NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)试剂盒说明书

货号: QS1003 规格:50管/48样NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)试剂盒说明书

紫外分光光度法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

MDH(EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中MDH是TCA 循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物,连接多条重要的代谢途径。因此,MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH, NADP-MDH主要存在于真核细胞中。

测定原理:

NADP-MDH催化NADPH还原草酰乙酸生成苹果酸,导致340nm处光吸收下降。

自备实验用品及仪器:

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1 mL石英比色皿和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

试剂一: 提取液60 mL×1瓶,在4℃保存;

试剂二: 液体50 mL×1瓶,在4℃保存;

试剂三: 粉剂×2支,-20℃保存;临用前加入300μL蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂四: 粉剂×2支,-20℃保存;临用前加入300μL蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

样本测定的准备:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

1、分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、将试剂二在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min以上。

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