核酸适配体及其在病原微生物学中的应用
生物工程学报 Chin J Biotech 2011, May 25; 27(5): 698?703 https://www.wendangku.net/doc/e28541468.html, Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@https://www.wendangku.net/doc/e28541468.html, ?2011 CJB , All rights reserved.
Received : December 22, 2010; Accepted : March 14, 2011
Corresponding author : Xianzhu Xia. Tel: +86-431-6758799; E-mail: xia_xzh@https://www.wendangku.net/doc/e28541468.html,
核酸适配体及其在病原微生物学中的应用
梁红茹1,2，杨松涛2，张涛2，胡桂秋2，夏咸柱2
1 吉林大学畜牧兽医学院，长春 130062
2 军事医学科学院军事兽医研究所，长春 130062
摘 要: 核酸适配体指利用指数富集配体系统进化技术筛选出的寡聚核苷酸片段，它可以特异性地识别靶标并与之结合，已经广泛应用于基础研究、临床诊断、纳米技术等。以下综述了适配体在微生物学方面的应用。 关键词: 适配体，病毒，细菌，指数富集配体系统进化技术
Aptamers: characteristics and applications in pathogenic microorganism
Hongru Liang 1,2, Songtao Yang 2, Tao Zhang 2, Guiqiu Hu 2, and Xianzhu Xia 2
1 College of Animal Science and Veterinary , Jilin University , Changchun 130062, China
2 Institute of Military Veterinary , Academy of Military Medical Science , Changchun 130062, China
Abstract: Aptamers are a group of artificial oligonucleotides identified by exponential enrichment system evolution technology
(Selective expansion of ligands by exponential enrichment, SELEX). Aptamers have been widely used in basic research, clinical diagnostics, and nano-technology. In this article we will introduce the technology of aptamer and summarize its applications in medical microbiology.
Keywords: aptamer, virus, bacteria, selective expansion of ligands by exponential enrichment (SELEX)
早在1988年至1989年，按照生物化学性质从人工合成的核苷酸库中分离筛选核苷酸就已经有广泛的报道。1990年，Robertson 等通过亲和层析的方法从人为构建的RNA 文库中筛选到能够高特异性和高亲和力地结合小分子ATP 的RNA 序列，此段序列即为适配体[1]；同年，Tuerk 等在试验室成功地从带有8个随机序列的RNA 文库中筛选出可特异性结合噬菌体T4 DNA 聚合酶的序列[2]。
适配体 (Aptamer) 是一种经体外筛选技术得到的寡核苷酸序列 (RNA 或DNA)，与相应的配体有严格的识别能力和高度的亲和力[3]，大小一般约6~40 kDa 。单链寡核苷酸，特别是RNA 的一些二级结构，如发夹、茎环、假节、凸环、G-四聚体等，可使核酸分子形成多种三维结构，成为适配体与靶物质特定区域结合的基础，二者之间的结合主要通过“假碱基对”的堆积作用、氢键作用、静电作用
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和形状匹配等产生高特异性的结合力。适配体具有高特异性、靶分子广、易于体外合成和修饰等优点，已经在基础研究、临床诊断和治疗中显示了广阔的应用前景。本文主要对于适配体的基本特点及其在微生物学中的应用进行综述。
1 核酸适配体的特点
大量适配体的结构已经通过酶学或化学探测，原子核磁共振 (NMR) 和X 衍射探测确定。由于它们的分子量相对比较小，NMR 方法相对更加适合检测适配体的结构。
1.1 适配体的大小
大多数情况下，应用的适配体应尽可能的小，以使成本更低，可以更容易和靶标结合等。因为功能RNA 折叠能力是有限的，适配体的最小长度通常比可控的空间序列大，而且，从体外筛选过程最初得到的适配体约50个碱基，包括用于扩增和转录的两侧固定序列区和中间随机序列。重组缺失分析、印记和体外合成法可以用于确定绑定于靶标所需的最短核苷酸的大小。最小的适配体长度范围相当广泛，例如在血管内皮生长因子内最小的长度在23~35个碱基；最小的黄嘌呤和鸟嘌呤配体有32个碱基；链霉素配体有46个碱基；与血液丝氨酸蛋白酶 (蛋白C) 结合的最小部分配体可达99个碱基。适配体分子量的范围在7.5~32 kDa ，一般标准大小是10 kDa ，标准适配体的暴露面积一般为50~60 nm 2。
1.2 适配体的靶标物质
大量的体外筛选已经表明筛选出的适配体可以特异地结合任何靶标，包括小的离子 (例如Zn 2+)、核苷酸 (例如ATP)、肽、大的糖蛋白 (例如CD4)、病毒粒子、细胞、甚至组织[4]，结合的靶标的大小可以为65 Da 到150 kDa ，理论上没有上限。
适配体结合靶标有一定的特点：1) 适配体绑定蛋白质的位点有一定的偏嗜性，大量报道表明适配体结合于蛋白质的多聚阴离子位点，例如核酸或者葡糖氨基聚糖类，包括凝血酶和其他凝血级联中的
蛋白酶、大量的肝素结合生长因子、细胞转录因子、病毒调节蛋白等；2) 适配体即使为不同的结构，它们在大蛋白上的结合位点有高度的相似性。例如，研究发现6种针对血管内皮生长因子的适配体都结合在相同的区域，它们与肝素和其他天然配体竞争结合并交联与同一个半胱氨酸，4个结构不同的适配体与反转录酶结合在同一位置。例如用3种RNA 库，不同的筛选程序，不同的筛选方法针对HIV-1的逆转录酶筛选的适配体，它们都具有假结结构并且都绑定于酶的相同位点[5]。
1.3 适配体的亲和力
已报道的适配体和靶标的亲和力变化范围很大，一般和小分子的亲和力相对比较低，例如适配体与氨基酸结合，如瓜氨酸和精氨酸，亲和力范围在0.3~65 μmol 之间；与ATP 、黄嘌呤结合的亲和力分别为6 μmol 、3.3 μmol ；与多巴胺结合的亲和力是2.8 μmol ；与维生素B12结合的亲和力是9.0 nmol ；适配体与典型核酸分子结合的亲和力在纳摩尔范围，适配体与反转录病毒整合酶结合的亲和力为10~800 nmol ；与反转录酶结合的亲和力为0.3~20 nmol ；与核蛋白结合的亲和力约为2 nmol ；与核糖体RNA 绑定氨基酸糖苷抗生素结合亲和力大约是0.8 nmol ；免疫球蛋白家族所包括的蛋白质筛选出的适配体亲和力在2~40 nmol 之间，这可能与免疫球蛋白和细胞表面糖蛋白的作用有关。
1.4 适配体的特异性
研究发现与靶标有高亲和力的适配体多数可以表现为高特异性，可以区别有相似酶活性的不同酶类，例如区分α-凝血酶和γ-凝血酶；区分猫免疫缺陷病毒和其他3种反转录病毒的反转录酶；区分仅仅有23个残基不同的蛋白激酶C 的同工酶；区分结构仅仅是1个甲基的差别的咖啡因和茶碱。
然而，适配体也只是在一定程度上具有特异性，有时也可以非特异地识别非靶标物质。例如辅酶A 的适配体也能够识别AMP ；识别黄嘌呤的适配体可以识别鸟嘌呤，但是不能识别腺苷胞嘧啶或尿
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嘧啶。 2 核酸适配体的筛选方法
适配体的体外筛选过程称为指数富集配体系统进化技术 (Selective expansion of ligends by exponential enrichment ，SELEX)，指模拟自然进化人工筛选技术，首先体外化学合成一个随机碱基数为n 的单链寡核苷酸文库，该文库则含4n 个不同的寡核苷酸序列，常用的寡核苷酸随机序列含30个碱基，库容量高达430(1018)；随机序列的两端为随后PCR 循环时结合引物所必需的固定序列，由于这种随机序列，而决定了库中每条链自然形成的空间构象，即二级结构的多样性，决定了库中潜在地存在能与各种蛋白和低分子靶物质有亲和力的核酸配体[6]。一般筛选文库的容量巨大 (可达1015左右)，理论上应用SELEX 技术能筛选到自然界几乎所有靶分子的适配子[7]。
筛选过程包含和达尔文进化理论一样的3个过程，分别是自发突变、自然选择、大量增殖，一般包括几轮筛选，每轮循环包括3个主要步骤：1) 寡核苷酸库和靶标分子孵育；2) 寡核苷酸复合物和未结合的寡核苷酸分离；3) 结合的序列用PCR 扩增[8]，再进入下轮的筛选过程，通过重复的筛选与扩增那些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的DNA 或RNA 分子被洗去，而与靶物质有强亲和力的DNA 或RNA 分子从非常大的随机库中分离出来且纯度随SELEX 过程的进行而增高，从pmol 到nmol ，有的甚至到μmol ，最后占据库的大多数 (＞90％左右)[9]，随着寡核苷酸库的逐渐富集对靶标的亲和性增加。一般经过6~15次的循环就可以获得特异性的适配体。
3 核酸适配体在病毒方面的应用
SELEX 技术发展至今，已针对广泛类型的病毒靶分子如逆转录酶、解螺旋酶、核衣壳蛋白和调节因子等筛选出了各自的适体。
目前SELEX 技术已经被广泛地应用到临床医学的各项研究领域当中，包括疾病的诊断和治疗。在多种病毒病研究中显示适配体能够识别和结合到病毒的特定部位上，适配体可以作为功能阻断剂直接影响病毒的复制、翻译中特定步骤，从而中断疾病发生；适配体也可以特异性的识别被病毒感染的细胞，从而用于诊断[10]。
3.1 在流感病毒方面的应用
流感病毒表面血凝素蛋白 (HA) 呈柱状，能与人、鸟、豚鼠等动物红细胞表面的受体相结合引起凝血，血凝素蛋白水解后分为轻链和重链两部分，后者可以与宿主细胞膜上的唾液酸受体相结合，前者则可以协助病毒包膜与宿主细胞膜相互融合，血凝素是流感病毒最重要的抗原成分，也是抗体最重要的结合位点。
2004年，Jeon 等筛选的ssDNA 适配体作用于HA 的受体绑定区域，阻断了病毒-宿主细胞的结合，而抑制流感病毒的感染，并且在细胞培养的试验证明筛选出的适配体可以阻断病毒感染细胞[11]。2006年，Gopinath 等针对A/Panama/2007/1999 (H3N2) 株HA 区域筛选出的适配体，和HA 的亲和性比单克隆抗体的亲和性高约15倍，可以用于鉴定A 型流感病毒的不同亚型，并且可以有效地抑制HA 介导的膜融合[12]。
3.2 在肝炎病毒方面的应用
肝炎病毒是指引起病毒性肝炎的病原体。甲型肝炎病毒 (HAV) 呈球形，无包膜，核酸为单链RNA ；乙型肝炎病毒 (HBV) 呈球形，具有双层外壳结构，外层相当一般病毒的包膜，核酸为双链DNA ；丙型肝炎病毒 (HCV) 是一种具有脂质外壳的RNA 病毒，直径50~60 nm ，其基因组为10 kb 单链RNA 分子。
2001年，Butz 等针对HBV 核心抗原筛选的适配体在细胞内和HBV 核心蛋白结合，能有效地干扰病毒衣壳的形成和病毒的生成[13]。2002年，Biroccio 等筛选出针对HCV 亚型1a 的RNA 适配
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体[14]；2003年，Bellecave 等筛选出针对HCV 亚型1b 的DNA 适配体[15]；2006年，Tomai 等筛选出针对HCV 亚型3a 的DNA 适配体，主要作用位点是RNA 依赖的RNA 聚合酶，抑制聚合酶的活性，从而干扰病毒的复制[16]。2009年，Kikuchi 等筛选出针对HCV 的IRES 区域Ⅱ的适配体，IRES 对于mRNA 的转录很重要，因此适配体通过影响病毒的转录，从而影响病毒的复制[17]。2006年，Fukuda 等筛选出针对HCV NS3的适配体，NS3为一种多功能酶，对于HCV 的复制和病毒扩增非常重要，筛选出的适配体在细胞水平上显示能抑制病毒的繁殖[18]。
3.3 在艾滋病毒方面的应用
艾滋病，又称获得性免疫缺陷综合症 (Acquired immune deficiency syndrome ，AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒 (Human immunodeficieney virus ，HIV) 引起的人体细胞免疫功能缺陷，导致一系列条件致病微生物感染和肿瘤发生的致命性综合征。
研究发现，在艾滋病毒的反转录酶上与适配体结合的裂隙是酶与病毒模板及引物结合的部位。Pheroze 等筛选针对反转录酶的适配体可以形成类假结结构的二级结构，细胞水平上在病毒反转录的早期可以有效地干扰HIV 的复制，阻碍病毒基因的延伸，并且毒性很小，较少形成耐药株。2000年Yamamoto 等筛选的针对Tat 蛋白的RNA 适配体，可以明显抑制HIV 的活性，在细胞水平上可以使HIV-1的复制减少70％[19]。
3.4 细胞-SELEX 病毒方面的应用
病毒感染时，在复制、组装、释放过程中，病毒蛋白会插入到细胞的表面从而修饰细胞表面成分，细胞这种表面的改变或者产生的标志物使细胞产生特异性的抗原，因此针对这种特异性的抗原设计探针可以检测病毒感染的细胞。而且，病毒感染细胞产生的标志物在未知的情况下，也可以用SELEX 技术筛选出适配体，而这种识别特异性靶标的适配体一旦筛选出可以用于检测病毒感染的细胞。2009年，Tang 等利用细胞-SELEX 技术，筛选
出识别牛痘病毒感染的A549细胞的适配体，它不仅识别病毒感染细胞，而且识别细胞质膜上病毒修饰成分[28]。
4 核酸适配体在细菌方面的应用
4.1 在细菌检测方面的应用
适配体检测抗原是近年来发展起来的新技术，将一个适配体末端交联到固相载体上作为捕获分子，去捕获待测标本中的靶物质，另一个适配体的5′端标有相应的指示剂，如荧光素、生物素、放射性同位素或胶体金等标记转化为检测分子，当检测分子与相应的待测标本结合后就会产生信号，以达到检测的目的。
结核分枝杆菌的基因编码的早期分泌蛋白ESAT-6，仅存于结核杆菌和少数几种非结核杆菌中，而所有的分支杆菌卡介苗菌株和非致病性分支杆菌中均缺失该基因，因此ESAT-6作为区分MTB 感染和卡介苗接种或环境分枝杆菌感染的特异性抗原，2007年，马占忠等以ESAT-6为靶蛋白，通过 SELEX 技术筛选获得ESAT-6的适配体，为结核病诊断和治疗试剂的开发奠定基础[21]。2010年，蔡江丽等获得结核分枝杆菌分泌蛋白64抗体的适配体并进行血清学检测方面的研究[22]。2004年，潘勤等针对pre ppilS 蛋白运用SELEX 筛选特异亲和伤感杆菌WB 型纤毛的RNA 适配子，并进行了初步RNA 适配子库的亲和力以及生物学作用的检测，为进一步研究伤寒杆菌的致病机制和预防、治疗伤寒热症的新型药物提供了基础[23]。
现在研究认为细菌是一个含有多种成分的复合物，以整个细菌作为靶分子进行筛选就可以在未知细菌的内部结构、功能的情况下筛选出与其特异性结合的一组适配体，与单个适配体相比，一组特异性的适配体必定能提高检出的敏感性和特异性；更重要的是组合应用能够提高适配体的通用性。
4.2 在细菌治疗方面的应用
虽然SELEX 技术的研究应用依然在初级阶段，
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但是适配子作为直接蛋白配体、抑制剂以及临床疾病的治疗药物已展现出潜在的应用前景，SELEX 技术出现8年后就已经有应用于临床试验的产品。适配体可以直接结合于靶物质表位，使病原不能和机体结合而使疾病得到控制。因此在理论上，适配体可以被用于治疗任何由有害基因的表达而引起的疾病，例如细菌感染、病毒感染、炎性疾病等。
2008年，杨清武等为获得内毒素 (LPS) 的抑制性适配子运用于临床脓毒症的防治，建立了从随机单链DNA (ssDNA) 文库筛选寡核苷酸的适配子的SELEX 技术平台，为后续的治疗性研究提供了平台[24]。
适配体折叠后形成的特定三维结构能与生物靶标如蛋白质结合，因此适配体可以直接作为蛋白配体，占据了致病因子的靶物质表位，从而控制疾病的发生。
5 其他
原生动物锥虫cruzi 是导致Chaga 病的病原虫，这种疾病通常侵犯神经系统和心脏，未经治疗的死亡率很高。针对锥虫成虫期的RNA 适配子能够使平均受侵害的细胞中的锥虫数目呈剂量依赖方式减少。1 μmol/L 的适配子能够抑制50％~70％的锥虫的入侵。
此外，适配体可以作为分子探针用于很多疾病的诊断，例如通过筛选出特异性的适配体，可以用于肿瘤的诊断。
6 展望
适配体自问世以来取得了令人鼓舞的进步，特别是一些SELEX 衍生技术的发展，使核酸适配体作为诊断和治疗药物的想法逐渐变为事实，迄今已有适配体药物进入临床前期或临床期试验，并逐步成为一类新型药物。Merck Serono 的董事Bernhard Kirschbaum 认为Aptamers 将在下一代的治疗药物
中起着非常关键的作用。
2004年末，Pifzer 和Eyetech 公司共同研制的用于治疗湿性老年黄斑变性的核酸适配子药物“Macugen ”(又名Pegaptanib) 在美国被批准上市，适配子在治疗方面的研究越来越深入。Aptamera 公司研制的AGRO100是一种新型的核酸适体药物，临床前试验表明AGRO100可在癌细胞表面与 Nucleolin 结合，抑制癌细胞DNA 的复制并诱导细胞凋亡，并对多种癌细胞均有抑制作用，如肺癌、宫颈癌、恶性黑色素瘤及白血病等，该药已于2003年第3季度进入Ⅰ期临床试验。
适配体作为一种新型的核酸药物正迅速发展，但是也存在一些不足之处，例如适配体虽然能与靶分子高亲合强特异性结合，但它难以穿透细胞膜与靶分子接近；适配体的半衰期大多较短。为了克服适配体难以接近和穿透靶组织的缺点，位点特异的传递系统成为药物合成研究的热点，而采用基因治疗的方法，构建重组病毒然后在体内表达外源的RNA 适体也成为一种新思路。相信随着适配体研究的深入，以及适配体筛选制备技术水平的提高，以上问题将逐步得到解决。而且由于适配体的高特异性、高亲合力、可修饰性，它不但在疾病的治疗诊断上有十分广阔的前景，而且在人类基因组学、蛋白组学的研究中也将成为极为重要的研究工具之一。
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DNA核酸适配体合作协议书【模板】
DNA核酸适配体合作协议书 甲方：我方 乙方：合作方 本协议甲方和乙方就靶标名称？？？？ DNA核酸适配体的相关合作达成共识，双方本着平等自愿、互惠互利原则，就结成长期合作关系，经友好协商达成以下合作意向。 一、合作总则 为特异性结合靶标名称？的单链DNA核酸适配体更好的进行应用，双方同意建立合作关系，甲方负责提供特异性结合靶标名称？的核酸适配体序列，乙方在此基础上开展应用方面的实验研究。 二、责任和义务 1.甲方责任和义务 1.1甲方承诺提供给乙方的数据以及实验条件真实可靠。提供的数据包含OX40?? 特异 性核酸适配体筛选方法和亲和力测试方法，亲和力数据，核酸适配体序列信息等（附 件一）。 1.2根据乙方的实际情况和要求，乙方在研究过程中，如果遇到了需要甲方提供该适配 体相关信息的地方，甲方应积极配合乙方，共同制定具体实施方案和安排，以促进 项目的顺利进行。 1.3在项目进行过程，未经乙方同意，甲方不得自行公开本合同中乙方基于甲方的核酸 适配体序列取得的研究进展，但不包括双方合作前甲方已得到该核酸适配体的信息。 1.4甲方应当保证其交付给乙方的研究开发成果和样品不侵犯任何第三人的合法权益， 如因甲方提供的研发成果及样品等导致乙方遭受任何索赔、指控时，甲方应承担相 应法律责任并承担乙方由此受到的损失。 1.5甲方不得限制乙方就甲方提供的核酸适配体所获得的研究成果发表研究论文或申 请专利。 2.乙方责任和义务 2.1乙方应尽力推进课题的实施，实验过程中应与甲方及时沟通研究进展。 2.2未经甲方同意，乙方不得公开本合同中甲方使用的实验方法和数据，不得公开甲方 提供的核酸适配体序列。乙方在以甲方提供的核酸适配体为基础，获得的研究成果 发表第一篇论文或申请第一项专利前，应征得甲方许可。
粘附素核酸适配体及其筛选方法和应用的制作技术
本技术公开了一种黏附素适配体及筛选该黏附素适配体的方法，本技术以幽门螺杆菌基因组DNA为模板，扩增得到其黏附素基因，将得到的基因与表达载体连接获得筛选靶标，再将筛选靶标与随机单链ssDNA文库孵育，SELEX筛选，PCR扩增文库，然后经多轮筛选得到黏附素核酸适配体。本技术还公开了该黏附素适配体在制备幽门螺杆菌的检测试剂盒以及制备幽门螺杆菌免疫药物中的应用。本技术的黏附素核酸适配体具有较高的亲和力与特异性，分子量小、渗透性强，相对现有技术能够更直观的反应机体感染Hp的状况。 技术要求 1.一种黏附素核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列含有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列；或含有以下任意一种核苷酸序列：与SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列同源性在60％以上、与SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列进行杂交的序列、SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列转录的RNA序列。 2.根据权利要求1所述的黏附素核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列被甲基化、巯基化、磷酸化、氨基化或同位素化。 3.根据权利要求1或2所述的黏附素核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列上连接有荧光物质、治疗性物质、放射性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料或酶标记。 4.一种权利要求1所述的核酸适配体的的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)以幽门螺杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到幽门螺杆菌黏附素(Hpa A)基因； (2)将得到的基因与表达载体Pet28a质粒经酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌E.coli BL21菌株并诱导表达，裂解细菌，纯化，获得的重组粘附素Hpa A即为筛选靶标； (3)将步骤(2)得到的黏附素Hpa A与ssDNA文库进行孵育，收集与筛选靶标结合的ssDNA； (4)将得到的ssDNA进行PCR扩增，得到dsDNA； (5)得到的dsDNA与pUC19质粒经酶切后连接，并转入大肠杆菌E.coli DH5α菌株； (6)选取阳性克隆测序，并验证阳性克隆扩增得到的ssDNA与Hpa A的结合力，得到核酸适配体。 5.如权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中Hpa A引物序列为： F:5’-CGGATCCTGCAGCCCGCATATTATTG-3’； R:5’-CAAGCTTTCGGTTTCTTTTGCCTTTT-3’。 6.如权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，ssDNA文库包括序列： 5’-CGGATCCATCCAGAGTGACGCAGCA-N45-TGGACACGGTGGCTTAGT-3’； 引物P1：5’-CGGATCCATCCAGAGTGACGCAGCA-3’； 引物P2：5’-GAAGCTTACTAAGCCACCGTGTCCA-3’。 7.如权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，将纯化的粘附素Hpa A包被于聚苯乙烯微孔中，然后将合成的ssDNA文库溶于筛选缓冲液投入其中，洗下结合的ssDNA作为下一轮的模板；第五轮后以空白孔为负向筛选介质。 8.权利要求1-3任意一项所述的黏附素核酸适配体或其衍生物在制备检测幽门螺杆菌的试剂盒、分子探针或靶向介质中的应用。
基于核酸适配体的蛋白质研究新技术和新方法
项目名称：基于核酸适配体的蛋白质研究新技术和新方法首席科学家：谭蔚泓湖南大学 起止年限：2011.1至2015.8 依托部门：教育部 二、预期目标 总体目标: 本项目针对当前蛋白质研究中存在的瓶颈问题，发展基于核酸适配体的蛋白质研究新技术新方法；以肝癌和食管癌为研究对象，面向我国社会发展中提高人类健康的重大需求，通过建立肝癌和食管癌相关蛋白的发现、分离分析、检测表征等新技术，探索肝癌和食管癌发生发展的分子机制，为恶性肿瘤等重大疾病早期诊断提供新技术和新方法。通过开展多学科交叉与综合研究，形成具有原始创新的方法学突破及自主知识产权的蛋白质研究支撑平台，获得具有国际影响的重要研究成果，培养造就一支具有多学科知识和创新研究能力的研究队伍，促进我国在蛋白质研究领域达到国际领先水平。 五年预期目标： 1. 阐明核酸适配体筛选过程的进化规律，建立针对蛋白质、细胞、组织等不同层次蛋白质靶标体系的高效率核酸适配体筛选技术平台，并筛选出针对肝癌和食管癌特异性标志物的核酸适配体15-30种。 2．揭示核酸适配体与蛋白质相互作用的分子机制，发展2-4种具有自主知识产权的系统研究核酸适配体分子识别的方法，为核酸适配体分子探针的设计、筛选、构/效关系和性能评价提供理论指导。 3. 发展高灵敏、高通量、高准确度的蛋白质定量检测的新原理、新方法，
提出高效率、高重现性的蛋白质分离富集的新方法、新技术，研制出相应高通量、自动化的蛋白质分离及检测系统，对低丰度蛋白检测的灵敏度达到1 pg/mL及更低水平，为肿瘤的蛋白质生物标志物的发现、重大疾病的分子机制研究与早期诊断提供研究工具。 4. 建立肝癌、食管癌等恶性肿瘤体系的特征核酸适配体分子识别指纹图谱，发现4-5种特异性高的癌症标志物，并完成核酸适配体分子识别体系在癌症早期诊断中的临床意义评估, 开发具有自主知识产权的诊断系统。 5. 取得有国际影响的重要基础研究成果，提出有自主知识产权的新理论和新方法。发表一批高水平、具有重要国际影响的学术论文。申请并获得一批具有产业化前景的发明专利。 6. 在蛋白质研究领域培养一批具有化学与生物医学交叉学科综合知识的优秀人才队伍与中青年研究骨干。通过项目协作，促进形成一支在核酸适配体相关领域具有国际领先水平的学术团队。 三、研究方案 （一）总体思路 （1）以肿瘤为研究模型，发展基于核酸适配体的蛋白质研究技术本项目从“国家中长期科学和技术发展规划纲要”中“人口与健康”等国家重 大战略需求出发，以2008年度起蛋白质研究重大计划重要支持方向“蛋白质研究的新技术和新方法”——“核酸适配体识别等新技术新方法”为依据，发挥核酸适配体所具备的高特异性、高亲和力、高稳定性、便于化学修饰与功能化、易于大量低成本与可重复性合成等优势，以及可通过核酸适配体筛选发现未知蛋白标志物并获得病变体系特征分子图谱的优越性，开展核酸适配体分子识别基础研究，指导蛋白质分离与检测方法的设计与发展，建立高通量、高灵敏、高准确度的蛋白质研究新方法和新技术，为癌症早期诊断提供特异性蛋白质标志物、分子探针、分子识别传感器件，满足提升我国人民健康水平的需求。
【CN110111849A】一种基于高性能计算平台的核酸适配体计算机辅助筛选方法及核酸适配体【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910379241.4 (22)申请日 2019.05.08 (71)申请人 北京市计算中心 地址 100094 北京市东城区东四南大街249 号 申请人 北京理工大学 (72)发明人 刘彤 屈锋 裴智勇 刘书霞 陆晓娟 刘满姣 袁寒玉 杨杰 (51)Int.Cl. G16B 50/00(2019.01) G16B 30/00(2019.01) (54)发明名称一种基于高性能计算平台的核酸适配体计算机辅助筛选方法及核酸适配体(57)摘要本发明提供了一种基于高性能计算平台的核酸适配体计算机辅助筛选方法，涉及分子生物学检测技术领域，根据匹配原则查询筛选平台集成的数据库系统中是否有与目标蛋白匹配的蛋白结构，如果有则作为受体模板，如果没有则进行同源构建，通过分子动力学模拟和分子对接筛选得到初选的核酸适配体，最为核酸适配体候选物，具有高效、快捷、准确率高的特点。该筛选方法可与“湿法”实验结合，减少“湿法”实验次数，节省实验成本，提高筛选成功率。通过计算机辅助模拟分析得到适配过程中蛋白质与核酸分子间化学反应机理等信息，并将数据在终端进行展示，并在揭示相应生物材料与核酸分子间可能的相互作用机理方面提供数据支撑，因此具有重要 的研究意义和使用价值。权利要求书2页 说明书11页 附图2页CN 110111849 A 2019.08.09 C N 110111849 A
权 利 要 求 书1/2页CN 110111849 A 1.一种基于高性能计算平台的核酸适配体计算机辅助筛选方法，其特征在于，包括： 步骤一，对数据库进行筛选，筛选出具有蛋白A相应结构的蛋白质数据库和核酸数据库，蛋白A为目标蛋白； 步骤二，对经过第一步筛选后的数据库进行下载，并对所述经过第一步筛选后的所述数据库中的数据进行数据处理，所述经过第一步筛选后的数据库和经过第一步筛选后的所述数据库中的数据存储录入筛选平台数据库系统中； 步骤三，搭建核酸适配体计算生物学筛选平台进行核酸适配体筛选； 包括：蛋白体系的构建： 所述蛋白体系的构建包括： S01：根据匹配原则查询所述筛选平台数据库系统中是否有与所述蛋白A匹配的蛋白结构： 如果所述筛选平台数据库系统中具有与所述蛋白A匹配的蛋白结构，则下载所述蛋白结构作为受体模板； 如果所述筛选平台数据库系统中没有与所述蛋白A匹配的蛋白结构，则进行同源构建； S02：根据所述受体模板或所述同源构建方法构建A蛋白三维结构； S03：对所述蛋白A进行分子动力学模拟，获得A蛋白稳定结构； S04：将所述蛋白A稳定结构与所述筛选平台数据库系统中的核酸分子进行对接；判断所述蛋白A稳定结构与所述核酸分子是否对接成功： 如果对接成功，则所述核酸分子为初选核酸适配体。 2.根据权利要求1所述的基于高性能计算平台的核酸适配体计算机辅助筛选方法，其特征在于，步骤二中所述数据处理包括：对经过所述第一步筛选后的所述数据库需求数据，从后台下载，对所述需求数据进行统一整合形成存储数据，存储录入筛选平台中数据库系统中。 3.根据权利要求2所述的基于高性能计算平台的核酸适配体计算机辅助筛选方法，其特征在于，所述存储数据包含蛋白的三维晶体结构序列信息、名称信息，将所述存储数据录入相应的后台数据库表格中，用以后续的存取、调用和删减操作。 4.根据权利要求1所述的基于高性能计算平台的核酸适配体计算机辅助筛选方法，其特征在于，所述S01步骤中是在所述筛选平台数据库系统中的所述蛋白质数据库进行查询；所述S04步骤中是与所述筛选平台数据库系统中的所述核酸数据库中的核酸分子进行对接。 5.根据权利要求1所述的基于高性能计算平台的核酸适配体计算机辅助筛选方法，其特征在于，所述S03步骤中所述分子动力学模拟过程包括： S0301：构建所述蛋白A格式文件； S0302：选择与所述蛋白A格式文件合适的力场文件； S0303：提交所述蛋白A格式文件与所述力场文件，进行计算。 6.根据权利要求1所述的基于高性能计算平台的核酸适配体计算机辅助筛选方法，其特征在于，所述S04步骤中所述核酸分子对接过程包括：安装分子对接软件； 还包括： S0401：构建与所述蛋白A进行分子对接的格式文件； 2
基于核酸适配体化学发光检测新技术(精)
基于核酸适配体化学发光检测新技术 核酸适配体是近年来发展起来的一类经体外人工合成筛选出的单链寡核苷酸,能高效、特异性地结合各种生物目标分子,故它的出现为化学生物学界和生物医学界提供了一种新的高效快速识别的研究平台。目前生物分子检测通常采用抗原抗体特异相互作用识别模式,但由于受到抗体易失活、制备时间较长等因素的影响,在一定程度上限制了抗体检测技术的广泛应用。相比之下,核酸适配体自身稳定性好、制备合成相对简单、快速、易获得、易功能化修饰与标记,且在生物传感器设计中应用灵活等优点,近几年在生物分析检测方面备受关注。目前已经成为临床诊断、环境监测、药学研究等许多领域中的研究热点。化学发光(CL)分析法具有不需光源,避免了杂散光的干扰,仪器设备简单、操作简便,具有极高的灵敏度,较宽的检测范围,可实现全自动化等特点,正逐渐成为分析检测中极为有用的工具,随着与众多学科交叉研究和应用领域的扩展,目前已成功地应用在药学、生物学、分子生物学、临床医学和环境学等诸多领域。在本论文中,我们采用化学发光分析法,利用核酸适配体对目标分子的高分辨识别,发展了多种具有创新意义的化学发光适配体生物传感器,也实现了同一份样品中双组分的同时检测。整个论文由以下五部分构成:第一章:绪论本绪论由两节构成,第一节介绍了核酸适配体技术检测生物分子的研究进展,包括了三部分。第一部分中简单介绍了核酸适配体的制备、特点、优势以及在分析领域中的应用;第二部分中介绍了基于核酸适配体识别模式的单组分检测技术的研究进展及其意义,主要内容包括:光检测、电化学检测以及其他检测方法,并列举了近年来分析领域中的部分典型示例;第三部分中介绍了基于核酸适配体识别模式的多组分检测技术的研究进展及其意义,也列举了近年来它们在该分析领域中的部分典型示例。第二节阐述了化学发光多组分酶检测研究进展以及本课题研究的目的、意义、主要研究内容以及创新之处,即核酸适配体在化学发光领域中应用与展望。第二章:基于核酸适配体的化学发光无标记检测腺苷的新技术由于目标分子在适配体上精确的结合位点与构象变化通常并不十分清楚,直接导致合适标记核酸适配体存在一定的难度,因此,适配体的无标记型检测技术已成为近年来的研究热点,尤其在生物检测、环境监控等领域无标记简单快速检测具有非常重要的意义。本章以腺苷为研究对象,采用羧基修饰的磁性微球作为分离载体,基于3,4,5-三甲氧基苯甲酰甲醛(TMPG)与鸟嘌呤(G)碱基之间的瞬时化学发光衍生反应,实现了生物小分子腺苷的无标记检测。本章包括以下两种腺苷检测原理的设计,具体实验步骤如下:(1)活化磁性微球,固定捕获探针序列;(2)方法A:一定量的适配体先与不同量的腺苷特异性结合,随后剩余的自由腺苷适配体与捕获探针序列在磁性微球表面进行杂交反应,从而连接在磁性微球上;方法B:适配体先与捕获探针序列进行杂交反应,随后加入不同量的腺苷,导致部分适配体序列脱离磁性微球表面,与溶液中腺苷形成复合物;(3)磁性分离后,TMPG直接检测结合在磁性微球表面的适配体中G碱基产生的CL信号,进行腺苷间接定量。结果表明:该两种方法均具有准确可靠、重现性和选择性好的特点。第一种方法的最低腺苷检测限为8×10~(-8)M,腺苷浓度在4×10~(-7)-1×10_(-5)M范围内,CL 信号呈线性增加(R~2=0.9852);第二种方法的腺苷浓度在4×10~(- 2)5×10(_5)M范围内,CL信号呈线性增加(R~=0.9764)。综合而言:本章发展的无标记检测生物小分子腺苷的CL新技术,具有简单,快速,灵敏度高等特点,有望在临床诊断、药学研究以及环境监测等领域发挥作用。第三章:基于核酸适配体
核酸适配体
SELEX适体选择的过程 RNA或DNA的核酸片段，与蛋白质，多肽或小分子结合，使三维结构互补。蛋白质，多肽或小分子。“适”来自拉丁词Aptus匹配。可应用于各种领域包括传感器探针，用于医疗诊断和环境毒性检测，分子成像，病毒治疗如疫苗和抗病毒药物，靶向药物送的发展与开拓新兴心态注定改变范式病人的护理。这个有前途的适体可在体外用。这个过程被称为“SELEX（系统的演变通过指数enrechiment 配体）”，在体外进化，库的单链DNA或RNA包含40-60基地随机序列区在~ 20基本常数序列引物地区有利于放大产生。SELEX过程继续，直到收敛于一个收集池序列为目标的亲和力和通常得到的周期后8-15选择。由于他们的高亲和力和选择性，适配体已经成功地分离出目标包括范围广泛小分子，肽，蛋白质，甚至整个cells5-8。在这里，在技术回顾系列，我们将在评价的适体技术更集中毒性。特别是，在这个问题上，不同的技术为获得适体，包括“技术”要讨论。传统的适体的选择技术的“技术”采用SELEX最成功的适体代表1 109 1013的分子在1从library9。通常选择过程的开始与低比例的核酸蛋白质为检查是否所有的分子结合的target10。选择第一轮需要长时间的培养时间和不严格的条件，而后来的周期通常需要严格的条件，如改变缓冲液条件下，反应体积和时间的潜伏期。 之间的核苷酸结合后的反应图书馆与靶分子，绑定物种分离通过各种分离技术。然后，该放大的分子被用于下一轮选择过程。目标结合的分离未结合的适配体在筛选的过程是成功的适体的选择是至关重要的一步。适体的选择是通过连续重复丰富目标绑定和未绑定的寡核苷酸去除步骤，其次洗脱，放大，和所选择的寡核苷酸净化。由于蒂尔克和黄金的第一次尝试使用硝酸纤维素过滤方法，其他几个适体被选定，它仍然被认为是一种有效的分离的方法。硝化纤维素过滤器的结合用于广泛调查的平衡结合和蛋白质oligonucleitides络合物的动力学性质由于硝基优先保留蛋白质和蛋白质的DNA或RNA复杂但不是免费的寡核苷酸。完成整个选择的过程，通常需要12个周期，之后选定的分子可以被克隆到一个合适的载体并测序。SELEX方法，而过滤策略已用于隔离适体对各种靶蛋白，这种技术仍然是一个繁琐，耗时的过程。此外，一些DNA核酸适配体已选择使用硝酸纤维素大肠杆菌RecA protein11）。同时，由于分离过滤效率，大量的选择轮是必需的。传统的各种改进技术1990中描述的方法已被报道在近十年来，如毛细管电泳（CE）- SELEX，量身定制的SELEX，切换技术，照片—研究开发新的技术应用简单，容易和廉价的方法，如非SELEX，NP（纳米）- SELEX（例如，磁珠，胶体金粒子），细胞SELEX，溶胶-凝胶技术和微流控技术。在本审查，几个隔离高亲和力的先进的分离方法和特异性核酸适配体的提供。这些新的变异大大缩短时间的选择和改进适体的亲和性和特异性。基于核酸适体的选择neccem；非SELEX毛细管电泳的应用（CE）为SELEX造成了巨大的改进
核酸适配体在治疗肿瘤中的的作用
核酸适配体在治疗肿瘤中的的作用 江西理工大学邹涛 摘要： 核酸适配体是一类能够特异性地和靶物质结合的寡核苷酸序列。它可作用于蛋白质、金属离子、小分子化合物、细胞膜表面受体等靶标。该寡核苷酸序列可以是RNA也可以是DNA，较其他识别分子而言，适配体具有性质稳定、易合成、易标记、分子量较小和目标分子广泛等优势。其结合能力可与抗体相当甚至更强, 并可结合各种药物及载体构建多元复合靶向给药系统用于肿瘤靶向治疗, 在生物医学领域引起了极大的关注.。 关键词：核酸适配体；肿瘤治疗；量子点 1990年，Ellington与Szostak及Tuerk与Gold筛选出了能与T4 DNA聚合酶高亲和力和特异性结合的随机寡核苷酸，并命名为核酸适配体(aptamer,Apt)，该筛选方法被命名为指数富集的配体系统进化技术(SELEX)，原理是首先构建容量巨大的随机寡核苷酸序列库，然后经过多轮结合和洗脱，从中筛选得到能够和靶标物质高亲和力结合的寡核苷酸。核酸适配体是通过折叠形成特定空间结构而与靶标结合，其亲和力可与抗体相当，亲和常数(Kd)可达纳摩尔或皮摩尔水平。近年来，核酸适配体受到科学家的广泛关注，由于其分子量较小、可化学合成、生物相容性好等优点，其在基础、临床、药物开发中的研究不断增多，越来越多的针对生命活动中重要分子的适配体被筛选出来，各种基于核酸适配体的分析方法和技术也有报道，核酸适配体在生物医学、疾病诊疗领域已显示出广阔的应用前景。靶向配体在抗肿瘤药物靶向传递方面有很大的应用潜能，其对靶分子结合的选择性可赋予抗癌药物靶向特异性，同时增加药物在病变组织内的富集。核酸适配体可体外合成且易于修饰，同时因其带负电荷，在体循环中很少参加非特异性相互作用。它们对靶物质可高亲和力并特异性地结合，使其具有高的穿透性。抗肿瘤药物一般都是在细胞内发挥作用，提高药物摄取量是其有效性的关键。纳米粒子能通过细胞内吞途径进入细胞，如果将核酸适配体连接到纳米粒子表面，药物靶向肿瘤细胞后，可介导内吞发生，有利于提高药物摄取量，这种给药方式成为目前研究的热点。以下综述了核酸适配体在肿瘤靶向治疗中的研究进展。 1 肿瘤标志物 肿瘤标志物(Tumor Marker)是反映肿瘤存在的化学类物质。它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。利用它的这一特性，可以筛选出某一肿瘤标志物的特异性适配体，从而靶向肿瘤细胞，达到诊断和治疗的目的。 1.1甲胎蛋白 甲胎蛋白（AFP）是肝细胞癌定性诊断中最重要的血清肿瘤标志物。利用
生物化学-核酸适配体及其在检测领域中的应用
核酸适配体及其在检测领域中的应用 （学号姓名） 南京师范大学化学与材料科学学院 摘要：核酸适配体是一段DNA或者RNA序列，是利用体外筛选技术——指数级富集配体系统进化技术从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段，该片段能与目标分子作用产生特殊的构象形式，对目标分子具有高度亲和力和专一的识别能力。核酸适配体通常由化学合成，不依靠生物；价格便宜；且易于保存；而且标记后的核酸适配体一般与目标分子的结合力不会改变。因此基于核酸适配体的生化检测技术到人们极大的关注[1]。本文基于对核酸适配体的基本了解，通过对SELEX技术及对核酸适配体在检测领域中的研究进展的了解做了简单的概述。 关键词：核酸适配体，检测 0 引言 核酸适配体是寡核苷酸DNA或RNA，长度一般为20-80个核苷酸，它对很广范围内的物质都具有极强的亲和性能和特异性能，这些物质如药物类、蛋白质类、碳水化合物、氨基酸、类脂、有机分子或者是无机分子类以及其它的小分子。核酸适配体的出现，使抗原抗体的反应发生了革命性的变化，它大大弥补了现有抗体的不足，也为传统免疫传感器发展开辟了一条新的道路。[2] SELEX技术即指数级富集配基系统进化技术。利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体(Aptamer)。自Tuerk 等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异寡核苷酸配基后，经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具。 1 发现核酸适配体的技术——SELEX技术 核酸适配体，是指一小段能与相应配体专一性紧密结合的寡核苷酸序列，一般由几十个核苷酸组成，可以是DNA也可以是RNA，最早是由Tuerk和Gold 发现的。1990年，Tuerk等提出了一种新的体外筛选和扩增核酸的方法，命名为
基于核酸适配体的微流控芯片酶反应器用于蛋白质的分析_肖鹏
２０１２年１１ 月Ｖｏｌ．３０ Ｎｏ．１１Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１２ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ １１２７～１１３２ 研究快报 ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１１２３．２０１２．０７０１９ ＊通讯联系人：邓玉林，教授，博士生导师，主要从事蛋白质组学新技术和新方法的研究等．Ｔｅｌ：（０１０）６８９１５９９６，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｅｎｇ＠ｂ ｉｔ．ｅｄｕ．ｃｎ． 基金项目：科技部科技支撑计划（２００９ＢＡＫ５９Ｂ０１）和北京市科技专项（Ｚ１１１１０２０５５３１１０７７）．收稿日期：２０１２－０７－ １１基于核酸适配体的微流控芯片酶反应器用于蛋白质的分析 肖 鹏， 李大雷， 满 燕， 耿利娜， 吕雪飞， 邓玉林＊ （北京理工大学生命学院，北京１０００８１ ）摘要：将核酸适配体作为胰蛋白酶固定化介质，制备了一种新型的微流控芯片酶反应器，并与高效液相色谱－串联质谱联用，搭建了在线分析平台；分别使用标准蛋白及混合蛋白样品对芯片的酶解效率及联用平台的分析能力进行了初步评价。结果表明，５ ｎｇ肌红蛋白经该平台分析后肽段覆盖率可达到３７％；对５００ ｎｇ混合蛋白进行３次平行分析，肽段覆盖率及相对标准偏差分别为４４．３％、６．５％（牛血清白蛋白），６５．０％、２．７％（肌红蛋白）和６２．０％、５．６％（ 细胞色素ｃ）；初步实验表明，该在线分析平台具有检测灵敏度高、重现性好、酶解效率高的特点，有望在蛋白质组学分析中发挥重要作用。 关键词：高效液相色谱－串联质谱；胰蛋白酶；蛋白质；核酸适配体；芯片酶反应器中图分类号：Ｏ６５８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－８７１３（２０１２）１１－１１２７－ ０６Ａｎ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｏｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｐ ｔａｍｅｒ ｍｏｄｉｆｉｅｄｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈｉｐ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓＸＩＡＯ Ｐｅｎｇ ，ＬＩ Ｄａｌｅｉ，ＭＡＮ Ｙａｎ，ＧＥＮＧ Ｌｉｎａ，Ｌ Ｘｕｅｆｅｉ，ＤＥＮＧ Ｙｕｌｉｎ＊ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｓ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ａｐｔａｍｅｒ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｓｔｕｄｉｅｄ ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｗｉｄｅｌｙ ｉｎ ｎｕ－ｍｅｒｏｕｓ ｓｃｉｅｎｃｅ ｆｉｅｌｄｓ ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙ ｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｏｒ ｈａｓ ｄｒａｗｎ ｍｕｃｈ ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｂｅ－ｃａｕｓｅ ｏｆ ｉｔｓ ｓｔｒｉｋｉｎｇ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ，ｓｕｃｈ ａｓ ｈｉｇｈ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｅａｓｅ ｉｎ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｅｐ－ａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ａ ｎｏｖｅｌ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｈｉｐ，ｗｈｉｃｈ ｉｍｍｏｂｉ－ｌｉｚｅｄ ｔｒｙｐｓｉｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｐｔａｍｅｒ，ｗａｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ａｎｄ ｐｒｏｐｏｓｅｄ．Ａｎ ｏｎｌｉｎｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｌａｔｆｏｒｍ，ｗｈｉｃｈｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ ａｎ ａｐｔａｍｅｒ－ｂａｓｅｄ ｃｈｉｐ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃ－ｔｒｏｍｅｔｒｙ，ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａ６－ｐｏｒｔ ｖａｌｖｅ ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃｃａｐａｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｃｈｉｐ ｒｅａｃｔｏｒ ｗｅｒｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｍｉｘｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓａｍ－ｐｌｅ，ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ），ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ（Ｍｂ）ａｎｄ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ（Ｃｙｔ．ｃ）．Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｉｐ ｒｅａｃｔｏｒ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ５．７６ ｓ ｗｈｉｌｅ １μＬ／ｍｉｎ ｏｆ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｗａｓ ａ－ｄｏｐｔｅｄ；ａｎｄ ｍｏｒｅｏｖｅｒ，５ ｎｇ ｏｆ Ｍｂ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｏｆ ３７％．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｖｅｒａｇ ｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ４４．３％ａｎｄ ６．５％ｆｏｒ ＢＳＡ，６５．０％ａｎｄ ２．７％ｆｏｒ Ｍｂ，６２．０％ａｎｄ ５．６％ｆｏｒ Ｃｙｔ．ｃ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｗｈｅｎ ５００ ｎｇ ｄｉｇｅｓｔｏｆ ｍｉｘｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｒｕｎｓ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ，ｔｈｅ ｏｎｌｉｎｅ ａｎａｌ－ｙｓｉｓ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｇｏｏｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｐｒｏｍ－ｉｓｉｎｇ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅａｒ ｆｕｔｕｒｅ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）；ｔｒｙｐｓｉｎ；ｐｒｏｔｅｉｎ；ａｐｔａｍｅｒ；ｃｈｉｐ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｏｒ（ｃｈｉｐ ＩＭＥＲ） 在后基因组时代， 发展和建立新型的快速且准确的蛋白质组分析方法是各国科学家努力的方 向［１］ 。目前，基于质谱分析技术的蛋白质组学研究 策略主要有两种，分别为“Ｔｏｐ －ｄｏｗｎ”和“Ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ”［ ２－４ ］ 。无论采取哪一种策略进行蛋白质组的分析，对蛋白质进行片段化都是必不可少的关键步骤。
核酸适配体用于肿瘤靶向治疗的研究进展汇总
高级生物化学 论文题：核酸适配体用于肿瘤靶向治疗的研究进展单位：中科院武汉物理与数学研究所 专业：分析化学 学号：XXX 学生姓名：XXX
核酸适配体用于肿瘤靶向治疗的研究进展 （XXX） 摘要 核酸适配体，包括DNA，RNA和多肽核酸适配体，是一类能够特异性地和靶标物质结合的寡核苷酸序列。核酸适配体与靶标具有非常高的亲和力，可以很好的选择性识别目标分子的性能，已经得到了了极大的关注。他们通长被用作生物分子探针、药物释放以及疾病的诊断和治疗（尤其是用于癌症诊断和治疗）。在这篇综述里，我们简要的综述了最近几年DNA和RNA核酸适配体用于肿瘤诊断和治疗的文献。 关键词：核酸适配体、肿瘤诊断、药物释放、纳米粒子、siRNA Abstract Aptamers, including DNA, RNA and peptide aptamers area group of promising recognition units that can specifically bind to target molecules and cells. Due to their excellent specificity and high affinity to targets, aptamers have attracted great attention in various fields in which selective recognition units are required. They have been used in biosensors, drug delivery, disease diagnosis and therapy (especially for cancer). In this review, we are concise and to the point to summarize recent applications of DNA and RNA aptamers in cancer treatment. Keywords: Aptamer, cancer diagnosis, drug delivery, nanoparticles, siRNA 1 引言 1990年，Ellington与Szostak[1]及Tuerk与Gold[2]筛选出了能与T4DNA聚合酶高亲和力和特异性结合的随机寡核苷酸，并命名为核酸适配体(aptamer，Apt)。随技术的发展，核酸适配体逐步扩展到非核酸结合蛋白(如蛋白激酶)、小分子有机物(如ATP、氨基酸等)、细胞膜蛋白、癌胚抗原等[3~5]。 近年来，核酸适配体受到科学家的广泛关注，由于其分子量较小、可化学合成、生物相容性好等优点，其在基础、临床、药物开发中的研究不断增多[6]。核酸适配体目前向配体在抗肿瘤药物靶向传递方面有很大的应用潜能。和抗体、多肽、小分子这些配体相比，核酸适配体可体外合成且易于修饰；同时因其带负电荷，在体循环中很少参加非特异性相互作用。而且由于它们对靶物质可高效的特异性地结合，因此其具有了较高的穿透性。 DNA核酸适配体可以在合适的条件下维持稳定且不被降解[7]。而RNA核酸适配体，易被体内的核酸酶降解，但经化学修饰后，可以延长其在体内的半衰期[8]。抗肿瘤药物一般都是在细胞内发挥作用，提高药物摄取量是其有效性的关键。纳米粒子能通过细胞内吞途径进入细胞，如果将核酸适配体连接到纳米粒子表面，药物靶向肿瘤细胞后，可介导内吞发生，有利于提高药物摄取量，这种给药方式成为目前研究的热点。本文综述了核酸适配体用于的肿瘤靶向治疗的研究进展。 1 核酸适配体与药物共价结合
核酸适配体及其在病原微生物学中的应用
生物工程学报 Chin J Biotech 2011, May 25; 27(5): 698?703 https://www.wendangku.net/doc/e28541468.html, Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@https://www.wendangku.net/doc/e28541468.html, ?2011 CJB , All rights reserved. Received : December 22, 2010; Accepted : March 14, 2011 Corresponding author : Xianzhu Xia. Tel: +86-431-6758799; E-mail: xia_xzh@https://www.wendangku.net/doc/e28541468.html, 核酸适配体及其在病原微生物学中的应用 梁红茹1,2，杨松涛2，张涛2，胡桂秋2，夏咸柱2 1 吉林大学畜牧兽医学院，长春 130062 2 军事医学科学院军事兽医研究所，长春 130062 摘 要: 核酸适配体指利用指数富集配体系统进化技术筛选出的寡聚核苷酸片段，它可以特异性地识别靶标并与之结合，已经广泛应用于基础研究、临床诊断、纳米技术等。以下综述了适配体在微生物学方面的应用。 关键词: 适配体，病毒，细菌，指数富集配体系统进化技术 Aptamers: characteristics and applications in pathogenic microorganism Hongru Liang 1,2, Songtao Yang 2, Tao Zhang 2, Guiqiu Hu 2, and Xianzhu Xia 2 1 College of Animal Science and Veterinary , Jilin University , Changchun 130062, China 2 Institute of Military Veterinary , Academy of Military Medical Science , Changchun 130062, China Abstract: Aptamers are a group of artificial oligonucleotides identified by exponential enrichment system evolution technology (Selective expansion of ligands by exponential enrichment, SELEX). Aptamers have been widely used in basic research, clinical diagnostics, and nano-technology. In this article we will introduce the technology of aptamer and summarize its applications in medical microbiology. Keywords: aptamer, virus, bacteria, selective expansion of ligands by exponential enrichment (SELEX) 早在1988年至1989年，按照生物化学性质从人工合成的核苷酸库中分离筛选核苷酸就已经有广泛的报道。1990年，Robertson 等通过亲和层析的方法从人为构建的RNA 文库中筛选到能够高特异性和高亲和力地结合小分子ATP 的RNA 序列，此段序列即为适配体[1]；同年，Tuerk 等在试验室成功地从带有8个随机序列的RNA 文库中筛选出可特异性结合噬菌体T4 DNA 聚合酶的序列[2]。 适配体 (Aptamer) 是一种经体外筛选技术得到的寡核苷酸序列 (RNA 或DNA)，与相应的配体有严格的识别能力和高度的亲和力[3]，大小一般约6~40 kDa 。单链寡核苷酸，特别是RNA 的一些二级结构，如发夹、茎环、假节、凸环、G-四聚体等，可使核酸分子形成多种三维结构，成为适配体与靶物质特定区域结合的基础，二者之间的结合主要通过“假碱基对”的堆积作用、氢键作用、静电作用
基于核酸适体与互补核酸和目标蛋白之间竞争反应的PDGF蛋白特异性识别
Vol．32 高等学校化学学报No．112011年11月CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 2509 2514 基于核酸适体与互补核酸和目标蛋白之间 竞争反应的PDGF 蛋白特异性识别 郑静1，2，秦佳华1，龚晨1，黄焕1，何品刚2，方禹之 2（1．上海工程技术大学化学化工学院，上海201620；2．华东师范大学化学系，上海200062） 摘要报道了一种利用核酸适体与互补核酸和目标蛋白之间的竞争反应用于PDGF 蛋白的特异性识别方法． 采用反相微乳液技术制备了包覆有亚甲基蓝（MB ）的SiO 2纳米复合物（SiO 2- MB ），利用固定在磁性纳米颗粒上的核酸适体与SiO 2- MB 纳米颗粒标记的互补核酸进行杂交反应，将一定数量的SiO 2-MB 纳米颗粒固定于磁性纳米颗粒的表面，引入PDGF 目标蛋白后，利用核酸适体与互补核酸和PDGF 之间的竞争反应，通过检测MB 电化学信号的变化来检测PDGF．该方法对PDGF 蛋白具有很高的特异性识别能力，不受其它蛋白质 如免疫球蛋白G 、凝血酶和溶菌酶等的干扰．实验结果表明，PDGF 浓度在5.51?10 －17 1.01?10－15mol /L 范围内具有良好的线性关系，检出限可达1.31?10 －17mol /L．关键词核酸适体；PDGF 蛋白；特异性识别 中图分类号 O657．1文献标识码A 文章编号0251-0790（2011）11-2509-06收稿日期：2010- 12-06．基金项目：国家自然科学基金（批准号：20675031）和上海市教委科研创新项目（批准号：09YZ374）资助． 联系人简介：郑静，女，博士，副教授，主要从事生物传感器、电化学及纳米材料等方面研究．E- mail ：kkzhengjing707@163．com 随着人类基因组计划（HGP ）的顺利完成及蛋白质组学研究的启动，人类进入了后基因组时代，对 特定疾病标志蛋白的检测日益受到重视 ［1 3］．血小板源生长因子（Platelet-derived growth factor ，PDGF ）是具有双链结构的蛋白多肽，是血小板分泌的主要丝裂原，在血凝过程中被释放出来，随血液循环而 行进并作用于间充质细胞 ［4，5］．它能刺激成纤维细胞、平滑肌细胞及神经胶质细胞等细胞的DNA 合成和细胞的增殖，是这些细胞体外培养的重要有丝分裂原，在创伤愈合、组织修复及动脉粥样硬化的形 成中起主要作用 ［6，7］；还能诱导成纤维细胞分泌基质成分和生长因子，如IGF-I ，HGF 和ET3等，这些生长因子能调节肿瘤生长和肿瘤微环境［8］，因此对PDGF 进行检测具有重要意义．目前，一般采用酶 联免疫吸附法检测PDGF ［9，10］，而基于免疫分析的方法具有抗体对外界温度敏感，活性保存期有限且固定时活性易受损等缺点．近年来，核酸适体（Aptamer ）技术已成为一种新型的蛋白质识别技术 ［11，12］，基于核酸适体识别PDGF 蛋白的生物传感器和相应的诊断技术备受关注 ［13，14］，已有利用荧光检测法［15 17］和电化学方法［18，19］等对PDGF 进行检测的报道． 纳米材料的优异性能为超灵敏分析检测带来了新的契机 ［20 22］．磁性纳米颗粒在生物检测和药物分析上具有很大的应用潜力 ［23，24］，利用磁性纳米颗粒良好的生物相容性和顺磁性来分离和富集样品，可极大提高生物传感器的灵敏度 ［25 27］．二氧化硅以其良好的生物相容性、多孔性、无毒性、化学惰性、生物降解性及热稳定性，引起了人们的广泛关注 ［28 30］．亚甲基蓝（MB ）是一种有机染料，具有很好的电化学响应．掺杂MB 的SiO 2纳米颗粒不仅具有良好的生物相容性，而且MB 分子（核）包埋于纳米SiO 2颗粒（壳）的三维网状结构中，有效地防止了MB 的流失，提高了电化学检测的灵敏度． 本文报道一种利用磁性纳米颗粒和掺杂MB 的SiO 2纳米颗粒，将基于竞争反应的核酸适体技术用于PDGF 蛋白的检测，原理如Scheme 1所示．将核酸适体固定在磁性纳米颗粒上，在互补核酸上标记SiO 2-MB 作为信标，在无PDGF 蛋白存在时，核酸适体与互补核酸杂交，将SiO 2-MB 带到磁性纳米颗粒的表面；引入目标蛋白后，核酸适体处于与互补核酸杂交和PDGF 蛋白特异性结合的竞争平衡反应中， 而核酸适体更倾向于与PDGF 结合［31］，通过检测MB 电化学信号的变化来检测目标蛋白．磁性纳米颗