SSR标记在水稻研究中的应用概况

SSR分子标记简介

微卫星DNA标记技术及其在遗传多样性研究中的应用 摘要微卫星DNA的高突变率、中性、共显性及其在真核基因组中的普遍性，使其成为 居群遗传学研究、种质资源鉴定、亲缘关系分析和图谱构建的优越的分子标记。本研究系统介绍了微卫星DNA在结构和功能上的特点，并对微卫星DNA标记技术应用的遗传学机理和一般方法进行了扼要的阐述。另外，本研究还探讨了微卫星DNA标记技术在遗传多样性研究中的应用现状，并进一步提出其发展前景。 关键词：微卫星DNA；微卫星DNA标记；遗传多样性 大量重复序列的存在是真核生物基因组的主要特点之一，而且这些重复序列的拷贝数可高达百万份以上。真核生物的基因组中，重复序列占有很大比重（＞50%）。按照重复序列在染色体上的分布方式，分为散布重复和串联重复（VNTR）两种类型。散布重复序列的拷贝数很多，在重复单位之间彼此常有序列的变化，难以用做分子标记。串联重复序列根据重复单元数目的大小又分为卫星序列(satellites)、小卫星序列(mini-satellites)和微卫星序列(microsatellites)3种类型。其中，卫星序列的重复单元大，一般分布在染色体的异染色质区，采用分子标记系统来揭示其多态性有一定的困难；小卫星序列主要存在于染色体近端粒处，通常以15~75个核苷酸为核心序列，长度从几十到几千个碱基不等；微卫星序列一般较短，属于以1~6个核苷酸为基本单元的简单串联重复。 微卫星DNA是真核生物基因组重复序列中的主要组成部分。微卫星DNA也称简单串联重复序列（SSRs）或简单串联重复序列多态性（STRP）。这些位点由非常短的串联重复DNA 片段（1-5个碱基）组成。微卫星DNA 最早是在人类基因组研究中发现的，它极其丰富，分布在整个基因组中[1]。人类基因组最普遍的微卫星是那些含有A、AC、AAAN、AAN 或AG（这里N 代表G、C或T）的序列。这5组重复序列大约占到人类基因组微卫星总量的75%。微卫星DNA 序列在大多数的其它动、植物基因组中也先后被发现，并且通过聚合酶链式反应可以确定其类型[2]。（AT）n和（A TT）n 是首先于大豆中发现的在不同的株系中长度有所不同的重复序列，它们也是第一个被定位的植物微卫星座位。Wang等[3]发现微卫星序列中所有的单、双和四核苷酸重复序列都分布在DNA非编码区，而含G-C 碱基对的三核苷酸重复序列有57%位于编码区。微卫星重复序列在植物中出现的几率比动物中少得多。在植物中，约29kb中有20bp的微卫星序列[4]，例如鹰嘴豆中（TAA）n、（GA） 和（CA）n 序列在平均60kb的长度中出现于12000个位点上[5]；而动物中，约每6kb中就n 有20bp的微卫星重复序列。另外，研究还发现植物中最丰富的微卫星是（A）n，其次是（AT）n，再次是（GA）n。

SSR分子标记在作物遗传育种中的应用_罗冉

基因组学与应用生物学，2010年，第29卷，第1期，第137－143页Genomics and Applied Biology,2010,Vol.29,No.1,137－143 评述与展望 Review and Progress SSR 分子标记在作物遗传育种中的应用 罗冉 吴委林 张旸 李玉花* 黑龙江哈尔滨东北林业大学生命科学学院,哈尔滨,150040*通讯作者,lyhshen@https://www.wendangku.net/doc/eb9514480.html, 摘 要 SSR (simple sequence repeat)是建立在PCR 技术上的一种广泛应用的分子标记，具有含量丰富、多 态性高、共显性等优点。本文简要介绍了SSR 分子标记技术的原理和特点，重点介绍了SSR 分子标记技术 在作物遗传育种中的应用，主要在作物遗传多样性、基因定位、分子辅助标记、遗传图谱构建、品种鉴定和纯度鉴定等方面进行阐述。 关键词SSR,分子标记,作物,遗传育种 SSR Marker and its Application to Crop Genetics and Breeding Luo Ran Wu Weilin Zhang Yang Li Yuhua * Heilongjiang Harbin College of Life Sciences of Northeast Forestry University,Harbin,150040*Corresponding author,lyhshen@https://www.wendangku.net/doc/eb9514480.html, DOI:/10.3969/gab.029.000137 Abstract SSR (simple sequence repeat)is a classic technique for molecular marker based on PCR technique,which had many advantages,such as abundance,high polymorphism,co-dominance etc.This paper has clarified the concept and characteristics of SSR marker,then presents emphatically its application to plant genetics and breeding,and focus on genetic diversity,gene mapping,marker assistant selection,construction of genetic map,varietal identification,purity identification and so on. Keywords SSR (simple sequence repeat),Molecular markers,Crop,Genetics and breeding https://www.wendangku.net/doc/eb9514480.html,/doi/10.3969/gab.029.000137 基金项目：本研究由国家科技部863项目(2008AA10Z156)和国家自然基金重点项目(30730078)共同资助 遗传标记(genetic marker)是指在遗传分析上用作标记的基因，也称为标记基因。它可追踪染色体、染色体的某一节段或某一个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。目前，应用较为广泛的遗传标 记主要有形态标记(morphological maker)、 细胞标记(cytological maker)、生化标记(biochemical maker)和分子标记(molecular maker)。前3类遗传标记都是对基因的间接表达，并且标记位点少，多态性差，容易受 到环境因素、 季节变化等影响，因此发展比较缓慢。分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式，它 以蛋白质、 核酸分子的突变为基础，检测生物遗传结构及其变异。分子标记技术从本质上讲都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。广义的分子标记是指可遗传的 并可检测的DNA 序列或蛋白质，狭义的分子标记 指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的 特异性DNA 片段。 目前广泛应用的DNA 分子标记有三代，分别为第一代的限制性片段长度多态性(RFLP)，随机扩增多态性DNA (RAPD)，第二代的扩增酶切片段长度多态性(AFLP)，简单序列重复长度多态性(SSR)，第三代的单核苷酸多态性(SNP)等。本文主要对SSR 分子标记技术的原理、特点以及在作物遗传育种中的应用进行概述。 1SSR 分子标记技术的原理和特点 SSR 也称为微卫星DNA (microsatellite DNA)、短串联重复(tendom-repeats)或简单序列长度多态性(simple sequence length porlymorphism)，它通常是指以2~5个核甘酸为单位多次串联重复的DNA 序列，

SSR标记的原理

简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR) 1.简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1一6 bp，其中最常见是双核苷酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10一60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。 2.SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。在真核生物中，存在许多2-5bp简单重复序列，称为“微卫星DNA”其两端的序列高度保守，可设计双引物进行PCR扩增，揭示其多态性。 3.SSR具有以下一些优点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。 4.SSR的分类 根据SSR核心序列排列方式的不同，可分为3种类型： 完全型(perfect)。指核心序列以不间断的重复方式首尾相连构成的DNA。如：ATATATATATATATATATATATATATATATATAT

不完全型(imperfect)。指在SSR的核心序列之间有3个以下的非重复碱基,但两端的连续重复核心序列重复数大于3 。如：ATATATATGGATATATATATCGATATATATATATATATGGATATATATA T 复合型(compound) 。指2个或2个以上的串联核心序列由3个或3个以上的连续的非重复碱基分隔开,但这种连续性的核心序列重复数不少于5 。如：ATATATATATATATGGGATATATATATATA 3种类型中完全型是SSR标记中应用较多的一种类型。 5.SSR在植物基因组中的分布 SSR广泛分布于各种真核生物的基因组中，大约每隔10～50kb 就存在一个SSR。哺乳动物中的SSR的数量大约为植物中的5～6倍。在植物中，平均23.3kb就有一个SSR；双子叶植物中的SSR数量大于单子叶植物，前者两个SSR之间的平均间距为21.2kb，后者为64.6kb；核DNA中的SSR数量多于细胞质DNA中的SSR，绝大多数单碱基重复型及2碱基重复型SSR存在于非编码区，3碱基重复型多位于编码区。 6.微卫星的利用价值 由于核心序列重复数的不同，等位的SSR位点可呈现出多态性（SSLP，simple sequence length polymorphism）。大多表现为共显性遗传，有的表现为显性遗传。由于SSR DNA两侧序列（离开20bp 以上）表现出保守特征，所以可设计出上下游PCR引物，扩增出包

SSR标记的原理步骤

SSR:微卫星DNA又叫简单重复序列，指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下。研究表明，微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。 微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们发展起了SSR标记。 SSR标记又称为sequence tagged microsatellite site,简写为STMS，是目前最常用的微卫星标记之一。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。由于SSR重复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性，这就是SSR标记的原理。? 与其它分子标记相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性； (4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。因而目前该技术已广泛用于遗传图谱的构建〔11，12，18，19，33〕、目标基因的标定〔8，9，21，22，26〕、指纹图〔22〕的绘制等研究中。但应看到，SSR标记的建立首先要对微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工设计合成引物以及标记的定位、作图等基础性研究，因而其开发费用相当高，各个实验室必须进行合作才能开发更多的标记。由于SSR标记具有较大的应用价值，且种属特异性较强，目前在一些主要的农作物中SSR标记研究都进行了合作，共同进行STMS引物的开发。 操作步骤 1、在25μl反应体系中，加入 模板DNA 1μl（20ng）； SSR引物1μl（0.15μM） 10×PCR缓冲液2.5μl MgCl2 2μl (25mM) dNTP 2μl (0.2mM) Tap 酶1单位 加ddH2O至25μl 2、反应在PE 9600热循环仪上进行。PCR反应先95℃变性4min,接着94℃45s、55℃30s 和72℃60s,35个循环,最后在72℃下延伸5min。PCR扩谱产物在测序电泳仪上用5%聚丙烯酰胺凝胶分离。点样时,样品量为5μl,电泳缓冲液为1×TBE,电泳工作电流50mA,电压1500V,时间约2～3h。DNA染色采用银染法。电泳结束后,凝胶连同胶板一起,经过固定、染色、显影、固定等步骤染色。电泳和银染具体操作与AFLP相似。 3、数据分析： 用BIO-RAD公司的Quantity One 软件统计，再用NTSYS软件计算出遗传相似性系数，用UPGMA法进行聚类分析构建聚类图。

EST-SSSR分子标记的建立

课程名称： 分子育种学 指导老师： 海瑞 成绩： 实验名称： EST-SSR 标记的开发 实验类型： 综合型 分工： 奕-EST 获取+结果分析+引物设计 王鹏潮-SSR 筛选+SSR 统计+结果分析 一、实验目的和要求 1、了解SSR 标记的开发策略； 2、明确EST-SSR 标记的特点和建立EST-SSR 标记的原理； 3、熟悉EST-SSR 标记的过程，掌握EST-SSR 标记的开发技术。 二、实验容和原理 1、实验容 通过从现有的EST 文库中获取序列，再用软件对其进行SSR 查找与引物设计。 2、实验原理 1）微卫星DNA 真核基因组中存在着大量的串联重复序列, 按重复单位的大小, 串联重复可分为卫星（重复序列>70bp ）、小卫星（6～70bp ）和微卫星DNA （1-6bp ）。 微卫星（Microsatellite, MS ）是指基因组中以少数几个核苷酸（多数为2～4个）为单位多次串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列，又称简单序列重复（Simple Sequence Repeats , SSR ）或短串联重复（Short Tandem Repeats , STR ）、或简单序列长度多态性（Simple Sequence Length Polymorphism ，SSLP ）。 重复数目是可变的，重复序列两侧都有物种特异性的保守序列，所以通过设计引物进行PCR 扩增，就可以检测到不同的DNA 区域重复数目的多态性。 2）SSR 标记的开发策略 SSR 包括基因组SSR （genomic SSR 或gSSR ）和表达区EST-SSR （genic-SSR 或EST-SSR ）。gSSR 是基于基因组序列开发的，开发起来费时费力，而且因为探针的缘故，种类比较局限。而EST —SSR 则是存在于表达的基因序列的SSR ，不包括含子及非表达的调控区等之中的SSR ，通常三个碱基重复的占多数，与不引起基因翻译过程中移码现象的发生相一致。 建立SSR 标记的前提是必需知道重复序列两列的DNA 序列。 与其他标记相比，SSR 标记具有如下特点： （1）数量较为丰富，覆盖整个染色体组； （2）具有多等位基因特性，信息含量高； （3）以孟德尔方式遗传，呈共显性； （4）易于利用PCR 技术分析，对DNA 数量和纯度要求不高，结果重复性好； （5）每个位点由引物序列决定，便于交换。 近年来，EST-SSR 标记的开发引起关注。数量迅速增加的ESTs 为开发新的SSR 标记提供了宝贵的资源，各种植物中约有5-10%的EST 含有可用于建立标记的SSR 。建立EST-SSR 标记要经济得多，而且EST-SSR 标记来源于DNA 的转录区域，比gSSR 标记具有更高的通用性，此外，标记-信息量高。

SSR分子标记遗传分析

SSR分子标记遗传分析 实验原理： SSR简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记），也叫微卫星序列重复，是由一类由几个核苷酸（1－5个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了SSR长度的高度变异性，由此而产生SSR标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。 优点：（1）标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上； （2）是共显性标记，呈孟德尔遗传； （3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。 缺点：开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高 实验材料： 欧美山杨杂种幼嫩叶片 实验器具、药品： 模板DNA、dNTP、PCR提取Buffer、Mg2+、上游引物、下游引物、Taq酶、去离子水、琼脂糖、Gel-RED染色剂、1×TAE、PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外凝胶成像系统 SSR引物及退火温度 位点Loci 重复单元 Repeat unit 引物序列(5′-3′) Primer sequence (5′-3′) 退火温度 T(℃) PTR2 (TGG)8AAGAAGAACTCGAAGA TGAAGAACT(F) ACTGACAAAACCCCTAA TCTAACAA(R) 63℃ PTR7 (CT)5A T(CT)6A TTTGA TGCCTCTTCCTTCCAGT(F) TA TTTTCA TTTTCCCTTTGCTTT(R) 49.4℃ PTR14 (TGG)5TCCGTTTTTGCA TCTCAAGAA TCAC(F) A TACTCGCTTTA TAACACCA TTGTC(R) 55.4℃ 实验步骤： 1.总DNA的提取 采用CTAB法提取植物总DNA （1）取700ul CTAB提取液加入20ul巯基乙醇于65℃金属浴内预热； （2）称取适量植物叶片,放入消过毒的研钵中,迅速加入液氮研磨成白色粉末； （3）将粉末移入提取液,混匀,65℃水浴（或金属浴）30min,其间不时的温和摇匀； （4）加入700ul氯仿:异戊醇(24:1)轻轻摇匀,10000rpm 离心10min,取上清(重复2次)；（5）加入700ul异丙醇室温沉淀10min,10000rpm 离心10min,弃上清； （6）用70%乙醇洗两次,37℃气干.去除DNA表面的盐或试剂小分子物质； （7）加入20ul灭菌的去离子水溶解DNA； （8）利用0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的总DNA的含量和纯度。 2.总DNA的检测

大规模开发及特性分析十字花科SSR分子标记 及其数据库的构建

Botanical Research 植物学研究, 2017, 6(3), 86-95 Published Online May 2017 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/eb9514480.html,/journal/br https://https://www.wendangku.net/doc/eb9514480.html,/10.12677/br.2017.63013 文章引用: 杨帅, 李慧, 侯欣, 张丽. 大规模开发及特性分析十字花科SSR 分子标记及其数据库的构建[J]. 植物学研究, Large-Scale Development and Character Analysis of SSR Markers and Database Build in Brassicaceae Shuai Yang 1,2*, Hui Li 2, Xin Hou 1, Li Zhang 1* 1College of Plant Protection, Shandong Agricultural University, Taian Shandong 2 College of Life Sciences, Jinan University, Jinan Shandong Received: May 4th , 2017; accepted: May 21st , 2017; published: May 24th , 2017 Abstract Brassicaceae is an important family in the plant kingdom. The Simple Sequence Repeats (SSRs) play a vital role in the study of Brassicaceae. By using 13 known sequenced Brassicaceae species with bioinformatics and comparative genomics methods, a total of 1,786,619 SSR loci and 1,919,464 pair of primers have been developed. The results show that the SSRs are widely distributed in the Brassicaceae species’ genomes, 1 - 3 bases duplication have a high ratio among these genomes and gene sequences, AT/TA repeats units have a high numbers in all of the 2 base duplication. In addi-tion, 435,414 specific SSR primers could be used to analyze the correlation between the species of Brassicaceae. 11 pairs of universal primers’ developed shows that there exist some consistent base fragments and could be amplified across different species. In this study, we constructed the world’s first SSR molecular marker database platform (BSSRD, Brassicaceae Simple Sequence Re-peats Database https://www.wendangku.net/doc/eb9514480.html,/BSSRD ) which will play an important role in the con-struction of genetic map, gene mapping and genetic breeding of Brassicaceae. Keywords Brassicaceae, SSR, Specific Primers, Universal Primers, Database 大规模开发及特性分析十字花科SSR 分子标记及其数据库的构建 杨 帅1,2*，李 慧2，侯 欣1，张 丽1* 1 山东农业大学植物保护学院，山东 泰安 2 济南大学生命科学院，山东 济南 * 通讯作者。

SSR标记实验步骤

SSR标记实验步骤 简介： SSR简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记），也叫微卫星序列重复，是由一类由几个核苷酸（1－5个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了SSR长度的高度变异性，由此而产生SSR标记或SSLP标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。 优点：（1）标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上； （2）是共显性标记，呈孟德尔遗传； （3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。 缺点：开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高。 操作程序： 取叶片→磨样→提取DNA→PCR扩增→电泳检测→染色→读带标记

1、DNA提取 按照Doyle和Dickson(1987)CTAB法（`Cetyl triethyl ammonium bromide）并略加改进的程序进行，具体步骤如下： ①成熟期取叶片加液氮研磨成粉末状，转入1.5ml离心管中，-20℃冰箱保存； ②加入600ul 65℃的2×CTAB混匀并置于65℃水浴中保温30～60分钟； ③取出，冷却，上下摇匀后，加入600微升24:1的氯仿异戊醇； ④12000转/分钟离心10分钟，取上清液于另一个1.5ml的离心管中； ⑤加异丙醇，12000转/分钟离心10分钟，倒掉上清液； ⑥干后用100%的洒精清洗，干后加适量TE 2、PCR扩增 模板DNA的浓度大约25ng/ul，扩增反应体系为20ul。具体如下：Sterile ddH2O 11ul PCR Buffer 3ul dNTP-mix 0.5ul Primer1 1ul Primer2 1ul Taq polymerase 0.5ul(2U/μL) DNA 3ul PCR扩增程序为：（2h30min）

SSR分子标记在水稻品种鉴定和遗传育种中的应用

SSR分子标记在水稻品种鉴定和遗传育种中 的应用 摘要我国最早的引入分子标记技术是在20世纪的80年代，经过近几十年的不断发展，分子标记法也取得了较快进步，不仅应用领域在不断拓展，应用成果也非常显著。作为世界上最重要粮食作物之一的水稻，对于人类的生存与发展起到了十分关键性的作用，而如何更好的运用生物技术全面提高水稻亩产量，提升水稻品质已经成为了国际社会共同关注的焦点话题。经过多年的技术研究和发展，遗传标记在识别生物群体的多态性的过程中逐渐充当着重要的角色，通过形态标记可以对生物的形态差异进行比较，分子标记直接检测出生物DNA分子结构上的变化，进而更好的将好的品种和遗传特性保留下来。在这种情况下，对于SSR分子标记在水稻品种鉴定和遗传育种中的应用进行分析和研究具有重要的现实意义。 关键词 SSR分子标记；水稻；品种鉴定；遗传育种；应用 中图分类号：S336 文献标识码：A 文章编号：1671-7597（2014）17-0071-02 在水稻品种鉴定和遗传育种以及水稻的遗传作图中，

SSR分子标记一直都充当着重要的角色。以往的育种主要依赖的是植株的表现型进行品种的鉴定和选择的，这对于育种者的经验具有很高的要求，而且需要进行多次技术测定，不仅耗时而且费力，因此需要在此基础上去寻求更好更加准确的标记方式，以此来提高项目育种的质量和效率。而自从SSR 分子标记的出现和发展，对于水稻育种工作和品种的鉴定具有重要的促进作用。和普通的标记方法相比，SSR标记是不受到周围的环境条件以及相关的因素影响的，因此具有很好的发展前景。本文也将从SSR标记的基本原理出发，对于SSR 分子标记在水稻品种鉴定和遗传育种中的应用进行了分析和论述，希望给读者一定的启示。 1 SSR标记的基本原理分析 无论是水稻还是其他的生物作物都是由特定的基因组组成的，但是由于每一个SSR序列的存在单元存在一定的差异性，因此基因的座位也存在多态性。而SSR标记的关键环节就是要对于SSR座位两侧的核苷酸进行全面的了解和分析，并且对其基本结构序列形成特定的特异保护[1]。SSR标记主要包括以下几个过程：一是要建立专门的DNA文库和数据资源库；二是要进一步筛选鉴定微卫星DNA克隆；三是完成基本的序列测定和标记。总的说来，SSR的操作程序就是指DNA的提取、微卫星DNA的扩增以及电泳处理。在这个过程中，还可以通过在已有的DNA数据库中进行SSR序列的搜

SSR标记电泳

3.1.2.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶分离可以达到几个碱基，以便真实的反应各样品的多态性，本实验采用用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离。 3.1.2. 4.1 凝胶的制备 （1）玻璃板的清洗：用洗涤灵或洗衣粉把玻璃板反复擦洗干净，用蒸馏水冲洗干净，放置干燥，备用。 （2）电泳凝胶的配制（常用6％和8％的非变性凝胶）： （4）按表4中顺序加入各组分（注意：TEMED一定要最后加入），充分摇匀后用注射器将配好的胶轻轻灌入好两玻璃板之间，当胶加到上部时，在灌胶口插入梳子，并注意防止梳子底部产生气泡。若有漏出，应及时补加聚丙烯酰胺溶液。置室温让其聚合1h以上。 3.1.2. 4.2 扩增产物的电泳 （1）电泳缓冲液：待凝胶聚合完后，在电泳槽中加入1×TBE（用5×TBE稀释）的电泳缓冲液。 （2）上样：1.5-2μl，用移液枪吸取混合液轻轻加入点样孔中，尽量缩短加样时间。 （3）电泳：将梳子轻轻拔出，170V预电泳1.5-2小时(50bp左右的用1个半小时）。电泳结束后，切断电源，卸下玻璃板，准备染色。 3.1. 4.2.3 扩增产物的快速银染显色 非变性聚丙烯酰胺电泳的银染方法参考Sanguinetti等1994并经改进简化如下：

（1）漂洗：在塑料盘中加入200ml蒸馏水漂洗1次，再加入200ml蒸馏水。染色：加入2ml 10％AgNO3 (10g AgNO3加入到100ml蒸馏水中)后，平行摇动5～8min。 （2）漂洗：倒掉定影液，加入蒸馏水漂洗2～3次，洗净后，倒掉蒸馏水。（3）显色：在瓷盘中加入200ml蒸馏水，10ml 30%NAOH和2ml甲醛，迅速振动，使显影液均匀作用，然后平行摇动10分钟左右，直至显影。 （4）洗涤：清楚显影后，倒掉显影液，加入蒸馏水清洗凝胶1～2次，彻底去掉显影液，以免保存时变色。 （5）保存：用蒸馏水冲洗干净，放在胶片上吸干水，上面盖上保鲜膜，统计带型，并照相或扫描。

EST-SSSR分子标记的建立

课程名称： 分子育种学 指导老师： 崔海瑞 成绩： 实验名称： EST-SSR 标记的开发 实验类型： 综合型 分工： 谢奕-EST 获取+结果分析+引物设计 王鹏潮-SSR 筛选+SSR 统计+结果分析 一、实验目的和要求 1、了解SSR 标记的开发策略； 2、明确EST-SSR 标记的特点和建立EST-SSR 标记的原理； 3、熟悉EST-SSR 标记的过程，掌握EST-SSR 标记的开发技术。 二、实验内容和原理 1、实验内容 通过从现有的EST 文库中获取序列，再用软件对其进行SSR 查找与引物设计。 2、实验原理 1）微卫星DNA 真核基因组中存在着大量的串联重复序列, 按重复单位的大小, 串联重复可分为卫星（重复序列>70bp ）、小卫星（6～70bp ）和微卫星DNA （1-6bp ）。 微卫星（Microsatellite, MS ）是指基因组中以少数几个核苷酸（多数为2～4个）为单位多次串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列，又称简单序列重复（Simple Sequence Repeats , SSR ）或短串联重复（Short Tandem Repeats , STR ）、或简单序列长度多态性（Simple Sequence Length Polymorphism ，SSLP ）。 重复数目是可变的，重复序列两侧都有物种特异性的保守序列，所以通过设计引物进行PCR 扩增，就可以检测到不同的DNA 区域重复数目的多态性。 2）SSR 标记的开发策略 SSR 包括基因组SSR （genomic SSR 或gSSR ）和表达区EST-SSR （genic-SSR 或EST-SSR ）。gSSR 是基于基因组序列开发的，开发起来费时费力，而且因为探针的缘故，种类比较局限。而EST —SSR 则是存在于表达的基因序列内的SSR ，不包括内含子及非表达的调控区等之中的SSR ，通常三个碱基重复的占多数，与不引起基因翻译过程中移码现象的发生相一致。 建立SSR 标记的前提是必需知道重复序列两列的DNA 序列。 与其他标记相比，SSR 标记具有如下特点： （1）数量较为丰富，覆盖整个染色体组； （2）具有多等位基因特性，信息含量高； （3）以孟德尔方式遗传，呈共显性； （4）易于利用PCR 技术分析，对DNA 数量和纯度要求不高，结果重复性好； （5）每个位点由引物序列决定，便于交换。 近年来，EST-SSR 标记的开发引起关注。数量迅速增加的ESTs 为开发新的SSR 标记提供了宝贵的资源，各种植物中约有5-10%的EST 含有可用于建立标记的SSR 。建立EST-SSR 标记要经济得多，而且EST-SSR 标记来源于DNA 的转录区域，比gSSR 标记具有更高的通用性，此外，标记-信息量高。

分子标记的实验原理及操作流程

一 AFLP 分子标记实验 扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism(AFLP 是在随机扩增多态性 (RAPD 和限制性片段长度多态性 (RFLP 技术上发展起来的 DNA 多态性检测技术, 具有 RFLP 技术高重复性和 RAPD 技术简便快捷的特点, 不需象 RFLP 分析一样必须制备探针, 且与 RAPD 标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征,同时弥补了 RAPD 技术重复性差的缺陷。同其他以 PCR 为基础的标记技术相比, AFLP 技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究, 种质资源鉴定方面的研究,构建遗传图谱等。 其基本原理是:以 PCR(聚合酶链式反应为基础, 结合了 RFLP 、 RAPD 的分子标记技术。把 DNA 进行限制性内切酶酶切,然后选择特定的片段进行 PCR 扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“ 接头” , 用与接头互补的但 3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异 PCR 扩增, 只有那些与 3-端严格配对的片段才能得到扩增 , 再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物,用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。 一、实验材料 采用青稞叶片提取总 DNA 。 二、实验设备 1. 美国贝克曼库尔特 CEQ8000毛细管电泳系统, 2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机,

3. 美国 MJ 公司 PCR 仪, 4. 安玛西亚电泳仪等。 三、实验试剂 1. 试剂:请使用高质量产品,推荐日本东洋坊 TOYOBO 公司的相关产品。 DNA 提取试剂盒; EcoRI 酶,MseI 酶,T4连接酶试剂盒; Taq 酶,dNTP, PCR reaction buffer; 琼脂糖电泳试剂:琼脂糖,无毒 GeneFinder 核酸染料替代传统 EB 染料; 超纯水(18.2M ? ·cm 2.其他实验需要物品 微量移液枪(一套及相应尺寸 Tip 头,PCR 管,冰浴等。 四、实验流程 1、总 DNA 提取 使用 DNA 提取试剂盒提取植物基因组 DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。一般来说, 100ng 的基因组 DNA 作为反应模板是足够的。 2、 EcoR1酶消化 (20ul 体系 /样品

SSR分子标记实验流程

实验流程及操作 SSR分子标记开发的流程主要有DNA提取、DNA质量监测、PCR扩增反应和非聚丙烯酰胺凝胶电泳。 1油棕DNA的提取 DNA的提取一般有改良的CTAB法和SDS法，本实验室采用的是CTAB提取法。由于购买液氮不变，提取液用的是CTAB提取缓冲液，其配方是：2%(w)CTAB，50 mol·L-1Tris·HCl (pH8.0)，1.4 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1EDTA，2%(!) β- 巯基乙醇。具体操作方法如下： 取2g嫩叶片在约600ulCTA提取液进行磨样，直至所磨样品看不到嫩叶残渣为止；将磨好的样品分装到对应离心管中，之后在65℃的水浴锅中煮45min-1h 后，期间每隔10分钟左右将其拿起来轻轻摇匀约30次，水浴时间到后降温至室温；在水浴好后的离心管中加入500ul氯仿异戊醇并缓慢混匀30次，静置5min；在把样品配平后，在离心机中以10000rmp，25℃，离心8min；离心好后用移液枪吸取上清液，加入等体积冰冻的无水乙醇，轻轻混匀后静置10min；最后将DNA用枪头挑出，用75%乙醇或乙醇铵浸泡过夜，让其风干；风干后DNA用50ulddH2O培养于-20℃冰箱中。 2DNA质量检测 将获得的DNA样品稀释1000倍后，用紫外分光光度计分别测定不同样品的DNA溶液在260、280nm波长下的OD值,以及OD260/OD280的比值，计算样品的纯度，并通过260nm处的吸光值计算样品中的DNA含量。取1ulDNA,，加1ul10×loading buffer 和8ulddH2O 于ρ= 0.008 g·mL-1琼脂糖凝胶电泳，电压100v，电泳45min，于紫外透射仪下检测DNA降解情况[5～7]。 其中，水平电泳的步骤是：①、制胶：1﹪琼脂糖凝胶：1×TAE 50ml；REGULAR （琼脂糖） 0.5g；Goldview Nuleie 4ul∕Bioteko Corporation 2ul（染色剂）。 ②、点样：点样时需加溴酚蓝，即：5ul样品+5ul溴酚蓝。③、将胶放入电泳槽，接上电源进行电泳，时间约为30min，电源电压为120v。 3 SSR-PCR扩增 PCR反应前将提取的DNA样品稀释200倍。 PCR扩增反应体系的总体积为20ul，其中，ddH2O 4.8ul，10×Buffer 1ul,25mMMg2+ 0.8ul,10umPrimerL 0.5ul,10umPrimerR 0.5ul,10mMdNTP 0.2ul，5u/ulTaｑ酶 0.2ul，DNA模板 2ul，矿物油 10ul（防止蒸发）。 扩增的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s,54.7℃退火30s,30个循环，72℃再延伸7min。 4电泳 ⑴装板：将玻璃板用洗洁剂冲洗干净后檫拭干净，然后按照说明书的说明正确装好板；板装好后封底，封底所用的试剂是1g琼脂糖+100ml 水。

分子标记技术的类型及其原理

分子标记技术的类型及其原理 08农生1班陈耀光 200830010403 所谓分子标记就是基于基因组DNA 存在极其丰富的多态性而发展的一类可以直接反映生物个体间DNA 水平上差异的新型的遗传标记方法。在遗传学发展过程中，先后出现了形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记，其中以分子标记最为理想、可靠，因为DNA分子中碱基的缺失、插入、易位、倒位或是长短与排列不一的重复序列等产生的差异，都可以通过分子标记进行检测。DNA 分子标记较以往的形态标记其优越性表现在：(1)以核酸为研究对象，不受季节、环境限制，不存在基因表达与否的问题，也没有组织或器官特异性；(2)数量的丰富性，遍及整个基因组，标记的数量几乎是无限的； (3)多态性高，自然存在丰富的等位变异；(4)许多标记表现为共显性，能很好地鉴别纯合基因型与杂合基因型；(5)检测手段简便、快速，并且重复性好；(6)既不对目标形状的表达造成影响，也不会与不良性状之间产生必然的关联。 1 分子标记的类型及其原理 分子标记技术自诞生以来，短短的几十年时间中得到突飞猛进的发展，至今被发展和利用的分子标记技术已有二十余种，为不同研究领域提供了有效的技术手段，同时也发挥着至关重要的作用。目前，根据对DNA 多态性检测手段和所应用序列范围的不同，对部分分子标记技术分类如下。 1.1 基于全基因序列的分子标记 RFLP (restriction fragment length polymorphism,限制性片段长度多态性)：RFLP 作为最早发展的分子标记技术由Grozdicker 等于1974 年创建，并由Bostein 等再次提出。RFLP 技术的出现开创了直接在DNA 水平上进行遗传研究的新时代。其基本原理是：基因组DNA中限制性内切酶所识别的序列由于出现碱基变化而致使酶切位点的数量也变化，从而使酶切片段长短发生差异产生长度多态性。利用特定的限制性内切酶切割不同个体的基因组DNA，由于不同个体中酶切位点的差别就得到了长短相异的片段DNA，电泳分离后，借助Southern 杂交将DNA 片段转移至硝酸纤维素膜上，将具有放射性标记的探针与膜上的片段杂交，通过放射自显影技术就可以获得显示物种特异性的多态性图谱。RFLP 标记的等位基因是共显性的，能区分纯合基因型和杂合基因型，结果稳定可靠，重复性好，适合于连锁图谱的建立。但是对DNA 要求较高，检测步骤多，操作复杂，耗时费资，而且需要放射性同位素等，这都在很大程度上限制了RFLP 技术的应用。

SSR分子标记实验操作及其注意事项

SSR分子标记实验操作及其注意事项 SSR(Simple Sequence Repeats ) 又称微卫星DNA，是一类由几个(多为1~6个) 碱基组成的基序(motif )串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，它们广泛分布于整个基因组的不同位置上，每个座位上重复单位的数目及重复单位的序列都可能不完全相同，因而造成了每个座位上的多态性。SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，而且分布均匀，多态性高，呈共显性遗传，重复性好，操作简便，是一种理想的分子标记技术，被广泛应用于构建基因连锁图分子辅助育种品种鉴定遗传资源的保存等方面。 一、试剂配制 1.0.2%亲水binding silence（现配现用）：1500μL95%乙醇，7.5μL冰醋酸，再加入3μLbinding silence，混匀后使用。 2.0.5%疏水repel silence（购买后可直接使用） 3.TBE母液（5×TBE）：Tris Base,54g;硼酸,7.5g;EDTA(0.5M pH8.0),20ml.搅拌溶化，定容至1000ml，无需灭菌，室温保存，母液的pH值应保持在8.3左右。 4.Urea－TBE(一块胶板用量)：5×TBE,12ml;尿素,27g.加双蒸水溶解后定容至51ml，使用漏斗过滤。 5.40％丙烯酰胺：丙烯酰胺,380g;甲叉双丙烯酰胺,20g.加热至37℃使之溶解，加水定容至1000ml，用醋酸纤维素滤膜（入Nalge滤器，0.45μm孔径）过滤，棕色瓶避光保存于室温。 6.10％APS（过硫酸铵）：超纯过硫酸铵,2g;超纯水,18ml.溶解后，4℃保存。 7.TEMED（购买后可直接使用）：电泳级的TEMED可购自Bio-Rad，Sigma或其他供应商。 8.Loading buffer：去离子甲酰胺,50ml;0.5MEDTA(pH8.0),1ml;二甲苯腈蓝cyanol,0.125g;溴酚蓝,0.125g.混匀后置于4℃保存。 9.固定液：无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml。配制成终浓度为10％乙醇，0.5% 冰醋酸的固定液。 10.染色溶液(ACS 试剂)：无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml，AgNO3 1g。配制成终浓度为