycin-resistance and LacZ-GUS genes plus the pUC9 MCS. ACCESSION AF234312 VERSION . KEYWORDS pCAMBIA1391Z SOURCE synthetic DNA construct ORGANISM synthetic DNA construct REFERENCE 1 (bases 1 to 11227) AUTHORS Cambia TITLE Direct Submission JOURNAL Exported from SnapGene Viewer COMMENT The GenBank record was corrected by inserting a G at position 4743. FEATURES Location/Qualifiers
叶绿体表达载体--如何构建载体
如何构建载体 1 启动子的选用和改造 外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。 目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。 在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。在植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。 2 增强翻译效率 为了增强外源基因的翻译效率，构建载体时一般要对基因进行修饰，主要考虑三方面内容：2.1添加5｀-3｀-非翻译序列 许多实验已经发现，真核基因的5｀-3｀-非翻译序列（UTR）对基因的正常表达是非常必要的，该区段的缺失常会导致mRNA的稳定性和翻译水平显著下降。例如，在烟草花叶病毒（TMV）的126kDa蛋白基因翻译起始位点上游，有一个由68bp核苷酸组成的Ω元件，这一元件为核糖体提供了新的结合位点，能使Gus基因的翻译活性提高数十倍。目前已有许多载体中外源基因的5｀-端添加了Ω翻译增强序列。Ingelbrecht等曾对多种基因的3｀-端序列进行过研究，发现章鱼碱合成酶基因的3｀-端序列能使NPTII基因的瞬间表达提高20倍以上。另外，不同基因的3｀-端序列增进基因表达的效率有所不同，例如，rbcS3｀-端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的3｀-端序列高60倍。 2.2 优化起始密码周边序列 虽然起始密码子在生物界是通用的，然而，从不同生物来源的基因各有其特殊的起始密码周边序列。例如，植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUGC,动物起始密码子周边序列为CACCAUG，原核生物的则与二者差别较大。Kozak详细研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活
几种新型植物基因表达载体的构建方法
几种新型植物基因表达载体的构建方法 摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体PCR 置换法适用于构建小分子RNA 表达载体；重组融合PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。 关键词: Micro RNA 前体PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法 基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。从1969 年Arber 等发现了限制性内切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到
植物表达载体 Pcambia1302 序列图谱
载体质粒图谱和多克隆位点信息 载体简介 载体序列 LOCUS AF234298 10549 bp DNA circular SYN 24-APR-2000 DEFINITION Binary vector pCAMBIA-1302, complete sequence. ACCESSION AF234298 VERSION AF234298.1 GI:7638073
KEYWORDS . SOURCE Binary vector pCAMBIA-1302 ORGANISM Binary vector pCAMBIA-1302 other sequences; artificial sequences; vectors. REFERENCE 1 (sites) AUTHORS Hajdukiewicz,P., Svab,Z. and Maliga,P. TITLE The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation JOURNAL Plant Mol. Biol. 25 (6), 989-994 (1994) PUBMED 7919218 REFERENCE 2 (bases 1 to 10549) AUTHORS Roberts,C., Rajagopal,S., Smith,L.M., Nguyen,T.A., Yang,W., Nugrohu,S., Ravi,K.S., Vijayachandra,K., Harcourt,R.L., Dransfield,L., Desamero,N., Slamet,I., Hadjukiewicz,P., Svab,Z., Maliga,P., Mayer,J.E., Keese,P.K., Kilian,A. and Jefferson,R.A. TITLE A comprehensive set of modular vectors for advanced manipulations and efficient transformation of plants JOURNAL Unpublished REMARK Full description of constructs REFERENCE 3 (bases 1 to 10549) AUTHORS Roberts,C., Rajagopal,S., Smith,L.M., Nguyen,T.A., Yang,W., Nugrohu,S., Ravi,K.S., Vijayachandra,K., Harcourt,R.L., Dransfield,L., Desamero,N., Slamet,I., Hadjukiewicz,P., Svab,Z., Maliga,P., Mayer,J.E., Keese,P.K., Kilian,A. and Jefferson,R.A. TITLE Direct Submission
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤 令狐采学 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。 （3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。 （5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与
克隆载体表达载体构建详细版
一、稀释引物 1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温） 2、根据OD值加DD水。 3、静置30min（冰上） 4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。 5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。 二、跑MIX检测引物（20ul体系）、 上引物0.8ul 下引物0.8ul Mix 10ul DNA（日本晴）1ul DD水7.4ul 三跑高保真酶（50ul体系） DNAorCDNA 2ul 上引物2ul 下引物2ul 5*buffer 10ul dNTPs 5ul DD水28ul Pfu（最后加）1ul 四胶回收流程 1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。 2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。 3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。 4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。 5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次） 6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。 7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。 8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。 五、胶回收产物检测（10ul）体系 上引物0.4ul 下引物0.4ul Mix 5ul 回收产物1ul DD水 3.2ul 六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系） 胶回收产物 3.5ul Blunt cloning 0.5ul 混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃
植物细菌诱导型表达载体的构建
收稿日期:2006-11-01 基金项目:广东省科技攻关项目(2002A2070402,2006B20101011);广东省自然科学基金资助项目(5011730). 作者简介:曾骥(1983— ),男,湖南湘潭人,湛江师范学院助理研究员,从事植物基因工程研究.3通讯作者 2006年12月第27卷第6期湛江师范学院学报JOURNA L OF ZH AN J I ANG NORM A L C O LLEGE Dec 1,2006Vol 127 No 16 植物细菌诱导型表达载体的构建 曾 骥1,黄真池23,刘 媛2,黄永莲2 (1.湛江师范学院自然科学与技术研究中心,广东湛江524048;2.湛江师范学院生命科学与技术学院,广东,湛江524048) 摘 要:根据G enBank 中细菌诱导型启动子的碱基序列设计一对引物,通过PCR 扩增出启动子PPP3 (AF469483,220bp ).经分子操作将启动子和质粒pUC18连接后转化E .coli DH5 α,经蓝白筛选和PCR 检测筛选阳性菌落,测序结果与G enebank 中的碱基序列完全相同.对扩增到的PPP3片段和含目的基因(hrap 或p flp )的pBI121质 粒进行双酶切,分别回收PPP3片段和含目的基因的pBI121大片段,连接后转化E .coli DH5 α,通过卡那霉素抗性筛选和PCR 检测,表明细菌诱导型启动子和目的基因已正确连接.用重组质粒转化农杆菌,经卡那霉素抗性筛选和PCR 检测,证明植物细菌诱导型表达载体构建成功. 关键词:细菌诱导型启动子;hrap ;p flp ;植物细菌诱导型表达载体 中图分类号:Q946 文献标识码:A 文章编号:1006-4702(2006)06-0071-04 目前,世界上已经报道的植物细菌性病害有500多种,对农林业生产造成了巨大损失[1] .传统育种方法虽然能利用作物本身或亲缘种的抗性基因选育抗病品种,但存在着可利用的抗性品种资源少,选育时间长,耗资大等缺点;施用化学药剂来防治细菌病害并非完全有效,而且污染环境.近年来植物基因工程技术的不断发展以及对植物和病原物相互作用的深入了解使得将外源抗性基因导入植物来提高抗病性成为一条有效途径.通过转基因技术可以打破传统育种中的种间不亲和现象,消除杂交障碍,极大地拓宽了抗性基因的来源和应用.目前利用基因工程技术提高作物抗病性的研究主要集中在阻碍病原菌间的信号交流,通过RNA 干涉抑制病原菌关键致病基因的表达,转入无毒基因或无毒基因簇,利用强启动子或转录因子促进抗病相关 基因的表达等来提高植物抗病力[2-5].但实践证明,抗性基因的高效表达虽然提高了植物的抗病力,但由于 外源基因在植物体内的持久的高水平表达,植株会因能量过多耗损、而生长缓慢、畸变,甚至死亡[1,4-6].为了 避免这些不足,在转基因中使用诱导型启动子是理想的基因工程策略. 病原微生物侵染植物后,通常会引起植物体内活性氧的爆发,进而诱发超敏反应.超敏反应是一种快速 的局部组织坏死,从而阻止病原物的传播、扩散[7-9].据一系列文献报道,从甜椒中克隆到的p flp 基因能改变 植物细胞中活性氧的水平,hrap 基因能协助一些超敏反应激发子增强超敏反应,而两种基因同时表达可以 大大提高植物的抗病力[10-11].彭建令等[12-13]报道从烟草中克隆到3个细菌诱导型启动子PPP1、PPP2、PPP3, 这些启动子受亲和性病原细菌(青枯菌)、水杨酸、超敏反应激发子harpin 等的诱导.本研究试图构建诱导型启动子和p flp 基因或hrap 基因相连的植物表达载体,期望在转基因植物的生长过程中,病原微生物侵染可作为诱导信号,作用于诱导型启动子引发p flp 基因或hrap 基因的表达从而增强抗病能力.1 材料和方法 1.1 材料
pCambia35s-ECFP植物表达载体
pCambia35s--‐ECFP 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT1010 pCambia35s--‐ECFP pCambia35s--‐ECFP载体基本信息 出品公司: --‐--‐ 载体名称: pcambia35s--‐ECFP 质粒类型: 植物双元表达载体 高拷贝/低拷贝: --‐--‐ 启动子: --‐--‐ 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: --‐--‐ 5' 测序引物及序列: --‐--‐ 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: ECFP 载体抗性: --‐--‐ 筛选标记: --‐--‐ 备注: --‐--‐ 产品目录号: --‐--‐ 稳定性: --‐--‐ 组成型: --‐--‐ 病毒/非病毒: --‐--‐ 其他植物载体质粒： pBI101 pDF15 pBI121 pEarleyGate 100 pBI221 pEarleyGate 101 pBI221--‐GFP pEarleyGate 102 pBin19 pEarleyGate 103 pBINPLUS pEarleyGate 104 pCambia0105.1R pEarleyGate 201 pCambia0305.1 pEarleyGate 202 pCambia0305.2 pEarleyGate 203 pCambia0380 pEarleyGate 204 pCambia0390 pEarleyGate 205 pCambia1105.1 pEarleyGate 301 pCambia1105.1R pEarleyGate 302 pCambia1200 pEarleyGate 303 pCambia1201 pEarleyGate 304 pCambia1281Z pFGC5941 pCambia1291Z pGA643 pCambia1300 pGreen
表达载体的构建
关于表达载体的构建 1.表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类 载体既有复制子，更要有强启动子； 2.大肠杆菌中的表达载体应含有 （1）强启动子 （2）在启动子下游区和A TG上游区有一个好的SD序列。 （3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。 我们实验室常用的就是PBI121的表达型载体，该载体具有35S强启动子，下游有MCS，并且具有T-DNA插入片段和Tet和Kan的抗性位点，有利于作为农杆菌浸染植物的表达载体。 3.载体构建的步骤 （1）.设计引物 1.引物的长度用于PCR扩增的寡核苷酸引物至少应在16个碱基以上，一般以20—30个碱基为宜，引物过短会使PCR特异性降低，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。 2. 引物自身序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。引物中碱基分布应尽可能避免嘌呤、嘧啶的连续排列，引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。 3. Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.Tm=2(A+T)+4(C+G) 4. 引物的GC含量引物中GC含量应占到45％一60％左右。在引物设计时应尽量避免引物二聚体和发卡结构，尤其是在引物3，端不应有互补结构。引物3，端应与目的片段完全配匹，而其5’端碱基可不与模板配匹，故在引物设计时可在其5，端加上限制酶位点或其他短的序列，这些与原初模板并不配对的非互补序列在后续的循环中将被带到双链DNA中去，这样反应产物不仅含有目的序列，同时在目的基因的两侧又有了新的限制酶位点，用相应
小鼠microRNA-125b过表达载体构建 毕业论文
小鼠microRNA-125b过表达载体构建 目录 摘要 (1) Abstract (3) 1 前言 (4) 2 材料与方法 (5) 2.1 材料 (5) 2.2主要试剂与仪器 (5) 2.2.1主要试剂 (5) 2.2.2主要仪器 (5) 2.3 方法 (6) 2.3.1质粒提取 (6) 2.3.2鼠尾基因组DNA提取 (6) 2.3.3 PCR引物设计与合成 (7) 2.3.4 PCR扩增 (7) 2.3.5琼脂糖凝胶电泳检测 (7) 2.3.6 DNA产物纯化及回收 (8) 2.3.7酶切及鉴定 (8)
2.3.8载体构建 (9) 3 结果与分析 (9) 4 讨论 (11) 5 结论 (11) 6 参考文献 (12) 致谢 (14)
摘要 NPC1是一种以溶酶体内脂质异常沉积为特征的中枢神经系统退行性疾病，迄今为止对NPC1的发病机制仍得不到合理的解释。研究发现miRNA对tau蛋白的调控和神经元存活至关重要，通过调节蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶来调节tau蛋白磷酸化水平。Tau 蛋白过度磷酸化损伤神经细胞功能和结构，如过度磷酸化使Tau 蛋白结合微管能力降低[1]，Tau 蛋白在神经元内聚积导致神经元轴突转运障碍[2]、乙酰胆碱释放减少[3]、蛋白酶体活性抑制[4-7]，这些功能和结构的改变可能导致神经元呈慢性进行性变性构建miR-125b表达载体，从tau蛋白磷酸化调控的研究入手，系统地研究参与tau蛋白磷酸化调控的miR-125b 的靶基因，阐释其中的分子作用机制，为tau蛋白异常病变引起的神经退行性疾病的研究与防治提供新的思路。 本实验目的：构建小鼠microRNA-125b（miR-125b）过表达载体。 方法：参考小鼠miR-125b前体序列的PCR扩增引物，重新设计限制性内切酶位点为Nhe I和EcoR I，PCR扩增，然后将目的片段和pcDNA3.1-EGFP质粒进行双酶切鉴定，使用T4 DNA连接酶进行连接，转化DH5α感受态细胞，挑取重组阳性克隆，对重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析。
植物乳杆菌高表达组成型表达载体构建
2018年第5期 吉林畜牧兽医·实验研究· ShiYan YanJiu 植物乳杆菌高表达组成型表达载体构建 王 雪，尚晓敏，李桂玲,刘 琼* 吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林长春 130052 摘 要：乳酸菌宿主对表达载体的启动子具有高度的选择性，本研究利用PCR技术扩增嗜酸乳杆菌表面蛋白SlpA 基因启动子，以诱导型表达载体pSIP409为基本框架删除其诱导型启动子，采用能快速连接的无缝克隆技术将SlpA 基因启动子连接到gusA基因上游，获得重组质粒409SlpA电转化至植物乳杆菌NC8中，Western Blot定性测定的gusA表达情况，同时利用MRS-X-gluC培养基特异性显色反应来鉴定阳性重组子表达gusA的活性，为利用该启动 子表达外源蛋白研制新型基因工程微生态制剂奠定基础。 关键词：嗜酸乳杆菌；启动子；组成型表达载体； Construction of constitutive Expression Vector Base on SlpA Gene Promoter and the Function Analysis Wang Xue, Shang Xiao-min，Li Gui-ling，Liu Qiong* College of Food Engineering Jilin Engineering Normal University, Changchun, Jilin, 130052 Abstract: Lactobacillus hosts have a high selectivity for the promoter of the expression vector. In this study, the promoter of the SlpA gene from Lactobacillus acidophilus was amplified by PCR, and the expression vector pSIP409 was used as the base frame to remove its inducible promoter. The promoter of the SlpA gene was ligated upstream of thegusAgene by Seamless Assembly Cloning technology and the recombinant plasmid 409SlpA was transformed into Lactobacillus plantarumNC8 by electrotransformation. The positive colony was screened by MRS-X-gluC medium and the specific colony was screened, and the complex steps of detecting the activity of expressed proteins were avoided. This study lays the foundation for further application of SlpA gene constitutive promoter. Keywords: Lactobacillus acidophilus; promoter; constitutive expression vector 乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一群革兰氏阳性、能够发酵碳水化合物、以乳酸为主要代谢产物的各类细菌统称，是人与大多数动物肠道内常见优势菌群。由于乳酸菌在医药、食品、饲料生产等相关领域具有较高的应用价值，被公认为安全级微生物(generally recognized as safe，GRAS)[1]。构建乳酸菌工程菌株最重要的是高效稳定表达，而启动子是决定外源基因表达效率的关键遗传组件[2]，且乳酸菌属的启动子对宿主有着高度的选择[3]。因此，在LAB表达系统中很少使用外源启动子。目前可用于构建LAB表达载体的启动子主要有lac A、lac R、lacS、nisA/nisZ、nisF和usp等[4]，启动子数量偏少，并且大多数属于诱导型启动子[5]。组成型乳酸菌表达载体在不添加诱导物情况下可以不断地表达目的蛋白，在饲料生产、食品 基金项目：吉林省教育厅科技研究项目（2016120）； 吉林工程技术师范学院（2016）校科研发展基金项目。 作者简介：王 雪（1995-），女，本科，生物工程专业， 河北省阜城，E-mail:7107172322@https://www.wendangku.net/doc/e15034164.html,. *通讯作者：刘 琼（1980-）,女,实验师，研究方向为 动物微生态与黏膜免疫学。 E-mail:liuqiong@https://www.wendangku.net/doc/e15034164.html,. 6
pFGC5941植物表达载体
pFGC5941 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT0360 pFGC5941 pFGC5941载体基本信息 出品公司: --‐--‐ 载体名称: pFGC5941 质粒类型: 植物表达载体；植物干扰载体 高拷贝/低拷贝: --‐--‐ 启动子: --‐--‐ 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 11405 b p 5' 测序引物及序列: --‐--‐ 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 羧苄西林 筛选标记: --‐--‐ 备注: --‐--‐ 产品目录号: --‐--‐ 稳定性: --‐--‐ 组成型: --‐--‐ 病毒/非病毒: --‐--‐ 载体质粒图谱和多克隆位点信息
其他植物载体质粒： pBI101 pDF15 pBI121 pEarleyGate 100 pBI221 pEarleyGate 101 pBI221--‐GFP pEarleyGate 102 pBin19 pEarleyGate 103 pBINPLUS pEarleyGate 104 pCambia0105.1R pEarleyGate 201 pCambia0305.1 pEarleyGate 202 pCambia0305.2 pEarleyGate 203 pCambia0380 pEarleyGate 204 pCambia0390 pEarleyGate 205 pCambia1105.1 pEarleyGate 301
pCambia1105.1R pEarleyGate 302 pCambia1200 pEarleyGate 303 pCambia1201 pEarleyGate 304 pCambia1281Z pFGC5941 pCambia1291Z pGA643 pCambia1300 pGreen pCambia1300GFP pGreen 0029 pCambia1301 pGreen0029 pCambia1302 pGreen029 pCambia1303 pGreenII pCambia1304 pGreenII 0049 pCambia1305.1 pGreenII 0179 pCambia1305.2 pGreenII 0229 pCambia1380 pGreenII 0579 pCambia1381 pHANNIBAL pCambia1381Xa pHELLSGATE pCambia1381Xb pHELLSGATE 12 pCambia1381Xc pHELLSGATE 4 pCambia1381Z pHELLSGATE 8 pCambia1390 pKANNIBAL pCambia1391 pPZP100 pCambia1391Xa pPZP101 pCambia1391Xb pPZP102 pCambia1391Xc pPZP111 pCambia1391Z pPZP112 pCambia2200 pPZP121 pCambia2201 pPZP122 pCambia2300 pPZP200 pCambia2301 pPZP201 pCambia2301--‐101 pPZP202 pCambia3200 pPZP211 pCambia3201 pPZP212 pCambia3300 pPZP221 pCambia3301 pPZP222 pCambia35s--‐ECFP pPZp--‐RCS2--‐Bar pCambia35s--‐EGFP pRI 101--‐AN pCambia35s--‐EYFP pRI 101--‐ON pCambia5105 pRI 201--‐AN pSB1 pRI 201--‐ON pSB11 pRI 909 pSoup pRI 910 pSPYCE(MR) pRI101 pTCK303 pSAT1--‐cCFP--‐C Super1300 pSAT1--‐cCFP--‐N
单子叶植物表达载体pUN3300的构建
龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/e15034164.html, 单子叶植物表达载体pUN3300的构建 作者：孙萍等 来源：《山东农业科学》2013年第01期 摘要：植物双元表达载体在植物基因工程研究中具有重要作用，表达载体所包含的结构元件，如启动子、多克隆位点、筛选标记等，对植物遗传转化效率、外源基因表达强度及遗传稳定性等具有重要影响。本研究中，为提高目的基因对单子叶植物的遗传转化效率，对植物表达载体pCAMBIA3300进行改造，在原有以bar基因作为选择标记的基础上，采用不完全酶切的方法添加了Ubiquitin启动子，经酶切、测序表明，植物双元表达载体pUN3300构建成功。该载体对于研究外源基因功能、植物性状改良及新品种的培育，具有重要的价值。 关键词：单子叶植物；表达载体；pUN3300；Ubiquitin启动子；bar基因 中图分类号：Q781文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0034-04 植物双元表达载体是植物基因工程研究的重要组成部分。通过植物表达载体，外源目的基因可进入宿主细胞并高效表达，为阐明基因功能、利用基因资源改良作物种质奠定了基础[1～3]。获得稳定、高效的植物双元表达载体是进行遗传转化研究的重要内容之一。目前，虽已有pBR121、pCAMBIA等系列的商业化表达载体出售，但并不能完全满足实验需求，因此，必须根据实际需要对表达载体进行改造。表达载体上携带的抗性标记基因是筛选转化体的有效手段，但同时也带来了生态环境及食品安全方面的潜在隐患，影响了大众对转基因植物的接受。而以除草剂抗性bar 基因作为筛选标记，具有一定的生物安全性，客观上可消除人们的顾虑[4]。因此本研究中，选取以bar 基因为筛选标记的商业化表达载体pCAMBIA3300为基础，通过不完全酶切等方法添加了单子叶植物高效、专一性启动子Ubiquitin，构建并获得了适于单子叶植物遗传转化的表达载体pUN3300，为外源目的基因对单子叶植物的遗传转化提供了有力 的分子生物学工具。 1材料与方法 11试验材料 植物表达载体pCAMBIA3300、含有Ubiquitin启动子的植物表达载体pUN1301由本实验室保存。大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金公司，各种限制性内切酶、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、T4 DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司，其他各种试剂均为国产分析纯产品。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。 12试验方法
几种新型植物基因表达载体的构建方法
几种新型植物基因表达载体的构建方法 文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-
几种新型植物基因表达载体的构建方法 摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载 体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半 功倍。植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、 三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建 方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体 PCR 置换法适用于构建小分子 RNA 表达载体；重组融合 PCR 法特 别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用 In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连 接的克隆方法 (Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。本文将在总结分析前人工作的基础 上，分析这 6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工 程表达载体的构建提供新的思路。 关键词: Micro RNA 前体 PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法 基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。而载 体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。随着植物基因 工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在 转基因植物中最常用的是质粒载体。传统的载体构建方法在进行构建多 片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多 个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的
植物表达载体转化农杆菌操作步骤
第一部分：农杆菌介导转化水稻 1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV3101 2、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif或Str；EHA 105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/m l。28℃培养。 3、农杆菌感受态细胞的制备： 1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。 2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min； 3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液； 4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min； 5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液； 6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化； 制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。 4、DNA直接转化农杆菌： 1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min； 2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min； 3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr； 4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。2天左右菌落可见。（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str） 5、重组农杆菌鉴定： 1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。 （pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str） 2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。3）质粒酶切或PCR鉴定。 6、三亲交配法： 参考一： 1）接种含重组质粒的大肠杆菌于含的LB平板，于37℃培养； （pEmu载体：50μg"ml -1AMP；pK载体：50μg"ml -1Kan；pTCK载体：50μg"ml -1Kan） 2）接种含动员质粒pRK2013的大肠杆菌于不含抗生素的LB平板上，于37℃培养； 3）接种受体农杆菌EHA105/LBA4404于50μg"mL-1 Rif/Str的LB平板上28 ℃培养； 4）分别挑取上述平板单菌落，分别于LB液体培养基中震荡培养； 5）待三种菌生长到对数期时，各取50μL，混匀，涂布于无抗生素的LB 平板上，28℃培养过夜； 6）挑取长出的小块菌，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养24h； （pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pT CK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str） 7）用接种环将上述培养液划线于含相应抗生素的LB平板，28℃培养至长出单菌落； （pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pT CK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str） 8）随机挑取若干克隆，于含相应抗生素的LB液体培养基振荡培养； 9）小量提取质粒DNA进行PCR鉴定。