共同感染对白色念珠菌感染状态的影响研究解析
?重症感染?共同感染对白色念珠菌感染状态的影响研究
杨卫明 吴春荣 许群欢 唐建国 周艳君
２００２４０ 上海，复旦大学附属上海市第五人民医院创伤急救危重病医学中心（杨卫
明、吴春荣、许群欢、唐建国）；２００２４１ 上海，中国农业科学院上海兽医研究所
（周艳君）
通信作者：唐建国，Ｅｍａｉｌ：ｔａｎｇｊｉａｎｇｕｏ＠５ｔｈｈｏｓｐｉｔａｌ畅ｃｏｍ；周艳君，Ｅｍａｉｌ：ｙｊｚｈｏｕ＠
ｓｈｖｒｉ畅ａｃ畅ｃｎ
ＤＯＩ：１０畅３７６０／ｃｍａ畅ｊ畅ｉｓｓｎ畅１６７１－０２８２畅２０１６畅０４畅００６
【摘要】目的 研究致病大肠杆菌和白色念珠菌共同感染对白色念珠菌侵袭力和破坏性的影
响。方法 通过构建白色念珠菌和致病大肠杆菌共同感染离体肠上皮细胞（Ｃａｃｏ－２）的模型来研究
共同感染对白色念珠菌感染状态的影响。通过倒置显微镜观察感染早期发生侵袭的白色念珠菌特
征；通过测定乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）活性评估上皮细胞被破坏程度；通过实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－
ＰＣＲ）检测感染相关基因（ＡＬＳ３、ＰＬＢ１和ＳＡＰ４）表达调控情况。采用ＳＡＳ软件包进行数据统计
分析。采用方差分析比较进行多组之间的比较，对于组间有差异的数据进一步采用Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法进
行两两比较。以Ｐ＜０畅０５为差异具有统计学意义。结果 显微镜观察发现共同感染组比单纯白色念
珠菌感染组在感染早期更容易发生上皮细胞侵袭，侵袭的白色念珠菌呈簇状分布；ＬＤＨ活性检测
显示同时共同感染组（组３）最高（与组１、组２、组４、组５比较Ｆ值分别为１４畅４８、５畅４８、
１１畅７４、３畅４５，Ｐ＜０畅０５），致病大肠杆菌继发白色念珠菌感染组（组５）和单纯致病大肠杆菌感染
组（组２）之间差异无统计学意义（Ｆ＝２畅０３，Ｐ＝０畅５４），白色念珠菌继发致病大肠杆菌感染组
（组４）和单纯白色念珠菌感染组（组１）之间差异无统计学意义（Ｆ＝２畅７４，Ｐ＝０畅１１），组５、组
２ＬＤＨ活性值大于组１、组４（Ｐ＜０畅０５）；同时伴随白色念珠菌致病相关基因（ＰＬＢ１和ＳＡＰ４）上
调，ＰＬＢ１基因表达组３高于组１（Ｐ＝０畅０１４３），ＳＡＰ４表达组３、组５高于组１（Ｐ值分别为
０畅０２７２、０畅００１８）。结论 致病大肠杆菌和白色念珠菌共同感染增强了白色念珠菌的侵袭力和破坏
性，并且增强的程度与两种菌的发病顺序和共存时间长短有关。
【关键词】致病大肠杆菌；白色念珠菌；共同感染；侵袭力；破坏性；倒置显微镜；乳酸脱氢
酶；实时荧光定量ＰＣＲ
基金项目：上海市卫生和计划生育委员会科研课题面上项目（２０１５４０１３６）；闵行区卫生和计
划生育委员会科研课题（２０１３ＭＷ１２）
Ｃｏ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈＥＨＥＣａｎｄＣ．ａｌｂｉｃａｎｓｉｎｖｉｔｒｏｅｎｈａｎｃｅｓｉｎｖａｓｉｏｎａｎｄｔｉｓｓｕｅｄａｍａｇｅｏｆｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅｓ
ｉｎｄｕｃｅｄｂｙＣ．ａｌｂｉｃａｎｓＹａｎｇＷｅｉｍｉｎｇ，ＷｕＣｈｕｎｒｏｎｇ，ＸｕＱｕｎｈｕａｎ，ＴａｎｇＪｉａｎｇｕｏ，ＺｈｏｕＹａｎｊｕｎ
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＴｒａｕｍａ－Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ＆ＣｒｉｔｉｃａｌＣａｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＳｈａｎｇｈａｉＦｉｆｔｈＰｅｏｐｌｅ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｆｕｄａｎ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，２００２４０，Ｃｈｉｎａ（ＹａｎｇＷＭ，ＷｕＣＲ，ＸｕＱＨ，ＴａｎｇＪＧ）；ＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＳｗｉｎｅ
ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ，ＳｈａｎｇｈａｉＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡＡＳ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，２００２４１，Ｃｈｉｎａ（ＺｈｏｕＹＪ）
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＴａｎｇＪｉａｎｇｕｏ，Ｅｍａｉｌ：ｔａｎｇｊｉａｎｇｕｏ＠５ｔｈｈｏｓｐｉｔａｌ畅ｃｏｍ；ＺｈｏｕＹａｎｊｕｎ，Ｅｍａｉｌ：ｙｊｚｈｏｕ
＠ｓｈｖｒｉ畅ａｃ畅ｃｎ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ，ｉｎｖｉｔｒｏ，ｔｈｅｃｏ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆＣａｃｏ－２ｃｅｌｌｓ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｏｆ
ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａ）ｗｉｔｈＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓａｎｄＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ
ａｂｉｌｉｔｙｏｆｂｏｔｈｓｐｅｃｉｅｓｔｏｉｎｖａｄｅｔｈｅＣａｃｏ－２ｃｅｌｌｓｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｉｎｖｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．ＤａｍａｇｅｔｏＣａｃｏ－２
ｃｅｌｌｓｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｍｅａｓｕｒｉｎｇｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓｖｉｒｕｌｅｎｃｅｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＡＬＳ３，ＰＬＢ１ａｎｄＳＡＰ４）ｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ
（ｑＲＴ－ＰＣＲ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＣｏｍｐａｒｅｄｔｏｓｉｍｐｌｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈＣ．ａｌｂｉｃａｎｓａｌｏｎｅ，ａｃｏ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｖａｄｅｄＣａｃｏ－２ｃｅｌｌｓｍｏｒｅｒａｐｉｄｌｙ，ａｎｄＣ．ａｌｂｉｃａｎｓｔｅｎｄｅｄｔｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｍｏｒｅｅａｓｉｌｙｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｉｎｃｌｕｓｔｅｒｓｈａｐｅｏｆｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅＬＤＨａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｔｈｅｃｏ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐ３）ｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｇｒｏｕｐｓ１，２，４ａｎｄ５，（Ｆｖａｌｕｅｓｏｆ１４畅４８，５畅４８，１１畅７４ａｎｄ３畅４５ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ａｌｌＰ＜０畅０５）；Ｔｈｅｒｅｗａｓ
ｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎＬＤＨａｃｔｉｖｉｔｙｆｏｕｎｄｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄａｒｙｆｕｎｇｏｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐ５）ａｎｄｔｈｅＥＨＥＣｉｎｆｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐ２）（Ｆ＝２畅０３，Ｐ＝０畅５４）ｏｒｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄａｒｙｂａｃｔｅｒｉａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐ４）ａｎｄｔｈｅＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐ１）（Ｆ＝２畅７４，Ｐ＝０畅１１）．ＴｈｅＬＤＨａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎｇｒｏｕｐｓ２ａｎｄ５ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｇｒｏｕｐｓ１ａｎｄ４（ａｌｌＰ＜０畅０５）．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ａｎｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｏｘｉｃｉｔｙ－ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓ（ＰＬＢ１ａｎｄＳＡＰ４）ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＬＢ１ｗａｓｈｉｇｈｅｒｉｎｇｒｏｕｐ３ｔｈａｎｔｈａｔｉｎｇｒｏｕｐ１（Ｐ＝０畅０１４３）ａｎｄＳＡＰ４ｗａｓｈｉｇｈｅｒｉｎｇｒｏｕｐｓ３ａｎｄ５ｔｈａｎｔｈａｔｉｎｇｒｏｕｐ１（Ｐ＝０畅０２７２，Ｐ＝０畅００１８，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＵｓｉｎｇＣａｃｏ－２ｃｅｌｌｓｆｏｒａｎｉｎｆｅｃｔｉｏｎｍｏｄｅｌ，ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｃｏ－ｉｎｆｅｃｔｉｎｇｉｎｖｉｔｒｏｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅｓｗｉｔｈＣ．ａｌｂｉｃａｎｓａｎｄＥＨＥＣｅｎｈａｎｃｅｄｔｈｅｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓａｎｄｔｉｓｓｕｅｄａｍａｇｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｏｆＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ；Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ；Ｃｏ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；Ｉｎｖａｓｉｏｎ；Ｔｉｓｓｕｅｄａｍａｇｅ；Ｉｎｖｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＬＤＨ；ｑＲＴ－ＰＣＲ
Ｆｕｎｄｐｒｏｇｒａｍ：ＳｈａｎｇｈａｉＭｕｎｉｃｉｐａｌＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＦａｍｉｌｙＰｌａｎｎｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｊｅｃｔ（２０１５４０１３６）；ＭｉｎｈａｎｇＭｕｎｉｃｉｐａｌＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＦａｍｉｌｙＰｌａｎｎｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｊｅｃｔ（２０１３ＭＷ１２）
近２０年来，随着广谱抗生素、皮质类固醇激素、免疫抑制剂的广泛使用，艾滋患者的日益增多，器官移植及心导管手术的开展，真菌感染已成为重要的院内感染［１－２］。尽管新的抗真菌药物不断研发，但由于侵袭性念珠菌病发病凶险、确诊困难、病原体耐药、治疗不良反应较多及治疗费用较高，给国民健康和经济带来了沉重负担［３－４］。如何预防和及时有效地控制念珠菌感染已成为刻不容缓的公共卫生问题。
白色念珠菌是侵袭性念珠菌病中最主要的致病菌，可以引起口腔、上呼吸道、肠道和阴道等多处浅表性念珠菌病，也可以通过血液传播形成念珠菌血症［１，５－６］。多数情况下，白色念珠菌以无害的形式（酵母相）共栖于人体黏膜表面，当机体免疫功能下降或菌群失调时，白色念珠菌大量繁殖并侵入宿主细胞引起机体疾病［１，７］。
近年来，已有大量学者在研究白色念珠菌的感染机制，并对其粘附、侵袭和宿主细胞破坏的机制有了一定掌握［７－９］。但目前的研究多数是针对单一白色念珠菌感染［７，１０－１１］，而临床感染往往是伴随着多病原体共存的复杂感染。因此，进一步研究多种病原体复合感染对白色念珠菌感染状态的影响对临床工作具有重大指导意义。
本研究通过构建白色念珠菌和致病大肠杆菌共同感染离体肠上皮细胞的模型来研究共同感染对白色念珠菌感染状态的影响。通过倒置显微镜观察感染早期发生侵袭的白色念珠菌特征；通过测定乳酸脱氢酶（ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＬＤＨ）活性评估上皮细胞被破坏程度；通过实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）检测感染相关基因表达情况。
１ 材料与方法
１畅１ 病原菌培养
本研究所用病原菌为白色念珠菌标准株ＡＴＣＣ１０２３１（便诊生物科技有限公司，南京，中国）和致病大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７（士峰生物科技有限公司，上海，中国）。引物序列ＩＴＳ１（５’－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３’）和ＩＴＳ４（５’－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３’）［１２］用于白色念珠菌菌种确认。
白色念珠菌培养选用ＹＰＤ培养基（１％酵母膏、２％蛋白胨和２％葡萄糖）常规培养４８ｈ。致病大肠杆菌培养选用ＬＢ培养基（０畅５％）酵母提取物、１％胰化蛋白胨和１％氯化钠）常规培养１０ｈ。病原菌在使用前采取平板活菌计数并定量稀释到２×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。
１畅２ 离体肠上皮细胞培养
离体肠上皮细胞选用肠腺癌来源Ｃａｏｃ－２细胞（中国科学院细胞库，上海，中国），该细胞可在体外表现出特征性的肠上皮细胞分化。细胞培养液选用ＤＭＥＭ＋１０％胎牛血清（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｉｂｃｏ，ＵＳＡ），不含双抗，培养在３７℃和５％ＣＯ２浓度的
温箱环境中。上板前进行细胞计数，１２孔板每孔约加入１ｍＬ细胞密度为１×１０５个／ｍＬ，隔天换液。细胞生长至高密度时（约铺满８０％～９０％孔板）再次换液后用于实验。
１畅３ 分组和感染
根据不同的感染条件将实验组分为５组。组１为单纯白色念珠菌感染，即用１ｍＬ浓度为２×１０６
ＣＦＵ／ｍＬ白色念珠菌感染Ｃａｃｏ－２细胞；组２为单纯致病大肠杆菌感染，即用１ｍＬ浓度为２×１０６ＣＦＵ／ｍＬ的致病大肠杆菌感染Ｃａｃｏ－２细胞；组３为同时共同感染组，即用０畅５ｍＬ浓度为２×１０６ＣＦＵ／ｍＬ的白色念珠菌和０畅５ｍＬ浓度为２×１０６ＣＦＵ／ｍＬ的致病大肠杆菌感染Ｃａｃｏ－２细胞；组４为白色念珠菌继发致病大肠杆菌感染组，即用０畅５ｍＬ浓度为２×１０６ＣＦＵ／ｍＬ的白色念珠菌感染Ｃａｃｏ－２细胞６ｈ后接种０畅５ｍＬ浓度为２×１０６ＣＦＵ／ｍＬ的致病大肠杆菌；组５为致病大肠杆菌继发白色念珠菌感染，即用０畅５ｍＬ浓度为２×１０６ＣＦＵ／ｍＬ的致病大肠杆菌感染Ｃａｃｏ－２细胞６ｈ后接种０畅５ｍＬ浓度为２×１０６ＣＦＵ／ｍＬ的白色念珠菌。其中组１、组２为单纯感染组，组３、组４、组５为共同感染组。组６为空白对照组，只含Ｃａｃｏ－２细胞，不加入任何病原菌。
实验组和对照组在实验开始之前都将置换新的细胞培养液，常规培养在３７℃和５％ＣＯ２的温箱环境中。
１畅４ 倒置显微镜观察
实验组在感染后每隔３０ｍｉｎ取样一次，移走待测样本细胞培养液后用ＰＢＳ冲洗３次以充分去除未侵袭的白色念珠菌，最后用８０％酒精固定４０ｍｉｎ后通过倒置显微镜直接观察Ｃａｃｏ－２细胞表面白色念珠菌侵袭情况。
１畅５ ＬＤＨ活性检测
本研究采用ＬＤＨ检测试剂盒（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ），通过分光光度法检测从细胞中释放到培养液中的ＬＤＨ的活性实现对细胞破坏程度的定量分析。实验组和对照组均在感染后第２４小时小心吸取细胞培养液，离心后检测ＬＤＨ活性。每个样本做３次复孔，非同代细胞进行２次重复试验。细胞破坏程度计算公式为：实验组ＬＤＨ活性－对照组ＬＤＨ活性。
１畅６ 致病基因表达分析
１畅６畅１ ＲＮＡ提取 收集感染后２４ｈ样本于１畅５ｍＬ离心管中，并浸泡在液氮中冰冻。在冰冻条件下加入５００μＬＢｕｆｆｅｒＲＢ／β－巯基乙醇。接着按顺序加入水饱和酚、２ｍｏｌ／ＬＮａＡｃ（ｐＨ４畅０）和氯仿裂解细胞。最后按真菌ＲＮＡ提取试剂盒（Ｏｍｅｇａ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＵＳＡ）说明完成ＲＮＡ提取。
１畅６畅２ ｃＤＮＡ合成 使用ｃＤＮＡ合成试剂盒（Ｔａｋａｒａ，ＪＰ）合成ｃＤＮＡ。根据说明书，将８μＬＲＮＡ混合２μＬｃＤＮＡ合成酶，置于３７℃水浴１５ｍｉｎ。然后置于８０℃干浴锅１０ｓ终止酶反应。１畅６畅３ 引物设计 本研究将用到以下引物：ＡＣＴ１［１３］、ＡＬＳ３［１４］、ＰＬＢ１［１５］和ＳＡＰ４［１６］（表１），其中ＡＣＴ１是内参基因［１３］，用于校正并计算目的基因倍数关系。
表１ ｑＲＴ－ＰＣＲ引物（Ｔａｂｌｅ１．ｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｆｏｒｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ）目标基因序列（５’－３’）方位［１３］ＴＴＴＣＡＴＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣＡＧＡＧＧＡＡＣＴＴＡＴＴＴ上游
ＡＴＧＧＧＡＴＧＡＡＴＣＡＴＣＡＡＡＣＡＡＧＡＧ下游ＡＬＳ３［１４］ＣＡＡＣＴＴＧＧＧＴＴＡＴＴＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡ上游ＡＧＡＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＴ下游ＰＬＢ１［１５］ＧＣＴＣＴＴＴＴＣＡＡＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＴ上游ＧＣＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＧＴＣＡＡＣＴ下游ＳＡＰ４［１６］ＣＡＡＴＴＴＡＡＣＴＧＣＡＡＣＡＧＧＴＣＣＴＣＴＴ上游ＡＧＡＴＡＴＴＧＡＧＣＣＣＡＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣ下游
１畅６畅４ 实时荧光定量ＰＣＲ技术（ｑＲＴ－ＰＣＲ） ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ试剂盒（Ｔａｋａｒａ，ＪＰ）用于ｑＲＴ－ＰＣＲ检测。根据说明，取１０μＬＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ、１μＬ上游引物、１μＬ下游引物、１μＬｃＤＮＡ和７μＬ去离子水，混匀。ｑＲＴ－ＰＣＲ反应条件为：９４℃３０ｓ；９５℃５ｓ，６０℃３４ｓ，循环４０次；９５℃１５ｓ，６０℃１ｍｉｎ，９５℃１５ｓ产生溶解曲线。每个样本设置一个对应的空白对照组，每个样本做３次复孔，非同代细胞进行３次重复试验。ｍＲＮＡ相对表达量计算使用２－△△Ｃｔ法。
１畅７ 统计学方法
采用ＳＡＳ９畅４软件包进行数据统计分析。对ＬＤＨ活性值及白色念珠菌致病相关基因表达量采用方差分析比较进行不同感染组之间的比较，对于组间有差异的数据进一步采用Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法进行两两比较。以Ｐ＜０畅０５为差异具有统计学意义。
２ 结果
２畅１ 白色念珠菌侵袭情况
倒置显微镜下直接观察到侵袭的白色念珠菌特征，发现同时共同感染组（组３）在感染后３０ｍｉｎ
即出现白色念珠菌侵袭（图１Ａ），而单纯白色念珠
菌感染组（组１）最早于感染后１ｈ发现白色念珠菌侵袭（图１Ｂ）（该结果相关论文在投）。致病大肠杆菌继发白色念珠菌感染组（组５），同样在感染后３０ｍｉｎ就可以发现侵袭的白色念珠菌，多数成簇状出现在侵袭部位（图１Ｃ）。但是，随着感染时间的延长，各实验组之间显微镜观察结果并未见明显区别，均表现为真菌量随感染时间的延长而增加，并均在感染后２～３ｈ出现伪足相，３～４ｈ出现菌丝相，呈簇状生长（图１
Ｄ）。
Ａ：同时共同感染组在感染后３０ｍｉｎ可见白色念珠菌（红色箭头）侵袭，部分呈簇状分布；Ｂ：单纯白色念珠菌感染组在感染后１ｈ可见白色念珠菌（红色箭头）侵袭；Ｃ：致病大肠杆菌继发白色念珠菌感染组在感染后３０ｍｉｎ可见白色念珠菌侵袭，成簇出现在侵袭部位（红色箭头）；Ｄ：致病大肠杆菌继发白色念珠菌感染组在感染后１２ｈ，局部可见大量菌丝状白色念珠菌成簇聚集生长，周边酵母相白色念珠菌分布（红色箭头）。
图１ 倒置显微镜下观察白色念珠菌感染特征（１０×２０）Ｆｉｇ１ ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＣ．ａｌｂｉｃａｎｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｕｎｄｅｒｉｎｖｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ
（１０×２０）
２畅２ 上皮细胞破坏程度（ＬＤＨ）检测
ＬＤＨ检测结果显示：不同感染组之间ＬＤＨ活性值不同（Ｆ＝７１畅１８，Ｐ＜０畅０１）。进一步进行组间两两比较，结果提示：同时共同感染组（组３）ＬＤＨ活性最高（与组１、组２、组４、组５比较Ｆ值分别为１４畅４８、５畅４８、１１畅７４、３畅４５，Ｐ值分别为Ｐ＜０畅０１、Ｐ＝０畅０１、Ｐ＜０畅０１、Ｐ＝０畅０１９），致病大肠杆菌继发白色念珠菌感染组（组５）和单纯致病大肠杆菌感染组（组２）之间ＬＤＨ活性值差异无统计学意义（Ｆ＝２畅０３，Ｐ＝０畅５４），白色念珠菌继发致病大肠杆菌感染组（组４）和单纯白色念珠菌感染组（组１）之间ＬＤＨ活性值差异无统计学
意义（Ｆ＝２畅７，Ｐ＝０畅１１），组５、组２ＬＤＨ活性
值大于组１、组４（Ｐ＜０畅０５）。（图
２）。
组３＞组５、组２＞组４、组１（ｎ＝６）
图２ 感染后２４ｈＬＤＨ活性值Ｆｉｇ２ ＬＤＨａｃｔｉｖｉｔｙａｔ２４ｈｏｕｒｓａｆｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
２畅３ 白色念珠菌致病相关基因表达检测
ｑＲＴ－ＰＣＲ检测白色念珠菌致病相关基因表达调控情况。结果显示：相对于空白对照组，实验组
ＡＬＳ３、ＰＬＢ１和ＳＡＰ４均上调（所有－
△△Ｃｔ值＞２）。对于ＡＬＳ３基因，组１、组３、组４和组５之间差异无统计学意义（Ｐ＝０畅０６３９）。ＰＬＢ１基因表达组３高于组１（Ｐ＝０畅０１４３），其余各组之间差异无统计学意义（均Ｐ＞０畅０５）。ＳＡＰ４表达组３、组５高于组１（Ｐ值分别为０畅０２７２、０畅００１８），其余各组之间差异无统计学意义（均Ｐ＞０畅０５）。（图
３）。
ＡＬＳ３基因四组之间差异无统计学意义（Ｐ＝０畅０６３９）；ＰＬＢ１基因表达组３高于组１（Ｐ＝０畅０１４３），其余各组之间差异无统计学意义（Ｐ＞０畅０５）；ＳＡＰ４表达组３、组５高于组１（Ｐ值分别为０畅０２７２、０畅００１８），其余各组之间差异无统计学意义（均Ｐ＞０畅０５）
图３ ｍＲＮＡ相对表达量
Ｆｉｇ３ ｍＲＮＡｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｔ２４ｈｏｕｒｓａｆｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
３ 讨论
近年来，白色念珠菌发病率呈逐年上升的趋势，越来越多的学者研究并报道白色念珠菌的致病机制［７，１７－１８］。但多数研究重点关注单纯白色念珠菌感染的情况，本研究根据多致病菌混合感染的临床感染特点，研究致病大肠杆菌和白色念珠菌共同感染对白色念珠菌侵袭和破坏宿主细胞能力的影响。
通过倒置显微镜观察，发现共同感染组在白色念珠菌感染后３０ｍｉｎ出现上皮细胞侵袭，早于单纯白色念珠菌感染组，提示共同感染在感染早期能够加速白色念珠菌对上皮细胞的侵袭。这一结果与
Ａｌｖｅｓ等［１５］和Ｓｉｌｖａ等［１９］的研究类似，他们发现白色念珠菌与光滑念珠菌共同感染的情况下，发生侵袭的白色念珠菌量会增加。本研究进一步改变共同感染顺序，即先用致病大肠杆菌感染６ｈ后接种白色念珠菌，发现最早也是于感染后３０ｍｉｎ发生上皮细胞侵袭。但无论是同时发生共同感染还是继发白色念珠菌感染，白色念珠菌形成伪足相和菌丝相的时间和单纯白色念珠菌感染是一致的，而菌丝相的形成被认为与白色念珠菌侵袭能力直接相关［２０－２１］。因此，笔者推测共同感染并不影响白色念珠菌菌丝相的形成，也就是不改变白色念珠菌本身的侵袭能力。但共同感染能够促使白色念珠菌更早发生侵袭，其可能的机制是致病大肠杆菌对上皮细胞的破坏使得白色念珠菌容易在破坏处发生侵袭。
在感染后２４ｈ，上皮细胞破坏检测结果为同时共同感染组高于单纯致病大肠杆菌感染和单纯白色念珠菌感染，提示共同感染增强了白色念珠菌对上皮细胞的破坏。而３组共同感染组之间进行比较，发现同时共同感染组的ＬＤＨ活性＞致病大肠杆菌继发白色念珠菌感染组＞白色念珠菌继发致病大肠杆菌感染组。因此，笔者认为致病大肠杆菌和白色念珠菌之间存在潜在的协同关系，能够增强致病菌对上皮细胞的破坏，并且增强的程度是受致病菌发病顺序和共存时间长短的影响。
本研究进一步从基因角度评估共同感染对白色念珠菌致病性的影响。所采用的ＡＬＳ３基因与白色念珠菌菌丝形成和侵袭相关［２２－２３］，水解酶编码基因ＰＬＢ１和ＳＡＰ４也是已知的与白色念珠菌破坏细胞的功能直接相关的基因［２４－２６］。结果显示所有参与检测的实验组相对于空白对照组，ＡＬＳ３、ＰＬＢ１和ＳＡＰ４均上调，证明了这３个基因参与了白色念珠菌的致病过程，与之前的研究结果一致［２２－２７］。笔者在此基础上进行实验组之间的对比，ＰＬＢ１和
ＳＡＰ４基因表达情况验证了ＬＤＨ活性检测结果，即共同感染增强了白色念珠菌的致病性，并且增强的程度是受参与共同感染的致病菌发病顺序和共存时间长短影响。Ａｌｖｅｓ等［１５］曾报道白色念珠菌与光滑念珠菌共同感染时ＡＬＳ３基因显著上调，但在本研究中ＡＬＳ３基因表达情况则为四组之间差异无统计学意义，其可能的原因是本研究所选择的基因检测时间点为感染后２４ｈ，在该时间点大量白色念珠菌已转变为菌丝相，而ＡＬＳ３基因被认为与白色念珠菌菌丝形成和侵袭相关［２２－２３］，所以四组之间差异无统计学意义。
综上所述，本研究结果提示致病大肠杆菌和白色念珠菌共同感染增强了白色念珠菌的侵袭力和破坏性，并且增强的程度与两种菌的发病顺序和共存时间长短有关。
参考文献
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（收稿日期：２０１５－１０－１４）
（本文编辑：何小军）