分子荧光分析法

分子荧光分析法的发展史和发展趋势

分子荧光光谱的发展经历了很长的一段时间，由于荧光的短暂性使得他的发展与应用经历了较长的时间。，第一次记录荧光现象是在1575年，西班牙内科医生、植物学家莫纳德斯(N. Monardes )提到：一种木头切片的水溶液呈“可爱的天蓝色”。17世纪，波义尔(Boyle)和牛顿(Newton)等再次观察到荧光现象并给予了更详细的描述。1852年，斯托克斯(G.G.Stokes)用分光光度计考察奎宁和叶绿素时发现：λ吸<λ荧（斯托克斯定则），所以判断荧光是先吸光再发光，即荧光是发射光。并且根据发荧光的矿物“萤石”→荧光。此外他还研究了荧光强度与浓度之间的关系；描述了高浓度时及有外来物质存在时的荧光猝灭现象。他也是第一个提出应用荧光作分析手段的人。

1867年，瑞士，高贝尔斯莱德(F.Goppelsr?der)进行了首次的荧光分析工作，应用铝-桑色素配合物的荧光进行铝的测定。1880年，莱伯曼(Liebeman)提出了最早关于荧光与化学结构关系的经验法则。19世纪末，人们已经知道了600种以上的荧光化合物。20世纪以来，荧光现象的研究就更多了： 1905年，伍德(Wood)发现共振荧光。1914年，弗兰克(Frank)和赫兹(Hertz)利用电子冲击发光进行定量研究。1922年，Wawillous 进行荧光产率的绝对测定。1926年，盖维奥拉(Gaviola) 进行了荧光寿命的直接测定。

分子发光在很多领域都有广泛的的应用。分子发光包括荧光，磷光，化学发光，生物发光和散射光。而各种分子发光都有其重要的应用。在这里主主要介绍的是分子荧光分析的应用。

分子荧光分析方法具有具有灵敏度高，选择性强，试样量少方法方便以及物理参数较多的特点。采用直角检测的方法，其灵敏度要比紫外—可见分光光度法高2～4个数量级，它的测定下限在0.1～0.001μg·cm-3之间。荧光强度计算是为If=2.3ΦI0εlc 由此可以看出提高I0能够提高灵敏度，另外荧光强度是一个绝对量，不像紫外-可见光谱是相对值，因此他就有更高的灵敏度。他的强选择性因为荧光法既能依据特征发射，又能依据特征吸收来鉴定物质。假如某几个物质的发射光谱相似，可以从激发光谱的差异把它们区分开来，而如果它们的吸收光谱相同，则可用发射光谱将其区分。

荧光分析法也有它的缺点，也就是应用范围不够广，干扰因素多。应用范围不广是因为本身能发荧光的物质相对较少，用加入某种试剂的方法将非荧光物质转化为荧光物质来进行分析，其数量也不是很多。另外，说到干扰因素主要是：溶剂，温度，ＰＨ对荧光强度影响，还有内虑光作用和自吸收现象，以及其他散射光的影响。以上这些缺点是我们在实验和研究过程中应该注意的，应该尽量减小这些影响，使得检测结果更加准确可信。

除了上述的优点和缺点之外荧光还有其他特点。其中一点，荧光光谱的形状不受激发光源的影响，而只与基态的振动能级有关，并且荧光光谱存在stokes位移。另一点，溶液中荧光物质的分子与溶剂分子相互作用会引起荧光强度降低，即我们所说的荧光的猝灭。利用这一特点可以进行物质的定性定量分析测量。

分子荧光分析法由于灵敏度高的特点，在物质定性定量检测方面有着重要应用。因为其发光特性，在黑暗体系中较为明显，可以作为一种有指示性作用的试剂；荧光分析法可以检测有机物和无机物，通过某些物质在特定的条件下发出荧光来进行物质检测；荧光还可以作为标记物进行机体内的跟踪和免疫分析。

由于荧光分析方法存在本身的影响荧光强度的因素，使得研究者应该尽可能的减少不利因素影响。例如应对内滤光作用和自吸现象以及散射光的影响，我们可以研发更好的溶剂，该溶剂的惰性要很强，很难被激发或者发生散射，另外我们可以对样品池的材质改进，使得其遮光作用远比之前使用的熔融石英低。综上所述，我们可以通过改进仪器本身的不足之处，使得荧光分析法的从系统上减小误差。另外，某些物质，如酚酞和荧光素，只是因为荧光素在苯环之间连有氧，使得荧光素具有刚性平面结构从而具有荧光特性，而酚酞则没有荧光特性。利用此特性，可以对本来没有荧光特性的物质，通过改变坏境使其发生化学反应从而生成具有荧光特性的物质，利于物质的检测。我们还可应利用荧光物质本身发光的特性为我们在未知领域探路。由于荧光物质本身的发光性使得他可以方便的被检测到，这一点对于人的机体内循环的跟踪有重要意义。

上述的想法很多已经被开发和利用。减少系统干扰的新的仪器和新的检测方法已经研发出来。分子的荧光特性也在检测，追踪方面有了广泛的应用。其中较为先进的有药物荧光分析法，荧光探针法，荧光猝灭法等。

在检测准确性上，由于受到拉曼峰和散射光的背景干扰, 影响到检测的灵敏度和选择性。因此, 一些新的荧光光谱分析新技术新方法应运而生, 诸如新型荧光试剂的合成、稀土荧光探针法、光化学荧光法、电解荧光法、激光荧光法、导数荧光法、时间分辨荧光法、全反射三维荧光光谱法、偏振荧光光谱法、荧光免疫测法、荧光反应速率法、荧光成象技术、荧光光定纤传感器、能量转移荧光分析、分子有序组合体微环境荧光分析等。这些方法和技术的应用加速了各种新型荧光分析仪器的研制, 使荧光分析不断朝着高效、痕量、微观和自动化方向发展, 极大地提高了荧光分析法的灵敏度、选择性和特异性, 应用范围不断扩大。随着荧光分析方法研究与应用的迅猛发展, 有关荧光分析法原理和应用的专著也陆续出版发行。

荧光分析法在药物的合成，分析，鉴定等方面也发挥着越来越重要的作用。常用的药物分析方法有重量分析法、滴定分析法、色谱分析法、光化学分析法、电化学分析法等。将荧光光谱分析法应用于药物分析，已在药物有效成分分析鉴定、药物代谢动力学研究、临床药理与药效分析等方面取得长足发展，并广泛应用于生化分析、生物医学、临床分析等领域的痕量分析。常规荧光分析法最早被应用于分析抗疟疾药物奎宁，随着荧光分析法的发展，其应用范围日益扩大，被广泛用于抗菌素药物、止痛药、镇静剂、止血药等的分析，涉及合成药物、生物药物和天然药物，由于自身具有发射荧光特性的物质相对较少，并且受到拉曼峰和散射光等背景的干扰，常规荧光分析法在药物分析中的应用受到限制，为使荧光分析法的应用更加广泛，发展了各类荧光分析方法，如对不发荧光的物质可通过某类化学反应使其转变为适合测定的荧光物质，对荧光较弱的物质可采取荧光增敏分析法，近年来，还发展了各种新型荧光分析技术，如激光诱导荧光法、同步荧光法、导数荧光法、荧光探针法、光化学荧光法、时间分辨荧光法、三维荧光法、偏振荧光法、荧光免疫测定法、荧光成像技术、荧光光纤传感器等，这些技术的应用加速了各种新型荧光分析仪器的研制，使荧光分析不断朝着高效、痕量、微观和自动化方向发展。

荧光探针分析法在荧光分析领域也具有重要作用。以稀土离子、荧光分子等和药物作用的荧光探针技术，大大拓宽了荧光分析法在药物分析中的应用范围，

显著提高了荧光分析的灵敏度和选择性。基于稀土荧光探针长寿命荧光特性而发展起来的高灵敏度时间分辨荧光生化分析技术已经在临床检测与生物技术领域得到了广泛的应用。对荧光探针研究已有综述。脱氧核糖核酸荧光探针的研究进展，以纳米粒子作为荧光探针在生物分析中的应用，以铽离子作为荧光探针测定了尿样中痕量的环丙氟哌酸小蘖碱的特殊的荧光性，用荧光探针分析法研究了缩氨基硫脲类钯抗癌配合物的初步筛选与作用机理等等，凡此种种都是对荧光探针的应用，也说明的荧光探针分析法的广泛应用前景。另外，荧光探针在提高其准确性和快速识别性方面还应有进一步提高。

随着药学学科的发展，人们对药物分析的要求越来越高，因此必须运用和发展更适当的分析方法来满足药物分析的要求。今后的发展方向是：探索并提出常规药物荧光分析新方法；与计算机技术紧密结合，研制出自动化程度高、获得和处理信息速度快的荧光分析仪器；发现和合成选择性优良的药物荧光试剂；与其他现代化分析仪器和方法联合使用，以更准确、更灵敏、更专一和更低检测限获得药物及药物与生物大分子相互作用的有关信息。

2011年4月19日

荧光分析法检测原理及应用举例

1 荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2 荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3 光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态， 用S i 表示，由此可推出，S 即为基态的单重态，S 1 为第一跃迁能级激发态的单重 态，S 2 为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子 在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T 1 即为第一激发态中 的三重态，T 2 即为第二激发态中的三重态，以此类推。

分子荧光分析法基本原理

分子荧光分析法基本原理 一. 分子荧光的发生过程 （一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”； 图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C） 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即 ?S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”； 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”； “三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的 10-6~10-7。 （二）分子去活化过程及荧光的发生： （一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级） 处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为： 1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。

荧光分析法基本概念

紫外可见吸收光谱 一紫外吸收光谱分析 基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱，是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。 二紫外光谱的产生 物质分子的能量具有量子化的特征（即物质分子的能量具有不连续的特征）。一个分子有一系列能级，其中包括许多电子能级，分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱 分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，从化学键的性质上考虑，与电子光谱有关的主要是三种电子：（1）形成单键的σ电子；（2）形成双键的π电子；（3）分子中非键电子即n 电子。 化合物不同，所含的价电子类型不同，所产生的电子跃迁类型不同，根据分子轨道理论，分子中这三种电子能级的高低次序大致是：（σ）＜（π）＜（n）＜（π*）＜（σ* ）σ,π是成键轨道，n 是非键轨道，σ* ,π* 是反键轨道 由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。 二紫外光谱的表示方法

紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的。 横坐标表示吸收光的波长，用nm（纳米）为单位。 纵坐标表示吸收光的吸收强度，可以用A(吸光度)、T(透射比或透光率或透过率)、1-T(吸收率)、 (吸收系数) 中的任何一个来表示。 吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置，纵坐标为它的吸收强度。

四、紫外光谱中常用的几个术语 1.发色基团和助色基团 发色基团：是能导致化合物在紫外及可见光区产生吸收的基团，不论是否显示颜色都称为发色基团。一般不饱和的基团都是发色基团（C=C、C=O、N=N 、三键、苯环等） 助色基团：指那些本身不会使化合物分子产生颜色或者在紫外及可见光区不产生吸收的一些基团，但这些基团与发色基团相连时却能使发色基团的吸收带波长移向长波，同时使吸收强度增加。助色基团通常是由含有孤对电子的元素所组成（-NH2, -NR2, -OH , -OR , -Cl等），这些基团借助P-π共轭使发色基团增加共轭程度，从而使电子跃迁的能量下降。 2．红移、蓝移、增色效应和减色效应 由于有机化合物分子中引入了助色基团或其他发色基团而产生

分子荧光分析法

分子荧光分析法 发光光谱：物质分子或原子吸收辐射被激发后，电子以无辐射跃迁至第一电子激发态的最低振动能级，再以辐射的方式释放这一部分能量而产生的光谱称为荧光、磷光。 根据物质接受的辐射能量的大小及与辐射作用的质点不同，荧光分析法可分为以下几种： 1. X射线荧光分析法 用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内（10-8 s）发射波长在X 射线范围内的荧光。 2. 原子荧光分析法： 待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内（10-8 s），部分将发生辐射跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进行定性，根据谱线强度进行定量。 荧光的波长如与激发光相同，称为共振荧光。 荧光的波长比激发光波长长，称为stokes荧光；若短，称为反stokes荧光。 3. 分子荧光分析法： 有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光（或红外光）照射时，也能发射波长在紫外、可见（红外）区荧光，根据其波长及强度可进行定性和定量分析，这就是通常的（分子）荧光分析法。

基本原理 一. 分子荧光的发生过程 （一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂， 称“单线态”； 图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C） 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即?S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”； 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1：S=1/2+1/2=1 其多重性：M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”； “三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的10-6~10-7。（二）分子去活化过程及荧光的发生： （一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级） 处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为： 1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能

分子荧光分析法基本原理

分子荧光分析法基本原理 发布日期：2005-10-07 浏览次数：9297 一. 分子荧光的发生过程 （一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂， 称―单线态‖； 图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C） 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即?S=0，则激发态仍是单线态，即―单线(重)激发态‖； 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1：S=1/2+1/2=1 其多重性：M=2S+1=3

即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为―三线(重)激发态‖； ―三线激发态‖ 比―单线激发态‖ 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的10-6~10-7。 （二）分子去活化过程及荧光的发生： （一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级） 处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为―去活化过程‖，这些途径为： 1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。