利用蚕豆根尖微核技术检查河流污染情况调查报告毕业论文正文

利用蚕豆根尖微核技术检测成都市区河流水质污染——锦江河林茂大厦至新村桥河段

1. 引言

人们早在很久以前就已知道微核在细胞中存在，早期的血液学文献中，就曾经有过对微核的描述。多年来，染色体异常的结果会产生微核已经成为一种共识。而将微核作为快速监测环境中致突变因子的方法之一，则是近年来的发展。

微核测定是根据在细胞质内产生额外小核的现象来判断理化因素诱导染色体异常作用的一种简便的体内实验方法。微核与染色体畸变有密切联系，可以说它是染色体畸变的另一种表现形式。自上世纪七十年代初，Biiler和Schmid[1,2]建立这一方法以来，经过不断改进和发展，目前已在辐射损伤、药物、工业毒物、农业等独立工作中得到应用，尤其是建立了紫露草花粉母细胞四分体微核检测系统和蚕豆根尖细胞微核监测系统后，细胞微核技术在环境污染监测方面得到广泛的推广和应用。蚕豆根尖细胞微核技术已被我国国家环境保护局审定编入了“生物监测技术规范”在全国推广应用[3]，成为监测淡水污染的报警系统和监测系统。

1.1 蚕豆根尖微核技术简介

1.1.1 蚕豆根尖微核技术的发展

蚕豆是一种很好的细胞遗传学研究材料。它的染色体为六对相当大的染色体，而且根尖含有较多的分裂相细胞，非常适合显微观察。早在1959年，放射生物科学家已经用蚕豆的根尖细胞来进行X射线的遗传损伤研究。到了70年代，蚕豆根尖染色体畸变技术已发展得相当成熟，作为一种监测化学品遗传学毒性的方法为人们所知，并广泛采用。而蚕豆根尖的微核实验是1982年由Degrassi和Rizzoni正式创立的[4]，他们指出微核实验与染色体畸变实验同样具有准确、快速、有明显的剂量——效应关系等特点，操作更简便，也更适于大批量样品的检测，并提出建立检测淡水污染诱变剂的警报系统。陈光荣、金波等[5.6]从1983年开始陆续发表了《利用蚕豆根尖的MNT检测农药和诱变剂损伤》、《蚕豆根尖细胞微核试验敏感品种的筛选》等系列论文，筛选并应用敏感品种—松滋青皮豆，

监测湖泊水质污染，提出了“污染指数法”[7]，首先在国内建立了利用蚕豆初生根尖微核（Micro-nuclear）技术监测淡水污染的报警系统和监测系统。1986年——1988年，陈光荣和金波等人[8]建立了利用蚕豆叶尖细胞的MNT（Micro-nuclear technology）监测大气污染的测试系统。1992年他们又发表了蚕豆细胞微核技术监测农业土壤的研究论文[9]。至此，他们研究建立的蚕豆细胞微核检测/监测系统能全面用于环境水、土、气污染的监测，成为国内较为完善、成熟并被国家有关部门确认的一个遗传毒理学检测/监测系统。此后，这项技术在环境污染监测中得到了积极的推广和应用。

1.1.2 蚕豆根尖微核技术的应用

蚕豆根尖微核试验的一个主要应用领域就是检测水体的致突变性。在自然水体方面,陈光荣等引入污染指数的概念把微核率与污染程度联系起来[7]，根据测试水样微核率与自来水对照的比例,确定污染指数，再根据污染指数的大小进行水体污染分区。孔志明、王永兴等则将此方法用于监测太湖水质,发现在指示水体污染时，蚕豆根尖微核率与一些化学指标如COD、氨氮等呈正相关,而与DO 显著负相关，说明蚕豆根尖微核试验在一定程度上可指示水体的水质优劣[10 ,11]；在污染水体方面，该法可用于排污口废水的致突变性筛选和整个河段污染源的调查；另外，蚕豆根尖微核试验还可用于水源水、饮用水、医院污水、磁处理水等致突变性的检测。值得一提的是,虽然蚕豆根尖微核试验并不是化学品安全测试的标准方法,但仍有不少报道证明蚕豆根尖微核试验对一些具体的化学污染物的致突变性也有敏感的指示作用[12~14]。如果对三类致癌物(确信致癌物、可能致癌物和潜在致癌物)进行系统的测试，可以较科学地评价该试验对于化学品致癌性初筛的可能性。

由于水污染与人群健康紧密相关，尤其是饮用水致突变性与人消化道肿瘤有着密切的联系，越来越多的研究把蚕豆根尖微核试验应用于环境流行病学，特别是肿瘤流行病学当中。在几个著名的高发现场,都有关于蚕豆根尖微核试验监测水体致突变性的研究报道。叶本法等[15]结合化学分析和病例对照，研究了江苏淮安食管癌现场的致病因素。经流行病学Logistic 回归分析和蚕豆根尖微核实验表明:水污染程度与微核出现率有剂效——应关系，污染严重的水域其微核率平均值与自来水对照有极显著的差异，提示水污染是当地食管癌高发的一个重要危

险因素。王旭全等在测定长乐胃癌高发区的塘水、河水、井水致突变性的同时，监测了水中的一些有机污染指标,对水体致突变的来源作了较为系统的分析[16]。水样采自长乐县21 个村，其中塘水6 份，河水7 份，浅井水8 份。结果表明当地 3 种饮用水均能在一定程度上诱发蚕豆根尖微核率升高。诱发微核效应的能力为河水> 塘水> 井水。同时测定的指标还有氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氨及耗氧量等。结果发现微核率的高低与水样的有机污染严重程度趋势一致。在广西抚绥肝癌高发区，也有人做了饮用水诱发蚕豆根尖微核率与肝癌发病率关系的调查[17]。结果表明，25 份饮用水样中有12 份塘水能明显诱导蚕豆根尖微核率的增高，提示饮用塘水中存在致染色体畸变的物质，摄入这类物质可能会增加当地居民患肝癌的潜在危险。另一组试验同时也证明,这类物质与当地居民肝癌的发病率有相关性[18]。这为肝癌的饮用水污染病因理论提供了实验依据。

总之，蚕豆根尖微核技术在环境致突变性检测/监测方面已经形成了一套完整的体系。随着科学的发展，其应用范围还将进一步扩大。

1.1.3 蚕豆根尖技术的优缺点

目前，在水体致突变性检测方面的成熟方法有很多，新方法也层出不穷，但应用于环境污染的大范围、大样本的遗传毒性检测，却仍然是为数不多的几种经典方法，如Ames试验和各种微核试验。蚕豆根尖微核试验作为其中之一，具有许多其它测试手段无法比拟的优点。

首先，它的可靠性和灵敏性较高。其次，蚕豆根尖微核试验的本底较低，这对于一种致突变性检测方法是十分重要的。第三，它的检测物谱较广。第四，在方法学上，它也特别适合环境致突变性监测和肿瘤流行病学调查。与其它动物试验或细胞学试验相比，试验材料容易获得，仪器设备简单，也不损害工作人员的健康；与其它植物测试相比，它还具有个体差异小及不受地理、气候条件限制等优点。这几点保证了它的普及性,特别适合于发展中国家及县、市级以下的监测点。

但是，蚕豆根尖微核试验也存在一些不足之处。首先它毕竟不是动物细胞试验，缺乏一定的代谢活化系统，其次它无法根据结果直接指示受试样品中致突变物的类型和诱变机制，第三，微核的判定、计数容易带有一定的主观性。

尽管蚕豆根尖微核试验与目前一些其它的细胞或分子生物学检测方法相比

有某些方面的不足，但由于该方法的简便、快速及其经济性,在环境监测、污染调查中作为致突变性大范围筛选还是十分有价值的。虽然这是一个已经成熟的方法,但是并没有过时。与其它的化学或生物测试方法联合使用，还将进一步扩大它的应用前景。

1.2 蚕豆根尖微核形成的机制

关于细胞微核的形成有多种假说。Heddle[19]和Shmidt[20]阐述了细胞质中微核的来源有两个方面:一是断裂或无着丝点染色体环在细胞分裂后期不能定向移动,而遗留在细胞质中；二是有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点的染色体断片在细胞分裂后期被留在细胞质中，因而微核试验既能检出断裂剂又能检出有丝分裂毒物。因为只有在第一个细胞分裂周期后才能观察到微核，所以在一个细胞群中所观察到的微核的频数依赖于细胞增殖动力学。

除此之外，微核的形成还有另外几种可能的途径。

<1> Rugh1964[21]曾指出，微核可能是由于细胞核向外突出并延伸而成。陈光荣、金波等（1985）在蚕豆根尖、叶尖细胞微核试验中，也观察到核突出类似核出芽现象。

<2> Maier等（1976）[22]认为大微核可能是由于细胞分裂进入后期，一条或几条染色体落后，末期滞留在细胞质中而形成。陈光荣、金波等（1985）在蚕豆微核试验中，也观察到一条或几条染色体落后及末期桥现象。

<3> Schleich[23]等提出，微核可能来源于间期细胞核的碎片；陈光荣、金波等在蚕豆微核试验中看到一种没有明显主核，只有大小不等的数个小核在一起的现象，他们称之为“粉碎性微核”，认为这可能是核膜破裂，细胞核变成多个核的碎片而形成。

1.3 微核识别的标准

目前多数学者认为，在镜检细胞微核时，应按下列标准计数微核：（1）凡主核大小1/3以下，与主核分离的小核；（2）小核的着色与主核相当或稍浅；（3）小核形态可为圆形，不规则等。

1.4 实验数据的统计处理和污染程度的划分

1.4.1 各测试样品（包括对照组）微核千分率（MCN ‰）的计算

对于蚕豆微核实验中微核千分率的计算可采用以下公式。

MCN ‰=

某测MCN 数某测试样点（或对照组）观察的细胞数 × 1000‰

1.4.2污染指数（PI ）判断

如果采用市售蚕豆种子，按规范操作标准实验条件（其对照本底为10‰以下），其监测样品污染程度的划分可采用“污染指数（PI ）”判断。

MCN ‰=

某测MCN 数某测试样点（或对照组）观察的细胞数 × 1000‰

根据《全国生物技术监测规范—蚕豆根尖微核技术》规定的污染指数划分标准，采用污染指数（PI ）值来划分受污染程度。此方法可避免因实验条件等因素带来的MCN ‰本底的波动，标准见表1

[24] 。凡数值在上、下限时定为上一级污

染。

表1 污染指数PI 值评价水质标准表

Table1 Pollution Index for evaluation of water quality standards value of PI table

1.5 研究目的与意义

随着世界人口经济的增长，城市工业化的发展，工业三废不断排放，城市污污染指数PI 值 水质污染等级 0 ～ 1.5 基本无污染 1.5 ～ 2.0 轻污染 2.0 ～ 3.5 中污染 3.5以上 重污染

水量在逐年增加，污水成分日趋复杂，污水中含有大量的病原体、致敏原、致癌原以及对人有急慢性毒作用的化学物质和放射性物质。本研究中用蚕豆根尖细胞微核技术监测成都市锦江河林茂大厦至新桥村河段的水质污染情况。其目的是利用生物监测对成都市锦江河的水质污染状况给出客观的评价，同时表明蚕豆根尖细胞MCN对生活污水很敏感，蚕豆根尖微核技术可用于生活污水的监测。

2. 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 蚕豆种子

来至于四川师范大学生命科学学院细胞生物学研究室的市售蚕豆种子，在陈光荣，金波等的研究中已证明是微核试验敏感品种。其本底MCN‰一般在10‰以下。

2.1.2水样采集

锦江河是成都市区最重要的河流之一，其居民的生活污水大部分都排放在其中。本次水样采集地点是在成都市锦江河林茂大厦至新桥村河段，并分别在其林茂大厦、九里桥、新村桥三点采集水样，避光保存在4℃的环境中。其具体情况见表2与图1。

表2 采集水样时间与地点表

Table2 The time an location of acquisition water

采样地点采集时间

林茂大厦九里桥新桥村2008年3月27日中午1时 2008年4月8日下午2时 2008年4月8日下午3时

图1 水样采集地点分布图

Fig1 Distribution of sampling section

2.2研究方法

基本按照《生物科技活动和生物使用技术》进行，并做部分改进。

2.2.1蚕豆浸种催芽

用蒸馏水浸种置25℃水浴箱内浸泡24h（其间用25℃蒸馏水换水两次），用培养皿在25℃水浴箱中催芽48h—60h，注意保持湿度。

2.2.2 被检测水样处理根尖

在将三个地方的取水点水样分别用蒸馏水稀释成100、10-1、10-2、10-3、10-4共5个浓度梯度，分别处理蚕豆根尖6h～8h。同时一组用蒸馏水处理6h～8h，以此作为对照。

2.2.3 根尖细胞修复培养

将经各受试水样处理过的根尖用蒸馏水冲洗干净，并用蒸馏水浸洗2次，每

次5～10min。再放回25℃水浴箱中恢复培养24h左右。

2.2.4 固定根尖细胞

取出各培养皿中的材料，用剪刀剪下长约1cm的幼根根尖，立即用卡诺氏固定液固定24h。以便以后的观察（固定好的根尖可在4℃的冰箱中保存一段时间）。

2.2.5 解离

取出固定好的根尖材料，用蒸馏水冲洗数次，在分别用１N HCl 28℃水解15～20min。

2.2.6 席夫试剂染色

终止水解后将根尖置入席夫试剂内避光染色30min左右。取出根尖分别用现配制的SO2漂洗液（漂洗液要现配现用）漂洗2次，每次5～10min，再用蒸馏水浸洗1次。

2.2.7 压片观察。

取出根尖分别置于载玻片上，切除根冠0.5mm后截取1mm左右根尖分生组织。对各种不同处理的根尖分生组织进行常规压片，每个处理各取3个根尖压片。在高倍镜下观察压片根尖分生区细胞分散良好的区域，并统计不少于1000个细胞中的微核数，统计算出每个根尖的MCN‰。

3结果与讨论

在对照组和各种水样处理组中均可见到一定数量的微核（图2 a），也发现少量有丝分裂期微核（图2 b、c），各种染色体畸变等（图2 d、e）。根据镜检统计结果，对3个采样点的5个不同浓度以及对照组（蒸馏水）共计16个样本的MCN‰进行统计（表3）。

表3 成都市锦江河林茂大厦至新桥村河段微核检测结果

Table3 The results of MCN‰ of root tip cells in Vicia faba from Jinjiang River of

Linmao Building to Xinqiao Cun

采样地点浓度MCN‰

对照组100 6.11（3.41，5.72，9.46）

林茂大厦100

10-1

10-2

10-3

10-4

20.76（24.39，18.56，19.34）

17.17（17.11，16.52，17.89）

14.69（15.38，12.91，15.77）

12.43（16.52，11.20，9.85）

9.89（12.54，7.78，9.36）

九里桥100

10-1

10-2

10-3

10-4

29.11（28.61，32.21，26.53）

21.97（17.30，26.86，21.74）

17.01（19.46，15.33，16.23）

13.59（9.58，14.61，16.57）

10.18（11.09，10.69，8.75）

新桥村100

10-1

10-2

10-3

10-4

16.73（16.51，14.99，17.62）

12.76（11.56，14.71，12.01）

9.82（11.09，9.61，8.77）

9.03（12.93，6.88，7.29）

7.29（6.14，7.44，8.29）

a b c

d e

图2 显微镜下观察的微核实物图

Fig2Observed under the microscope of micro-verification plans

从表3中，三个取样点的不同浓度水样所得实验数据上来分析，可以知道，蚕豆根尖微核率和污染物剂量成正相关。而从实际预期来讲，污染物剂量与微核率是呈下抛物线相关。在某一个污染物浓度时，微核率达到最大。当浓度小于它时，随着污染物浓度的不断增大，毒素刺激蚕豆根尖细胞越来越强烈，所以微核率也随着上升。在这个阶段，微核率与污染物剂量成正相关。当浓度大于它时，前面已经提到，微核的形成与细胞的有丝分裂有密切关系，这时污染物随着浓度的增大从而可以不断的抑制细胞的有丝分裂，当然细胞微核率也就慢慢减小了。在本研究中可以明显的看到，虽有严重污染的情况，但其程度还没有达到抑制细胞有丝分裂的状况。所以用原液(100浓度)所得的实验数据是可靠的。可根据1.4.2计算出各个取样点的污染指数（表4）。

表4 成都市锦江河林茂大厦至新桥村河段污染指数

Table4 Jinjiang River Linmao Building to Xinqiao Cun Pollution Index

采样地点MCN‰总数PI 污染指数

对照组 6.11（3.41，5.72，9.46）

林茂大厦20.76（24.39，18.56，19.34） 3.39 中度污染

九里桥29.11（28.61，32.21，26.53） 4.76 重度污染

新桥村16.73（16.51，14.99，17.62） 2.74 中度污染

前面已经提到，微核形成的两条途径：一是诱变剂打断DNA分子形成DNA

断片，该断片因没有纺锤丝相连无法随染色体分离过程被拉向两极，因而随机滞留在某一个子细胞的细胞质中形成独立于细胞核之外的微小的具有核形态的微核；二是由纺锤丝毒剂打断纺锤丝造成整条染色体落后于核分裂周期形成微核。这两条途径发生的概率各为1/2。当外界环境中存在一定浓度的致突变物时，可使细胞发生损伤，从而使具有微核的细胞增多，即细胞微核率上升。另外细胞微核率的上升，提示环境中存在有致突变物，亦即受试水样中含有能打断DNA分子的诱变剂或能打断纺锤丝的纺锤丝毒剂，从而表现出遗传性。

从表4中我们可以得出：在九里桥取样点的污染程度明显高于其他两个地方，而新村桥取样点附近的污染程度弱于其他两个地方。从赵琦等的成都市主要河流污染调查报告[25]中可知锦江河沿岸有许多家饭店、机关、学校、医院等。附近居民密集，生活污水、和含农药、化肥的农业污水等是造成水质污染的主要原因。主要污染是氰化物、苯、酚、汞、氮、磷、铜、硫等。其中苯、酚、汞等是目前公认的致突变物质[26]，对遗传物质的损伤形成微核具有直接的作用，而且这些物质在生物体内还可以不断地积累，随着有毒物质积累的加剧，可引起相关的疾病或出现代谢故障，进而危害人体健康。根据实地考察发现府河中大量的污染物来源主要还是生活污水，河流污染程度与其所处的地理环境河所受到人类活动的影响密切相关。在九里桥取样点，由于是在三环内，与旁边的九里堤公交站比邻，所以平时人流量比较大，附近的居民也比较多，自然生活污水和各种垃圾就直接排放到河流中。污染物主要又是家庭用的洗衣粉、洗涤剂、清洁剂、杀虫剂，另外还有新居家庭在装潢中使用的油漆、二甲苯等有机溶剂的残留物。家用洗衣粉、洗涤剂是目前具有代表性的环境污染物，其主要的成分除具有本身的固有毒性外，还有其降解代谢产物对生物的毒害效应，其潜在的致突变性和致癌作用已引起了人们的普遍关注[26]。由此可见,生活污水是造成水质污染的一个不容忽视的重要原因。同样我们在林茂大厦取样点得到了相同的结果。而在新村桥取样点，靠近三环路口，附近居民明显比前两个地段明显减少，而污染程度仍然属于中度污染，其污染物主要是从城市外来的农药和农业种植残留物，属于有机物污染。另外,大气降水和地表经流对府河下游水质污染也有一定影响。存在于大气中的N、P 等营养物质,均可经降雨的淋洗,直接带入河中。沿岸大量的垃圾废弃物,当雨季或暴雨时,所形成的地表经流富含N、P 等携带大量垃圾杂物进入河中。

在本研究中微核率明显偏高。还有，在个别根尖的监测中微核率有比上一级浓度还高的情况。造成怎样的原因可能与某步或几步的实验操作有关。但是这并没有影响我们对污染程度的划分，从前面的分析中可以看出，如果是用污染指数（PI）来划分污染程度，就可以避免因实验条件或其他因素带来的MCN‰本底的波动，所以本研究所得的结果与实际情况基本是相符合的。

4.展望

微核技术作为一种新兴的生物科学短期测试方法，正在展示着强大的生命力。蚕豆根尖微核技术已被列入国家“生物监测技术规范（水环境部分）”，在其各个方面都得到了充分的发展，比如蚕豆叶尖细胞微核技术进一步扩大了蚕豆这一生物测试材料的监测范围。近几年来，人们对微核技术的研究更趋于精细化，新近研究的一种双激光流式术监测方法，对微核自动检测速度比人工观察提高40倍以上[27]。为了研究微核的需要，制备微核标本技术也应运而生。辛华[28]介绍了一种制备小鼠雄性生殖细胞微核标本的简易方法，这都积极地推动了微核技术的发展。又有资料显示，可以直接利用污染水体中动物的细胞微核指示水体污染状况[29]，其结论与蚕豆根尖微核技术一致。当然，蚕豆微核技术只适于测试潜在的染色体损伤因子，其获得的信息外推致突变物时任有一定的局限性。致突变物对蚕豆作用的机制在分子和超显微结构水平上还缺乏知识，以及在不同条件下出现的差异，材料选择，方法应用方面，都还有待进一步深入研究，统一认识。只有逐步做到规范化、标准化、微量化之后，才能更有效地发挥微核技术的优越性。

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致谢

在本研究进行中，非常感谢王煜老师在实验阶段细心的指导，如深入浅出的讲解了实验原理、实验过程、实验注意事项等，指导实验药品的配制，以及在实验初期进展不顺利时帮助分析实验失败原因以及鼓励自己继续前进。而在论文写作阶段，帮助其几次改稿。可以说没有王煜老师的指导就没有这篇研究。再次感谢。同时也要感谢在一起做实验的同组同学在实验过程中的实际帮助以及四川师范大学生命科学学院细胞实验室为此次研究提供实验场地、实验材料。