大鼠骨髓间充质干细胞的诱导分化
近年来的研究表明，干细胞作为组织材料对生物组织工程及医学的发展有着巨大影响，是目前科学界广泛关注的课题。骨髓间充质干细胞（mesenchymal
stem cells ，MSCs ）是来源于中胚层的一类干细胞，主要
存在于骨髓及其他结缔组织，不仅具有向中胚层分化的能力，而且具有向内胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的能力，在特定条件下可定向分化为骨、肌肉、血管内皮和神经等多种终末功能的细胞，参与自身组织细胞的更新、再生、修复和分化［1］。但MSCs 具体向哪个方向分化及其调控机制目前仍不十分清楚，
作者单位：050051石家庄市，河北省人民医院泌尿外科（王振
显）；050051石家庄市，河北医科大学第二医院泌尿外科（蔡文清，宋
永周，瞿长宝）
血管平滑肌细胞培养液和膀胱匀浆上清对
大鼠骨髓间充质干细胞的诱导分化
王振显
蔡文清宋永周瞿长宝
摘
要
目的：探讨已经分化成熟的平滑肌细胞的培养液和膀胱匀浆上清对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs ）
诱导分化的影响，期望为组织工程膀胱提供种子细胞。方法：分离得到的大鼠MSCs 和血管平滑肌细胞在体外扩增、传代。第4代MSCs 用10％碱性成纤维生长因子预诱导1d 后加入已分化成熟的血管平滑肌细胞的培养液和低糖培养基（1∶1）诱导培养2d ，然后加入膀胱匀浆上清进行诱导分化7d 。以未进行诱导的MSCs 为阴性对照组，分化成熟的平滑肌细胞为阳性对照组，观察干细胞形态学的变化并运用免疫细胞化学检测特异性α－平滑肌肌动蛋白抗体的表达。结果：MSCs 经诱导分化的细胞形态呈梭形平滑肌样，融合后形成峰谷状排列，并表达平滑肌特异性蛋白标志物α－肌动蛋白。诱导分化率为（25．6±3．5）％，与阴性和阳性对照组相比差异有显著性（P ＜0．05）。结论：MSCs 经体外诱导可分化为平滑肌样细胞，可作为膀胱修复的种子细胞进一步研究。
关键词
骨髓细胞；
间质干细胞；
平滑肌；
细胞培养；
分化
因表达的水平决定了蛋白表达的高低，基因表达变化应该早于蛋白水平的变化。因此，基因表达的变化应更早于其蛋白的变化，灵敏性更强。但基因表达调控是一个极其复杂而又十分精细的过程。仅就真核生物基因表达调控来说，其主要调控过程是发生在转录水平上的，转录因子通过特定的结构域与染色体或其他的蛋白质相结合，从而对基因的转录起促进或阻碍作用．这个过程又涉及许多基因和基因、基因和蛋白质、蛋白质和蛋白质等之间既相互促进又相互抑制的调节作用，至今仍有许多问题没有阐明。虽然本实验显示了AQP3和AQP3mRNA 变化的一致性，究竟AQP3mRNA 变化是否早于AQP3，其灵敏性是否好于AQP3都需要进一步的研究。
总之，大鼠胆道梗阻解除后AQP3mRNA 的表达变化趋势与AQP3一致：短期内表达下降；随梗阻解除时间延长，表达增强。AQP3mRNA 变化反映了肾功能的变化，且其早于BUN 和Cr 两者变化的出现，反映肾功能变化的灵敏性和特异度高于BUN 、Cr 。
致谢：感谢中国医科大学盛京医院麻醉科王勇讲师在实验过程中给予的无私帮助和指导！
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（收稿：2008－12－05
编辑：吴淑金）
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多数认为周围微环境是影响干细胞分化的主要因素。本实验利用已经分化成熟的血管平滑肌细胞培养液和膀胱组织匀浆上清对MSCs体外定向分化为平滑肌样细胞进行了初步研究并获得成功，希望为进一步的动物实验和临床研究提供理论依据和实验基础，为膀胱组织工程提供种子细胞来源。
1材料与方法
1．1实验材料4～6周龄100～150g健康清洁级SD大鼠，雌雄不限，由河北医科大学实验动物中心提供。L-DMEM（Sigma公司），胎牛血清（北京元亨圣马公司）、0．25％胰蛋白酶（Sigma公司），PBS液，小鼠抗大鼠α－平滑肌肌动蛋白一抗（SM-α-actin），山羊抗小鼠二抗。日本OLYMPUS荧光倒置显微镜IX71和光学显微镜CX31。
1．2实验方法
1．2．1SD大鼠MSCs的分离与培养［2］0．6％水合氯醛按照0．5mL／100g的标准腹腔注射麻醉后，无菌条件下取大鼠双侧股骨、胫骨和胸骨，并用含有双抗（青霉素100U／mL、链霉素100U／mL）的L-DMEM培养基冲出骨髓于离心管中，吹打制成单细胞悬液，离心去除上清及脂肪，用含10％FBS、100U／mL双抗的L-DMM培养基重悬。将细胞接种于培养瓶中，37℃、5％CO2环境下进行培养，3d后首次半量换液，去除未贴壁细胞。5d后全量换液。以后每2～3天换液1次，待细胞达95％融合时，用0．25％的胰酶消化2～3min 后进行传代。倒置显微镜下观察原代及传代后的细胞生长特点。
1．2．2血管平滑肌细胞的分离和培养［3］无菌条件下取大鼠胸腹主动脉，剥除外膜及内膜后将中膜剪成1mm3组织块。1．0g／LⅡ型胶原酶消化2h后再用2．5g／L胰蛋白酶消化10min，终止消化后细胞悬液离心（1000r／min，5min），加DMEM完全培养基（含10％胎牛血清，青霉素及链霉素各100U／mL）常规培养。2～3d换液，细胞70％～80％融合时传代。倒置显微镜下观察原代及传代后的细胞生长特点。1．2．3血管平滑肌细胞条件培养液的制备取对数生长期的血管平滑肌细胞培养液，0．2μm的针头滤器过滤，作为血管平滑肌细胞条件培养液，4℃冰箱保存备用。
1．2．4大鼠膀胱组织匀浆上清液的制备健康SD 大鼠4只，8周龄，体重220～250g。0．6％水合氯醛按照0．5mL／100g的标准腹腔注射麻醉，下腹部切口取出膀胱，立即用4℃0．01mol／L的PBS液冲洗，并置于8mL4℃0．01mol／L的PBS液中进行匀浆、离心（2000r／min，10min），取上清液用0．2μm的针头滤器过滤，－20℃下冷冻保存备用。
1．2．5血管平滑肌细胞条件培养液和大鼠膀胱匀浆上清对MSCs的诱导分化取第4代MSCs以2×104／mL 密度接种于预置盖玻片的6孔培养板中培养2d，使细胞贴壁。吸出培养基，用含10ng／mL碱性成纤维生长因子的完全培养基预诱导24h以促进分裂，然后用0．01mol／L的PBS液洗涤3次，换入血管平滑肌细胞条件培养液和完全培养基各半的混合培养液培养2d，最后换入膀胱匀浆上清液与DMEM为1∶3的混合培养基培养7d，期间换液1次。荧光倒置显微镜下每天观察细胞的形态变化。
1．2．6诱导后细胞的鉴定取出6孔板中的盖片，用4℃的4％多聚甲醛固定至少30min，PBS洗涤，0．2％的Triton X-100室温浸泡15min，3％H2O2室温封闭15min，PBS再洗涤，正常山羊血清封闭，37℃孵育60 min，加SM-α-actin，4℃过夜，滴加生物素化二抗工作液、辣根过氧化物酶标记的三抗工作液，DAB染色，苏木素复染，中性树胶封片，光学显微镜下观察。以未进行诱导的MSCs为阴性对照，分化成熟的平滑肌细胞为阳性对照，分别进行同样的染色处理。
1．3统计学方法数据用SPSS11．0软件处理，各组实验数据以x±s表示，组间比较用单因素方差分析。
2结果
2．1MSCs的形态学特征原代培养的骨髓细胞成分复杂，1～2d开始有少量细胞贴壁，形状不规则，有长梭形、多角形等。半量换液后，细胞开始迅速增殖，以集落形式生长为主。7～9d细胞长满瓶底，达95％以上融合，主要呈纺锤形，其中散在少量折光性强的小圆形细胞。细胞整体排列趋于规律性，呈漩涡状、辐射状或鱼群样排列（图1）。传代后细胞贴壁更加迅速，细胞形态更均一（图2）。
2．2诱导后MSCs的形态学改变实验组MSCs用含10ng／mL碱性成纤维生长因子的完全培养基预诱导及血管平滑肌细胞条件培养液和完全培养基各半的混合培养液培养2d后，细胞形态逐渐变成细长梭形，排列规则。膀胱匀浆上清诱导分化7d后MSCs转变为梭形平滑肌样的细胞，细胞变大，胞膜清晰，无空泡，可重叠生长，融合后形成峰谷排列，呈良好的去分化状态（图3）。
2．3诱导后细胞的鉴定采用平滑肌细胞特异性蛋白标志物（SM-α-actin）进行鉴定。结果显示，血管平滑肌细胞条件培养液联合膀胱匀浆上清诱导MSCs7d后，部分细胞表现为SM-α-actin染色阳性，胞浆呈现棕黄色（图4）。随机计数10个视野计算诱导分化率为（25．6±3．5）％。未进行诱导的MSCs亦有少量细胞SM-α-actin染色阳性（3．8±0．77）％，分化成熟的平滑肌细胞绝大多数表达SM-α-actin抗体（89．3±7．2）％。经统计学分析，实验组和阳性对照组、阴性对照组的α-SMA染色阳性率比较差异有显著性（P＜0．05）。
3
图1
培养到第1代第1天的大鼠MSCs 形态（倒置相差显微镜×100）；图2培养到第3代第1天的大鼠MSCs 形态（倒置相差
显微镜×100）；图3联合诱导7d 的大鼠MSCs 形态（倒置相差显微镜×100）；图4
联合诱导7d 后大鼠MSCs SM-α-actin 表达
（光镜×100）
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3讨论
组织工程学是近年来新兴起的一门学科，受到了科学界的广泛关注。其核心是利用组织工程学技术与生命科学的成果，将活细胞与生物材料结合，构建具有生物活性的组织替代材料，修复、重建、维持、恢复或提高人体组织的功能［4］。工程化组织的构建需要大量活性良好的种子细胞。组织工程膀胱采用的种子细胞多为平滑肌细胞和移行细胞，进行支架材料双面种植［5］。各种资料及临床经验提示移行上皮细胞具有很强的再生及修复能力，而平滑肌细胞则需要种植。但是平滑肌细胞取材培养困难，且体外传代有限。而MSCs 是成体干细胞，起源于中胚层，通常位于特定的微环境，具有跨系统分化的可塑性。但应用贴壁方法得到的骨髓MSCs 并不是成分均一的细胞，还含有成纤维细胞和内皮细胞、脂肪细胞等等。经过反复传代纯化，3代后的细胞形态趋于一致，所以应用4代细胞进行实验。结果显示，实验中的阴性对照组（未进行诱导的MSCs ）亦有少量细胞SM-α-actin 染色阳性（3．8±0．77）％，说明干细胞在增殖过程中有自主向其他类型细胞分化的行为。而诱导组分化率为（25．6±3．5）％，与阴性对照组相比差异有显著性（P ＜0．05），说明经过干预，可明显增加干细胞向平滑肌细胞的转化率。但是与分化成熟的平滑肌细胞相比（89．3±7．2）％转化率仍较低（P ＜0．05）。
5－氮杂胞苷和二甲亚砜是目前间充质干细胞向成肌细胞诱导分化研究中常用的诱导剂，但其诱导干细胞分化为心肌、骨骼肌细胞的作用较强，向平滑肌作用的诱导作用较弱。而且浓度和诱化后的细胞活性比较难以掌握。有文献报道5－氮杂胞苷浓度越高，诱导的作用越强，但较高的毒性作用也相应增加［6］。我们实验室曾用10％的二甲亚砜联合成纤维细胞生长因子成功的将大鼠骨髓间充质干细胞诱导为神经元样细胞，但7h 后细胞即开始死亡，24h 后大部分细胞已经脱离培养瓶瓶底。以上均说明高浓度化学诱导剂对细胞的毒性作用。而分化成熟的平滑肌细胞的培养液和膀胱匀浆上清均不是化学制剂，不含有化学诱导剂的毒性作用。
MSCs 在体内分化为何种细胞，可能受很多因素
的影响。近年来的研究表明，环境因素在干细胞分化过程中起关键作用。干细胞所处微环境的改变、宿主对其的诱导趋化作用及其可能分泌的某些趋化因子、生长因子等可能是很重要的诱导因素。大量体内分化的实验也证明了微环境诱导学说的合理性。杨景全等［7］报道，大鼠脊髓匀浆上清液可在体外有效地诱导骨髓MSCs 分化为神经样细胞。分化成熟的平滑肌细胞的培养液含有其在体外培养时分泌的多种细胞因子，是血管平滑肌细胞生存所必需的微环境。膀胱匀浆组织大部分是膀胱平滑肌组织和移行上皮组织，其上清液则可能含有平滑肌和移行上皮细胞存活、生长的某些细胞因子等，如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子及转录生长因子等，对干细胞的分化起到重要的作用。经过血管平滑肌细胞培养液和膀胱匀浆上清诱导分化成为的平滑肌样细胞可能具有膀胱平滑肌细胞的某些特性，从而有望为组织工程膀胱提供丰富的种子细胞。但是如果提高MSCs 的分化率以及其具体的分化机制是怎样的，仍需进一步的深入研究。
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（收稿：2008－09－05
编辑：陈嘉伟）
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骨髓间充质干细胞研究进展(一)
骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast，。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次〔1〕；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4～7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells，AS)，在一
大鼠的骨髓间充质干细胞提取
大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。 心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！ ④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。 第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会： ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml 细胞生长液中大约需要4.5ml
人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养
万方数据
ＩＳＳＮ１６７３—８２２５ＣＮ２１．１５３９／Ｒ赵凌云，等人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养ｗｗＭ．ｚｇｌｃｋｆ，ｃｏｍｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ０引言 骨髓间充质干细胞是具有形成骨、软骨、脂肪、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群，取材方便，易于体外扩增，可进行自体移植，而不存在组织配型和免疫排斥的问题，被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞。本实验目的在于建立一种可行的骨髓间充质干细胞取材和分离扩增的培养方法。 １材料和方法 设计：开放性实验。 单位：解放军济南军区总医院脊髓修复科。 材料：实验于２００６—０２／１２在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者，对本实验均知情同意。基础培养液由含体积分数为０．１５胎牛血清和低糖仪一ＭＥＭ配置。低糖ｄ－ＭＥＭ培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；淋巴细胞分离液（密度１．０７７ｇ／ｍＬ，上海试剂二厂生产）；胰蛋白酶，胎牛血清（Ｇｉｂｉｃｏ）；Ｃ０２培养箱（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦ９０）；生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦｓａｆｅ一１２００／ｃ）；倒置显微镜（Ｌｅｉｃａ）；离心机（ＪＯＵＡＮＢ４ｉ多功能台式机）。 设计、实施、评估者：设计、实施为第一作者，评估为第二、三作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。 方法： 骨髓间充质干细胞的分离及传代培养：在无菌条件下，以含５ｍＬ肝素钠生理盐水的２０ｍＬ注射器，于患者髂后上棘穿刺抽取骨髓组织６ｍＬ，移入含５ｍＬ肝素钠生理盐水的试管内，混匀，而后沿管壁缓慢加入含１０ｍＬ淋巴细胞分离液的离心管中，２０００ｒ，ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，小心吸取界面层细胞，用Ｄ—Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液洗２次，２０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ，加入基础培养液，血细胞计数板计数，调整细胞的浓度，将细胞悬液按１０９—１０１０Ｌ－１接种于培养瓶，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２饱和湿度孵箱中培养。于培养后的两三天更换培养液，并用Ｄ－Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液冲洗２次，以去除未贴壁的造血细胞，以后每３ｄ换液一次，进一步去除未贴壁的细胞。观察细胞生长情况，待细胞融合成片、长满培养瓶底部后，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶流过所有细胞表面，盖好瓶盖，将培养瓶放在倒置显微镜下观察，发现细胞变圆，部分脱壁，控制消化时间不超过３ｍｉｎ，立即加入２ｍＬ有血清培养液终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞生长区域，吹打过程中不要用力，结束后再用少量培养液漂洗一遍，然后加入适 ５６５０量培养液计数，分别接种在新的培养瓶内。 骨髓间充质干细胞的生长曲线的绘制：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养。以细胞数为纵坐标，时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。 骨髓间充质干细胞贴壁率的测定：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养，每隔２ｈ进行细胞贴壁率检测。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的形态学观察。②骨髓间充质干细胞的生长曲线。③骨髓间充质干细胞的贴壁率。 统计学分析：由第一作者采用ＥＳＡ４．０软件进行统计处理，数据以娃ｓ表示。 ２结果 ２．１骨髓间充质干细胞的形态学观察倒置显微镜下，骨髓间充质干细胞接种１ｄ即贴壁，２ｄ时贴壁细胞较多。经冲洗和换液去除悬浮细胞后，贴壁细胞继续培养３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（图１）。至１４ｄ细胞密集在集落中心，基本铺满瓶底，第３～５代细胞呈均匀一致的长梭型，排列成旋涡状或放射状（图２）。 图１原代培养的骨髓间充质干细胞贴壁后３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（倒置显微镜，ｘ２０） ２．２骨髓间充质干细胞的生长曲线骨髓间充质干细胞传代后３ｄ内处于潜伏期，３ｄ后进入生长期，７ｄ后进入平台期。第３代骨髓间充质干细胞生长曲线见图３。 Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１２００。Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ 万方数据
小鼠间充质干细胞分离培养与纯化
小鼠间充质干细胞 一、细胞复苏和接种 1. 37℃预热小鼠间充质干细胞培养液和基础培养液。 2. 从液氮中取出细胞产品管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。 3. 在生物安全柜中，用75%的酒精擦拭产品管外壁。 4. 将产品管中的细胞移至15ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃基础培养液4－5 ml混匀，边滴加边摇匀。 5. 用1ml基础培养液冲洗产品管，并将其转移到15 ml离心管中，边滴加边摇匀。 6. 轻轻混匀细胞后，取10 μl细胞悬液和10 μl台盼蓝混匀，从中取10 μl计数。 7. 细胞悬液在1 000 rpm，室温条件下，离心5分钟，去除上清。 8. 加完全培养液4－5 ml，调整细胞量，轻轻混匀细胞，备用。 9. 按10 000-15 000个细胞/cm2接种细胞。 10. 每个T25培养瓶中加完全培养液3-5 ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。 二、细胞换液和培养 注意：复苏或传代后的细胞，请于24小时后，第一次更换培养液。 1. 复苏后的细胞经37℃、5%CO2培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后，请继续在37℃，5％CO2培养箱内培养。 2. 之后，每2-3天更换培养液1次，至细胞长到培养瓶表面的80% 可进行传代或冻存。 3. 换液前，请将培养液从4℃中取出，使其恢复到室温。 三、消化细胞 1．消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分别配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液，
用前按1：1混合。 将PBS或D-Hank's液, 消化液，含10% FBS的基础培养液恢复到室温。 2．具体操作如下： （1）吸去培养液，加入3 ml PBS或D-Hank's液，使PBS或D-Hank's液均匀的分布在培养瓶细胞表面。1分钟之后，吸去PBS或D-Hank's液。 （2）每个T25培养瓶加入消化液2 ml，使消化液均匀的分布在培养瓶细胞面。 （3）25℃消化2分钟，在显微镜下看细胞回缩成圆形后，轻轻震动使绝大部分细胞脱落。（4）向每个培养瓶中加3-5 ml 含10% FBS的基础培养液中和胰酶的消化作用。 （5）用移液管轻轻吹打培养瓶表面使细胞完全脱落后，吸至15 ml无菌离心管内。 （6）20℃，1 500 rpm 离心5分钟，弃上清。 （7）加入一定量的完全培养液，调整细胞数量后，抽样加入胎盘蓝计数，得到细胞数和活性后，按细胞数传代或冻存。 四、细胞传代 1．消化细胞（详见第三步）。 2．按10000-15000个细胞/cm2接种细胞于T25的培养瓶中。 3．每个培养瓶中加完全培养液3-5ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。 五、小鼠骨髓MSCs的体外分离、培养及扩增 断颈处死小鼠，超净台上取胫骨和股骨，切开两端松质骨，并在骨干中部剪断，无血清DMEM-LG培养基冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，经Percoll密度梯度离心法，分离和收集有核细胞，用含15％FBS的DMEM-LG培养基重悬离心管中的MSCs，镜下细胞计数，使细胞密度达到1X106个/ml，CO2培养箱培养，换液，将MSCs不断纯化。当细胞生长融合达80%-90% 时，用1:1 的0.25% 胰蛋白酶和0.02%EDTA消化分散细胞，在显微镜
小鼠骨髓间充质干细胞培养
小鼠骨髓间充质干细胞培养 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。 实验准备： 1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。 2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器 操作步骤 1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养 取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5?2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每两天换液1次，并观察细胞形态。待细胞长至80%-85%时传代（1传2） 2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速。 采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。 分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs 获得或失去这些表面标记物的表达。
_骨髓间充质干细胞在骨科中的应用
第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述 doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011） 2 南方医科大学在读博士（南宁530011） *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
小鼠骨髓间充质干细胞使用说明
小鼠骨髓间充质干细胞 小鼠骨髓间充质干细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠骨髓间充质干细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠骨髓间充质干细胞产品简介： 产品名称：小鼠骨髓间充质干细胞 组织来源：正常小鼠骨髓 产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠骨髓间充质干细胞简介： 小鼠骨髓基质系统内存在的骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stemcells，BM-MSCs）是一种除造血干细胞以外的、具有多向分化潜能的干细胞，可以向骨、软骨、肌组织、皮肤、脂肪、神经等多种组织分化，因此可以作为组织工程中的种子细胞。 本公司生产的小鼠骨髓间充质干细胞采用冲洗骨髓，密度梯度离心，骨髓基质细胞专一性选择培养筛选获得，经检验细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
小鼠骨髓间充质干细胞的目前干细胞培养难点
干细胞培养基的选择 研究背景： 小鼠骨髓间充质干细胞的目前干细胞培养难点。小鼠的骨髓基质细胞成分复杂，间充质干细胞比率低，分离培养有一定的难度。广东医学院的博士研究生陈博士在培养过程中就遇到该问题。他曾成功饲养成人和大鼠骨髓间充质干细胞。但新近培养的小鼠间充质干细胞状态就很差。按照自己的分析：细胞培养操作没有问题，培养条件也不错，试剂来源可靠。问题应该出现在培养基配方上。陈博士以原来的骨髓间充质干细胞培养基为基础，按照导师的提点，修改了配方，但细胞不好不坏。为此他做了两次正交，结果缺总不理想，细胞状态并不稳定。陈博士为此焦头烂额，担心下一步的实验无法进行。经朋友介绍找到百恩维公司的技术支持。 解决方案： 百恩维的干细胞技术专家了解了陈博士的情况，培养技术、取材和试剂来源等，觉得不存在大问题；问题主要的原因是培养基的成分配比。建议陈博士重新配制培养基或使用现成的完全培养基。陈博士为了加快实验进度，直接选用了百恩维小鼠骨髓间充质干细胞培养基。 选用产品：小鼠间充质干细胞培养基（Catalog No.BW110014） 实施步骤： 1、使用百恩维的小鼠间充质干细胞培养基，进行原代的取材； 2、同样时间下，百恩维的培养基的MSC细胞状态明显优于自己配置的培养液； 3、经过传代，细胞的状态和增殖能力都很好； 4、成功获得了足够进行下一步实验所需的mouse MSC。 结果分析：细胞状态良好，成梭状、紧密分布，大小较均匀。目前已经传至20代。对于这次走的弯路，陈博士感慨良多。要高效的完成课题实验，就需要转变观念，合理利用和整合现有的各个优势资源，快速达到实验目标。 案例分析：目前成功的间充质干细胞培养液主要包含DMEM+FBS+谷氨酰胺+双抗。其中FBS的品牌和批次对细胞都会有不同的影响；无菌技术不成熟的新手，或者无菌条件不完善的实验室，最好使用双抗。最后，各成分的配比也有较大影响：大部分间充质干细胞适用低糖，加约10%的FBS等等，对不以寻找配方为目的的干细胞研究人员，我们建议直接使用经过不断优化和严格质量检测的百恩维干细胞培养基，提高科研效率。
人脐带间充质干细胞静脉输注小鼠的安全性
人脐带间充质干细胞静脉输注小鼠的安全性 何君1,2，李洋1,2，陈威1,2，郝好杰3，李名烁1,2，韩瑞红1,2，武鑫1,2，卢星辰1,2，金翠英1,2，郭珣1,2，易辉1,2，李晓岑1,2，赵颖1,2，武岩1,2，徐玉环1,2 1.中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京，100021 2.中国医学科学院糖尿病研究中心，北京，100005 3.解放军总医院生命科学院基础医学所，北京，100853 【摘要】目的探讨C57/BL6J小鼠重复多次尾静脉输注人脐带间充质干细胞后的免疫反应和毒性。方法将SPF级别的32只C57/BL6J小鼠随机分为阴性对照组、细胞移植组，每组16 只，雌雄各半，细胞移植组小鼠尾静脉注射分离培养的第5代人脐带间充质干细胞，一次5×106/只，每周注射一次，连续注射4周；阴性对照组每次注射相同容积的PBS。注射后后观察小鼠的一般症状，末次注射后1周、4周进行血细胞计数、血生化、免疫反应指标、脏器质量测定和组织病理学检查。结果细胞移植组小鼠血细胞计数、血生化、脏器重量和脏器系数与对照组无显著性差异（P > 0.05），脏器组织病理学在光镜下检查结果与对照组无形态学差别，以及免疫结果测定（T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+）与对照组无显著性差异( P> 0.05)，较对照组有显著性差异（P 0.01）。结论人脐带间充质干细胞重复多次尾静脉输注C57/BL6J小鼠是安全可行的，对受者无明显免疫反应和毒副作用。【关键词】人脐带间充质干细胞；静脉输注；重复多次 【中图分类号】R332 A safety study of intravenous injection of human umbilical cord mesenchymal stem cells in mice HE Jun1,2, LI Yang1,2, CHEN Wei1,2, HAO Hao-jie3, LI Ming-shuo1,2, HAN Rui-hong1,2, WU Xin1,2, LU Xing-chen1,2, JIN Cui-ying1,2, GUO Xun1,2, YI Hui1,2, LI Xiao-cen1,2, ZHAO Ying1,2, WU Yan1,2, XU Yu-huan1,2, 1.Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Science，Beijing 100021，China 2.Diabetes research center，Chinese Academy of Medical Science，Beijing 100005，China 3.Institute of Basic Medicine Science, College of Life Science, Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China [Abstract]Objective: To study the toxicity of intravenous injection of human umbilical cord mesenchymal stem cells in C57/BL6J mice with repeated administrations. Methods: 32 SPF C57/BL6J mice were randomly divided into negative control group and HUMSC transplantation group, of equal gender. HUMSCs were isolated and subsequently cultured through 5 passages in
人骨髓间充质干细胞的生物学特性分析
[基金项目]广东省科技计划项目资助(2002A3020206)。?论著? 人骨髓间充质干细胞的生物学特性分析 陈建锋1,高 毅2,潘明新2 (1中国人民解放军第401医院,山东青岛266071;2南方医科大学珠江医院) [摘要] 目的 对人骨髓间充质干细胞(HM SCs)的生物学特性进行初步分析,为其临床应用奠定基础。方法 抽取4例健康人髋骨内骨髓5～20m l,密度梯度离心法分离HM SCs。体外培养扩增后流式细胞仪检测HM-SCs表面标记物;M M T法绘制生长曲线,计算细胞倍增时间;吉姆萨染色法检测细胞核型。结果 HM SCs表面标记物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166、HL A-A BC、U EA-1阳性表达;CD34、CD45、HLA-DR阴性表达;生长曲线呈S 形,细胞倍增时间随代次增加而延长;核型分析显示第3、6代HM SCs的染色体数目未发生改变。结论 密度梯度离心法可得到纯度较高的HM SCs,表可达人类间充质干细胞的表型特征。HM SCs可在体外较长时期培养。在第7代之前细胞增殖旺盛,之后细胞增殖能力逐渐下降;在第6代之前染色体数目未发生改变。 [关键词] 人;骨髓;间充质干细胞;细胞培养 [中图分类号] R329.2+7 [文献标识码] A [文章编号] 1002-266X(2006)29-0001-03 Isolati o n an d cu ltivati o n of hu man bone marrow mesen chym al stem cells in vitro an d analysis of th ei r biological characterization s CH EN J ian-f eng,GA O Y i,PA N M ing-x in (401H osp ital of PL A,Qingdao266071,P.R.China) Abstract:[Objective]T o establish a sim ple and feasible method t o culture and pr olifer ate human bone marro w der ived mesenchy mal stem cells(HM SCs)in v itro and analyze t heir biological characterizations.[M ethods]HM SCs w er e isolated by combining gradient density centrifug ation w ith plastic adherence.T he g row th curves o f HM SCs w er e dr aw n by M T T assay,cell phenoty pes wer e detected by flow cyt ometry,cell doubling time was caculated,and cell kar yoty pes wer e measur ed by Giemsa staining.[Results]T he posit ive ex pr essio n of cell pheno type of HM SCs includes CD29,CD44,CD71,CD105,CD166,HL A-A BC,U EA-1,w hile the neg ative expression of cell phenoty pe in-cludes CD34,CD45,HL A-DR.T he g row th curve of HM SCs w as“S”shaped.T he cell doubling time pro longed w ith the passag es increased.T he chr omosome number of HM SCs of passage3and6were both46,same as human be-ings.[Conclusion]HM SCs of higher purity can be isolated by combining gr adient density centrifug ation with plastic adher ence,and maintain cell pheno types as human beings.T he pr olifer ation ability of HM SCs is strong before pas-sag e7,but decreases r apidly later.T he chr omosome number of HM SCs remains orig inal befo re passage6. Key words:human;bone mar row;m esenchymal stem cell;cell culture 骨髓组织可分为造血和基质两大系统。骨髓基质细胞是来源于骨髓基质的一种间充质细胞,在空间上起支持作用,在造血方面起精细的调节作用。体外获得足够的基质细胞是进行各项研究的基础。2004～2005年,我们对人骨髓间充质干细胞(HM SCs)进行了体外培养扩增,并对其表型、生长曲线、核型等生物学特性进行了初步分析。现报告如下。 1 材料与方法1.1 HM SCs的获取及培养 采集4例无血液疾病志愿者髂骨内骨髓5～20ml。5m l骨髓标本中加入5 ml的PBS,900g离心10min2次,以PBS制成4×107细胞数的悬液,取5m l加到5ml Percoll分离液(1.073g/ml)上,900g离心30min,吸取富含有核细胞的中间细胞层。将获取的单个核细胞加2倍量的PBS,900g离心5min,弃上清,以1×106/ml的密度接种于50ml培养瓶中,加入HM SCs完全培养基10 ml。待贴壁细胞达到80%～90%融合后,以1÷3的比例传代培养。 1.2 HM SCs表型鉴定 取传至第3～6代HM SCs, 1 山东医药2006年第46卷第29期
D609诱导小鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化
D609诱导小鼠骨髓间充质干细胞向神经元 样细胞分化1 赵洪令，孙春辉，陈箐，赵静，张尚立，苗俊英 山东大学生命科学学院发育研究所，济南（250100） E-mail: miaojy@https://www.wendangku.net/doc/ec10859148.html, 摘要：研究D609能否诱导小鼠骨髓间充质干细胞定向分化为神经元样细胞。参考Pittenger 的方法提取小鼠骨髓间充质干细胞；倒置相差显微镜观察细胞形态学变化；免疫细胞化学检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经纤维丝蛋白（NF）的表达；利用荧光探针（DCHF）并结合激光扫描共聚焦显微术检测分化细胞内活性氧(ROS)水平。结果表明D609能诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化成神经元样细胞，并表达神经元特异性蛋白NSE、NF。分化过程中ROS水平升高，FGF-2能通过降低细胞内的ROS水平提高细胞存活率。 关键词：D609；骨髓间充质干细胞；神经元分化 1.前言 骨髓间充质干细胞具有很强的自我增殖能力和分化潜能，能在特定的体内外环境条件下分化为神经细胞[1]。磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C（PC-PLC）是多种细胞中普遍存在的一种磷脂酶，其结构、功能、亚细胞分布具有物种、细胞特异性。本课题组在研究中已经发现PC-PLC参与调节血管内皮细胞、肺癌细胞以及神经元的增殖、分化和凋亡等多种信号通路[2]。同时发现PC-PLC的特异性抑制剂D609[3]能诱导部分人脐带静脉血管内皮细胞和大鼠骨髓间充质干细胞（rat Bone Mesenchymal Stem Cells，rBMSCs）定向分化成神经元样细胞[4]。小鼠骨髓间充质干细胞（mouse Bone Mesenchymal Stem Cells ,mBMSCs）是一种重要的动物实验模式细胞，D609能否诱导小鼠mBMSCs分化成神经元样细胞？目前尚未搞清。 研究表明，非毒性水平的ROS能作为信号分子，参与细胞增殖、分化和凋亡的信号转导，从而调控这些重要细胞活动[5]。我们先前的实验结果表明,ROS参与rBMSCs向神经元分化的过程。另外，碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）能维持分化的细胞存活[6]。为了探讨D609诱导mBMSCs向神经元分化的分子机制，我们检测了mBMSCs分化前后ROS水平的变化以及FGF-2对ROS水平的影响。 2. 材料与方法 2.1 材料 昆明小鼠（山东大学实验动物中心）；DMEM（low glucose）培养液（美国GIBCOBRL公司）；胰酶（上海生工）；D609 (Cat. No. T-8543；美国Sigma公司)；NSE及NF抗体（美国Sigma公司）；MTT（美国Amresco公司） 2.2 方法 2.2.1 mBMSC的提取、培养 选用6～8周龄健康雄性昆明小鼠，乙醚麻醉后淹死，无菌条件下分离股骨和胫骨，用注射器吸取4mL MSC培养液冲出骨髓，吹打成单细胞悬液，种于直径60mm的塑料培养皿 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20050422013）的资助。