illumina TruSeq Small RNA Protocol

i llumina TruSeq Small RNA Sample Prep. (LT) Protocol 1 Performed using the TruSeq Small RNA Sample Prep Kit (Illumina Sets: A cat#RS200-0012, B cat#RS200-0024,

C cat#RS200-0036,

D cat#RS200-0048)

NOTE: Use 1ug of Total RNA to initiate protocol (Quantity may vary by sample type – Reference protocol for details). NOTE: Previously isolated microRNA can be used as starting material. Use the entire fraction of small RNA purified from 1-10ug of total RNA. Purified small RNAs must be in water or 10mM Tris-HCI, pH 8.5.

NOTE: Ambion FirstChoice human brain total RNA (cat#AM7962) can be used as a positive control for this protocol. Adapter Ligation

NOTE: Thaw the following Illumina supplied consumables on ice: Ligation buffer (HML), RNA 3’ adapter, RNA 5’ adapter, Stop Solution and Ultra Pure water. Remove Enzymes and 10mM ATP from -25?C when

needed and place on ice. Return to -25?C promptly after use.

NOTE: Preheat thermal cycler to 70?C.

3’ Adapter Ligation

1. Set up the Ligation reaction in a 200ul PCR tube on ice as follows:

RNA 3’ Adapter (RA3) 1ul

1ug Total RNA variable

Nuclease-free H2O variable

Total Volume 6ul

2. Pipette to mix, then centrifuge briefly

3. I ncubate at 70?C in a thermal cycler for 2.5 min. using the following profile: ANNEAL

70?C hold NOTE: Use heated lid

4. Transfer samples immediately to ice to avoid secondary structures from forming

5. Pre-heat thermal cycler to 28?C using the following profile: 28HOLD

28?C hold

6. Prepare the following ligation mix on ice. Adjust volume 10% for multiple samples. Pipette to mix. DO NOT VORTEX

Ligation Buffer (HML) 2ul

RNase Inhibitor 1ul

T4 RNA Ligase 2, Deletion Mutant 1ul

Total volume per sample 4ul

7. Transfer 4ul ligation mix into each sample for a 10ul total volume. Pipette to mix 6-8x’s. Centrifuge briefly if required

8. Transfer to thermal cycle r and incubate at 28?C for 1 hr

9. With the reactions remaining in the thermal cycler, add 1ul of Stop Solution (STP). Adjust pipette volume to 9ul and gently pipette up and down 6-8 times to mix thoroughly

10. Continue 28?C for 15 min. Transfer samples to ice

5’ Adapter Ligation2

1. Pre-warm thermal cycler to 70?C by initiating cycler profile: ANNEAL

2. Aliquot (1.1 x N ul) of the RNA 5’ Adapter (RA5) into a 200ul nuclease-free tube.

NOTE: N equals the number of samples to be processed.

3. Incubate the adapter in the pre-heated thermal cycler at 70?C for 2.5 min. then immediate place on ice

NOTE : It is very important to keep the RNA 5’ Adapter on ice after denaturing to prevent secondary structure formation.

Keep all solutions on ice that will be transferred to the 5’ Adapter.

4. Pre-heat the thermal cycler to 28?C by initiating the cycler pr ofile: 28HOLD.

5. Add (1.1 x N ul) of 10mM ATP to the aliquoted RNA 5’ Adapter tube on ice. Pipette entire volume to mix on ice

6. Add (1.1 x N ul) of T4 RNA Ligase to the aliquoted RNA 5’ Adapter mix on ice. Pipette entire volume to mix on ice

7. Trans fer 3ul of 5’ Adapter mix to the 3’ Adapter reaction for a total of 14ul. Gently pipette entire volume to mix on ice

8. Incubate 5’ Adapter reaction at 28?C f or 1 hour. Place samples on ice

Reverse Transcription and Amplification

NOTE: Remove the following Illumina consumables and thaw on ice – 1st Strand Buffer,100mM DTT, 25mM dNTP mix, RNA PCR Primer (RP1), RNA PCR Primer Index (RPI1 – RPI48), RNA RT Primer (RTP), Ultra Pure H2O.

Remove Phusion Polymerase and RNase Inhibitor when needed and place on ice. Return to -25?C immediately

after use.

NOTE: Pre-heat thermal cycle to 70?C. Use heated lid.

Dilute 25mM dNTP Mix

1. Dilute the 25mM dNTP mix in a tube labeled “1

2.5mM dNTP” as follows:

25mM dNTP mix 0.5ul NOTE: Adjust reagent volume to accommodate multiple samples.

Ultra Pure H2O 0.5ul Make 10% extra for multiple samples.

2. Vortex briefly and place on ice

Perform Reverse Transcription

1. Prepare RT as follows for each sample in a labeled 200ul PCR tube:

5’ & 3’ Adapter-ligated RNA 6ul NOTE: Remaining 5’ & 3” Adapter ligated RNA can be stored at -80?C.

RNA RT Primer (RTP) 1ul

Total volume per sample 7ul

2. Gently pipette the entire volume up and down 10x to mix. Centrifuge as needed

3. Incubate the samples at 70?C for 2.5 min. using the ANNEAL program. Immediate place the tubes on ice

4. Pre-heat the thermal cycler to 50?C using profile: 50HOLD

5. Prepare the RT Master Mix as follows: 3

5x First Strand Buffer 2ul NOTE: Adjust reagent volume to accommodate

12.5mM dNTP mix 0.5ul multiple samples. Make 10% extra for multiple

100mM DTT 1ul samples.

RNase Inhibitor 1ul

SuperScript II Reverse Transcriptase 1ul

Total volume per sample 5.5ul - gently vortex to mix and place on ice

6. Add 5.5ul of the RT Master mix to each sample for a total volume of 12.5ul. Pipette to mix. Centrifuge as needed

7. Incubate for 1 hr at 50?C using profile: 50HOLD

8. Place samples on ice

Perform PCR Amplification

1. Prepare an Indexing list for all samples based on the RNA PCR Primer Index (RPI X) that will be used

2. Add 2ul of the appropriate RNA PCR Primer Index (RPI X) to each RT sample

3. Prepare the PCR Master mix as follows using a 10% excess for multiple samples:

Ultra Pure H2O 8.5ul

PCR Mix (PML) 25ul

RNA PCR Primer (RP1) 2ul

Total volume per sample 35.5ul

4. Gently mix and centrifuge as needed. Place on ice

5. Add 35.5ul of the PCR Master mix to each RT sample for a total volume of 50ul

6. Pipette to mix. Place on ice

7. Place tube on the thermal cycler and close lid

8. Amplify samples using the following thermal cycle program: SMALLPCR

1 cycle

98?C30 sec NOTE: Use pre-heat lid option and set to 100o C

11 cycles

98?C10 sec

60?C30 sec

72?C15 sec

1 cycle

72?C10 min

4?C hold

9. Run 1ul of each sample on a Agilent High Sensitivity DNA Chip

NOTE: Amplification products can vary based on RNA input amount, tissue type and species. This process was optimized using 1ug of total RNA from mouse and human brain. The number of PCR cycles can be

adjusted to a maximum of 15 cycles if clear and distinct bands are not observed in the Agilent

electropherogram.

NOTE: The bands of the high sensitivity chip can shift from sample to sample due to an incorrect identification of the marker by the Bioanalyzer software.

NOTE: Components for the amplification may interfere with Bioanalyzer reagents. It may be necessary to dilute the sample before running on the high sensitivity DNA chip.

NOTE: The amplified cDNA constructs can be stored at -25?C until ready to perform purification.

Purify cDNA Construct 4 Perform purification and size selection using the Sage Pippin Prep 3% Cassettes Dye-Free (CDF3010).

NOTE: Bring Pippin Prep loading solution to RT? for 30 min.

Size Selection options:

A - Contains mature miRNA without adapters.

B - Contains piwi-interacting RNAs, miRNAs, regulatory small RNAs.

C - Cut size adjusted for adaptor sequence.

Program Protocol

1. S elect “Protocol Editor” tab to go to the Protocol Editor Screen. Pre ss “New” to open a new protocol

2. Select the appropriate cassette type (3% Marker H)

3. Select “Use Internal Standards” button NOTE: Make sure the “Ref Lane” values match the lane numbers.

4. Select collection mode “Range” for each lane NOTE: Verify lane assignment of software display vs cassette lanes.

5. Enter - bp target size 143bp

-bp start size 125bp

-bp end size 160bp

6. Enter sample name into the “Sample ID” field

7. Select “Save as” and name protocol to retain for future applications (TruSeq miRNA 125-160bp)

8. Press “Main” tab to return to the main screen

Calibrate Pippin

1. Place calibration fixture onto the optical nest making sure the black strip is facing down and close lid

2. Press “CALIBRATE” to launch the calibration window

3. Enter 0.80in the “Target I ph, mA” field

4. Press “CALIBRATE”, and when complete press “EXIT”

Prepare Cassette

1. Remove cassette from packaging and wipe off excess moisture. Verify correct cassette type is used

2. Visually inspect buffer chamber and gel columns. From side view ensure buffer chamber volume is more than ? full. Inspect gel

column for breakage, bubbles or gaps. Any lanes with these defects must be abandoned. Remaining lanes are still functional

3. Inspect for air gaps in and behind elution wells by tilting cassette to the left (loading well end). Tap on bench lightly to dislodge

4. Install cassette into tray of Pippin Prep with loading wells to the left

5. Remove sealing tape without tipping the cassette

6. Remove all buffer from elution well and replace with 40ul of electrophoresis buffer

7. Test electrophoretic current continuity:

a. Close sliding lid on instrument

b. In the run screen select “Manual Mode” from the “Protocol Name” dro p down menu

c. Press “Test” in controller on the Main Screen. Test takes 30 sec. finishing with “Pass” of “Fail” message

d. If test fails – in the separation lane: lane unusable – no recovery

– in the elution lane: Verify 40ul of running buffer is present in the elution well and re-test. If it fails again lane can be used for reference sample

8. Cover all collection wells with tape to minimize recovery volume to ~50ul

Prepare DNA Samples for loading

1. Initiate the Pippin Prep instrumentation allowing software to launch

2. Add 10ul of water to each sample in the 0.2ml amplification tube to obtain 60ul total volume

3. Add 20ul of RT? Pippin Prep loading solution to each sample for a total of 80ul. Mix well and centrifuge briefly

Sample Loading

1. Verify that sample wells are completely full. Top off wells with electrophoresis buffer if necessary. Total well volume is 70ul 5

2. Remove 40ul of running buffer from the loading well leaving ~30ul in well

3. Load 40ul aliquots from the 80ul of prepared sample into two adjacent loading wells of the cassette (2 samples /cassette can be run)

4. Close lid

5. Select desired protocol from the “Protocol Name” drop down menu (TruSeq miRNA 125-160bp) and press start

Sample Collection

1. When complete, remove elution well tape using a scalpel to cut between samples to prevent cross contamination

2. Pool the aliquoted runs by transferring all sample from both sample elution wells to a labeled microcentrifuge tube

3. Determine volume of collected sample. Volume should be ~80ul

4. Clean electrodes of Pippin Prep by installing cleaning cassette filled with H2O and closing lid for 30 seconds. Remove Cassette Sample Clean-Up

Use the Qiagen MinElute PCR Purification Kit (cat# 28004) for clean-up procedure. Perform the PCR Purification

Protocol.

NOTE: Must add 120ul of the pH Indicator to 30ml of the PB buffer before proceeding.

: Add ETOH to the wash buffer PE

1. Add 5 volumes of PB buffer (with Indicator) to 1 volume of the Pippin Prep elute (400ul PB+I buffer + 80ul Pippin Prep Elute).

2. Check the color of the mixture and ensure that it is yellow (similar to the original color of buffer ERC)

a. If color is orange or violet add 10ul of 3M sodium acetate pH 5.0 and mix. The color will return to yellow

3. Place a MinElute column in a 2ml collection tube

4. Bind DNA by adding the sample to the MinElute column and centrifuging 1 min at 13,000 RPM at RT?

5. Discard the flow through and place the MinElute column back in the same collection tube

6. Wash column by adding 750ul of Buffer PE to the MinElute column and centrifuge 1 min at 13,000 RPM at RT?

7. Discard flow-through and place MinElute column back in the same collection tube

8. Centrifuge MinElute column for an additional 1 minute to remove any residual wash buffer PE

9. Place the MinElute Column in a new labeled 1.5ml microcentrifuge tube

10. Elute DNA by adding 12ul of EB buffer (10mM Tris-HCl pH 8.5) to the center of the mem brane. Let column stand at RT? 1 min

11. Centrifuge MinElute column for 1 min at 13,000 RPM

12. Place sample on ice and proceed to validation of the library

Validate the Library

1. Load 1ul of library on an Agilent 2100 Bioanalyzer using either the High Sensitivity DNA Chip or the DNA 1000 chip

2. Calculate nM amount and adjust the concentration of each library to 2nM using EB buffer (10mM Tris-HCL pH 8.5) supplemented with 0.1% Tween20

3. Pipette up and down to mix 10x

4. For non-multiplexed samples that do not require pooling proceed to cluster generation

NOTE: Illumina recommends storing libraries diluted to 2nM in EB buffer supplemented with 0.1% Tween20. During long term storage at -20?C the Tween20 helps to prevent the absor ption of the template to the plastic tube upon

repeated freeze-thaw cycles which can decrease cluster numbers from the sample over time.

Pooling Libraries (Optional)

1. Determine the sample libraries to be pooled. Prepare a de-multiplexing guide for pooled samples

NOTE: Verify that libraries to be pooled have unique indexes!!

2. Add equal volumes of each sample to be pooled and pipette up and down 10x to mix thoroughly

3. Proceed to cluster generation

DNA测序结果分析

学习 通常一份测序结果图由红、黑、绿和蓝色测序峰组成，代表不同的碱基序列。测序图的两端（本图原图的后半段被剪切掉了）大约50个碱基的测序图部分通常杂质的干扰较大，无法判读，这是正常现象。这也提醒我们在做引物设计时，要避免将所研究的位点离PCR序列的两端太近（通常要大于50个碱基距离），以免测序后难以分析比对。 我的课题是研究基因多态性的，因此下面要介绍的内容也主要以判读测序图中的等位基因突变位点为主。 实际上，要在一份测序图中找到真正确实的等位基因多态位点并不是一件容易的事情。由于临床专业的研究生，这些东西是没人带的，只好自己研究。开始时大概的知道等位基因位点在假如在测序图上出现像套叠的两个峰，就是杂合子位点。实际比对了数千份序列后才知道，情况并非那么简单，下面测序图中标出的两

个套峰均不是杂合子位点，如图并说明如下： 说明：第一组套峰，两峰的轴线并不在同一位置，左侧的T峰是干扰峰；第二组套峰，虽两峰轴线位置相同，但两峰的位置太靠近了，不是杂合子峰，蓝色的C峰是干扰峰通常的杂合子峰由一高一略低的两个轴线相同的峰组成，此处的序列被机器误判为“C”，实际的序列应为“A”，通常一个高大碱基峰的前面1～2个位点很容易产生一个相同碱基的干扰峰，峰的高度大约是高大碱基峰的1/2，离得越近受干扰越大。一个摸索出来的规律是：主峰通常在干扰峰的右侧，干扰峰并不一定比主峰低。最关键的一点是一定要拿疑似为杂合子峰的测序图位点与测序结果的文本序列和基因库中的比对结果相比较；一个位点的多个样本相比较；你得出的该位点的突变率与权威文献或数据库中的突变率相比较。通常，对于一个疑似突变位点来说，即使是国际上权威组织大样本的测序结果中都没有报道的话，那么单纯通过测序结果就判定它是突变点，是并不严谨的，因一份PCR产物中各个碱基的实际含量并不相同，很难避免不产生误差的。对于一个未知

高通量测序生物信息学分析(内部极品资料,初学者必看)

基因组测序基础知识 ㈠De Novo测序也叫从头测序，是首次对一个物种的基因组进行测序，用生物信息学的分析方法对测序所得序列进行组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。 目前国际上通用的基因组De Novo测序方法有三种： 1. 用Illumina Solexa GA IIx 测序仪直接测序； 2. 用Roche GS FLX Titanium直接完成全基因组测序； 3. 用ABI 3730 或Roche GS FLX Titanium测序，搭建骨架，再用Illumina Solexa GA IIx 进行深度测序，完成基因组拼接。 采用De Novo测序有助于研究者了解未知物种的个体全基因组序列、鉴定新基因组中全部的结构和功能元件，并且将这些信息在基因组水平上进行集成和展示、可以预测新的功能基因及进行比较基因组学研究，为后续的相关研究奠定基础。 实验流程： 公司服务内容 1.基本服务：DNA样品检测；测序文库构建；高通量测序；数据基本分析（Base calling，去接头， 去污染）；序列组装达到精细图标准 2.定制服务：基因组注释及功能注释；比较基因组及分子进化分析，数据库搭建；基因组信息展 示平台搭建 1.基因组De Novo测序对DNA样品有什么要求？

(1) 对于细菌真菌，样品来源一定要单一菌落无污染，否则会严重影响测序结果的质量。基因组完整无降解(23 kb以上)， OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；每次样品制备需要10 μg样品，如果需要多次制备样品，则需要样品总量=制备样品次数*10 μg。 (2) 对于植物，样品来源要求是黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组培样品，最好为纯合或单倍体。基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (3) 对于动物，样品来源应选用肌肉，血等脂肪含量少的部位，同一个体取样，最好为纯合。基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (4) 基因组De Novo组装完毕后需要构建BAC或Fosmid文库进行测序验证，用于BAC 或Fosmid文库构建的样品需要保证跟De Novo测序样本同一来源。 2. De Novo有几种测序方式 目前3种测序技术 Roche 454，Solexa和ABI SOLID均有单端测序和双端测序两种方式。在基因组De Novo测序过程中，Roche 454的单端测序读长可以达到400 bp，经常用于基因组骨架的组装，而Solexa和ABI SOLID双端测序可以用于组装scaffolds和填补gap。下面以solexa 为例，对单端测序(Single-read)和双端测序(Paired-end和Mate-pair)进行介绍。Single-read、Paired-end和Mate-pair主要区别在测序文库的构建方法上。 单端测序(Single-read)首先将DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段，引物序列连接到DNA片段的一端，然后末端加上接头，将片段固定在flow cell上生成DNA簇，上机测序单端读取序列(图1)。 Paired-end方法是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块(Paired-End Module)引导互补链在原位置再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序(图2)。 图1 Single-read文库构建方法图2 Paired-end文库构建方法

高通量测序RNA-seq数据的常规分析

案例一 虽然RNA-seq早已被大家所熟知，特别是在高通量测序越来越便宜的今天，但是RNA-seq数据的分析仍令多数小菜抓狂。多个软件的使用，参数设置，参考基因组准备，输出结果的解读等等，都让很多初次接触测序数据或者非生物信息专业的人头疼不已。 哈哈，不用怕，有云生信，这都不是事儿！今天我就向大家简单介绍一下如何用云生信做RNA-seq数据的常规分析。不过在此之前，我要稍稍啰嗦一下RNA-seq的常规分析流程，请不要拍砖头。图1是RNA-seq数据从产生到分析的常规分析流程：根据实验设计，提取细胞RNA，并将RNA提交给测序公司，就可以坐等测序数据了。测序公司会根据客户提供的RNA进行建库，上机测序。拿到测序数据后，就到了我们大显身手的时候了。首先，我们要对测序结果做个简单的质量评估，剔除低质量的数据。然后，根据基因组数据（这里我们讲的是基因组数据已知的物种，基因组未知的有套独立的流程，这里不讲），将测序数据组装。根据组装结果，计算基因或转录本的表达量。最后，同芯片数据一样，我们可以根据表达量数据做很多分析，如差异表达分析，网络分析（包括蛋白互作网络，共表达网络等），也可以结合临床数据做分析（如预后，亚型分类、关联，药效等）。 图1. RNA-seq常规分析流程

叨叨完毕，进入正题。 进入尔云后，打开“测序数据处理”模块，我们会看到图2的结果。在这一模块，我们可以完成RNA-seq数据分析的前两步：1、数据质控和过滤低质量数据；2、基因组组装，计算基因表达量。对于上面两部，尔云又根据是双端测序还是单端测序，分了两块。以edgeR 为例，输出的DEGs.txt就是根据我们设定的参数得到的差异表达基因的列表，有geneSymbol, logCPM, PVlue信息。 图2. 测序数据处理模块 质控结束后，尔云会给出全部的质控结果。图3是以demo数据为例的双端测序的质控结果，好多好多呀，可以下了慢慢看。建议主要关注一下xxx_qc_TABLE，该表格是对质控前后的数据统计，反应了测序的好坏。Clean_xxx.fq是质控后的干净的fastq数据，是第2步组装的输入文件。 图3.质控结果 组装完成后，会返回一个expression.txt的表达矩阵文件，该文件是下一步差异表达分析的输入分析。 得到表达矩阵后，我们就可以进入到第3步差异表达数据分析。进入尔云的“差异分析”模块（如下图所示），它针对芯片和测序两种检测技术提供了不同的分析方案。对于RNA-seq

高通量测序的生物信息学分析

附件三生物信息学分析 一、基础生物信息学分析 1.有效测序序列结果统计 有效测序序列：所有含样品barcode（标签序列）的测序序列。 统计该部分序列的长度分布情况。 注：合同中约定测序序列条数以有效测序序列为准。 图形示例为： 2.优质序列统计 优质序列：有效测序序列中含有特异性扩增引物、不含模糊碱基、长度大于可供分析标准的序列。 统计该部分序列的长度分布情况。 图形示例为：

3.各样本序列数目统计： 统计各个样本所含有效测序序列和优质序列数目。 结果示例为： 4.OTU生成： 根据序列的相似性，将序列归为多个OTU（操作分类单元），以便后续分析。 5.稀释曲线（rarefaction 分析） 根据第4条中获得的OTU数据，做出每个样品的Rarefaction曲线。本合同默认生成OTU相似水平为0.03的rarefaction曲线。 rarefaction曲线结果示例：

6.指数分析 计算各个样品的相关分析指数，包括： ?丰度指数：ace\chao ?多样性指数：shannon\simpson ?本合同默认生成OTU相似水平为0.03的上述指数值。 多样性指数分析结果示例： 注：默认分析以上所列指数，如有特殊需要请说明。 7.Shannon-Wiener曲线 利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物信息。绘制默认水平为：0.03。 例图：

8.Rank_Abuance 曲线 根据各样品的OTU丰度大小排序作丰度分布曲线图。结果文件默认为PDF格式（其它格式请注明）。 例图： 9.Specaccum物种累积曲线（大于10个样品） 物种累积曲线( species accumulation curves) 用于描述随着抽样量的加大物种增加的状况，是理解调查样地物种组成和预测物种丰富度的有效工具，在生物多样性和群落调查中，被广泛用于抽样量充分性的判断以及物种丰富度( species richness) 的估计。因此，通过物种累积曲线不仅可以判断抽样量是否充分，在抽样量充分的前提下，运用物种累积曲线还可以对物种丰富度进行预测。

高通量测序及分析

高通量测序与功能分析 微生物群落测序是指对微生物群体进行高通量测序，通过分析测序序列的构成分析特定环境中微生物群体的构成情况或基因的组成以及功能。借助不同环境下微生物群落的构成差异分析我们可以分析微生物与环境因素或宿主之间的关系，寻找标志性菌群或特定功能的基因。对微生物群落进行测序包括两类，一类是通过16s rDNA，18s rDNA，ITS区域进行扩增测序分析微生物的群体构成和多样性；还有一类是宏基因组测序，是不经过分离培养微生物，而对所有微生物DNA进行测序，从而分析微生物群落构成，基因构成，挖掘有应用价值的基因资源。 以16s rDNA扩增进行测序分析主要用于微生物群落多样性和构成的分析，目前的生物信息学分析也可以基于16s rDNA的测序对微生物群落的基因构成和代谢途径进行预测分析，大大拓展了我们对于环境微生物的微生态认知。 目前我们根据16s的测序数据可以将微生物群落分类到种（species）（一般只能对部分菌进行种的鉴定），甚至对亚种级别进行分析， 几个概念： 16S rDNA（或16S rRNA）：16S rRNA基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因，长度约为1542bp，其分子大小适中，突变率小，是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。16S rRNA基因序列包括9个可变区和10个保守区，保守区序列反映了物种间的亲缘关系，而可变区序列则能体现物种间的差异。16S rRNA基因测序以细菌16S rRNA基因测序为主,核心是研究样品中的物种分类、物种丰度以及系统进化。 OTU：operational taxonomic units (OTUs)在微生物的免培养分析中经常用到，通过提取样品的总基因组DNA，利用16S rRNA或ITS的通用引物进行PCR 扩增，通过测序以后就可以分析样品中的微生物多样性，那怎么区分这些不同的序列呢，这个时候就需要引入operational taxonomic units，一般情况下，如

DNA测序结果分析比对(实例)

DNA测序结果分析比对（实例） 关键词：dna测序结果2013-08-22 11:59来源：互联网点击次数：14423 从测序公司得到的一份DNA测序结果通常包含.seq格式的测序结果序列文本和.ab1格式的测序图两个文件，下面是一份测序结果的实例： CYP3A4-E1-1-1(E1B).ab1 CYP3A4-E1-1-1(E1B).seq .seq文件可以用系统自带的记事本程序打开，.ab1文件需要用专门的软件打开。软件名称：Chromas 软件Chromas下载 .seq文件打开后如下图： .ab1文件打开后如下图： 通常一份测序结果图由红、黑、绿和蓝色测序峰组成，代表不同的碱基序列。测序图的两端（下图原图的后半段被剪切掉了）大约50个碱

基的测序图部分通常杂质的干扰较大，无法判读，这是正常现象。这也提醒我们在做引物设计时，要避免将所研究的位点离PCR序列的两端太近（通常要大于50个碱基距离），以免测序后难以分析比对。 我的课题是研究基因多态性的，因此下面要介绍的内容也主要以判读测序图中的等位基因突变位点为主。 实际上，要在一份测序图中找到真正确实的等位基因多态位点并不是一件容易的事情。一般认为等位基因位点假如在测序图上出现像套叠的两个峰，就是杂合子位点。实际比对后才知道，情况并非那么简单，下面测序图中标出的两个套峰均不是杂合子位点，如图并说明如下：

说明： 第一组套峰，两峰的轴线并不在同一位置，左侧的T峰是干扰峰；第二组套峰，虽两峰轴线位置相同，但两峰的位置太靠近了，不是杂合子峰，蓝色的C峰是干扰峰通常的杂合子峰由一高一略低的两个轴线相同的峰组成，此处的序列被机器误判为“C”，实际的序列应为“A”，通常一个高大碱基峰的前面 1~2个位点很容易产生一个相同碱基的干扰峰，峰的高度大约是高大碱基峰的1/2，离得越近受干扰越大。 一个摸索出来的规律是：主峰通常在干扰峰的右侧，干扰峰并不一定比主峰低。最关键的一点是一定要拿疑似为杂合子峰的测序图位点与测序结果的文本序列和基因库中的比对结果相比较；一个位点的多个样本相比较；你得出的该位点的突变率与权威文献或数据库中的突变率相比较。 通常，对于一个疑似突变位点来说，即使是国际上权威组织大样本的测序结果中都没有报道的话，那么单纯通过测序结果就判定它是突变点，是并不严谨的，因一份 PCR产物中各个碱基的实际含量并不相同，很难避免不产生误差的。对于一个未知突变位点的发现，通常还需要用到更精确的酶切技术。 (责任编辑：大汉昆仑王)

DNA测序结果分析

DNA果套峰分析 Q-12. 测序结果有很多套峰（出现很多N)，还照常收费，为什么? 返回顶端 A-12. DNA模板上出现二处以上的引物结合位点，或者DNA模板上有严重的重复序列，以及测序引物不纯时, 测序结果便会出现套峰现象（见图4)。出现这种现象的原因由DNA模板本身或者引物本身所造成，对这些结果（公司保证进行2次以上的测序工作)，公司会根据具体情况进行收费（详细见测序结果说明)。 Q-13. 为什么用PCR产物测序时，经常会出现套峰现象? 返回顶端 A-13. PCR产物测序出现套峰现象，一般有以下几种原因： 1）PCR用模板不纯或PCR用引物特异性不好，扩增出的产物除了目的片段外，还有与目的片段长度相近的片段，即使用凝胶电泳也无法分离开，这样的PCR产物测序结果是套峰。 2）结构上的原因，造成了PCR产物测序出现套峰的现象。PolyA/G/C/T以及原因不明的复杂结构的存在，都会出现测序结果套峰的情况。 Q-14. 出现套峰的原因是什么？返回顶端 A-14. 在测序反应中，模板或引物的原因都可能造成套峰的形成，归结其形成原因有以下几点 1）测序引物在模板上有两个结合位点形成套峰 2）模板不纯，如果是质粒或是菌液，原因是非单克隆，如果是PCR,原因为非特异性条带 3）模板序列的特殊结构，如poly结构、发卡结构等 4）引物降解，引物不纯，或引物的特异性不好 Q-15. 测序结果不到800 Bases，还照常收费了，为什么? 返回顶端 A-15. 如在DNA样品中的DNA序列分布匀称，没有复杂结构时，正常的测序反应能保证达到800 Bases以上。但有一些DNA样品立体结构复杂，造成聚合酶延伸反应终止，测序信号突然减弱或消失，或者测序结果出现套峰现象。出现这些现象的原因由DNA模板本身所造成（公司保证进行2次以上的测序工作)。对这些结果，公司会根据具体测序情况，进行收费（详细见测序结果说明)。出现这些情况的原因分析如下： 1) G/C rich、G/C Cluster：这种情况一般表现为测序信号突然减弱或消失（见图1)； 2) A、T的连续结构：这种情况一般表现为A、T连续结构后面的测序结果出现套峰（见图2)。根据文献记载，原因在于聚合酶进行聚合反应时，由于A或T的连续，聚合酶难以识别完整的每个A或T，在某个A或T的后面便开始进行A或T连续结构以后序列的聚合反应（打滑现象)，造成测序结果紊乱，出现套峰。出现这样的情况，建议反向测序。 一般在多少个A或T的后面能出现这种情况呢? 现在还没有这方面的报道。根据我们的经验，这一情况的出现和A或T的连续结构后面的序列的排列情况有着直接的关系。有时10多个A或T的连续结构后面便出现套峰，但有时60～70个A或T的连续结构后面的序列也一样可以完整地读出来。具体情况还有待考证。 一般来说，PCR片段直接测序时，A或T的连续结构后面的序列测序结果都会出现套峰。原因在于测序时经历了PCR反应及测序反应（测序反应本身也是PCR 反应）二次聚合酶的打滑现象。 3)原因不明的复杂结构，测序结果出现突然信号减弱或消失。从序列上看，DNA碱基排列并无特别异常。估计是DNA整体出现复杂结构，从某一位置开始聚合酶的聚合反应便无法进行（见图3)。 查看大图

高通量测序(NGS)数据分析中的质控

高通量测序错误总结 一、生信分析部分 1）Q20/Q30 碱基质量分数与错误率是衡量测序质量的重要指标，质量值越高代表碱基被测错的概率越小。Q30代表碱基的正确判别率是99.9%，错误率为0.1%。同时我们也可以理解为1000个碱基里有1个碱基是错误的。Q20代表该位点碱基的正确判别率是99%，错误率为1%。对于整个数据来说，我们可以认为100个碱基里可能有一个是错误的, 在碱基质量模块报告的坐标图中，背景颜色沿y-轴将坐标图分为3个区：最上面的绿色是碱基质量很好的区，Q值在30以上。中间的橘色是碱基质量在一些分析中可以接受的区，Q值在20-30之间。最下面红色的是碱基质量很差的区。在一些生信分析中，比如以检查差异表达为目的的RNA-seq分析，一般要求碱基质量在Q在Q20以上就可以了。但以检查变异为目的的数据分析中，一般要求碱基质量要在Q30以上。 一般来说，测序质量分数的分布有两个特点： 1.测序质量分数会随着测序循环的进行而降低。 2.有时每条序列前几个碱基的位置测序错误率较高，质量值相对较低。

在图中这个例子里，左边的数据碱基质量很好，而右边的数据碱基质量就比较差，需要做剪切（trimming），根据生信分析的目的不同，要将质量低于Q20或者低于Q30的碱基剪切掉。

2）序列的平均质量 这个是碱基序列平均质量报告图。横坐标为序列平均碱基质量值，纵坐标代表序列数量。通过序列的平均质量报告，我们可以查看是否存在整条序列所有的碱基质量都普遍过低的情况。一般来说，当绝大部分碱基序列的平均质量值的峰值大于30，可以判断序列质量较好。如这里左边的图，我们可以判断样品里没有显著数量的低质量序列。但如果曲线如右边的图所示，在质量较低的坐标位置出现另外一个或者多个峰，说明测序数据中有一部分序列质量较差，需要过滤掉。

高通量测序数据分析-环境样品数据处理方法

环境微生物群落多样性分析 QQ空间新浪微博腾讯微博微信更多71微生物群落多样性的基本概念 环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究热点。长期以来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面，对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因芯片等新技术的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。第二代高通量测序技术（尤其是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医疗健康有着重要的理论和现实意义。 在国内，微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。以在医疗领域的应用为例，通过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群落的结构和功能变化，可以对正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性进行比较分析，研究获得人体微生物群落变化同疾病之间的关系；通过深度测序还可以快速地发现和检测常见病原及新发传染病病原微生物。 研究方法进展 环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四类：传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学方法等等。 近几年，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，为微生物分子生态学的研究策略注入了新的力量。 目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包括:DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等。DGGE等分子指纹图谱技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中少数优势菌的信息；另一方面，由于分辨率的误差，部分电泳条带中可能包含不只一种 16S rDNA序列，因此要获悉电泳图谱中具体的菌种信息，还需对每一条带构建克隆文库，并筛选克隆进行测序，此实验操作相对繁琐；此外，采用这种方法无法对样品中的微生物做到绝对定量。生物芯片是通过固定在芯片上的探针来获得微生物多样性的信息，“只能验证已知，却无法探索未知”，此方法通过信号强弱判断微生物的丰度也不是非常的准确。 而近年来以454焦磷酸测序为代表的高通量测序技术凭借低成本、高通量、流程自动化的优势为研究微生物群落结构提供了新的技术平台。Roche 454高通量测序技术能同时对样品中的优势物种、稀有物种及一些未知的物种进行检测，获得样品中的微生物群落组成，并将其含量进行数字化。最近，美吉生物推出了新的测序平台———MiSeq。MiSeq高通量测序平台集中了Roche 454和Illumina HiSeq 2500的优点，不仅可实现

高通量测序分析

高通量测序分析 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(Deep Sequencing)。 对于微生物群落多样性分析，基于Roche 454 FLX +、Illumina MiSeq等第二代高通量测序平台，对核糖体DNA高变区域，比如16S/18S/ITS等序列；或功能基因，比如细菌和古菌的氨氧化酶基因、硫酸盐还原菌的异化型亚硫酸盐还原酶基因进行测序分析，揭示环境样品中众多不同类型微生物种类以及它们之间的相对丰度和进化关系。高通量测序获得庞大的数据信息，通过生物信息学手段，结合统计分析，对大量数据进行PCA、PCoA等分析，得出不同条件取样中微生物的主要组成成分是否存在差异；并进一步通过RDA分析，找到与环境因子（理化因子、疾病等）相关的微生物群落组成。探讨微生物多样性，对于研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源利用，及疾病预防和诊断等有着重要的理论和现实意义。高通量测序及微基生物的优势： 1.测序通量高，可检测到环境样品中的痕量和微量微生物。 2.PCR产物可直接进行测序，结果稳定，重复性强，实验周期短。 3.微基生物开发了一套稳定的多样本平行测序实验方案，解决了样本间数据量不平衡的技术难题，一次可实现上百个样品的平行测序。 4.微基生物采用顶级期刊杂志Science中2012年7月发表文献中的低偏差扩增（LEA-Seq）方法构建文库，更真实的还原样本中微生物的分布比例。 5. 微生物群落多样性分析有Roche 454 FLX +和Illumina MiSeq两种高通量测序平台可供选择，根据不同的测序要求提供不同的解决方案。 6.专业的生物信息学分析人员，真实准确的对测序结果进行数据分析，针对客户的不同需求，提供专业的分析流程和结果。 生物信息学分析流程： 实验流程：