部编版2020高中生物 第1章 走近细胞 第2章 组成细胞的分子检测试题 新人教版必修1
第1、2章检测试题
(时间:60分钟满分:100分)
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1.下列有关甲型H1N1病毒和艾滋病病毒的叙述中,错误的是( C )
A.都含有C、H、O、N、P
B.都含有核酸和蛋白质
C.都是最基本的生命系统
D.都必须寄生在细胞中才能繁殖
解析:甲型H1N1病毒和艾滋病病毒均是由RNA和蛋白质组成,RNA含有C、H、O、N、P元素,蛋白质至少含有C、H、O、N元素;病毒没有细胞结构,不属于最基本的生命系统,最基本的生命系统是细胞;病毒必须寄生在寄主细胞中才能繁殖。
2.某同学向牛奶中加入双缩脲试剂后产生紫色反应,由此可推知牛奶中含有( D )
A.淀粉
B.葡萄糖
C.脂肪
D.蛋白质
解析:蛋白质可与双缩脲试剂发生紫色反应。
3.如图为某二肽结构示意图,其中用虚线框出的①、②、③依次表示( C )
A.肽键、氨基、羧基
B.羧基、肽键、氨基
C.氨基、肽键、羧基
D.氨基、羧基、肽键
解析:—NH2表示氨基,表示肽键,表示羧基。
4.硝化细菌、破伤风芽孢杆菌、酵母菌的细胞结构及功能有很大区别,但是它们( C )
A.都是自养型生物
B.都没有核膜和染色体
C.都能合成蛋白质
D.遗传物质都是DNA和RNA
解析:硝化细菌能自己制造有机物,是自养型生物;破伤风芽孢杆菌和酵母菌是异养生物。硝化细菌、破伤风芽孢杆菌是原核生物,没有核膜和染色体,酵母菌是真核生物,有核膜和染色体。三种细胞都有核糖体,都能合成蛋白质。三种细胞都含有DNA和RNA,但遗传物质都是DNA。
5.下列关于水在生物体内作用的叙述,错误的是( D )
A.自由水是细胞内的良好溶剂
B.自由水参与细胞内的一些生化反应
C.水在生物体内的流动可以运输物质
D.自由水是细胞结构的重要组成成分
解析:结合水是细胞结构的重要组成成分。
6.以下是形成蛋白质分子的结构层次,从小到大依次是( D )
①氨基酸②C、H、O、N等元素③氨基酸脱水缩合④一条或几条多肽链盘曲、折叠⑤多肽
⑥蛋白质
A.②—①—③—④—⑥—⑤
B.①—②—③—④—⑥—⑤
C.①—②—⑥—③—④—⑤
D.②—①—③—⑤—④—⑥
解析:蛋白质的基本单位是氨基酸,氨基酸由C、H、O、N等元素组成;氨基酸经过脱水缩合形成多肽;一条或几条多肽链连接在一起,形成一定的空间结构,构成蛋白质。所以蛋白质分子的结构层次从小到大依次是②→①→③→⑤→④→⑥。
7.下列说法正确的是( C )
A.生物体内一切生命活动必须在细胞内才能完成
B.最基本的生命系统是细胞,植物和龟的生命系统结构层次都相同
C.多细胞生物依赖各种分化的细胞密切合作,共同完成复杂的生命活动
D.原核细胞和真核细胞最明显的区别在于有无核物质
解析:各种生物的生命活动都是在细胞内或在细胞参与下完成的,并不一定在细胞内完成;植物没有系统这个层次,龟具有系统层次;原核细胞和真核细胞最明显的区别在于有无由核膜包被的细胞核。
8.
某50肽中有2个丙氨酸(C3H7O2N),现脱掉其中的丙氨酸(相应位置如图)得到几种不同的有机产物,其中脱下的氨基酸均以游离态正常存在。下列有关该过程产生的全部有机物中有关原子、基团或肽键数目的叙述,错误的是( D )
A.肽键数目减少4个
B.氢原子数目增加8个
C.氨基和羧基分别增加4个
D.氧原子数目增加2个
解析:依题意可知,在50肽中,2个丙氨酸均位于肽链中,每去掉1个丙氨酸需水解掉2个肽键,同时要消耗2个水分子,因此将2个丙氨酸去掉后肽键数目减少了4个,同时要消耗4个水分子,水解得到的所有产物比原50肽增加了4个氧原子、8个氢原子;每水解掉1个肽键,就增加1个氨基和1个羧基,所以水解掉4个肽键,氨基和羧基分别增加4个。
9.下列关于原核细胞与真核细胞的叙述,错误的是( C )
A.蓝藻和水绵细胞中都含有核糖体
B.细菌细胞膜与真菌细胞膜相似
C.发菜与草履虫都有染色体
D.原核生物与真核生物细胞结构的主要区别是前者没有成形的细胞核
解析:蓝藻与发菜都属于原核生物,没有成形的细胞核,没有染色体及复杂的细胞器,只有核糖体,但都有细胞膜。故C错误。
10.下列关于细胞中水的叙述,不正确的是( D )
A.一般而言,水是细胞中含量最多的化合物
B.水在细胞中有自由水和结合水两种存在形式
C.自由水是细胞内的良好溶剂
D.代谢旺盛的细胞中结合水含量相对较高
解析:代谢旺盛的细胞中自由水含量相对较高。
11.下列有关细胞中元素和化合物的叙述,正确的是( C )
A.用苏丹Ⅲ染液对脂肪组织进行染色时,可用无水酒精洗去浮色
B.脂肪分子中H的含量比糖类多,是主要的能源物质
C.氨基酸脱水缩合产生水,水中的氧来自氨基酸的羧基
D.DNA和RNA主要组成元素的种类不同,碱基种类不完全相同
解析:用苏丹Ⅲ染液对脂肪组织进行染色时,用体积分数为50%的酒精洗去浮色;脂肪分子中H的含量比糖类多,相同质量的脂肪氧化分解释放出的能量比糖类多,脂肪是主要的储能物质;氨基酸脱水缩合时,产生的H2O中的H来自氨基和羧基,氧来自羧基;DNA、RNA主要组成元素相同,都为C、H、O、N、P,DNA含A、T、C、G四种碱基,RNA含A、U、C、G四种碱基。
12.英国医生塞达尼·任格在对离体蛙心进行的实验中发现,用不含钙的生理盐水灌注蛙心,其收缩不能维持;用含有少量钙和钾的生理盐水灌注时,蛙心可持续跳动数小时。实验说明钙盐和钾盐( D )
A.对维持细胞的形态有着重要作用
B.是细胞中某些复杂化合物的重要组成部分
C.为蛙心的持续跳动提供能量
D.对维持生物体的生命活动有重要作用
解析:用不含钙的生理盐水处理蛙心,不收缩;用含有少量的钙和钾的生理盐水处理蛙心,肌肉收缩,说明无机盐离子对维持生物体的生命活动有着重要作用。
13.图甲是小耳鼩细胞中化合物含量的扇形图(A>B>C),图乙是小耳鼩活细胞中元素含量的柱形图,下列说法不正确的是( C )
A.若图甲表示细胞鲜重,则A、B化合物依次是H2O、蛋白质
B.图乙中a、b、c依次是O、C、H
C.地壳与细胞中含量最多的元素都是a,说明生物界与非生物界的统一性
D.若图甲表示干重状态细胞化合物的含量,则A化合物具有多样性
解析:细胞鲜重含量最多的两种化合物依次是H2O和蛋白质,根据甲图分析A、B化合物依次是H2O、蛋白质。在组成细胞的化学元素中,含量最多的元素是O,然后依次是C、H。地壳与活细胞中含量最多的元素都是O,但从元素的角度看能说明生物界与非生物界具有统一性的是组成生物体的化学元素在非生物界都可以找到,没有一种是生物界所特有的。若图甲表示干重状态细胞化合物的含量,则A化合物为蛋白质,其分子结构具有多样性。
14.下列有关蛋白质结构和功能多样性的说法正确的是( C )
A.蛋白质结构多样性与构成蛋白质的氨基酸的种类、数目和空间结构有关
B.已知某化合物含有C、H、O、N等元素,可以推断此物质是蛋白质
C.有些蛋白质具有防御功能,如抗体;有些蛋白质具有传递信息的功能,如胰岛素
D.蛋白质的功能多样性与结构多样性无关
解析:蛋白质结构多样性与肽链的空间结构有关,而与氨基酸的空间结构无关,A错误;含C、H、O、
N等元素的化合物有蛋白质、核酸等,B错误;蛋白质具有催化、调节、运输、免疫等功能,C正确;蛋白质的结构多样性决定了蛋白质功能的多样性,D错误。
15.下列有关核酸的叙述,错误的是( C )
A.生物体内具有遗传功能的大分子化合物
B.在生物体遗传和变异中起重要作用
C.由含氮碱基、脱氧核糖和磷酸组成
D.由核苷酸聚合而成的大分子化合物
解析:核酸是由核苷酸组成,而核苷酸是由含氮碱基、磷酸、核糖或脱氧核糖组成。
16.糖类和脂质在生物体中含量、功能各不相同,下列说法不正确的是( B )
A.乳糖是人体内重要的二糖
B.相同质量的糖类与脂质比较,糖类分子中氧的含量少于脂质
C.当细胞生命活动需要时,脂肪可以分解利用
D.葡萄糖、核糖、脱氧核糖是动植物细胞共有的糖类
解析:乳糖属于人和动物细胞特有的二糖。与脂质相比,同质量的糖类含有的氧多,氢少。当生命活动需要时,如糖类作为能源物质供能不够时,脂肪可以分解供能。动植物细胞共有的糖有葡萄糖、核糖、脱氧核糖。
17.下列关于细胞内糖类的叙述正确的是( C )
A.蔗糖水解后的产物均不具有还原性
B.麦芽糖是构成纤维素的基本单位
C.脱氧核糖是动植物细胞都有的单糖
D.糖类物质都是细胞内的能源物质
解析:蔗糖水解后的产物为果糖和葡萄糖,二者都是还原糖;构成纤维素的基本单位是葡萄糖;脱氧核糖是构成DNA的成分之一,DNA在动植物细胞中都存在;有些糖不是细胞内的能源物质,如脱氧核糖、核糖等。
18.下图为多肽的结构简图,对该多肽的叙述正确的是( D )
A.由5个氨基酸缩合而成
B.有4种不同的侧链基团
C.有游离的氨基和羧基各1个
D.含有3个肽键
解析:根据题意和图示分析:图中多肽含有三个肽键(—CO—NH—),即该多肽由4个氨基酸脱水缩合而成,氨基酸的侧链基团分别为:—CH2—CH2—COOH、—CH3、—CH2SH、—CH3,说明组成该多肽的氨基酸有三种。图中多肽有两个游离的羧基和一个游离的氨基。
19.下列关于细胞内化合物的叙述,错误的是( C )
A.代谢较旺盛的细胞内线粒体的数量较多
B.叶肉细胞内有些复杂化合物的形成离不开无机盐
C.蔗糖、麦芽糖和乳糖水解的产物完全不同
D.固醇中能激发并维持动物的第二性征的是性激素
解析:一般情况下,代谢越旺盛的细胞耗能越多,与此生命活动相适应的结构基础是线粒体的数量较多。一些无机盐是细胞内复杂化合物的重要组成成分,如Mg2+是构成叶绿素的重要成分,而叶肉细胞内含有叶绿素。蔗糖、麦芽糖和乳糖水解的产物中均有葡萄糖。性激素能激发并维持动物的第二性征,其化学本质为脂质中的固醇。
20.关于生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定实验,下列叙述正确的是( C )
A.还原糖、脂肪的鉴定通常分别使用双缩脲试剂、甲基绿溶液
B.鉴定还原糖、蛋白质都需要进行水浴加热
C.脂肪鉴定可以制备样液进行染色观察
D.脂肪、蛋白质鉴定时分别可见橘黄色颗粒、砖红色沉淀
解析:还原糖鉴定试剂是斐林试剂,需要水浴加热;蛋白质鉴定试剂是双缩脲试剂,不需要水浴加热;脂肪鉴定时可用苏丹Ⅳ或苏丹Ⅲ染液染色并在显微镜下观察到染成红色或橘黄色颗粒,也可以进行样液染色观察;蛋白质鉴定时呈紫色。
21.对于显微镜的使用,下列操作及叙述正确的是( A )
A.换用高倍镜时,从侧面观察,防止物镜与装片碰擦
B.换成高倍镜后,先调节视野的清晰度再调节视野的亮度
C.换成高倍镜后,用粗准焦螺旋调节焦距
D.一个视野中,用10×物镜看到8个细胞,换用40×物镜后则可看到32个细胞
解析:高倍物镜镜头较长,换用时应从侧面观察,防止物镜与装片碰擦;换成高倍镜后,视野变暗,应先调节视野的亮度再调节视野的清晰度; 换成高倍镜后,应用细准焦螺旋调节焦距;放大倍数越大,看到的细胞数目越少。
22.在低温雨雪冰冻天气下,农作物细胞中自由水与结合水比值及农作物抗寒性都发生了相应变化,图中能正确描述这种变化的是( D )
解析:当环境温度下降时,植物细胞中的自由水含量减少,自由水与结合水比值下降;随着自由水与结合水比值的下降,农作物抗寒性增强。
23.下列关于生物大分子的叙述正确的是( D )
A.M个氨基酸构成的蛋白质分子,有N条环状肽链,其完全水解共需M-N个水分子
B.若某氨基酸R基的羧基中的氧用18O标记,则在其参与形成多肽时,脱去的水中一定含有18O
C.糖原、脂肪、蛋白质和葡萄糖都是生物体内大分子化合物
D.细胞中氨基酸种类和数量相同的蛋白质不一定是同一种蛋白质
解析:M个氨基酸形成N条环肽,脱去的水分子是M个,完全水解需要的水分子是M个;由于氨基酸脱水缩合反应产生的水中的氧来自氨基酸中与中心碳原子直接连接的羧基,因此如果某氨基酸R 基的羧基中的氧用18O标记,则在其参与形成多肽时,脱去的水中一般不会含有18O;葡萄糖是单体,不是大分子化合物,脂肪的相对分子质量较小,也不是大分子化合物;氨基酸种类和数量相同的蛋白质,其氨基酸的排列顺序和蛋白质的空间结构可能不同,因此可能不是同一种蛋白质。
24.如图表示SARS病毒中两种重要化合物的化学组成关系,相关叙述正确的是( C )
A.图中大分子B的空间结构由呈双螺旋结构的双链组成
B.a与a之间通过NH—CO相连接,b与b之间通过磷酸二酯键连接
C.b的种类为4种核糖核苷酸,a的种类约有20种
D.大分子B彻底水解为b,一分子b是由一分子核糖、一分子磷酸和一分子碱基构成
解析:SARS病毒是RNA病毒,由蛋白质和RNA组成,分析题图可知,A是蛋白质,a是氨基酸,a与a
之间通过肽键相连接,表示为“—NH—CO—”;B是RNA,为单链结构,b是核糖核苷酸,RNA彻底水解后形成一分子核糖、一分子磷酸和一分子碱基。
25.下列关于细胞中生物大分子的说法,错误的是( C )
A.每一个单体都以若干个相连的碳原子构成的碳链为基本骨架
B.生物大分子都是由单体连接而成的,故又称为单体的多聚体
C.多糖、蛋白质、核酸等生物大分子都是由相同的单体连接而成
D.“碳是生命的核心元素”是因为碳原子对组成生物大分子有重要作用
解析:生物大分子的单体以若干个相连的碳原子构成的碳链为基本骨架。生物大分子都是由单体连接而成的,故又称为单体的多聚体。多糖由单糖分子缩合而成,蛋白质由不同种类、不同数目的氨基酸脱水缩合而成,核酸由4种核苷酸连接而成。“碳是生命的核心元素”是因为碳原子构成的碳链是生物大分子的基本骨架。
二、非选择题(共5小题,共50分)
26.(10分)据图回答下列问题。
(1)判断甲、乙两图中属于真核细胞的是,属于原核细胞的是,判断的主要依据是。
(2)甲、乙两细胞的相似之处为(至少两处),由此看出原核细胞与真核细胞具有性。
(3)细菌和蓝藻都属于生物。蓝藻细胞内含有和,因而可以进行光合作用,属于(填“自养”或“异养”)生物。
(4)原核细胞和真核细胞都有的细胞器是。
解析:分析图解可知,甲细胞中没有以核膜为界限的细胞核,只有拟核;乙细胞中具有以核膜为界限的细胞核。
答案:(每空1分)
(1)乙甲甲无以核膜为界限的细胞核,而乙有
(2)都有细胞膜、细胞质、核糖体和DNA分子统一
(3)原核叶绿素藻蓝素自养(4)核糖体
27.(12分)如图中的①代表磷酸基团,②代表五碳糖,③代表含氮碱基。请据图回答下列问题:
(1)若③是胞嘧啶,当②是时,该图代表核糖核苷酸;若③是尿嘧啶,则②是;若
③是胸腺嘧啶,则②是。
(2)图中③有种,若②是脱氧核糖,则③有种。
(3)若该图所示的物质存在于草履虫中,则由A、T、C三种碱基构成的核苷酸有种;若该图所示的物质存在于SARS病毒中,则②一定是,而③可以是、、、(写碱基名称)。
解析:核酸包括DNA和RNA,DNA基本组成单位是脱氧核苷酸,脱氧核苷酸由一分子磷酸、一分子脱氧核糖、一分子含氮碱基组成,四种碱基分别是A、T、C、G。RNA的基本组成单位是核糖核苷酸,核糖核苷酸由一分子磷酸、一分子核糖、一分子含氮碱基组成,四种碱基分别是A、U、C、G。草履虫中的核酸有DNA和RNA,SARS病毒中的核酸只有RNA。
答案:(除标注外,每空1分)
(1)核糖核糖脱氧核糖(2)5 4
(3)5(2分) 核糖腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶尿嘧啶
28.(8分)下图表示构成细胞的元素、化合物,a、b、c、d代表不同的小分子物质,A、B、C代表不同的大分子物质,请分析回答下列问题:
(1)物质a是,在动物细胞内,与物质A作用最相近的物质是。若物质A在动物、植物细胞中均可含有,并且作为细胞内最理想的储能物质,不仅含能量多而且体积较小,则A 是。
(2)若某种B分子由n个b分子(平均相对分子质量为m)组成的2条链组成,则该B分子的相对分子质量大约为。
(3)物质c在人体细胞中共有种,分子中的不同决定了c的种类不同。
(4)物质d是,d和、维生素D都属于固醇类物质。
解析:由分析可知,A是淀粉,基本组成单位a是葡萄糖,动物细胞中与淀粉相似的物质是糖原。在动物、植物细胞均可含有,并作为细胞内的最理想的储存能量的物质,不仅含能量多而且体积较小的物质是脂肪。b是氨基酸,n个b脱水缩合形成2条肽链,脱去的水分子数是(n-2),某种B分子由n个b分子组成的2条链组成,故该B分子的相对分子质量大约为mn-18(n-2)。染色体由蛋白质和DNA构成,c是脱氧核苷酸,因为碱基有A、T、C、G四种,所以c有4种,分子中碱基的不同决定了c的种类不同。d能促进生殖器官的发育、激发并维持动物的第二性征,所以d是性激素。固醇包括性激素、维生素D、胆固醇。
答案:(每空1分)
(1)葡萄糖糖原脂肪
(2)mn-18(n-2)
(3)4 含氮碱基
(4)雄性激素胆固醇
29.(10分)如图表示某化合物的结构式,据图回答:
(1)该化合物的名称是,由个氨基酸经(填反应名称)形成。
(2)造成氨基酸种类不同的原因是不同。
(3)蛋白质的功能多种多样,是构成细胞和生物体的重要物质,有的蛋白质有免疫功能,如;有的具催化功能,如酶;有的起作用,能调节机体的生命活动,如胰岛素。
(4)科学家发现了一种可以分解鸡毛的角蛋白酶,有可能被用来“消化”导致疯牛病和人类克雅氏症的毒蛋白。实验表明,角蛋白酶确实能够破坏毒蛋白,使其丧失传染能力,由此可知,该角蛋白酶一定破坏毒蛋白的。
A.氨基酸的数量
B.空间结构
C.氨基酸的种类
D.氨基酸的排列顺序
(5)某二十二肽被水解成1个四肽,2个三肽,2个六肽,则这些短肽的氨基总数的最小值及肽键总数依次是。
A.6,18
B.5,18
C.5,17
D.6,17
解析:题图中化合物含有4个肽键(—CO—NH—)、5个R基,是由5个氨基酸经脱水缩合反应形成
的五肽化合物。氨基酸的结构通式是,造成氨基酸种类不同的原因是R基不同。胰岛素的化学本质是蛋白质,可降低血糖浓度,体现了蛋白质能够起信息传递作用,调节机体生命活动。角蛋白酶可以破坏毒蛋白,使其丧失传染能力,由此可知角蛋白酶一定破坏毒蛋白的空间结构(功能改变其空间结构一定改变)。某二十二肽被水解成1个四肽,2个三肽,2个六肽,则这些短肽的氨基总数的最小值=肽链数=1+2+2=5(个),含有的肽键总数=氨基酸数-肽链数=22-(1+2+2)=17(个)。
答案:(除标注外,每空1分)
(1)五肽 5 脱水缩合
(2)R基
(3)抗体信息传递
(4)B(2分)
(5)C(2分)
30.(10分)某校高中生物研究学习小组的同学打算调查市场上的奶粉质量,下面是该学习小组设计的实验,请补充完整。
(1)奶粉中最重要的营养成分的基本单位的结构通式是。在几年前检测技术中,单纯检测奶粉中的含量是无法确定这种营养成分是否达标的。因为在奶粉中添加三聚氰胺后,可以在食品检测时提高这一元素的测定值,达到以次充好的目的,危害消费者。随着奶粉食品安全问题的曝光,现在实验室中可以通过来定性检测待测物中有无蛋白质存在。
(2)奶粉有全脂奶粉和脱脂奶粉之分。假冒的脱脂奶粉通常有两种:一是用全脂奶粉冒充脱脂奶粉,二是用淀粉冒充。若用对样品进行检测呈色,则表明是用淀粉冒充脱脂奶粉;若用对样品进行检测呈色,则表明是用全脂奶粉冒充脱脂奶粉。
(3)据报道,小动物食用了含有被三聚氰胺污染的麦麸的宠物食品后导致肾衰竭死亡。某课题小组为验证含有被三聚氰胺污染的麦麸的宠物食品的危害,做了如下实验:
第一步:选取生长状况相同的小鼠若干只,平均分为两组,分别编号甲、乙。
第二步:甲组每天 ;
乙组每天。
第三步:在相同且适宜的条件下饲喂一段时间。
第四步:每天检测小鼠的健康状况,统计。
实验结果预测:甲组小鼠健康成长,乙组小鼠的死亡率远远高于甲组小鼠。
实验结论:含被三聚氰胺污染的麦麸的宠物食品可导致动物死亡。
解析:(1)奶粉中最重要的成分为蛋白质,其组成单位为氨基酸,其通式见答案。由于不能确定检测样品中的氮元素是否是氨基酸或者肽键中的氮元素,所以单纯检测奶粉中氮元素的含量无法确定营养成分是否达标;实验室中通常用双缩脲试剂和蛋白质的紫色反应来检测待测物中是否含有蛋白质。(2)淀粉与碘液反应呈蓝色,可用来鉴定是否是用淀粉来冒充脱脂奶粉;脂肪可与苏丹Ⅲ染液反应呈橘黄色,与苏丹Ⅳ染液反应呈红色,据此可鉴定脱脂奶粉中是否含有脂肪,若呈现橘黄色或者红色,则说明是用全脂奶粉冒充脱脂奶粉。(3)实验设计要遵循对照原则,实验组通过与对照组进行比较,得出合理的结论。甲组作为对照组,每天饲喂不含被三聚氰胺污染的麦麸的宠物食品,
乙组小鼠每天饲喂等量含被三聚氰胺污染的麦麸的宠物食品;每天检测小鼠的健康状况,统计实验组和对照组死亡的小鼠数量。在此基础上整理数据,得出结论。
答案:(每空1分)
(1)氮元素双缩脲试剂
(2)碘液蓝苏丹Ⅲ(Ⅳ)染液橘黄(红)
(3)饲喂不含被三聚氰胺污染的麦麸的宠物食品饲喂等量含被三聚氰胺污染的麦麸的宠物食品各组小鼠死亡的数目(死亡率不能直接统计,要计算)
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
分子生物学技术信息 关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器 一、上游分子克隆 分子克隆技术是分子生物学的核心技术，这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，从而可以深入分析基因结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线： 1) 分离制备目的基因或DNA片段； 2) 目的DNA与载体在体外进行连接； 3) 重组DNA分子转入宿主细胞； 4) 筛选及鉴定阳性重组体； 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器：
二、核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选，基因组中特定基因序列的定量定性检测，基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。 核酸分子杂交中常用的仪器： 三、下游蛋白的表达及分离纯化 目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达 大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易，产量高和成本低廉等优点，使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是：表达缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养，繁殖快，便于基因操作等优点，渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达
Southern杂交: 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。 RNAi技术: 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。 Southern杂交一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量]。 扫描电镜技术：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 细胞显微分光光度计：用来描述薄膜、涂层厚度超过1微米的物件的光学性能的显微技术。 免疫荧光技术：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。 电镜超薄切片技术：超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。用当代较好的超薄切片机，大多数生物材料，如果固定、包埋处理得合适，可以切成50-100微米的超薄切片。 Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 放射自显影技术：放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。放射自显影技术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。 核磁共振技术：可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小(20，000 道尔顿以下)的蛋白质、核酸以及其它分子的结构，而不损伤细胞。 DNA序列分析：在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
我国大规模细胞培养生物反应器综述 文章比较全面的介绍了我国目前生物反应器的现状,各种品种发酵的特点.提出了反应器的设计要以代 谢流分析为核心,要从系统生物学的角度出发. 1、发展大规模细胞培养及其生物反应器 借助于细胞培养进行各种产品生产已是我国生物技术产业化的重要组成部分，涉及医药、化工、轻工、食品、农业、海洋、环保等行业。培养的细胞不仅只是微生物，用于生物技术产品生产的动物细胞、植物细胞和藻类细胞大规模培养已引起了大家重视，显露出令人鼓舞的前景。而且随着生物技术的发展，在人类今后发现的一切具有生物活性的物质都可以借助于细胞培养方法得到。它们可以是细胞代谢产物、生物转化、酶或某基因表达产物。 此外，随着人类社会经济发展，如果没有基于科技进步的大力开发，能源和资源将难以支撑人类社会进一步发展的目标，人类社会的发展必须将基于碳氢化合物的经济转变为基于碳水化合物的经济。这种能源结构和资源结构的转变将直接关系到我国经济的可持续发展，社会的稳定、和国家安全。解决上述问题的最有效方法就是发展工业微生物，只有工业微生物才能将来源于太阳能的可再生资源碳水化合物转变为现代社会所需要的化工原料和能源。 显而易见，要进行这些产品的生产，无不涉及到细胞代谢与大规模培养研究。为了提高生产水平，除了获得高生产能力的细胞株外，生物反应器是重要的核心技术，必需提供有利于生物过程研究的装置技术和高效节能的生产装置。但是在生物技术产业化平台中，细胞大规模培养技术等中下游技术是我国最薄弱的技术环节之一，以我国生物医药等领域产业化来说，与先进国家的差距是全面的。滞后的一个重要原因之一就是缺乏相配套工艺的工业化放大技术研究和相应的装备技术支撑。例如以哺乳类细胞培养技术来看，西方国家基因工程抗体的开发已经进入大规模细胞反应阶段，细胞工程研究规模已经达到1000L以上，基因工程抗体的生产反应系统最大规模达到20000L以上。相形之下，我国多数药物开发单位的细胞反应规模仍停留在2-30L 规模，100L的培养技术还不稳定，长期以来都是照抄照搬国外的技术和进口国外设备。国内只能生产一些低档装置, 仅靠科研成果模仿和基础科学的跟随。 与其他各行业的装备制造业一样，生物反应器为生物技术产业再生产和扩大再生产提供共性技术和关键技术，它的发展水平也反映了国家在科学技术、工艺设计、材料、加工制造等方面的综合配套能力。装备制造业和商品化的迫切性可以归纳为如下几点： l 每年有大量的从摇瓶到不同大小的实验室生物反应器进行生物技术的实验室研究或中试放大的项目，这些项目有的已购买设备，但需要维修，有的则需新添有关装置。 l 每年有相当数量的生物技术工程项目投入，需要大量的用于生产的生物反应器，传统生物技术的生物反应器一般体积较大（几十M3到上百M3），而现代生物技术所需的反应器装置体积较小，但技术要求高。 l 随着不同产品过程优化与放大技术研究的进展，迫切需要新设计原理的生物反应器发挥作用。由此，必需有不断更新技术的生物反应装置推向市场，或者对现有生物反应器生产装置进行新技术改造，这也是包括制药、食品、轻工在内的传统产业现代生物技术改造的主要内容之一。 l 随着生物技术的发展，需要性能更高的生物反应器，例如哺乳类动物细胞大规模培养是当前高附加值的糖基化活性蛋白医药产品的发展趋势，如何开发适应动物细胞特殊需要的生物反应器并商品化就成为迫切需要
细胞和分子生物学实验重点知识点汇总 Experiment1细胞有丝分裂 间期：有明显的细胞核，染色质分布较均均，由于染色质易与碱性染料结合，故细胞核的染色比细胞质深。核中可见1～3个染色较浅的呈球状的核仁 前期：细胞核膨大，染色质逐渐螺旋化为丝状的染色丝，其后染色丝进一步缩短变粗，形成一定形态和书目的染色体（这时候的每条染色体由两条染色单体组成，但在光镜下一般不易看清），核膜、核仁逐渐消失 中期：每条染色体中的成对染色单体逐渐分开（但着丝粒仍未分离）全部染色体（2n=16）移向细胞中央的赤道面上，形成赤道板。在赤道板到两面有许多纺锤丝连接细胞两极和染色体的着丝点，成为纺锤体，但不易观察到，此时染色体形态最典型 后期：着丝粒纵裂为二。这是，每条染色体的两条染色单体已完全分开，由于纺锤丝的牵引，分别向细胞的两极移动，形成了数目相等的两组染色体（这是所观察到的染色体数目比原来增加1倍，是由于S期内DNA含量倍增的结果） 末期：染色体移到两极并解旋为染色质，细胞中部出现细胞板，并逐渐向边缘发展。当染色质构成核网时，核膜、核仁重新出现。细胞板达到两边，分裂结束，形成两个子细胞，细胞又进入间期状态。 Experiment2动物染色体的制备 原理：染色体只有在分裂期的细胞，特别是中期细胞中表现出典型形态便于观察和计数，所以必须采取特殊的技术方法，从发生有丝分裂的组织和细胞悬液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备。骨髓细胞数量多、分裂旺盛，不需体外培养和无菌操作，便于取材。 秋水仙素的作用：抑制纺锤体的形成，使细胞停留在分裂中期 KCl低渗溶液：使细胞膨胀，促使中期染色体散开 固定液：有固定作用，对染色体还有一定的分散作用 Giemsa染色液：染色 结果：低倍镜下，可见到许多大笑不等被染成紫红色呈圆形的间期细胞核以及分散在它们之间的中期分裂象。小鼠染色体一般呈“U”形，染色体2n=40
分子生物学实验思考题答案 实验一、基因组DNA的提取 1、为什么构建DNA文库时，一定要用大分子DNA 答、的大小(即数目)取决于基因组的大小和片段的大小，片段大则文库数目小一些也可以包含99%甚至以上的基因组。而文库数目小则方便研究人员操作和文库的保存。所以构建文库要用携带能力大的载体尽量大的DNA片段. 2、如何检测和保证DNA的质量？ 答、用看，有没有质白质和RNA等物质的污染，还可以测OD，用OD260/280来判断，当OD260/OD280< ，表示蛋白质含量较高当OD260/OD280> ，表示RNA含量较高当OD260/OD280=～，表示DNA较纯。 实验二、植物总RNA的提取 1、RNA酶的变性和失活剂有哪些？其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种？ 答、有DEPC,Trizol，氧钒核糖核苷复合物，RNA酶的蛋白抑制剂以及SDS，尿素，硅藻土等；在总RNA提取中用PEPC,Trizol 2、怎样从总RNA中进行mRNA的分离和纯化。 答、、利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特点合成一段oligo(dT)的引物，根据碱基互补配对原则，可将mRNA从总RNA中分离出来 实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备 1、感受态细胞制备过程中应该注意什么？ 答、A）细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备的菌液。细胞生长密度以刚进入时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600为时，细胞密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 B）所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。 C）经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；D）化合物及的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； E）所使用的器皿必须干净。少量的或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率； 2、感受态细胞制备可用在哪些研究和应用领域？ 答、在中将导入受体细胞是如果受体细胞是细菌则将它用Ca2+处理变为质粒进入。 实验五、质粒在大肠杆菌中的转化和鉴定 1、在热激以后进行活化培养，这时的培养基中为什么不加入抗生素？ 答、活化培养用的一般是SOC培养基，这种培养基比LB培养基营养，此时进行的活化培养只是为了让迅速复苏，恢复分裂活性，此时的细胞还不具抗性，加入会细胞会死亡。 2、什么是质粒？根据在细菌中的复制，质粒有几种类型？用于基因重组的主要用到哪些质粒？ 答、是细菌体内的环状。
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
第三章 细胞生物学研究方法 第一节细胞形态结构的观察方法 分辨率： 肉眼0.2mm 光镜0.2μm 电镜0.2nm 一、光学显微镜技术 （light microscopy ） （一）普通复式光学显微镜技术 a ． 光学放大系统：目镜和物镜 光镜 照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片 组成 机械和支架系统 b ．分辨率D ：分开两个质点间的最小距离。 0．61 λ 其中： λ为光源波长 D ＝ α为物镜镜口张角 N ·sinα/2 N 为介质折射率 c.普通光镜样品制备： 固定（如甲醛）、包埋（如石蜡）、切片（约5μm）、染色 （二）荧光显微镜技术（fluorescence microscopy 光镜水平对特异蛋白定性定位） 1．FM 包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术 2．不同荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上荧光 素标记。荧光显微镜中只有激发荧光可以成像。 （三）激光共焦点扫描显微镜技术（laser scanning confocal microscopy ） 1．特点：瞬间只用很小一部分光照明，保证只有来自焦平面的光成像，成像清晰 分辨率比普通荧光显微镜提高1.4－1.7倍。 通过改变焦平面位置可以观察较厚样品的内部构造，进行三维重构。 2． 共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。 （四）相差和微分干涉显微镜技术 1．相差显微镜（phase-contrast microscopy ） 光线通过不同密度物质产生相位差，相差显微镜将其变成振幅差。它与普通光镜 的不同是其物镜后有一块“相差板”，夸大了不同密度造成的相位差。 2．微分干涉显微镜（differential －interference microscopy ）——用的是平面偏振光 光经棱镜折射成两束，通过样品相邻部位，再经棱镜汇合，使样品厚度上的微 小 差别转化为明暗区别，使样品产生很强的立体感。 二、电子显微镜技术（electron microscope ） （一）电子显微镜基本知识 1．与光镜的基本区别：电子束作光源、电磁透镜聚焦、镜筒高真空、荧光屏等成像 2．分辨本领与有效放大倍数： 分辨率0.2nm ，比肉眼放大有效放大倍 数 分辨本领指电镜处于最佳状态下的分辨率。 实际情况中，分辨率受样品限制。 3．电子显微镜 电子束照明系统：电子枪、聚光镜 基本构造 成像系统：物镜、中间镜、投影镜等 真空系统：用两级真空泵不断抽气 记录系统：荧光屏或感光胶片成像 （二）主要电镜制样技术介绍
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍 (2011-04-23 11:01:29)转载▼ 标签：分子生物学细胞生物学常用实用技术基本实验室技术生物学实验教育 常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization） Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA 变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显
分子生物学实验技术 目录 实验一细菌的培养 2 实验二质粒DNA的提取 3 实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4 实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5 实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7 实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8 实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9 实验八 RNA提取与纯化 11 实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13 实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15 实验十一感受态细胞的制备及转化 16 实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18 实验十三 DNA分析——Southern杂交 19 一基本操作 实验一、细菌培养 实验二、质粒DNA提取 实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化 二、目的基因获取
实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA 三、目的基因的克隆和表达 实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应 实验十一、感受态细胞的制备及转化 实验十二、克隆的筛选和快速鉴定 实验十三、DNA分析——Southern杂交 实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到 1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养 基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 （一）实验材料 大肠杆菌 （二）试剂 1、胰蛋白胨 2、酵母提取物
分子生物学与细胞生物学实验基本技术 苏州大学医学院 2008-01-21
实验一组织块培养法 一、目的 学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。 二、概述 组织块培养法是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养方法。可以采用剪切法，即将组织块剪切成小块后，接种于培养瓶，组织小块贴壁24h或更长时间后，细胞就从组织四周游出。但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。用于组织块培养的培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理，如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长。（本节以新生牛主动脉平滑肌培养为例） 三、材料 （一）仪器 1.净化工作台 2.恒温水浴箱 3.冰箱（4℃、-20℃） 4.倒置相差显微镜 5.培养箱 （二）玻璃器皿 1.培养皿（Φ100mm） 2.吸管（弯头） 3.烧杯（500ml、200ml、10ml） 4.广口试剂瓶（500ml） 5.玻璃瓶（250ml、100ml） 6.培养瓶 7.废液缸 （三）塑料器皿 1.吸头 2.枪头 3.胶塞 4.EP管 （四）其他物品 1.微量加样枪 2.眼科组织剪（直尖、弯） 3.眼科组织镊（直、弯） 4.12.5cm组织镊（无钩、1×2钩） 5.25cm敷料镊（无钩） 6.止血钳（18cm直纹式、12.5cm直纹式、弯纹式） 7.解剖剪 （五）试剂 1.D-Hanks液 2.小牛血清 3.RPMI1640 4.双抗（青霉素、链霉素） 5.1N HCl
6.7.4%NaHCO 3 四、操作步骤 1.取材：打开胸腔，无菌操作下取出主动脉胸段，浸到预先配制好的含双抗（500u/ml青、 链酶素）的D-Hanks液中漂洗。 2.组织的冲洗、修剪：取出主动脉，用锋利的剪刀修剪除去周围组织，再用D-Hanks冲洗 主动脉3次，除去血块及杂组织等。 3.平滑肌组织分离：纵向剖开主动脉，撕下主动脉内层，取主动脉中层的平滑肌组织，无 血清RPMI1640漂洗3次。 4.剪切：将平滑肌组织用锋利的眼科剪反复剪切至剪成1mm3小块，在剪切过程中，可以适 当向组织中滴加1～2滴培养液，以保持湿润。 5.贴块：将剪切好的组织小块，用眼科镊送入培养瓶内，用弯头吸管将组织块均匀摆置， 每小块间距0.5cm左右，组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注入适量含10%牛血清培养液，盖好瓶盖。 6.培养：将培养瓶瓶底朝上，37℃培养箱放置2～4h，待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢 翻转平放，静置培养。 7.换液：原代培养3～5d，需换液一次，去除漂浮的组织块和残留的血细胞。 组织块培养法也可不用翻转法，即在摆放组织块后，向培养瓶内仅加入少量培养液，以能保持组织块湿润即可，盖好瓶盖，放置37℃培养箱24h再补加培养液。 注意事项 1.取材的组织最好尽快培养。因故不能即时培养，可将组织浸泡于培养液内，放置于冰浴 或4℃冰箱中，如果组织块很大，应切成1cm3以下的小块再低温保存，但时间不能超过24h。 2.从消化道、周围有坏死组织等污染因素存在的区域取材，可用含500～1000u/ml的青、 链霉素BSS液漂洗5～10min，或用10%达克宁注射液冲洗浸泡10min再作培养。 3.组织块不易贴壁，可预先在瓶壁涂薄层血清、胎汁或鼠尾胶等。 4.原代培养的1～2d内要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染，一旦发现，要及时清除。 审 实验二消化培养法 一、目的 学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养 二、概述 此法采用消化分离法（即结合生化和化学手段把已剪切成小体积的组织进一步分散的方法），将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等去除，使细胞分散，形成悬液，可直接进行培养。分散后细胞易于从外界吸收养分和排出代谢产物，容易生长，存活率高，可以很快得到大量活细胞，细胞在短时间内生长成片。由于各种消化试剂的作用机制各不相同，要根据组织类型和培养的具体要求选择消化方法和试剂。本方法适用于培养大量组织，原代细胞产量高，但步骤繁琐，易污染。（本节以乳鼠心肌细胞培养为例） 三、材料： （一）仪器 1.净化工作台 2.离心机 3.恒温水浴箱
分子生物学实验项目三
实验三植物基因组DNA的提取 实验目的 通过本实验学习从植物组织中提取DNA的方法。 实验原理 利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。 仪器、材料与试剂 （一）仪器 1低温离心机 2 恒温水浴锅 3 台式离心机 4 琼脂糖凝胶电泳系统 5 微量加样器 （二）材料与试剂 1 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 2 乙二胺四乙酸（EDTA） 3 氯化钠（Nacl） 4 β-巯基乙醇 5 氯化钾（KCl） 6 异丙醇
7 乙醇 8 琼脂糖 9 十二烷基硫酸钠（SDS） 10 50mL离心管 11陶瓷研钵 12 吸头、小指管 13 细胞提取液 100mmol/L Tris.HCl(PH 8.0) 5 mmol/L EDTA(PH 8.0) 500 mmol/L Nacl 1.25% SDS 1 mmol/L β-巯基乙醇 14 5 mol/L KCl 15 TE缓冲液 10 mmol/L Tris.HCl(PH 8.0) 1 mmol/L EDTA(PH 8.0) 16 哥伦比亚野生型拟南芥（Arabidopsis Columbia）三周幼叶。 17 TIANGEN基因组DNA提取试剂盒（Plant Genomic DNA Kit）（离心柱型）。 实验步骤 一、自配试剂提取步骤
1 取4g新鲜叶片，在液氮中充分研磨成粉末状（越细越好）。 2 将研磨好的粉末转移至50mL的离心管中，加入16mL细胞提取液，充分混匀，65℃水浴保温20min。 3 从水浴中取出离心管，加入5mL5mol/L的KCl溶液，混匀，冰浴20min。 4 4000r/min离心20min。 5 降上清液转移到另一50mL的离心管中。 6 加等体积的酚/氯仿混匀，12000 r/min离心5min，取上清。 7 加等体积氯仿，混匀，12000r/min离心5min，取上清。 8 加入0.6-1倍体积的异丙醇（沉淀DNA），混匀。 9 离心获得沉淀，加70%乙醇洗涤3次，风干沉淀。 10加入500μLTE缓冲液，溶解DNA。 11取3 mL上清液，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量。 二植物基因组DNA提取试剂盒提取步骤 1、拟南芥基因组DNA的提取 以野生型拟南芥(Arabidopsis Columbia)2周幼叶为材料（称取叶片约100毫克），用TIANGEN基因组DNA提取试剂盒（Plant Genomic DNA Kit）（离心柱型）按以下步骤提取基因组DNA： 1) 取干净幼叶100mg，加入液氮充分研磨。 2) 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴中20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数
细胞培养用生物反应器 细胞培养用生物反应器 2010年12月22日 1、发展大规模细胞培养及其生物反应器 借助于细胞培养进行各种产品生产已是我国生物技术产业化的重要组成部分，涉及医药、化工、轻工、食品、农业、海洋、环保等行业。培养的细胞不仅只是微生物，用于生物技术产品生产的动物细胞、植物细胞和藻类细胞大规模培养已引起了大家重视，显露出令人鼓舞的前景。而且随着生物技术的发展，在人类今后发现的一切具有生物活性的物质都可以借助于细胞培养方法得到。它们可以是细胞代谢产物、生物转化、酶或某基因表达产物。 此外，随着人类社会经济发展，如果没有基于科技进步的大力开发，能源和资源将难以支撑人类社会进一步发展的目标，人类社会的发展必须将基于碳氢化合物的经济转变为基于碳水化合物的经济。这种能源结构和资源结构的转变将直接关系到我国经济的可持续发展，社会的稳定、和国家安全。解决上述问题的最有效方法就是发展工业微生物，只有工业微生物才能将来源于太阳能的可再生资源碳水化合物转变为现代社会所需要的化工原料和能源。 显而易见，要进行这些产品的生产，无不涉及到细胞代谢与大规模培养研究。为了提高生产水平，除了获得高生产能力的细胞株外，生物反应器是重要的核心技术，必需提供有利于生物过程研究的装置技术和高效节能的生产装置。但是在生物技术产业化平台中，细胞大规模培养技术等中下游技术是我国最薄弱的技术环节之一，以我国生物医药等领域产业化来说，与先进国家的差距是全面的。滞后的一个重要原因之一就是缺乏相配套工艺的工业化放大技术研究和相应的装备技术支撑。例如以哺乳类细胞培养技术来看，西方国家基因工程抗体的开发已经进入大规模细胞反应阶段，细胞工程研究规模已经达到1000L以上，基因工程抗体的生产反应系统最大规模达到20000L以上。相形之下，我国多数药物开发单位的细胞反应规模仍停留在2-30L规模，100L 的培养技术还不稳定，长期以来都是照抄照搬国外的技术和进口国外设备。国内只能生产一些低档装置, 仅靠科研成果模仿和基础科学的跟随。 与其他各行业的装备制造业一样，生物反应器为生物技术产业再生产和扩大再生产提供共性技术和关键技术，它的发展水平也反映了国家在科学
表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 一、原理 细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。 二、试剂准备 1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。 2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。 3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。 4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。 5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。 6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。 7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。 8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。 9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。 二、操作步骤 采用垂直式电泳槽装置 （一）聚丙烯酰胺凝胶的配制
2006 年《分子生物学实验技术》实验内容 RT-PCR （一）总 RNA的提取 实验安排：每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。 8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- Free Water）将RNA 溶解并于-20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。然后用高压灭 菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水 配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 二）反转录 实验安排： 每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样 μl4 5× Buffer
第三章 细胞生物学研究方法 第一节 细胞形态结构的观察方法 分辨率： 肉眼0.2mm 光镜0.2μm 电镜0.2nm 一、光学显微镜技术 （light microscopy ） （一）普通复式光学显微镜技术 a ． 光学放大系统：目镜和物镜 光镜 照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片 组成 机械和支架系统 b ．分辨率D ：分开两个质点间的最小距离。 0．61 λ 其中： λ为光源波长 D ＝ α为物镜镜口张角 N ·sin α/2 N 为介质折射率 c.普通光镜样品制备： 固定（如甲醛）、包埋（如石蜡）、切片（约5μm ）、染色 （二）荧光显微镜技术（fluorescence microscopy 光镜水平对特异蛋白定性定位） 1． FM 包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术 2． 不同荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上荧光 素标记。荧光显微镜中只有激发荧光可以成像。 （三）激光共焦点扫描显微镜技术（laser scanning confocal microscopy ） 1．特点：瞬间只用很小一部分光照明，保证只有来自焦平面的光成像，成像清晰 分辨率比普通荧光显微镜提高1.4－1.7倍。 通过改变焦平面位置可以观察较厚样品的内部构造，进行三维重构。 2． 共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。 （四）相差和微分干涉显微镜技术 1．相差显微镜（phase-contrast microscopy ） 光线通过不同密度物质产生相位差，相差显微镜将其变成振幅差。它与普通光镜的不同是其物镜后有一块“相差板”，夸大了不同密度造成的相位差。 2．微分干涉显微镜（differential －interference microscopy ）——用的是平面偏振光 光经棱镜折射成两束，通过样品相邻部位，再经棱镜汇合，使样品厚度上的微小 差别转化为明暗区别，使样品产生很强的立体感。 二、电子显微镜技术（electron microscope ） （一） 电子显微镜基本知识 1．与光镜的基本区别：电子束作光源、电磁透镜聚焦、镜筒高真空、荧光屏等成像 2．分辨本领与有效放大倍数： 分辨率0.2nm ，比肉眼放大 分辨本领指电镜处于最佳状态下的分辨率。 实际情况中，分辨率受样品限制。 3．电子显微镜 电子束照明系统：电子枪、聚光镜 基本构造 成像系统：物镜、中间镜、投影镜等 真空系统：用两级真空泵不断抽气 记录系统：荧光屏或感光胶片成像 （二） 主要电镜制样技术介绍 制样要求：①要求样品很薄（数十纳米） ②要求保持精细结构 1．超薄切片技术 ①固定：保持样品形态结构，甚至超微和分子水平上结构。 固定剂：常用饿酸（OsO 4）和戊二醛等，另外有物理方法如高频微波。