宝生物反转录说明书

?
TaKaRa Code ：DRR047A
PrimeScript ? ? RT reagent Kit
W ith gDNA Eraser
(Perfect Real Time)
（100 次量）
宝生物工程( ( 大连) ) 有限公司
说明书

目 录
内 容 页 码
● ● 制品说明 1 1
● ● 制品内容 1 1
● ● 保 存 1 1
● ● 特 长 1 1
● ● RNA 样品制备 2 2
● ● 使用注意 2 2
● ● 操作方法 3 3
● ● 实验例 7 7
● ● 引物设计说明 9 9
● ● 引物设计服务说明 9 9
● ● 制品说明
为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有 cDNA 作为模板检出的先决条件，但 Total RNA 中常常
混有基因组 DNA，并可以直接作为 PCR 反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。为了避免这
种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组 DNA 得不到扩增。但是，此方
法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因， 同时当基因组上有伪基因存
在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本
方法。在这种情况下，我们常常需要对 Total RNA 样品进行 DNase I 处理，以除去残存的基因组 DNA。
而 DNase I 处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成 RNA 的降解和损失。
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA 进行Real Time RT-PCR反应的专
用反转录试剂。Kit 中使用了具有较强 DNA 分解活性的 gDNA Eraser，通过 42℃，2 min 即可除去基因
组 DNA。同时由于反转录试剂中含有抑制 DNA 分解酶活性的组分，经过 gDNA Eraser 处理后的样品可
以直接进行 15 min 的反转录反应合成 cDNA， 因此， 20 分钟内即可迅速完成从基因组 DNA 去除到 cDNA
合成的全过程。
使用本制品合成的cDNA适用于SYBR ? Green分析法和TaqMan ? 探针分析法，可以根据实验目的，选择与
SYBR ? Premix Ex Taq TM II （Perfect Real Time） 、 Premix Ex Taq TM （Perfect Real Time）等TaKaRa
Perfect Real Time系列定量试剂组合使用。
● ● 制品内容 （ 20 μ μl l 反应×0 100 次）
1. gDNA Eraser 100 μl
2. 5×gDNA Eraser Buffer*1 200 μl
3. PrimeScript ? RT Enzyme Mix I*2 100 μl
4. 5×PrimeScript ? Buffer 2（for Real Time）*3 400 μl
5. RT Primer Mix*4 400 μl
6. RNase Free dH 2 O 1 ml×2 本
7. EASY Dilution（for Real Time PCR）*5 1 ml
*1 5×gDNA Eraser Buffer 在反转录反应前使用，请务必进行基因组 DNA 的除去反应。
*2 含有 RNase Inhibitor。
*3 含有 dNTP Mixture。
*4 含有 Oligo dT Primer 和 Random 6 mers。
*5制作标准曲线时梯度稀释cDNA或RNA标准品的稀释液。 模板DNA或RNA如果用水或TE Buffer
稀释时，由于受 Microtube 吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释

，导致实验结果精度降
低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定量
的标准曲线。EASY Dilution 也可以单独购买（TaKaRa Code：D9160） 。
EASY Dilution 请与本公司 Real Time PCR 试剂组合使用， 对于其他公司的同类制品的适用性本
公司尚未进行确认。
● ● 保 存： -20℃。
● ● 特 长
1． 含有去除基因组 DNA 的 gDNA Eraser，只需 2 min 即可除去基因组 DNA。
2． 只需 15 min 即可高效合成 Real Time PCR 反应用模板 cDNA， 是进行 2 Step Real Time RT-PCR 反应
的最佳试剂。
3． 反转录引物使用了 Random 6 mers 和 Oligo dT Primer 混合的 RT Primer Mix，可以均匀合成样品中的
各种 cDNA。
-1-
4． 本制品提供了 SYBR Green 分析法和 TaqMan 探针分析法各自最适反应体系，可以根据分析方法选择
体系。
5． 制品中附加了标准曲线制作用稀释液 EASY Dilution（for Real Time PCR） ，将 Total RNA 或 cDNA 稀
释至低浓度时也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。
● ● RNA 样品制备
本制品是将 RNA 反转录成 cDNA 的专用试剂。RNA 的纯度会影响 cDNA 的合成量，而制备 RNA 的关键
是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的 RNA 分解酶的污染。因此，在实验中必须采
取以下措施：戴一次性干净手套；使用 RNA 操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办
法可以防止实验者的汗液、唾液中的 RNA 分解酶的污染。
【使用器具】
尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列（1）或者（2）方法进行处理。
（1）干热灭菌（180℃，60 min）
（2）用 0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37℃下处理 12 小时。然后在 120℃下高压灭菌 30 分钟
以除去残留的 DEPC。
RNA 实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。
【试剂配制】
用于 RNA 实验的试剂，需使用干热灭菌（180℃，60 min）或用上述方法进行 DEPC 水处理灭菌后的玻
璃容器盛装 （也可使用 RNA 实验用的一次性塑料容器） ， 使用的无菌水需用 0.1%的 DEPC 处理后进行高
温高压灭菌。
RNA 实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。
【制备方法】
使用简单的 RNA 纯化方法即可获得满足于 RT-PCR 反应的 RNA（只需少量的 RNA 便可进行 RT-PCR
反应） 。但为了保证实验的成功率，建议使用 GTC 法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度 RNA。
从培养细胞、组织中提取时，使用 RNAiso Plus（TaKaRa Code: D9108） 。
● ● 使用注意
以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。
1． 当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂

的混合液（Master Mix；其中包括 RNase Free dH 2 O、
Buffer、酶等） ，然后再分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免
重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。
2． gDNA Eraser和PrimeScript ? RT Enzyme Mix I在使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于酶保存
液中含有 50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。同时，要使用精确、量程适合的移液枪，并且不
要使Tip插入液面过深，否则会因Tip壁粘着造成损失，而使酶量不足。
3． 5×gDNA Eraser Buffer 和 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）在使用前需 Vortex 轻轻离心。
4． 分装试剂时务必使用新的枪头（Tip） ，以防止样品间污染。
5． 将得到的 RT 反应液加入到下一步的 Real Time PCR 反应体系中，其加入量不要超过 Real Time PCR
反应体积的 1/10（V/V）量。
-2-
● ● 操作方法
1．反转录反应。
【SYBR ? Green Assay】
① 基因组 DNA 的除去反应。
试剂 使用量
5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μl
gDNA Eraser 1.0 μl
Total RNA *1
RNase Free dH 2 O up to 10 μl
42℃ 2 min（或者室温 5 min*2）
4℃
② 反转录反应。
反应液配制请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+1 的量配
制 Master Mix，然后再分装到每个反应管中*3。
试剂 使用量
5×PrimeScript ? Buffer 2（for Real Time） 4.0 μl
PrimeScript ? RT Enzyme Mix I 1.0 μl
RT Primer Mix *4 1.0 μl
①的反应液 10.0 μl
RNase Free dH 2 O up to 20 μl*5
37℃ 15 min*6
85℃ 5 sec
4℃*7
*1 20 μl 反应体系可最大使用 1 μg 的 Total RNA。
*2 室温反应时，可以延长至 30 分钟。
*3 不配制 Master Mix， 向①的反应液中添加试剂时， 要先加入 RNase Free dH 2 O和5×PrimeScript
Buffer 2 (for Real Time)，混合后再添加 RT Primer Mix、PrimeScript RT Enzyme Mix I，轻轻
混匀进行反转录反应。
*4 使用 RT Primer Mix 可以高效合成 cDNA。因为实验目的不同，也可以不使用 RT Primer Mix，
而选择 Oligo dT Primer 或 Gene Specific Primer 进行反转录反应，引物使用量如下：
Oligo dT Primer 50 pmol／20 μl 反应体系
Gene Specific Primer 5 pmol／20 μl 反应体系
*5 反转录体系可以根据需要相应扩大。
*6 使用 Gene Specific Primer 时，建议反转录反应条件设置为 42℃ 15 min。PCR 反应有非特异
性扩增时，将温度升到 50℃会有所改善。
*7 合成的 cDNA 需要长时间保存时，请于-20℃保存。
-3-
【TaqMan ? Probe Assay】
① 去除基因组 DNA 反应。
试剂 使用量
5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μl
gDNA Eraser 1.0 μl
Total RNA *1
RNase Free dH 2 O up to 10 μl
42℃ 2 min（或者室温 5 min*2）
4℃
② 反转录反应。
反应液

配制请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+1 的量配
制 Master Mix，然后再分装到每个反应管中*3。
试剂 使用量
5×PrimeScript ? Buffer 2（for Real Time） 4.0 μl
PrimeScript ? RT Enzyme Mix I 1.0 μl
RT Primer Mix *4 4.0 μl
①的反应液 10.0 μl
RNase Free dH 2 O up to 20 μl*5
37℃ 15 min*6
85℃ 5 sec
4℃*7
*1 20 μl 反应体系可最大使用 2 μg 的 Total RNA。
*2 室温反应时，可以延长至 30 分钟。
*3 不配制 Master Mix， 向①的反应液中添加试剂时， 要先加入 RNase Free dH 2 O和5×PrimeScript
Buffer 2 (for Real Time)，混合后再添加 RT Primer Mix、PrimeScript RT Enzyme Mix I，轻轻
混匀进行反转录反应。
*4 使用 RT Primer Mix 可以高效合成 cDNA。因为实验目的不同，也可以不使用 RT Primer Mix，
而选择 Oligo dT Primer 或 Gene Specific Primer 进行反转录反应，引物使用量如下：
Oligo dT Primer 50 pmol／20 μl 反应体系
Gene Specific Primer 5 pmol／20 μl 反应体系
*5 反转录体系可以根据需要相应扩大。
*6 使用 Gene Specific Primer 时，建议反转录反应条件设置为 42℃ 15 min。PCR 反应有非特异
性扩增时，将温度升到 50℃会有所改善。
*7 合成的 cDNA 需要长时间保存时，请于-20℃保存。
2．Real Time PCR 反应。
以下是使用本制品进行反转录反应后，选择SYBR ? Premix Ex Taq TM II（Perfect Real Time） （TaKaRa
Code： DRR081） 进行Real Time PCR反应的操作方法。 采用TaqMan ? 探针法进行检测时， 请选择 Premix
Ex Taq TM （Perfect Real Time） （TaKaRa Code：DRR039） 。
-4-
◆应用 Therma l Cycler Dice ? ? Real Time System 扩增仪的操作方法
请按照Thermal Cycler Dice ? Real Time System（TaKaRa Code：TP800）的使用说明书要求进行实
验操作。
① 按下列组份配制 PCR 反应液（反应液配制请在冰上进行） 。
试剂 使用量 终浓度
SYBR ? Premix Ex Taq TM II（2×） 12.5 μl 1×
PCR Forward Primer（10 μM） 1.0 μl 0.4 μM*1
PCR Reverse Primer（10 μM） 1.0 μl 0.4 μM*1
RT 反应液（cDNA 溶液） 2 μl*2
dH 2 O（灭菌蒸馏水） 8.5 μl
Total 25 μl
*1 通常引物终浓度为 0.4 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在 0.2～1.0
μM 范围内调整引物浓度。
*2 建议在 25 μl 反应液中使用相当于 10 pg～100 ng Total RNA 量的 cDNA 为模板。
反转录反应液的加入量不能超过 PCR 反应液总体积的 10%。
② 进行 Real Time PCR 反应。
建议采用下列图表显示的两步法 PCR 反应程序。退火/延伸时间可在 20～30 秒范围内进行调整，推荐
使用 30 秒的条件。由于使用 Tm 值较低的引物等原因，两步法 PCR 反应扩增性能较差时，可以尝试
进行三步法 PCR 扩增反应。
两步法 PCR 扩增标准程序：
S

tage 1：预变性
Repeat：1
95℃ 30 秒
Stage 2：PCR 反应
Repeat：40
95℃ 5 秒
60℃ 30-60 秒
Stage 3：Dissociation*
* 使用SYBR ? Green I时进行。
◆特别提示：
本制品中使用的 TaKaRa Ex Taq HS是利用抗 Taq 抗体的Hot Start用DNA聚合酶， 与其他公司的化学修
饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的 95℃、5～15 分钟的酶的活性化反应。如果高
温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反
应前进行模板的预变性，通常设定为 95℃、30 秒。
③ 实验结果分析。
反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线（使用SYBR ? Green I时） ，进行PCR定量时制作
标准曲线等。
-5-
◆ ◆ 应用 ABI PRISM ? ? 7000/7700/7900HT ， 7300/7500/7500 Fast Real- - Time PCR System 的操作方法
请按照 Applied Biosystems 公司的仪器使用说明书要求进行实验操作。
① 按下列组份配制 PCR 反应液（反应液配制请在冰上进行） 。
试剂 使用量 使用量 终浓度
SYBR ? Premix Ex Taq TM II（2×） 10 μl 25 μl 1×
PCR Forward Primer（10 μM） 0.8 μl 2 μl 0.4 μM*1
PCR Reverse Primer（10 μM） 0.8 μl 2 μl 0.4 μM*1
ROX Reference Dye or Dye II（50×）*3 0.4 μl 1 μl 1×
RT 反应液（cDNA 溶液） 2 μl*2 4 μl
dH 2 O（灭菌蒸馏水） 6 μl 16 μl
Total 20 μl*4 50 μl*4
*1 通常引物终浓度为 0.4 μM 可以得到较好结果。 反应性能较差时， 可以在 0.2～1.0 μM 范围内调整
引物浓度。
*2 建议在 20 μl 反应液中使用相当于 10 pg～100 ng Total RNA 量的 cDNA 为模板。 反转录反应液的
加入量不能超过 PCR 反应液总体积的 10%。
*3 ROX Reference Dye II（50×）比 ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用 7500 Real-Time PCR
System 和 7500 Fast Real-Time PCR System 时，请使用 ROX Reference Dye II（50×） 。与使
用 ROX Reference Dye（50×）相比，校正后的荧光信号值高，但解析结果完全相同。使用 ABI
PRISM7000/7700/7900HT 及 7300 Real-Time PCR System 时， 请使用 ROX Reference Dye （50
×） 。
*4 96 孔板、Single-Tube、8 联 Tube 采用 50 μl 反应体系，384 孔板、96-well Fast Thermal Cycling
plate 采用 20 μl 反应体系。
② 进行 Real Time PCR 反应。
建议采用下列图表显示的两步法 PCR 反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行 PCR
条件的优化。由于使用 Tm 值较低的引物等原因，两步法 PCR 反应扩增性能较差时，可以尝试进行三
步法 PCR 扩增反应。
< ABI PRISM ? ? 7000/7700/7900HT ， 7300/7500 Real- -T T ime PCR System >
两步法 PCR 扩增标准程序：
Stage 1：预变性
Reps：1
95℃ 30 秒
Stage 2：PCR 反应
Reps：40
95℃ 5 秒
60℃ 30～34 秒*
Dissociation Stage
* 使用 7700 和 7900HT 时

请设定在 30 秒。
使用 7000 和 7300 时请设定在 31 秒。
使用 7500 时请设定在 34 秒。
-6-

◆特别提示：
本制品中使用的 TaKaRa Ex Taq HS是利用抗 Taq 抗体的Hot Start用DNA聚合酶， 与其他公司的化学
修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的 95℃、5～15 分钟的酶的活性化反应。如
果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在
PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为 95℃、30 秒。
③ 实验结果分析。
反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线（使用SYBR ? Green I时） ，进行PCR定量时制
作标准曲线等。
● ● 实验例：
A. Total RNA 中混有基因组 DNA 的去除效果验证
[ [ 方法] ]
使用提取的 Mouse Liver RNA 2 μg 进行 gDNA Eraser 添加（+）/不添加（-）实验后，再进行 RTase 不添
加的反转录反应，以确认 Total RNA 中基因组 DNA 的残存量。每个反应做 3 个复孔。
Real Time PCR反应
试 剂： SYBR ? Premix Ex Taq TM （Perfect Real Time） （TaKaRa Code：DRR041）
模 板： 上述反转录反应液 2 μl
反应体积： 25 μl
Target Gene： Mouse Rsp18
Primer： 使用 TaKaRa Real Time PCR 用引物数据库中的引物
反应条件： Thermal Cycler Dice ? Real Time System 标准反应条件
[ [ 结果]
Real Time PCR 扩增曲线图如下：
从以上扩增曲线结果可以看出，Total RNA 经过 gDNA Eraser 处理后，没有检测到基因组 DNA 的残留。
-7-
gDNA Eraser （－）
gDNA Eraser （+ + ）
B. cDNA 合成量比较
反转录反应
试 剂： DRR047A；PrimeScript ? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）
DRR037A；PrimeScript ? RT reagent Kit（Perfect Real Time）
模 板： Mouse Liver 来源 Total RNA 2 pg-2 μg 以及灭菌水
反应体积： 20 μl
RT Primer： RT Primer Mix
反应条件： 各 Kit 推荐的反应条件
Real Time PCR反应
试 剂： SYBR ? Premix Ex Taq TM （Perfect Real Time） （TaKaRa Code：DRR041）
模 板： 上述反转录反应液 2 μl
反应体积： 25 μl
Target Gene： Mouse Rsp18
Primer： 使用 TaKaRa Real Time PCR 用引物数据库中的引物
反应条件： Thermal Cycler Dice ? Real Time System 标准反应条件
Reagent R 2 扩增效率（%） Standard Curve
DRR037A 1.000 95.9 Y= －3.425×LOG（X）+ 43.05
DRR047A 0.999 95.7 Y= －3.429×LOG（X）+ 42.94
结果
从以上实验结果可以看出，使用PrimeScript ? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）进行
反转录反应，与TaKaRa深受好评的现有制品DRR037同样，可获得高质量的Real Time PCR用cDNA。
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● ● 引物设计说明
进行 Real Time PCR 反应时，设计反应性能良好的 PCR 引物非常重要。根据以下原则，可以设计 PCR

扩增效率高，反应特异性强的良好引物。
◆ PCR 扩增产物长度：80～150 bp 最为合适（可以延长至 300 bp） 。
◆ 设计引物要求如下：
*1 OLIGO: Primer Analysis Software。
*2 Primer3: （https://www.wendangku.net/doc/e810030603.html,/ftp/distribution/software/）
*3 https://www.wendangku.net/doc/e810030603.html,/BLAST/
● ● 引物设计服务说明：本公司提供用于基因表达定量分析的引物设计及合成服务
本公司以美国 NCBI Data Base 上登录的 Human、Mouse、Rat、Cow、Dog、Chicken 的 RefSeq 为对
象， 已经设计完成了各基因用于定量表达分析的Real Time RT-PCR用高特异性Primer Set， 此Primer Set
最适于本制品使用，可省略 PCR 反应条件优化实验。具体情况如下：
可提供 1～3 对合适的引物，由客户自己选择。
1. 从 3’端开始的 1,500 Base 内的引物候补序列。
2. 从 5’端开始的 1,500 Base 内的引物候补序列。
3. 针对 Target 基因全长的引物候补序列。
注）本公司只对在本公司合成的引物/探针提供免费设计服务，恕不受理不在本公司合成的引物/探针的设
计委托！
-9-
引物长度 17～25 mers
GC含量 40～60%（45～55%最佳）
Forward Primer和Reverse Primer的Tm值不能相差太大。
Tm值的计算使用专用软件。
OLIGO *1： 63～68℃
Primer3 *2：60～65℃
A、G、C、T整体分布尽量均匀。
不要有部分的GC rich或AT rich（特别是3'端）。
避开T/C（Polypyrimidine）或A/G（Polypurine）的连续结构。
避免GC rich或AT rich。
3'端碱基最好为G或C。
尽量避免3'末端碱基为T。
互补序列
避开引物内部或两条引物之间有3个碱基以上的互补序列。二条引物间的3'末端避
开有2个碱基以上的互补序列。
特异性 使用BLAST *3检索确认引物的特异性。
Tm值
引物序列
3'末端序列

技术咨询热线：
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本制品仅供研究用。请勿用于人体及动物的医疗、临床诊断或作为食品 、化妆品、家庭用品的添加剂
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