玉米淀粉的生物合成及其关键酶

玉米淀粉的生物合成及其关键酶

摘要：淀粉是许多植物重要的储藏物质。近10年来，淀粉生物合成的研究进展很快，特别是对淀粉合成过程中的关键酶的研究比较深入，已经达到了分子水平。目前，许多研究结果揭示了玉米淀粉的生物合成涉及4类酶——ADPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶和去分支酶，它们在淀粉的生物合成中发挥着不同作用。本文综述了玉米淀粉合成中4类关键酶的生理生化特性、分子生物学特性以及表达调控等方面的研究进展，并讨论了今后的可能发展方向，旨在为相关研究提供参考。

关键词：玉米淀粉；生物合成；关键酶

引言

淀粉是人类的主要食物来源之一，也是化学工业的重要原料。玉米淀粉是最主要的淀粉产品，占据了国际淀粉市场80%以上的市场份额[1]。美国淀粉加工业95％的淀粉是玉米淀粉，我国淀粉的主要生产原料也是玉米。玉米淀粉除了作为食品和饲料外，还被广泛用于制造酒精、纸张、粘合剂、生物降解塑料、建筑和包装材料。玉米淀粉有直链和支链之分，直链淀粉是D-葡萄糖基以α-(1，4)糖苷键连接的多糖链，支链淀粉分子中除有叫α-(1，4)糖苷键的糖链外，还有α-(1，6)糖苷键连接的分支。淀粉在不同领域中的应用取决于其分子结构，淀粉分子结构的重要参数包括: ( 1)直链淀粉和支链淀粉的比例( 直/ 支比) ; (2 )直链淀粉的聚合度; ( 3)支链淀粉分支链长及分布等等，这些参数影响淀粉加工的理化和功能特性。淀粉的理化性质主要包括: ( l)淀粉凝胶化所需温度; (2 )凝胶化淀粉的赫性; ( 3)长期保存或冻融过程稳定性。这些特性决定着其在食品和工业应用中的价值其中, 直/支比是淀粉分子结构最重要的分子结构参数, 例如, 普通玉米淀粉直/ 支比为1 ：3, 但是直/ 支比大于l 的高直链淀粉, 具有更快的凝胶化作用, 凝胶强度高, 作为食品添加剂在改善食品的质地和结构方面有独特效果许多类型的胶卷中用高直链淀粉, 是因其具有独特的透明性, 柔韧性, 拉伸强度及防水性目前人们对环保日益关注, 高直链淀粉生产的可再生可降解膜可以减少工业废气及减弱温室效应气体的释放, 正日益引起人们的兴趣。支链淀粉具有更好的勃性, 可增加膨化食品的体积, 作为食品添加剂具有不同于直链淀粉的效果, 在翻合剂领域具有较多应用此外, 那些介于直链淀粉和支链淀粉之间的中间成分, 其淀粉分支链的长度和分支程度等物理参数有所不同, 可能会有不同的理化性质, 因而有着不同的用途[2]。

一玉米淀粉的生物合成

淀粉合成场所可以是叶绿体，也可以是淀粉体。叶绿体存在于光合器官如叶片中，淀粉体存在于非光合器官如胚乳中，它们的淀粉生物合成均有一系列的酶共同作用，但是也有很多不同之处。在叶绿体中(图一)，通过卡尔文循环固定C02，并形成3-磷酸甘油酸(3-PGA)，然后转化为磷酸丙糖(TP)。磷酸丙糖可以通过丙糖-磷酸易位体转运至胞液中，或在叶绿体

中转变成6-磷酸果糖（F-6-P)，先后转变成6-磷酸葡萄糖(G-6-P)和1-磷酸葡萄糖(G-1-P)。

G-1-P在ADP一葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase)作用下形成ADPG。所需的ATP来自光合电子传递链。ADPG可以作为淀粉合成的直接前体，在淀粉合成酶和分支酶作用下合成直链淀粉和支链淀粉[3]。

在胚乳中(图二)，叶片中合成或淀粉降解产生的蔗糖作为合成淀粉的碳源，它通过韧皮部长距离运输至贮藏器官，在胞液中蔗糖合成酶的作用下分解为果糖和UDP-葡萄糖(UDPG)，继而形成6一磷酸葡萄糖(G-6-P)或1一磷酸葡萄糖(G-1-P)。G-6-P或G-1-P进入淀粉体，再通

过AGPase催化其与ATP反应生成腺苷二磷酸葡萄糖参与淀粉合成。在淀粉合成最后阶段有三个关键的调控酶：淀粉合成酶(Starch synthase，SS)、淀粉分支酶(Starch branching enzyme，SBE)及去分支酶(Starch debranching enzyme，SDBE)的催化下合成直链淀粉和支链淀粉。SS

的主要功能是催化G-1-P以α-1，4糖苷键连接起来，形成直链淀粉或延伸支链淀粉的分支链。直链淀粉主要是由颗粒结合型淀粉合成酶催化合成，而支链淀粉是由可溶性淀粉合成酶(SSS)、SBE、SDBE三种酶协同催化形成，其中SBE催化葡聚糖链中1，4糖苷键的断裂，并将释放出的寡葡聚糖链的还原端连接到另一葡聚糖链的一个葡萄糖残基C-6羟基上，形成一个新的α-1，6糖苷键，产生一个分支，因此它是支链淀粉合成中非常关键的一种酶，对淀粉的品质具有重大的影响。然后SDBE对淀粉分支酶产生的分支进行修饰，最后合成具有一定结构特性的淀粉结晶体。叶片和胚乳中淀粉的生物合成途径相同之处在于G-1-P至淀粉合成步骤和催化反应的酶相同，特别是一些与淀粉合成有关酶的基本酶学特点相同。

图一：图二：

二淀粉合成的关键酶

1 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶

AGP存在于叶片和种子中, 是影响淀粉合成速率的关键因子。叶片中AGP主要存在于叶绿体膜上，受异构化调节,3一PGA激活, 无机磷(P i)抑制[2]。胚乳AGP 在不同物种的种子中的定位及调控有所不同, 如马铃薯、大豆的AGP 酶存在于造粉体, 玉米、大麦、水稻的存在于细胞质中; 马铃薯、玉米胚乳中AGP 酶均受到3-PGA 和Pi相对比率的调节, 但在小麦、大麦胚乳中该酶不受此调节。AGPase分为胞质型与质体型两种。在大多数植物细胞中, AGPase主要是质体型, 但在禾本科植物的胚乳中, AGPase主要是胞质型。AGPase是一个异源四聚体, 由两种结构不同的亚基组成, 其中两个小亚基（SSU）的分子量在50 000 ~55 000之间, 两个大亚基(LSU)的分子量在51 000 ~60 000之间。在功能上, 大亚基是酶活性的调节中心, 主要增加小亚基对激活因子的亲和性, 降低小亚基对抑制因子的亲和性。而小亚基则是酶活性的催化中心, 是酶别构效应的关键部位, 对淀粉的合成起关键作用[4]。玉米AGPase的LSU 突变体Sh 2与SSU 突变体Bt2内AGPase活性下降了90% ~ 95%, 淀粉含量降低了75%[5]。

AGPase是合成淀粉的限速酶。Espada在发现ADP －glucose( ADP －Glc)焦磷酸化酶时指出，其是催化淀粉合成第一步反应。Thai等［6］通过试验提出玉米淀粉合成产生是通过如下反应得到: ATP + α －glucose 1-P = ADP-glucose +PPi。后来相继发现，反应中的葡萄糖从蔗糖分解后，再通过AGPase 等一系列催化反应后淀粉合成所利用［7］，在玉米胚乳中，

运输到胞质蔗糖先经蔗糖合酶的分解，产生的果糖和UDPG 分别由磷酸变位酶和UDPG 焦磷酸化酶反应形成AGPase 的反应底物α-glucose 1-P( G1P) ，形成ADP-glucose( ADPG)后，转移到造粉体中，再进一步生成淀粉。

2 淀粉合成酶

在玉米中淀粉合成酶(starch synthase ,SS)主要有GBSS，SSI，SSIIa，SSIIb，SSIII，SSIV 等6种同工型[8]，可分为2 大类，即可溶性淀粉合成酶（SSS）和颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)。SSS主要与淀粉分支酶共同作用合成支链淀粉。GBSS与淀粉颗粒紧密结合，作物籽粒中主要起催化作用的GBSS是指由waxy基因编码的GBSS I，它是与直链淀粉合成直接有关的酶[9]。

SS是植物淀粉合成的关键酶，与淀粉的含量、直链淀粉与支链淀粉的比例、支链淀粉的链长分布和淀粉粒的结构直接相关。淀粉合成酶以寡聚糖为前体，ADPG为底物，通过α-l，4糖苷键不断增加寡聚糖的葡萄糖单位，最终合成以α一1，4糖苷键连接的多聚糖，该产物又作为SBE的底物合成支链淀粉。

3 淀粉分支酶

SBE的分子量一般在70~ 114 kD范围内。依据酶的结构、底物专一性和免疫反应等特点，SBE可分为两类：同工型A和同工型B。玉米的SBEⅡa、SBEIIb属于同工型A，玉米的SBEI属于同工型B。对比同工型A和同工型B的氨基酸序列发现，同工型A比同工型B多出一个额外的N-末端区域，通常以3个连续的脯氨酸结尾，这个额外的N-末端区域具有高度的可塑性，推测它在决定与其它酶的相互作用或决定酶的作用底物等方面起作用。据研究表明，N-末端结构域决定链长转移的专一性，而C-末端结构域参与底物的特异性[10]。在离体条件下，观察到SBE同工酶在支链淀粉生物合成中所起的作用不同。同工型A类的SBE作用的底物为支链淀粉，能使较短的糖苷键转移到支链淀粉上；而同工型B对直链淀粉的亲和力更高，在玉米中SBEI在直链上产生分支的效率是在支链上产生分支的十倍以上[9]。

SBE具有双重功能，一方面切开α-1,4-糖苷键连接的葡聚糖，另一方面对切下的短链通过α-1,6 糖苷键连接在受体上。SBE通过水解直链淀粉的α-1,4-糖苷键, 把切下的短链转移到C-6氢氧键末端, 形成α-1,6 糖苷键, α-1,6糖苷键连接形成支链淀粉的分支结构。

4 淀粉去分支酶

淀粉去分支酶(Starch debranching enzyme，SDBE)，能水解支链淀粉的α一1，6糖苷键，对淀粉的结构起“修饰”作用，根据它们作用的底物不同可将其分为两类：直接去分支酶和间接去分支酶。间接去分支酶存在于动物及酵母中，通过与4-α-葡萄糖转移酶及淀粉α-1,6-

葡萄糖转移酶的共同作用去除α-l,6连接。直接去分支酶存在于细菌及植物中，可直接去除α-1,6糖苷键。直接去分支酶根据作用底物不同又可分为两种：极限糊精酶或称R酶(Limit dextrinase；R enzyme，RE)和异淀粉酶(Isoamylase，ISA)。极限糊精酶以极限糊精为底物，特异去除它们的α-1，6糖苷键；而异淀粉酶则以支链淀粉或糖原为底物，去除它们的α-1,6糖苷键，它不能作用于极限糊精[9]。

DBE主要催化多糖链中α-( 1-6)糖苷键的水解, 在淀粉合成中起最后的修饰作用。改变DBE活性可改变直、支链淀粉的比例, 而且还可改变支链淀粉的结构, 形成分支程度不一的支链淀粉, 从而赋予淀粉新的理化特性。它的两种同工酶的功能分别是: ISA 主要水解支链淀粉和糖原的α-1,6-糖苷键, 但不能作用于极限糊精, 它在支链淀粉合成中起着主

要作用。其中ISA-1和ISA-2具有相似的催化活性, 它们构成一个复合体, 共同分枝可溶性葡聚糖, 而ISA-3 所起的作用与它们不同,可能主要参与淀粉的运转[11]。ZPU 主要水解极限糊精, 但不能作用于糖原, 它在淀粉合成过程中起着某种程度的补偿作用, 与ISA的功能并不重叠[12]。

目前, 有关DBE在支链淀粉合成中的作用机理主要有2种假说[13], 一种是以Erlander[14]为代表,认为植物糖原( Phytog ly cogen, PG)是支链淀粉合成的中间产物, 经过DBE的作用形成支链淀粉。另一种以Nakamura和Yuki[15] 等为代表, 认为SBE和DBE这2种酶的酶活性平衡对α- 1, 6-分支酶的频率或支链淀粉的α- 1, 4-侧链的链长的分配有着重

要的决定作用[16]。之后，有人认为上面2 种假说其本质是一致的, 只是着眼点不同。前一假设是以DBE的底物为着眼点,而后一假设则是以SSS、SBE、DBE 3种酶的协同作用为着眼点, 并且这2 种假说彼此是相互补充的。

5 淀粉合成过程中酶之间的互作及磷酸化反应

淀粉的合成是一个复杂的生理生化过程，需要不同酶的协同参与。Gao等[17]从玉米转座插入突变体中筛选到dul突变体。该突变体胚乳中SSII和SBEIIa 的活性下降，胚乳中直链淀粉含量、中间类型的淀粉含量以及支链淀粉的分支度显著提高。于是认为du1 是玉米胚乳淀粉结构的决定因子之一。Cao等[18]发现在发育的玉米胚乳中大部分的SS 活性由DU1和zSSI 表达的，在淀粉合成过程中2种同工酶的相对活性并没有显著改变。在缺乏DU1的突变体中发现其对剩余的SS 有显著的刺激作用，认为DU1 和zSSI 相互补充。

在催化淀粉合成过程中, 与淀粉合成相关的几个关键酶还需经历磷酸化过程。Telow 等[19]发现完整的质体经γ-32P-ATP培养后, 在检测出的质体可溶性磷酸蛋白中, 造粉体的BEⅠ、BEⅡ a与BEⅡ b及叶绿体的BEⅠ与BEⅡ a均发生磷酸化反应, 位点在ser(丝氨酸)残基上;

在颗粒结合磷酸蛋白中,BEⅡ和两个SS(包括SSⅡ a)也发生了磷酸化反应。磷酸化能提高造粉体与叶绿体BEⅡ a及造粉体BEⅡ b 的活性, 去磷酸化则降低这些酶的活性。

三展望

随着生物技术的迅速发展，人们对植物玉米淀粉的生物合成机理、关键酶的生化特性、表达调控等方面有了很大的突破。但现今玉米淀粉生物合成方面仍有许多问题有待进一步的研究。如：1. 如各个同工酶之间的互作关系以及它们对淀粉结构形成的调控机制还未完全清楚; 2.各个同工酶基因转录后调控对淀粉合成影响的研究甚少；3.除了这四种酶以外其它较重要的酶( 如异化酶、磷酸化酶、淀粉酶等) 是否参与淀粉的合成,目前尚未有明确的结论。

4.四类关键酶是如何相互作用的？因此，关于玉米淀粉的生物合成还有待我们更加深入的研究。

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酶法合成阿莫西林原理

酶法合成阿莫西林介绍 β-内酰胺抗生素经过多年的发展，己成为抗生素中的最主要类型之一。由于具有良好的抗菌效力，较低的毒副作用，在临床上广泛应用，其发展非常迅速。现全世界耗用量已过万吨，预计今后还会增长。其中，青霉素和头孢菌素为最重要的两大类β-内酰胺抗生素。酶法合成技术始于20世纪60年代末70年代初，经过30多年的发展，现在酶缩合反应技术、产品分离以及固定化酶技术等方面取得很大的发展，配套技术日益完善，具备了大规模工业化生产的条件。全球著名的β-内酰胺抗生素生产厂家如荷兰DSM公司已有酶法合成的商品头孢氨苄、阿莫西林等产品面世。由于酶法应用于β-内酰胺抗生素合成，不仅可减少反应步骤，而且还可减少废弃物的产生，有利于保护环境，降低生产成本，产品质量优异，所含杂质极少。因此，21世纪β-内酰胺抗生素的酶法合成将是发展的必然趋势。我国酶法合成研究起步并不晚，但至今仍未形成大规模工业化生产，与国外先进厂家差距较大。随着我国经济快速发展，人们对自身居住环境的要求，政府对环保的重视，政府和越来越多的企业加大“绿色化学制药”的研究开发，特别是加快工业化生产的推进进程。 酶法产品主要有三大特点： 一是产品含量稳定、变化小，可降低制剂在有效期内的检测风险，并且杂质低，降解速度慢，对制剂的安全性，尤其是特殊制剂的稳定性尤为重要。 二是酶法产品生产批量能够达到化学法产品的2～3倍，这既能够大幅度节省制剂生产商的检验成本，粗略估算原料检测成本能够节约人民币9元/kg；同时，也便于物流、仓储和生产管理。 三是酶法产品是通过生物酶一步到位生产而得，以纯净水为介质，不使用传统化学工艺中的特殊化工原料，有机溶剂的使用量大幅度减少90%，废水排放减少80%，品质更纯净。 1 青霉素酰化酶的发展 青霉素酰化酶是从微生物或其代谢产物中发现的一类具有特定活性的蛋白质。能够产生青霉素酰化酶的微生物广泛分布于细菌、放线菌、真菌和酵母中,如:醋酸杆菌、假单胞菌、粪产碱菌、黄单胞菌、产气单胞菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、枝状杆菌、克氏梭菌( Kluyvera) 等,其中常用的有巴氏醋酸杆菌、粪产碱

(转化率)酶法合成头孢氨苄工艺研究

. 516 . 收稿日期：2012-08-10 基金项目：国家863计划(2012AA021204)。 作者简介：王艳艳，女，生于1978年，学士，工程师，主要从事生物酶的制备和应用，E-mail: wyycspc@https://www.wendangku.net/doc/ea13202273.html, 文章编号：1001-8689(2013)07-0516-04 酶法合成头孢氨苄工艺研究 王艳艳 袁国强 朱科 王进贤 (石药集团中诺药业(石家庄)有限公司，河北省抗生素工程技术研究中心，石家庄 050041) 摘要：目的 酶法合成氨苄西林工艺优化并回收套用母液中的母核。方法 采用酶催化法，以7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸(7-Amino-3-methyl-3-cephem-4-carboxylic acid , 7-ADCA) 为母核，苯甘氨酸甲酯(D-phenylglycine methyl ester, PGM) 为酰基供体，在水相中用固定化青霉素酰化酶(Penicillin Gacylase, PGA)催化合成头孢氨苄(Cephalexin)；对投酶量、侧链与底物投料比、反应温度、反应pH 、反应时间及母液中7-ADCA 回收套用等条件进行优化，考察头孢氨苄摩尔收率及产品质量。结果 工艺优化后头孢氨苄摩尔收率85%以上，套用母液中回收的7-ADCA 后头孢氨苄摩尔收率91%以上，高于目前化学法的收率(89%)，产品质量合格。结论 酶法合成头孢氨苄工艺反应条件温和，收率高，排放废水中仅含有一些简单的无机盐，对环保无压力，属于绿色合成工艺。 关键词：青霉素G 酰化酶；头孢氨苄；7-ADCA 中图分类号：R978.1+1 文献标识码：A Study on preparation of cephalexin by enzymatic method Wang Yan-yan, Yuan Guo-qiang, Zhu Ke and Wang Jin-xian (Shijiazhuang Pharm.Group Hebei Zhongnuo Pharmaceutical Co., LTD, Hebei Province Antibiotic Engineering Technology Research Center, Shijiazhuang 050041) Abstract Objective To study the process optimization of cephalexin by enzymatic synthesis and recycling the nucleus in the mother liquid. Method Using the enzymatic method, 7-amino-3-methyl-3-cephem-4-carboxylic acid as the nucleus, D-phenylglycine methyl ester as the acyl donor, in the aqueous phase with immobilized penicillin G acylase catalyzed synthesis of cephalexin; temperature, pH, side chain and substrate feed ratio, investment conditions, Such as the amount of enzyme, reaction time and recycling the nucleus in the mother liquid was optimized, examining the yield and quality of the products. Result The molar yield of cephalexin was 85% after process optimization, and the molar yield of cephalexin was 91% after mother liquor was recycled, it was higher than the chenmical method(89%), and product quality was quali ? ed. Conclusion The reaction conditions of enzymatic cephalexin was mild, the yield was higher, waste water of reaction contained only some simple inorganic salt and it decreased the environmental pressure, which belonged to the green synthesis process. Key words Penicillin G acylase; Cephalexin; 7-ADCA 头孢氨苄是广谱抗生素，通过抑制细胞壁的合成，达到杀菌作用，是目前临床使用量较大的一个半合成头孢菌素，是头孢类抗生素中的一个主要品种。 头孢氨苄的传统合成方法是把母核和侧链经过 化学方法结合而得到头孢氨苄[1-2]，化学合成过程经过混酐、缩合、水解和结晶等工序，由于需要基团保护、工艺路线较长，工序中用到吡啶、特戊酰氯、N, N-二甲基甲酰胺(DMF)β-萘酚等毒性很大的 中国抗生素杂志2013年7月第38卷第7期 DOI:10.13461/https://www.wendangku.net/doc/ea13202273.html,ki.cja.005215

关键酶

糖酵解的关键酶——己糖激酶Hexokinase ，磷酸果糖激酶-1 PFK-1，丙酮酸激酶regulative factor：Insulin promotes the synthesis of three key enzymes 磷酸果糖激酶-1 PFK-1： 1)6- 磷酸果糖、1,6-二磷酸果糖、2,6-二磷酸果糖、ADP、AMP是变构激活剂。 2)ATP、柠檬酸及长链脂肪酸是变构抑制剂。 丙酮酸激酶： 1)1,6-二磷酸果糖、ADP是变构激活剂 2)ATP，乙酰CoA及长链脂肪酸是变构抑制剂。 丙酮酸氧化脱酸的关键酶——丙酮酸脱氢酶复合体 E1 TPP VitaminB1 E2 硫辛酸硫辛酸 coenzyme A 泛酸 E3 FAD Vitamin B2 NAD+ Vitamin PP Regulation：受催化产物ATP、乙酰CoA的抑制。AMP 、CoA 、NAD+增加乙酰CoA减少，酶激活 三羧酸循环的关键酶—— 1)柠檬酸合酶 2)异柠檬酸脱氢酶（高能状态-ATP多-的情况下受抑制，and vice verse ）， 3)α-酮戊二酸脱氢酶（类似丙酮酸脱氢酶复合体，3，5形式） 产物堆积抑制TCA，主要是ADP 、ATP 的变化。 Ca+ 可促进TCA 磷酸戊糖的关键酶——6-磷酸葡萄糖脱氢酶 受NADPH 的反馈抑制性调节 糖异生的关键酶——G-6-P酶，果糖二磷酸酶，磷酸烯醇式丙酮酸激酶(草酰乙酸磷酸烯醇丙酮酸)、丙酮酸羧化酶（丙酮酸草酰乙酸） 途径Ⅰ：果糖二磷酸酶（1，6二磷酸果糖G-6-P）G-6-P酶（G-6-P Glucose ）2,6-二磷酸果糖和AMP激活G-6-P酶，而抑制果糖二磷酸酶的活性而抑制糖异生 途径Ⅱ：丙酮酸激酶（磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸） 1，6二磷酸果糖是丙酮酸激酶的变构激活剂 增强糖异生，必要抑制糖酵解。 原料增加可促进糖异生，乙酰CoA可加强糖异生 丙酮酸羧化酶，辅基：生物素。需要Mg2+ 和Mn2+ 磷酸烯醇式丙酮酸有能量最高的高能磷酸键 糖原合成的关键酶——糖原合酶

谷胱甘肽化学与酶法合成

谷胱甘肽化学法和酶法合成 1 化学性质 谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽，半胱氨酸上的巯基为其活性基团（故谷胱甘肽常简写为G-SH）分子式为C10H17N3O6S，分子量为307.32348，熔点为189~193℃，晶体呈无色透明细长拉状，等电点为5.93。GSH有还原型（G-SH）和氧化型（G-S-S-G）两种形式，在生理条件下以还原型GSH占绝大多数。谷胱甘肽还原酶催化两型间的互变。该酶的辅酶为磷酸糖旁路代谢提供的NADPH。 图1 GSH的结构式 2 药理作用 GSH可促进糖、脂肪及蛋白质代谢，加速自由基排泄，保护肝脏的合成、解毒、灭活激素等功能。 3 谷胱甘肽的生产方法 1888年，GSH首先从酵母中分离出来。日本1983年进行了含量较多的GSH 酵母的生产，其后又研究了GSH提取、分离技术及分析检测方法。目前国外实现了GSH规模生产。世界主要的氨基酸制造商Kyowa，Aji-nomoto和Degussa 等都相继投巨资于氨基酸的研究与开发，仅Kyowa 1998年氨基酸的研究与开发就耗费达1.9亿美元，而GSH是其重点之一，Kyowa目前是GSH主要的供应商。目前GSH的主要生产方法有：萃取法、发酵法、酶法和化学合成法。 3.1萃取法 萃取法主要是通过萃取和沉淀的方法从GSH含量比较高的动植物组织中将GSH分离提取的一种方法，GSH的早期生产都是采用萃取法，是生产GSH的经典方法，也是发酵法生产流程中的下游过程基础。其工艺路线如下图：

图2 GSH发酵法工艺路线图 该方法的不足：由于GSH在组织中含量极低，可用原料少，制备的纯度和收率都不高，故在实际生产中应用不广泛。 3.2酶法 在酶催化合成GSH中，几种关键的化合物和条件包括：GS HⅠ和GS HⅡ、氨基酸原料(L-谷氨酸、甘氨酸和L-半胱氨酸)、ATP、保持GS HⅠ和GSHⅡ活性所必需的辅因子(Mg2+)和一个适当的pH值环境。合成中，需求大量ATP，给GSH的工业化生产带来麻烦，大大提高了GSH生物合成的成本，所以只能寻求一个ATP生成系统来藕联ATP消耗系统。两种系统同在一种生物体内的称为自藕联系统，在多种生物体内的称为共藕联系统。自藕联系统研究的比较少，因为很难找到一种生物体同时含有ATP生成系统和ATP消耗系统。 Murata等人发现酒酵解菌(s.cerevisae)中的葡萄糖是最简单的ATP生产系统之一，可以提供足量的ATP用来GSH的生物合成。酶催化法合成GSH的浓度可以达到99/l，但是所用的氨基酸原料比较贵，提高了GSH生物合成的成本。 3.3发酵法 生物发酵法是利用廉价的糖作为原料，利用微生物体内物质的代谢途径来合成GSH的方法。由于发酵法所使用的细菌或酵母容易培养，加之生产方法及工艺的不断改进和完善，因此微生物发酵法已成为目前GSH工业化生产的最普遍方法。在工业上，生物发酵法一般都选用s.eerevisae和Candidautilis为原料进行发酵。 一般情况下，微生物细胞中GSH含量不高，仅为细胞干重的0.1~1.0%。过高含量的GSH容易破坏体内业已平衡的氧化还原环境，GSH是胞内产物，实际生产过程中需要进行提取，较低的含量无疑会大大提高生产成本。因此，发酵法生产GSH的关键问题在于如何提高细胞密度以及细胞内的GSH含量。二者的有机结合将有利于GSH产量的大幅度提高。

糖原合成酶激酶

糖原合成酶激酶 【关键词】胃癌；,,GSK 摘要：目的：探讨糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase3β，GSK3β) 与胃癌细胞中PCNA表达之间的关系及其临床意义。方法：应用免疫组织化学SP法检测75例人胃癌组织和10例正常胃粘膜组织中GSK3β和PCNA的蛋白表达。结果：GSK3β蛋白在胃癌中的阳性率为48.00%。GSK3β的蛋白表达与胃癌患者的分化程度、TNM 分期以及淋巴结转移均密切相关（P＜0.05）。在75例人胃癌组织中，COX2、EGFR蛋白表达之间呈显著负相关（P=0.000, r=0.422）。结论：GSK3β的低表达促进了胃癌细胞的增殖，有一定的预后意义。 关键词：胃癌； GSK3β； PCNA；免疫组织化学 糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase3β，GSK3β)作为一种丝/苏氨酸蛋白激酶，其生物学作用已远远超过了最初认为的糖代谢调节酶的功能。新近研究发现，GSK3β能磷酸化多种底物，包括代谢与信号蛋白、细胞结构蛋白和转录因子等，因而在细胞的生长、发育、肿瘤发生等过程中发挥着重要的作用［1,2］。近几年来的研究发现GSK3β的活性能抑制某些肿瘤细胞的增殖和生存［3］，关于GSK3β参与胃癌细胞增殖的确切机制目前尚不清楚。因此，本研究探讨了GSK3β与胃癌细胞中PCNA表达之间的关系及其临床意义。

1 材料与方法 11 标本来源 随机收集本院2003年9月～2005年10月手术切除后的胃癌标本75例，其中男性48例，女性27例；年龄35～73岁，平均年龄56岁。临床TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期33例，Ⅲ期28例，Ⅳ期4例。伴有淋巴结转移的胃癌组织49例，不伴有淋巴结转移的肺癌组织26例。癌细胞分化程度：高分化21例，中分化31例，低分化23例。正常胃组织10例，为非肿瘤患者手术标本。胃癌手术切除标本取材后经4%中性缓冲福尔马林固定。以4μm厚连续切片3张，1张进行苏木素伊红染色，由两名高级病理医师复查切片并重新诊断，另2张进行GSK3β、PCNA的蛋白检测。 12 试剂 兔抗人GSK3β多克隆抗体（SC9166）、鼠抗人PCNA单克隆抗体（ZM0213）、通用型SP试剂盒（SP9000）和DAB底物试剂盒（ZLI9018）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 13 免疫组织化学染色及结果判断

各种物质代谢关键酶及其调节

各种物质代谢关键酶及其调节 代谢途径关键酶抑制剂激活剂 糖酵解 己糖激酶G6P、长链脂酰CoA 胰岛素 磷酸果糖激酶-1ATP、柠檬酸ADP、AMP F-1，6-2P、F-2，6-2P 丙酮酸激酶ATP、丙氨酸、胰高血糖素F-1，6-2P 糖的有氧氧化(除糖酵解) 丙酮酸脱氢酶复合体ATP、乙酰CoA NADH、脂肪酸 AMP、CoA NAD+、Ca2+异柠檬酸脱氢酶ATP ADP、Ca2+α-酮戊二酸脱氢酶ATP、NADPH、琥珀酰CoA Ca2+ 磷酸戊糖途径葡糖-6-磷酸脱氢酶NADPH/NADP+比例↑NADPH/NADP+比例↓糖原合成糖原合酶糖原合酶b(无活性、磷酸化) 糖原合酶a(有活性、去磷酸化) 糖原分解糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶b(去磷酸化) 糖原磷酸化酶a(磷酸化) 糖异生 葡糖-6-磷酸酶 果糖二磷酸酶-1 果糖-2,6-二磷酸ATP/AMP 丙酮酸羧化酶乙酰CoA 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 胆固醇的合成羟甲基戊二单酰CoA还原酶 (HMG CoA还原酶) 甲羟戊酸、胆固醇、7β-羟胆固 醇、25β-羟胆固醇、胰高血糖素、 皮质醇 胰岛素、甲状腺素 甘油三酯的合成脂酰CoA转移酶 脂肪酸的合成乙酰CoA羧化酶脂酰CoA 胰高血糖素、肾上腺素、生长素柠檬酸、异柠檬酸、乙酰CoA 胰岛素 脂肪动员激素敏感性甘油三酯脂肪酶 (HSL) 胰岛素、前列腺素E2 Adr、NA、胰高血糖素、ACTH、 TRH

代谢途径关键酶抑制剂激活剂脂肪酸分解(β-氧化) 肉碱脂酰转移酶I 尿素的合成氨基甲酰磷酸合成酶I N-乙酰谷氨酸 精氨酸代琥珀酸合成酶 嘌呤核苷酸的从头合成磷酸核糖焦磷酸(PRPP)合成酶 PRPP酰胺转移酶 嘧啶核苷酸的从头合成氨基甲酰磷酸合成酶II(人类) 天冬氨酸氨基甲酰转移酶(细菌) 胆汁酸的合成胆固醇7α-羟化酶 DNA的合成DNA-pol(DNA聚合酶) RNA的合成RNA-pol(RNA聚合酶) 蛋白质的合成氨基酰tRNA合成酶 冈崎片段的处理是复制过程中的切除修复，所需的酶——RNA酶、DNA-pol I、DNA连接酶 由糖基化酶起始作用的损伤切除修复所需的酶——内切酶、外切酶、连接酶、聚合酶 紫外线所致损伤修复所需的酶——蛋白质UvrA、B、C，解螺旋酶、DNA-pol I、连接酶

糖原合成酶(Glycogen synthase,GCS)试剂盒说明书

货号：MS3600 规格：100管/96样糖原合成酶（Glycogen synthase，GCS）试剂盒说明书 微量法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： GCS（EC 2.4.1.11）催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UTP，以α-1，4-糖苷键相连延长糖链，是肝和肌肉糖原合成酶的限速酶，是胰岛素作用的主要靶酶，对糖代谢的调节和血糖稳态的维持具有重要作用。 测定原理： GCS催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UDP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映GCS活性。 自备实验用品及仪器： 分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：100mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体18 mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体2.5mL×1瓶，4℃保存； 试剂三：液体16.4uL×1支，4℃保存； 试剂四：粉剂×1支， -20℃保存； 试剂五：粉剂×1支， -20℃保存； 样本的前处理： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、工作液的配制：临用前将试剂三和试剂四转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分 装后-20℃保存，禁止反复冻融。 3、试剂五的配制：临用前在试剂五中加入1mL试剂二充分溶解待用；用不完的试剂分装后 -20℃保存，禁止反复冻融。 4、将工作液和试剂五置于37℃预热5分钟。 5、在1mL微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂五和180μL工作液，立 即混匀，记录340nm处初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。 注意：在该试剂盒中，若ΔA大于0.1，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使ΔA小于0.1可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。 GCS活性计算： a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按样本蛋白浓度计算 第1页，共2页

第二章 酶的生物合成与发酵生产

第二章酶的生物合成与发酵生产 酶工程就是将酶所具有的生物催化功能，借助工程手段应用于社会生活的一门科学技术。酶制剂是如何生产的呢？我们知道，酶是活细胞产生的具有催化作用的生物大分子，广泛存在于动植物和微生物体内。酶的生产方法有三种：提取分离法、生物合成法、化学合成法。生物合成法又包括：微生物细胞发酵产酶、植物细胞发酵产酶和动物细胞发酵产酶 第一节酶生物合成及调节 一、酶的生物合成 先从遗传信息传递的中心法则谈起（1958年，Crick提出） 遗传信息传递的中心法则：生物体通过DNA复制将遗传信息由亲代传递给子代，通过RNA 转录和翻译而使遗传信息在子代得以表达。 DNA具有基因的具有基因的所有属性。基因是DNA的一个片段，基因的功能最终由蛋白质来执行，RNA控制着蛋白质的合成。核酸是遗传的物质基础，蛋白质是生命活动的体现者。 1970年Temin和Baitimore发现了逆转录酶，是对中心法则的补充。即：细胞能否合成某种酶分子。首先取决于细胞中的遗传信息载体－DNA分子中是否存在有该酶所对应的基因。DNA分子可以通过复制生成新的DNA，再通过转录（transcription）生成所对应的RNA，然后再翻译（translation）成为多肽链，经加工而成为具有完整空间结构的酶分子。 （一）RNA的生物合成--转录(transcription)P102 DNA分子中的遗传信息转移到RNA分子中的过程，称为转录。 转录：见课件附图，书P102 定义：以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。 模板链（template strand）：又称反意义链（antisense strand），指导转录作用的一条DNA RNA的转录过程：转录过程分为三步：起始、延长、.终止 补充：原核生物的RNA聚合酶(DDRP)-见课件附图 E.coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（α2、β、β′、） 全酶（holoenzyme）包括起始因子σ和核心酶（core enzyme）。

糖原的分解和生物合成

第二十三章糖原的分解和生物合成 一、是非判断题 1、α-淀粉酶和-β淀粉酶的区别在于α-淀粉酶水解-1，4糖苷键，β-淀粉酶水解β-1，4糖苷 键。（） 2、麦芽糖是由葡萄糖与果糖构成的双糖。（） 3、在糖类物质代谢中最重要的糖核苷酸是CDPG。（） 4、淀粉，糖原，纤维素的生物合成均需要“引物”存在。（） 5、在高等植物中淀粉磷酸化酶既可催化α-1，4糖苷键的形成，又可催化α-1，4糖苷键的 分解。（） 6、在植物体内，蔗糖的合成主要是通过蔗糖磷酸化酶催化的。（） 答案 1、错。 2、错。 3、错。 4、对。 5、对。 6、错。 二、填空题 1．α淀粉酶和β–淀粉酶只能水解淀粉的_________键，所以不能够使支链淀粉完全水解。 2、________是碳水化合物在植物体内运输的主要方式。 3、植物体内蔗糖合成酶催化的蔗糖生物合成中葡萄糖的供体是__________ ，葡萄糖基的受 体是___________ ； 4、淀粉的磷酸解过程通过_______酶降解α–1，4糖苷键，靠________和________ 酶降 解α–1，6糖苷键。 5、合成糖原的前体分子是_________，糖原分解的产物是______________。 6、物中淀粉彻底水解为葡萄糖需要多种酶协同作用，它们是__________，___________， _____________，____________。 7、将淀粉磷酸解为G-1-P，需_________，__________，__________三种酶协同作用。 8、糖类除了作为能源之外，它还与生物大分子间___________有关，也是合成__________，___________，_____________等的碳骨架的共体。 答案 1、α-1，4糖苷键 2、蔗糖 3、UDPG；果糖 4、淀粉磷酸化酶；转移酶；α-1，6糖苷酶 5、UDP-葡萄糖；G-1-P 6、α-淀粉酶；β–淀粉酶；R酶；麦芽糖酶 7、淀粉磷酸化酶；转移酶；脱支酶 8、识别；蛋白质；核酸；脂肪 三、选择题 1、植物合成蔗糖的主要酶是：

生物酶法制备生物柴油研究综述.

生物酶法制备生物柴油研究综述 分数低于0.0005 %，十六烷值高达73.6，在0#柴油中添加了 20%的生物柴油后，尾气排放中 CO 降低了28%，未燃烧的碳氢化合物降低了 36 %，NOx降低了24 %，全负荷烟度下降幅度达到 0.2～0.9 Rb。 蔡志强等 [10]探究了固定化脂肪酶分别催化酯化与醇解两种方法合成生物柴油的最佳工艺条件。 研究发 现，酯化工艺的最佳工艺条件是：2%固定化脂肪酶，温度为30 ℃，油酸∶甲醇=1∶1（摩尔比），分 2 次等摩尔流加甲醇，反应时间 24 h，或分 3 次等摩尔流加甲醇，反应时间 36 h，酯化率都可以达到 95%以上；醇解的最佳工艺条件是：4%固定化脂肪酶，温度为30 ℃，菜籽油∶甲醇=1∶3（摩尔比），分 3 次等摩尔流加甲醇，反应时间为 48 h，酯化率可以达到 95%以上，去除下层甘油后，菜籽油甲酯纯度可达 98%。 安永磊等 [11]利用固定化脂肪酶催化餐饮废油与乙醇反应制备生物柴油。通过实验获得了酯化反应的最佳条件：反应温度47 ℃，有机溶剂为正己烷，醇油比3∶1，5 次投加乙醇，酶用量为 0.3 g，反应时间 32 h 时，生物柴油产率可达 81%。 徐桂转等 [12]利用固定化脂肪酶 Novozym 435，在无有机溶剂存在的情况下，催化菜籽油与甲醇酯交换反应制取生物柴油。研究得到了菜籽油间歇酯交换反应的适宜工艺条件：转速200 r/min，反应温度：50 ℃，甲醇∶菜籽油=1∶5 （摩尔比），酶用量 10%（与菜籽油的质量比）。 反应分两次加入等量甲醇，即先加入总量一半的甲醇，反应 10 h（菜籽油的酯交换率达到 47%）；再加入剩下全部甲醇，反应26 h（酯交换率达到80%）。 唐凤仙等 [13]以戊二醛交联壳聚糖固定的 A.niger Li-38脂肪酶催化棉籽毛油 合成生物柴油取得了不错的效果。 研究发现该固定化酶的贮藏稳定性较好，室温放置 12 d, 酶活性仍能保持 80%以上。固定化酶在30~70 ℃，pH=5.5~6.5 之间较稳定，其热稳定性和 pH 稳定性较游离酶有所提高。固定化酶可重复使用 7 次，转化率保持在80%以上。 洪鲲等 [14]研究了两种脂酶顺序催化制备生物柴油的生产工艺。结果表明：固相化细菌 A007 脂酶催化甘油三酯（TAG）水解的最适条件为：含水量 40%、脂酶用量100 U/g、反应温度30 ℃、反应时间 12 h，此时 TAG水解率和游离脂肪酸（FFA）含量分别为 93.3%和90.1%；在催化 FFA 甲酯化过程中，固相 化 Candidaantarctica 脂酶在FFA∶甲醇=1∶5 时可达到最佳效果；在第二次甲酯化时，加入甘油有利于提高FFA 酯化率，经过 24 h 反应，可将总酯化率

酶法合成研究进展

β-内酰胺抗生素的酶法合成研究进展β-内酰胺抗生素经过多年的发展，己成为抗生素中的最主要类型之一。由 于具有良好的抗菌效力，较低的毒副作用，在临床上广泛应用，其发展非常迅速。现全世界耗用量已过万吨，预计今后还会增长。其中，青霉素和头孢菌素为最重要的两大类β-内酰胺抗生素。酶法合成技术始于20世纪60年代末70年代初，经过 30多年的发展，现在酶缩合反应技术、产品分离以及固定化酶技术等方面取得很大的发展，配套技术日益完善，具备了大规模工业化生产的条件。 全球著名的β-内酰胺抗生素生产厂家如荷兰DSM公司已有酶法合成的商品头孢氨苄、阿莫西林等产品面世。由于酶法应用于β-内酰胺抗生素合成，不仅可减少反应步骤，而且还可减少废弃物的产生，有利于保护环境，降低生产成本，产品质量优异，所含杂质极少。因此，21世纪β-内酰胺抗生素的酶法合成将是发展的必然趋势。 我国酶法合成研究起步并不晚，但至今仍未形成大规模工业化生产，与国外先进厂家差距较大。随着我国经济快速发展，人们对自身居住环境的要求，政府对环保的重视，政府和越来越多的企业加大“绿色化学制药”的研究开发，特别是加快工业化生产的推进进程。现将近年来β-内酰胺抗生素合成研究、产品的分离纯化、酶反应器研究进行概述。 1 现状 青霉素中如氨苄西林、阿莫西林等，头孢菌素中如头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢克洛、头孢丙烯、头孢唑林等，这些产品有化学半合成法（简称化学法）和酶半合成法（简称酶法）。化学法是将母核与侧链以化学法缩合，现在世界上绝大多数生产这些产品的企业使用的是化学法，常用的方法有酰氯法、混合酸酐法、Vilsmeier法及活性醋法。酶法则是将母核与侧链通过酶催化缩合。化学法需要较多的有机化学原料（如溶剂二氯甲烷、吡啶、二甲苯胺），反应条件苛刻，如需无水条件，反应温度低（有的需低至零下90℃），反应步骤多，产生大量的三废需处理。 这些产品酶法合成技术自1969年开始报道，但由于当时酶的性能较差，分离纯化技术也一直未能很好的解决，因此多年来酶法合成技术仍处于研究和试生产阶段。近年来，随着生物工程技术和固定化酶技术的快速发展，酶法制备β-内酰胺抗生素的技术也不断得到提高。 2 酶催化合成研究进展 2.1 酶催化酰胺化缩合反应 酶法制备β-内酰胺抗生素酰胺化缩合反应的研究涉及的品种有氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢丙烯、头孢克洛等。 酶催化缩合反应类型一般有两类，一类为热力学控制的酶催化缩合反应，另一类为动力学控制的酶催化缩合反应。 (1)热力学控制的酶催化缩合反应 其特点是不必活化酰基配体，废物产生少。Schroen等研究了不同pH、溶剂浓度和温度条件下，热力学控制的头孢氨苄酶法合成。pH 5－8，酶的稳定性

现有产品的酶法工艺路线选择汇总620【新版】

现有产品的酶法工艺路线选择 我公司为一个化学制药企业，开发的产品均为有一定合成难度的化学药。现有产品中共有四个产品的部分中间体可利用生物酶法进行合成： 一、瑞舒伐他汀钙的酶法合成： 瑞舒伐他汀钙为一种新型的降血脂药物，也是疗效最好、市场最大的降脂药，2012年全球市场销售规模为89亿美元。我公司目前为国内该品种最大的生产企业，研发了多条工艺路线，其中两条路线的部分反应步骤可以用酶法来替代： 1.中间体J6的酶法合成： 参考文献： Tetrahedron Letters 51 (2010),309-312 2.中间体C3的酶法合成 参考文献： Appl Microbiol Biotechnol(2005)69:9-15、Korean J.Chem.Eng.,30(1),166-171(2013) US6001615 二、依泽替米贝中间体ZT-5的酶法合成： 依泽替米贝为一种胆固醇吸收抑制剂，与他汀药物具有协同作用，增强降血脂的疗效，全球销售49亿美元。我公司为国内第一个在美国注册该产品的企业，生产初具规模。现有工艺中有一步可以使用酶法来替代原有化学法生产工艺： 参考文献： J Ind Microbiol Biotechnol (2009) 36:1369-1374、US5618707、US6133001、US2009047716、US2012028316、WO2008151324

三、普瑞巴林的酶法合成： 普瑞巴林为辉瑞研制的抗癫痫药物，同时具有治疗神经痛的适应症，由于具有适应症广的特点，销售一直呈现上升趋势，2013年全球销售45亿美元。我公司为全球第一批在美国注册该产品的企业，生产工艺成熟可靠，但现有化学法生产成本较高，计划采用酶法工艺替代现有工艺： 参考文献： EP1992609、US2007196905、US2008311635、US2009143615、US2005283023、US2010292506、CN102102114、CN1972904 四、阿利吉仑中间体AL-6的酶法合成： 阿利吉仑是全球首个肾素抑制剂，为最新一代的降压药，该产品结构复杂，有四个手型中心，现有工艺生产成本高，路线长，有可能能够使用酶法来缩短工艺路线，降低成本。但酶法工艺目前未见报道：

糖原合成酶(GCS)活性检测试剂盒说明书 微量法

糖原合成酶（GCS）活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC3335 规格：100T/96S 产品简介： 糖原合成酶（Glycogen synthase,GCS）将UDPG的糖基加到原有糖原或是糖原蛋白的非还原端，以α-1,4糖苷键连接。GCS是动物机体糖原合成过程的限速酶，同时也是胰岛素作用的主要靶酶，在糖代谢及维持血糖相对稳定的过程中有着重要作用。 GCS催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UDP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH生成NAD+，在340nm下测定NADH的下降速率，即可反映GCS活性。 试验中所需的仪器和试剂： 紫外分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 产品内容： 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体18mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体7.5mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体14μL×1支，4℃避光保存。 试剂四：粉剂×1支，-20℃保存。 试剂五：粉剂×1支，-20℃保存。 试剂六：液体48μL×1支，4℃避光保存。 试剂七：粉剂×1支，-20℃保存。 试剂八：粉剂×1瓶，4℃避光保存。 工作液的配制：临用前将试剂三、试剂四和试剂五转移到试剂一中混合溶解后待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。-20℃保存2周。

试剂八的配制：临用前在试剂八中加入5mL试剂二充分溶解，再将试剂六和试剂七转移到试剂八中混合溶解后待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。-20℃保存1周。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后，8000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。 细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细胞数量（104个）:提取液体积（mL）为500~1000:1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率200w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 血清等液体：直接检测。 二、测定步骤： 1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、临用前将工作液与试剂八置于37℃水浴锅中预热5min（工作液用多少预热多少）。 3、操作表：在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂： 试剂名称（μL）空白管测定管 样本10 蒸馏水10 试剂八4040 工作液150150加入样本即开始计时，充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1和1min10s时的吸光值A2，计算ΔA测定管=A1测定-A2测定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。空白管只需做1-2次。 三、GCS酶活计算 1、按微量石英比色皿计算： （1）按蛋白浓度计算 酶活定义：每毫克蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 GCS酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷（V样×Cpr）÷T=3215.4×ΔA÷Cpr

玉米淀粉的生物合成及其关键酶

玉米淀粉的生物合成及其关键酶 摘要：淀粉是许多植物重要的储藏物质。近10年来，淀粉生物合成的研究进展很快，特别是对淀粉合成过程中的关键酶的研究比较深入，已经达到了分子水平。目前，许多研究结果揭示了玉米淀粉的生物合成涉及4类酶——ADPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶和去分支酶，它们在淀粉的生物合成中发挥着不同作用。本文综述了玉米淀粉合成中4类关键酶的生理生化特性、分子生物学特性以及表达调控等方面的研究进展，并讨论了今后的可能发展方向，旨在为相关研究提供参考。 关键词：玉米淀粉；生物合成；关键酶 引言 淀粉是人类的主要食物来源之一，也是化学工业的重要原料。玉米淀粉是最主要的淀粉产品，占据了国际淀粉市场80%以上的市场份额[1]。美国淀粉加工业95％的淀粉是玉米淀粉，我国淀粉的主要生产原料也是玉米。玉米淀粉除了作为食品和饲料外，还被广泛用于制造酒精、纸张、粘合剂、生物降解塑料、建筑和包装材料。玉米淀粉有直链和支链之分，直链淀粉是D-葡萄糖基以α-(1，4)糖苷键连接的多糖链，支链淀粉分子中除有叫α-(1，4)糖苷键的糖链外，还有α-(1，6)糖苷键连接的分支。淀粉在不同领域中的应用取决于其分子结构，淀粉分子结构的重要参数包括: ( 1)直链淀粉和支链淀粉的比例( 直/ 支比) ; (2 )直链淀粉的聚合度; ( 3)支链淀粉分支链长及分布等等，这些参数影响淀粉加工的理化和功能特性。淀粉的理化性质主要包括: ( l)淀粉凝胶化所需温度; (2 )凝胶化淀粉的赫性; ( 3)长期保存或冻融过程稳定性。这些特性决定着其在食品和工业应用中的价值其中, 直/支比是淀粉分子结构最重要的分子结构参数, 例如, 普通玉米淀粉直/ 支比为1 ：3, 但是直/ 支比大于l 的高直链淀粉, 具有更快的凝胶化作用, 凝胶强度高, 作为食品添加剂在改善食品的质地和结构方面有独特效果许多类型的胶卷中用高直链淀粉, 是因其具有独特的透明性, 柔韧性, 拉伸强度及防水性目前人们对环保日益关注, 高直链淀粉生产的可再生可降解膜可以减少工业废气及减弱温室效应气体的释放, 正日益引起人们的兴趣。支链淀粉具有更好的勃性, 可增加膨化食品的体积, 作为食品添加剂具有不同于直链淀粉的效果, 在翻合剂领域具有较多应用此外, 那些介于直链淀粉和支链淀粉之间的中间成分, 其淀粉分支链的长度和分支程度等物理参数有所不同, 可能会有不同的理化性质, 因而有着不同的用途[2]。

生物化学真题之糖代谢与糖原合成

糖代谢 2017 EMP 途径的调控关键酶及2，6-二磷酸果糖对其的调控作用及其生物学意义是什么？ EMP 途径即糖酵解途径，在所涉及的诸多反应以及所催化的酶当中，调控的关键酶分别为己糖激酶、磷酸果糖激酶以及丙酮酸激酶。 果糖－２，６－二磷酸是新发现的酵解过程的调节物，它是磷酸果糖激酶强有力的激动剂。在肝脏中，其提高果糖磷酸激酶与果糖－６－磷酸的亲和力并且降低ATP 的抑制效应。实际上果糖-2，6-二磷酸是一个变构激活剂，它控制着磷酸果糖激酶的构象转换，维持构象之间的平衡关系。 果糖-2，6-二磷酸是由果糖-6-磷酸通过磷酸果糖激酶2催化得来的，果糖-2，6-二磷酸也存在着水解，在果糖二磷酸酶2的催化下水解为果糖-6-磷酸。 高浓度的果糖-6-磷酸加速果糖-2，6-二磷酸的合成，并防止它分解，造成高浓度的果糖-2，6-二磷酸，此即前馈此劫作用。使糖酵解的过程加速。 另外上午的磷酸果糖激酶2以及果糖二磷酸激酶2由酶分子上的一个丝氨酸残基往复磷酸化控制。当葡萄糖缺乏时，则磷酸果糖激酶2抑制，反之果糖二磷酸激酶2受到抑制。 2017 将氧加入正在无氧条件下代谢葡萄糖的细胞中，会引起消耗率的降低、乳酸蓄积终止的现象，该现象称为巴斯德效应，解释为什么会出现该效应 总得来说，巴斯德效应实质上是有氧呼吸压制无氧呼吸的作用。巴斯德效应是生物体自身进行能量节制的一种表现。 由于从呼吸（完全氧化）所得的能量，远大于等量糖发酵所得的能量，因此为了获得对维持生命活动所需的能量，在有氧情况下与无氧下相比，只消耗少量的糖即足。生物体根据氧的有无，来调节糖的分解量，而使能量得到节制。 2017写出葡萄糖彻底降解过程中的底物水平磷酸化反应 葡萄糖彻底降解过程中底物水平磷酸化反应如下 1，3-二磷酸甘油醛在磷酸甘油酸激酶的催化下转移高能磷酸键形成3-磷酸甘油酸和ATP 磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的催化下，将磷酸基团转移到ADP 上形成ATP 琥珀酰－CoA 在琥珀酰—CoA 合酶的催化下，生成琥珀酸和，并将磷酸基团转移到GDP 上形成GMP 。 2017 HPM 途径的灵活性很大，会随着细胞不同的代谢需求采取不同的途径，分别写出细胞主要需要（1）5-磷酸核糖，（2）NADPH 与5-磷酸核糖，（３）NADPH ，（４）NADPH 和ATP 时的代谢途径。 （1）这种情况可见于细胞分裂期，这时需要核糖－５－磷酸合成DNA 的前体核苷酸。为了满足这种需要，大量的葡萄糖-6-磷酸通过糖酵解途径转变为果糖-6-磷酸 和甘油醛-3-磷酸。这时由转酮酶和转醛酶将两分子果糖-6-磷酸和一分子甘油醛-3-磷酸通过反方向戊糖磷酸途径反应转变为3分子核糖-5-磷酸，全部的反应是： +++→+H ADP -5-6ATP -6-5磷酸核酸磷酸葡萄糖 （2）这时戊糖磷酸途径的氧化阶段处于优势。通过这一阶段形成２分子NADPH 和一分子核糖－５－磷酸。反应式为： 22CO 2H 2NADPH -5-O H 2NADP -6-+++→++++磷酸核糖磷酸葡萄糖