细胞

类：植物学|生物科学

文献类型：pdf 和txt 出版时间：1992

作者：莫永胜李仕琼关键词：植物性细胞工程花粉原生质体

期刊名称：大自然探索.1992,11(2).-29-34 全文长度：9156个字

文献来源：https://www.wendangku.net/doc/f55574560.html, 第六图书馆机构：不详

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全文：我国植物性细胞工程研究进展第六图书馆植物性细胞工程花粉原生质体大自然探索莫永胜李仕琼不详1992第六图书馆７第１卷１１９９２年第｛Ｏ期第２期大自然探索Ｖｏ．．ｕｎＮｏ４１ＩＳ／＂．０ＩＮｏ．２．９１９２ＥＸＰＬＯＲＡＴＩＯＮＯＦＮＡＴＵＲＥ一我国植物性细胞工程研究进展莫永胜李仕琼夕争２［内容提要］奉文阐述了植轴性细胞工程的基末思想，ｉ并Ｊ重托１来馥铺碱国内的研宅进０丰展作了综述，目前存在的洱逛和夸后的研党进行了讨论和羞望。对关调苎兰堕型，塑苎，殖胞精，一卵胞操键，竺鲤垄曼亟堡生细，子胚，细，作细胞工程是当今生物技术的基础从植物科学领域来看，往人们将发展细胞工程的着眼以点放在体细胞工程上，方面的研究主流是体细胞原生质体的分离、养、合及其相关的遗这培融传操作，已取得了令人惊叹的进展。最近几年，物生殖系统中的细胞和原生质体的开发和并植利用受到了普遍的关注和重视ｒ一个新的、动人心的高技术领域——植物性细胞工程，激（ｌｎ∞ｘａｃｌｅｇｅｒｇ正在迅速形成。ｐａｔｕｌｅｎｉｅｎ）ｌｎｉ植物性细胞工程植物性细胞工程是指在细胞水平上综合应用已有的现代生物科学的理论和方法来认识、控制并利用植物有性生殖过程从而改良植物的高技术领域。它不仅包括精细胞工程、细胞工卵程和受精工程，包括生殖细胞操作、还花粉原生质体操作、单花粉操作和旺囊操作等相关领域的探索研究。每一具体领域有其各自的研究体系，如精细胞工程，其研究体系有精细胞的分离、纯化、力保存技术，细胞和体细胞原生质体杂交、细胞培养、生植株以及相应的各种遗括精精再传转化，物受精工程则指分离的雌、配子的体外融合（如动物方面的“管受精”不过，植雄犹试，植物胚胎学中常用的“管受精”语，试术则指的是离体授粉）并进一步在离体条件下培养以期，得到工程檀株。“植物性细胞工程”术语中的“细胞”性泛指植物生殖系统中单倍性的细胞及其原生质体。文献中有含义同“物性细胞工程”。物生殖细胞工程”语】考虑到后者中植的植术，“殖细胞（ｅｒｄｃｉｅｃｌ＇同花粉粒或花粉管中和营养细胞相对应的“殖细胞（ｅｅａ生ｒｐｏｕｔｅ）易ｖ１生８ｎｒ－ｔｅｃＩ”混淆，ｉ￣ｉ相ｒ）故权以“植物性细胞工程”之。名植物性细胞工程的提出基于以下几方面的背景；一，殖系统有其重要的固有特点。植第生物有性生殖过程跨越植物个体发育的三个世代，是植物一生中发育最复杂、曲折的阶段，最也是最重要的环节，、雌雄配子的融合是自然的生殖过程，是一种天然的细胞融合模式Ｉ生殖系统·２·９

https://www.wendangku.net/doc/f55574560.html,第六图书馆我国植物性细胞工程研究进展中有着丰富的、倍性的细胞和原生质体，遗传育种的好材料。二，单是第植物生殖系统单倍性的细胞和原生质体的分离和培养工作近年来有了迅猛发展，为对它们的进一步开发和利用奠定了基础。第三，物体细胞工程实验系统的创建和完善为建立植物性细胞工程新体系提供了较植好的借鉴。第四，横向角度来看，已跨入实用阶段的动物性细胞工程为发展植物性细胞工从

现程树立了榜样。回顾一下近代植物胚胎学的发展简史（１可以发现，物胚胎学的性质已超越了传统图）植形态学的格局，已成为一门综合性的新学科——植物生殖生物学．主要研究工作已朝有性生其殖的实验操作倾斜和深化，而导致了植物性细胞工程的诞生。·从植物胚胎学／檀物实验胚胎学＼＼植物生殖生物学／我国植物性细胞工程研究进展我国科学工作者在这一靳的高技术领域中有许多工作取得了阶段性的重要成果．分工部作居国际领先地位。现拟就我国植物性细胞工程近１来的研究进展予综述。０年一植物实验生殖生物学＋植物性细胞工程＋、雄性生殖系统细咆和原生质体的离体植物体细胞工程撮作田ｌ植物性细胞工程形成矗要植物雄性生殖系统细胞和原生质体的离体操作指从花粉粒精细胞各阶段相应的离体操作（括分离、养、合及进一步的遗传操作）包培融。各环节的离体操作存在密切的内在联系（图２。从单花粉培养到精细胞离体操作逐渐深入的趋势反映了当今植物生殖细胞工程实验手段）的越来越精密化和高层次化。?田２植物雄性生殖系统细胞和席生质体的］蕾体操作ｔ花粉到精细胞从近１来，国植物性细胞工程的研究工作主要集中在该领域。下面按工作开展的时间０年我先后进行介绍。１单花粉培养．单花粉培养是指将花粉粒从花药中分离出来成为分散的状态，后通过培养使花粉粒脱然分化启动发育再生植株的一种技术。国际上单花粉培养首次成功获到植株是在１７年。９３国内·３０…https://www.wendangku.net/doc/f55574560.html,第六图书馆大自然探索１９第２（９２年期总第４期）０较早期的工作有陆文梁（９８在烟草Ⅲ、１７）顾淑荣（９９在茄子：和陈英等（９１在水稻嘲中１７）１８）开展的离体花粉诱导再生植株。目前已在多种植物中获得成功。于这方面的理论和研究，关陆文粱已有较多的论述：。花粉培养兼有单倍体、”］单单细胞和天然分散性三大特点，这是任何体细胞培养所没有的，因此，它将在高等植物的微生物化育种及遗传工程等研究中有着广阔的前景。２花粉管亚原生质体的分离和培养．近年来，质体、细胞和液泡体等亚原生质体作为新型的基因转移实验系统已引起了极胞微大的关注，而花粉管亚原生质体也许为植物性细胞工程的研究提供一个较理想的实验系统。花粉管亚原生质俸指的是花粉粒离体萌发长成花粉管后，再在酶解作用下使花粉管原生质体发生质壁分离、胞内舍物断裂、被消化而形成的一些较小的舍核或不台核的原生质细壁体。国际上分离花粉管亚原生质体的工作始于１７９３年。】８年以来，激领导的课题组从金９，１朱鱼草和烟草等植物中先后分离出大量花粉管亚原生质体·对它们进行了培养试验，现花粉并发管亚原生质体能进一步生长，生壁和长出类似花粉管的结构。这是我国在植物雄性生殖再系统中最早开展的原生质体离体操作工作。花粉管亚原生质俸大量分离的成功在细胞工程上的应用意义是，核亚原生质体可作为类似棱质体、棱的亚原生质体可作为胞质体加以利有无用［］。８Ｏ－］３花粉生殖细胞的分离和培养．花粉生殖细胞是雄配子（即精细胞）的前身。占被子植物大多数的二细胞型花粉植物的成熟花粉粒中只含生殖细胞和营养棱。过去对生殖细胞的研宠局限在花粉粒或花粉管中。如果能将生殖细胞从花粉粒中分离出来，现游离生殖细胞的离体培养，有可能将它们建成一种实便对细胞工程具潜在价值的实验体系。周嫦及其课题组从１８年开始在国际上率先研究和建９６立了若干种有救的分离技术，从多神植物中成功地分离出大量生活的生殖细胞Ⅲ。从花并粉粒中人工分离出来的生殖细胞，否在体外培养条件下进一步发育．该领域具挑战性的新能是课题。１９９０年，吴新莉和周嫦在黄花菜中尝试离体培养分离的花粉生殖细胞取得阶段性重大突破，动了细胞核分裂［ｊ一工作表明分离的生殖细胞是有发育潜能的，启ｉ这ｒ）为进一步的培养工作展示了前景，有重要意义。具４花粉原生质体的分离和培养．花粉原生质体是花粉被去除了花粉壁、由质膜包裹的裸露细胞。它具有单倍性、仅结构简单、发育同步和群体数量大等优点，些优点使它可和体细胞原生质体相

媲美，这甚至更具优越性，认为是。传操作和突变研究的卓越体系”被遗。然而，熟花粉的壁由内、两层构成，中成外其外壁的主要成分是孢粉索．迄今尚缺乏相应的酶能使孢粉素降解。因此，具孢粉素的外壁是开展花粉原生质体离体研究的一大障碍，这也是国际上有关花粉原生质体研究工作一度进展缓慢的主要原因。１８年，９８周嫦设计了避开花粉外壁障碍的巧妙方法，即利用花粉的水合作用，在适宜的渗透压条件下，使外壁破裂、内壁暴露，经酶解作用分离出大量花粉原生质体。再应用这一方法，周嫦成功地分离出茑尾、风雨花和董草等三种单子叶植物的花粉原生质体并进行了初步的培养，中萱草花粉原生质体的培养实现了细胞壁再生、其管状及其他多种结构的形成以及生殖核的一、次分裂一ｏ。二］——花粉原生质体大量分离成功后，着的工作自然是在离体培养下研究其两条发育途径接配予体途径和孢子体途径。花粉原生质体在离体培养条件下往往会继续体内预定的配予．３１．https://www.wendangku.net/doc/f55574560.html,第六图书馆我国植物性细瞻工程研究进屉体发育程序。昊燕和周嫦（９０在唐菖蒲成熟花粉原生质体离体培养中成功地诱导了细胞壁】９）再生和花粉管萌发：。诱导胚胎发生走孢子体途径的关键在于迫使花粉原生质体脱分化。周踹（９９将董草含单核后期花粉的花蕾经低温预处理后再分离出花粉原生质体，１８）在改进的培养条件下使培养的花粉原生质体启动了细胞分裂，形成了多细胞团及类似原胚的结构“。这一工作突破了花粉原生质体胚胎发生（孢子体发育途径）的第一关，明花粉原生质体离体表培养工作将有新的进展，其再生植株可望成功。即５生活精细胞的分离和保存．植物的精细胞就是雄配子（称精子）是由生殖细胞在花粉粒（胞型花粉）花粉管（简，三或－胞型花糨）中分裂成的一对细胞。以往对被子植物精细胞的研究都局限在原位进行的。国际上最早尝试被子植物精细胞的分离工作始于１７９３年，后这方面的研究停顿了相当长时间。最蚪近几年，国际上掀起了一股分离精细胞的太热潮，并于１８年分离到生活精细胞，今已从十９７至多种被子植物中分离出生活精细胞０２。１８年在荷兰召开了讨论植物精细胞作为生物工程?］９７５工具为中心的国际性专题会议，于ｌ８并９８年出版了会议论文集《物工程工具——植物精细生胞，。植物精细胞之所能作为生物工程的新工具，因为具有以下若干特征１来源车富ｌ是（）（）倍性Ｉ３天然的原生质体Ｉ类似棱质体；５一对姊妹精细胞可能存在二型性｝６自２单（）（）（）（）然的精卵融合特性。杨弘远和周嫦于１８年在国内首次报道了从油菜、９９玉米和黑麦三种植物中分离出生活精细胞，中，其分离的油菜精细胞在低温下可存活３０］天Ｉ。莫永胜（９０从茶树１９）花粉离体萌发的花粉管中也分离出有限的精细胞口。分离的精细胞若以遗传操作为目标，”要具有足够的生活力，此，因改进精细胞的分离和保存技术已显得非常重要。最近的研究已对前人的方法进行了改进和完善，中，离的紫菜苔和油菜精细胞已能在低温条件下存活近一其分周ｒ。生活精细胞的成功分离和保存是鼓舞人心的。因为，它为对精细胞的全面的生化和分子生物学研究、性单倍体植株再生、雄雌雄配子的离体受精以及其它各种实验操作开辟了一条新的探索逾径ｒ｝且，一步研究分离的精细胞的保存技术，望建立高等植物的“子２而Ｂ］进有精库。ｒ一。＝雌性生殖系统细胞和原生质体的离体鼻作植物雌性生殖系统细胞和原生质体主要指胚囊及其组成细胞和原生质体。由于本身结构复杂等原因，和雄性生殖系统方面的工作相比，植物雌性生殖系统方面的离体操作研究相对地显得较薄弱。胚囊是被子植物的雌配子体，具有重要的研究价值，而且，胚囊具有作为基因工程受体的潜在可能性］。然而，在体内它为珠被和珠心组织层层包围，使得胚囊分离尤其是生活旺囊的分离显得困难重重，胚囊组成细胞原生质体的分离则更加麻烦。而国际上用压片法分离旺囊的工作始于１４９８年，而应用酶解法分离生活胚囊的工作则始于１７９５年。从１８年开

２９始，嫦与杨弘远、适宜主持的课题组在国内先后开展了这方面的研究。应用酶解作用

结合周胡液体振动的力法，从近十种植物中分离出旺囊，并对部分植物分离的完整胚囊进行了活力鉴定ｒ］胡适宜主持的课题组还在烟草和颠茄中尝试分离旺囊组成细胞原生质体的探索，国。在际上首次获得成功，证明分离出来的卵细胞等旺囊组成细胞原生质体是具生活力的ｒｍ。并３］ｓ在此基础上，适宜提出了开展雌雄性细胞体外融合的“物受精工程想·］胡植设。这一设想随即为同行学者所关注，为最近的玉米精卵细胞体外人工模拟受精成功的试验所实现。并·３·２https://www.wendangku.net/doc/f55574560.html,第六图书馆大自然探索１９第２期（第４）９２年总０期问题和展望（）将植物有性生殖系统细胞和原生质体真正建成细胞工程理想的实验系统，先要－要首建立它们的人工大量分离、化、养和融合乃至转化的整个实验体系。然而，宏观上来看，纯培从植物有性生殖系统细胞和原生质体的开发和利用至今在国际上尚处于探索阶段，实际操作

在技术上很多方面仍来过关，些操作技术仅处于尝试抑或设想阶段。倒如，雄性生殖系统细有就胞原生质体的离体操作而言，分离方面已有了大量的工作，其培养工作则进展甚缓，在但今后似应更充分地借鉴体细胞工程和花药培养方面的成功经验。前述周嫦进行花粉原生质体培养启动了胚胎发生便是这方面借鉴成功的一个倒证。分离技术亦有待完善化。比如，现今花粉原生质体分离成功的物种，花粉外壁一般较薄，其是其萌发沟较宽大。于具萌发孔的花粉，其尤对迄今尚无有效的分离技术。者，离的成熟花粉原生质体培养后往往按体内预定途径长花粉再分管，离的幼嫩花粉（核期）生质体培养才能走孢子体途径启动胚胎发生，目前在绝大多分单原而数植物中尚未建立幼嫩花粉的原生质体分离技术。已开展的工作来分析，量的研究工作倾就大斜在雄性生殖系统方面．雌性生殖系统方面的离体操作相对地较单薄，后者今后应予于重视。（）该领域国内外研究水平的横向比较来分析，管国内起步不晚，干方面的工作还二就尽若居国际领先地位，就总体水平而言，内的工作和国际上的发展水平尚有明显的差距。近，但国最国际上该领域的研究又有了重大突破，主要进展在于：１其（）自１８９６年以来，国Ｐｗｒ印英ｏｅ和度Ｐｎａ两家实验室分别尝试了“子一体细胞杂交（ａｔ－ｏｔｙｒｉｔｎ”探索，ｅｔｌ配ｇｍｅｏｓｍａｉｈｂｉｚｉ）的ｃｄａｏ成功地在烟草属的种间和矮牵牛属的种问和种内利用四分体原生质体和体细胞原生质体的融合，养出三倍体的可育杂种植株。这一工作开辟了植物细胞杂交研究的又一个新天地。（）培２１８９９年美国俄克拉荷马大学Ｒｕｌ等在白花丹中用酶解法戒功地分离出大量生活的卵细胞￣ｌ和中央

细胞。（）１９３在９０年荷兰召开的“际植物组织和细胞培养”术会议上，德学者国学西Ｋａｚ等人报道了玉米精卵细胞离体电融合，将融合体进一步培养诱导产生了小愈伤组织ｒｎ并的试验结果。这一工作实现了胡适宜于１８９５年明确提出的“物受精工程”设想，人工控植的使制植物受精过程成为可能。（）１９ｄ在９０年召开美国生物科学年会上，拿大亚伯达大学的加ｃｓａｓ报道了建立玉米和冬小麦精细胞部分ｃＡ文库的结果和构建卵器及中央细胞ｅＮ文ＤＮＤＡ库的设想。这一工作开创了在植物性细胞工程领域中引进基因工程先进技术的先河。国际上这些突破性进展对国内下一步拟开展的工作不无启迪。（）目前的研究现状来分析，现植物性细胞工程的道路已基本探明，种生活单倍体三就实各原生质体的大量分离成功可说是实现点火的关键。因此，正处于取得更大突破进展的前夜。现在我国，关植物性细胞工程的研究于１８有９５年被列入国家自然科学基垒资助项目，９８年被１８列入“６”构思、设想研究项目，９９年被正式列入“６”技术攻关项目，９２年被列入８３新新１８８３高１９国家自然科学基金重大课题，志着迎接这一新的高技术挑战的日子已经到来。于该领域今标关后进一步研究的课题，已有较多设想］。可以预测，今后几年可望在如下若干方面取得突菠，（）粉原生质体培养再生植株－２生殖细胞培养启动细胞分裂；３精子库的建立；４卵细１花（）（）（）胞和中央细胞等胚囊组成细胞原生质体大量分离技术的完善化－５花粉原

生质体、（）生殖细胞、精子乃至卵细胞或中央细胞同体细胞原生质体之间广泛的。子一体细胞杂交”（）卵细胞配；６精“子一配子杂交”植物受精工程－７上述众多“子原生质体”吸收外源Ｄ配的（）配在ＮＡ、传转化遗等方面的应用。容置疑，毋植物性细胞工程的发展将为改良和培育农作物新品种开辟一条新的尝试途径，生产实践上具有广阔的潜在应用前景。在．·３·３https://www.wendangku.net/doc/f55574560.html,第六图书馆我国植物性细胞工程研究进展承导师杨弘远教授和周嫦教授蛤予热情鼓励和关心．谨盈谢忱。参考文献．蜘，ｎ删…～［］１周姑、杨弘远，物学报，９９３：２。植１８ｔ１７６［］２杨弘远周嫦，物学通报，９９（）１３植１９，６；９。［］３陆文粱，中国科学，９８（）３Ｉ１７．３：５。［］４顾淑荣，植物学报，９９２：０１７，１３［］５铱荚等．传学报．９１８１８蔗１８，：８。Ｉ］ｓ陆文粱，植物生物技术，科学出版社．９７Ｉ０１８，。Ｏ［］７陆文粱，植物细胞学研究方法，学出版社，９７科１８，３１４。［］赣等物学报，９４２：４。县朱植１８，６４９［］最等，ｇ朱实验生物学报，９５１：３。１８，８Ｉ９［０胡适宜，物学通报，９６（）２。１］植１８，４０［Ｉｚ，ｅ丑．１］ｃ１，ｔｃ船，９６９３Ｂ１８．：０．，９８７１７１８，ｌＩ－）［］嫦，１周２植物学报，９７２：Ｉ。１８·９１７［３ｚｏｔ－尸８Ｒ１］ｈ．Ｃ，［］嫦．物细胞工程应用基础研究新进展１周植（９８，术期刊出版杜．９９１２１８）学１８．５。ｎｓｆｇ妇７ｎｅｎｔｎｌｏ１ＩｔｒａｉａｈｏｃＩ。ｌ１鼬ｅａｄｃｕｃｎ拈（ＪＪ呻ｇｎＰａ１ｎｅｕｕ．．ｏｔＮｋｒｔ丑．ｄ－．ＱｗｒＡａｅｉｕＩｈ，ｉｏｅ１ｅｓ）［ｕｅｃｄｍｃＰｂｓ啪ａｐｌ１９，２．９０２２［３周嫦·２３植物学报，９９３；９１８，１Ｏ。［４Ｚｏ，ｅａ，＆，９９８；２．２］ｈｕｃＬ，ｔ１８．２２９［５莫永胜，物学通报，９Ｉ（ｏ：。２］生１９，１）３［ＳＹｎ，ＬＹ．２ｌｕＣ２］ａｇｌ－，ｏ，．Ｊ矾．１ｇ，ｌ０．．９９１．８［７莫永胜．２］自然杂志，９０１：１。１９，３３８［８莫永胜弘远．２］杨植物学报，９１３；４。１９，３６９［９蘩德田、２］陈冬玲，中农业大学学报．９８（：华１８，）４７２。［Ｏ周嫦、３］杨弘适，植物学报．９２２０．１８．４４３［１杨弘远、３］周端，植物学报１８，６３５９４２，５．［２周嫦、３］橘弘远．实验生物学报。９４ｔｌ４。１８。７１１［周嫦、３植物学报，９５２，５．１８，７２８［５周嫦１］曼新莉，植物学报，９０３ｌ０。１９，２４４［吴新莉嫦ｔ验生物学报，９Ｉ２：５１］８周蜜１９，４Ｉ。［ｚ．．Ｙｎ，．．５，９５１５２５３］抽ｕＣ，ａｇＨＹ岫１８，６，２．…［５胡适宜等。３］植物学报．９５２３。Ｉ８＋７３７［７莫永胜，１］自然杂志，９／１：７１９，３７９）［８曼新莉１］周姑·植物学报．９０３ｔ７。Ｉ９·２５７［９周嫦，１］植物学报，９８３：６。１８，０３２【６李乐工３］胡适宜，生物学报．９６ｉ５。实验１８．９２４［７吴燕３］周嫦，汉植物学研究，９８８３５武１８．；１。［８吴蒹、嫦，３］周植物学报，９８３，１．ｌ８．０２ＯＲＥＣＥＮＴＤｖＡＮＣＥＴＯＷＡＲＤＳＰＬＡＮＴＸＵＡＬＡＳＥＣＥＵＥＮＧＩＮＥＥＲＩＧＮＮＡＮＩＣＨＩＭｏＹｏｇｈｎｎｓｅｇＬｉｈｌｎ岫ｏｇＳ（ｅａｔｎｆＢｏｏｙ，ｕａｉｅｓｔＤｐｒｍｅｔｉｌｇＷｈｎＵｎｖｒｉｏｙ）Ａｂｔａｔｓｔｃ。Ｔｅｂ咖ｉｅｓｄ帅ｈａｄａｔｅｔｅｎｉｅｒｎ·ｎｆｔｅ１ｔＳｅｃｔｇａ蛆ｉａｔｉｃ０吨ｔｄｙ，ｒｌＳｎ—ｘｍｌＵｅｇｎｅｉｇ０ｅｏＯｔｘｉｎｒｎｌｎ．ｓｃｈＴｉ￣ｂ咖ｏａａｃ￣ｅｅｔｅ·Ｒ￣ｅｔＭｖｎｅｔｄｃｎａ￣ｏｗａｒｓｔｉ

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细胞生物学常用研究方法

Southern杂交: 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。 RNAi技术: 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。 Southern杂交一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量]。 扫描电镜技术：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 细胞显微分光光度计：用来描述薄膜、涂层厚度超过1微米的物件的光学性能的显微技术。 免疫荧光技术：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。 电镜超薄切片技术：超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。用当代较好的超薄切片机，大多数生物材料，如果固定、包埋处理得合适，可以切成50-100微米的超薄切片。 Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 放射自显影技术：放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。放射自显影技术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。 核磁共振技术：可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小(20，000 道尔顿以下)的蛋白质、核酸以及其它分子的结构，而不损伤细胞。 DNA序列分析：在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信

肠系膜淋巴结细胞MLNs和固有层单核细胞LPMCs

外周血单个核细胞的分离 3．1．4．2密度梯度分离 从肘静脉无菌采集外周EDTA抗凝血5ml，用等量的生理盐水稀释，将稀释血液按1：1比例小心缓慢加在淋巴细胞分离液上，室温800xg离心30rain，离心后分四层，上层为血浆、血液稀释液和大部分血小板，下层为红细胞和粒细胞，中间层是淋巴细胞分离液，分离液和血浆交界部位的乳白色混浊液体就是单个核细胞层，小心吸取该层，加入10．15ml生理盐水洗涤，室温250xg离心10min，弃上清；再重复洗涤两次，弃上清。 3。1．4．3外周血单个核细胞样品RNA的抽提和纯化 将分离好外周血单个核细胞样品的迅速加入lml trizol，冰浴匀浆使细胞样品充分裂解。转移到一1．5ml DEPC处理的无菌离心管中，加入400ul氯仿，剧烈震荡混匀，4度12000rpm离心10min。转移上清至另一离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，剧烈震荡混匀，4度12000rpm离心10rain。转移上清至另一离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，剧烈震荡混匀，4 度12000rpm离心10min。转移上清至另一离心管中，加入等体积异丙醇，震荡混匀，室温放置2min，4度12000rpm离心10min。轻轻移弃上清，防止吸去沉淀，加入lml 70％乙醇，悬浮沉淀，4度12000rpm离心10min。轻轻移弃上清，防止吸去沉淀，4度12000rpm离心lmin，用移液器吸干残余酒精，室温空气干燥，使酒精挥发，加入50ul DEPC处理的灭菌水，溶解RNA。电泳察看RNA的浓度和完整性。 在微量Tube中配制下列反应液，全量50ul

全RNA 20ug 1 0xDnase I Buffer 5ul Dnase I(Rnase-free，5U／u1) 2ul Rnase Inhibitor(40U／u1) 0．5ul DEPC处理水 upto 50ul 37℃反应20．30分钟。加入50ul的DEPC处理水。加入100ul(等量)的苯酚／氯仿／异戊醇(25：24-1)，充分混匀。离心，取上层(水层)移至另一微量离心管中。加入10ul(1／10量)的3 M NaOAC(pH5．2)。加入250ul(2．5 倍量)的冷无水乙醇，．20。C放置30．60分钟。离心回收沉淀，用70％的冷乙 醇清洗沉淀，真空干燥。用适量的DEPC处理水溶解后，进行Agarose电泳确认是否除去基因组DNA。 3．1．4．4 RNA反转录上海交通大学博士学位论文 RNA(2u曲xul Primer(oligo dT)lul RNase抑制剂0．5ul 补DEPC水至终体积lOul。轻轻混匀并在微量离心机低速将混合液收集在 底部。75"C水浴5 min，迅速冰浴2rain。离心收集混合液至管底。 每个反应管中顺序加入以下试剂： 5×RT Buffer 4ul dNTP Mix(10 mM each) 1 ul RNase抑制剂 O．5ul

细胞周期同步化1

细胞周期同步化 借助某种实验手段(自然地或经人为地),使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相的现象。 细胞周期同步化分：自然同步化和人工同步化。 自然同步化：是自然界存在的现象, 在动、植物细胞都有发现。它们不受人为条件的干扰, 因而有可能在接近自然的条件下进行观察, 但自然同步化的细胞群体受到诸多条件的限制, 对结果有很大的影响。 人工同步化：是利用细胞培养的方法, 用各种理化因素处理获得的同步化生长的细胞。常用的细胞人工同步化的方法分为选择同步化、诱导同步化或者两者的结合。 同步化分类及方法 （一）自然同步化 1．多核体 如粘菌只进行核分裂，而不发生胞质分裂，形成多核体。数量众多的核处于同一细胞质中，进行同步化分裂，使细胞核达108，体积达5~6cm。疟原虫也具有类似的情况。 2．某些水生动物的受精卵 如海胆卵可以同时授精，最初的3次细胞分裂是同步的，再如大量海参卵受精后，前9次细胞分裂都是同步化进行的。 3．增殖抑制解除后的同步分裂 如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。 （二）人工同步化 1．选择同步化 1) 有丝分裂选择法：使单层培养的细胞处于对数增殖期，此时分裂活跃，分裂指数高,MI高。有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿的附着性低，此时轻轻振荡，M期细胞脱离器壁，悬浮于培养液中，收集培养液，再加入新鲜培养液，依法继续收集，这样每隔1h摇一次并收获一次，倾出培养液贮存于2~4℃冰箱中保存可连续收集24h，则可获得一定数量的中期细胞。其优点是，操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害，缺点是获得的细胞数量较少。（分裂细胞约占1%～2%） 2）细胞沉降分离法：不同时期的细胞体积不同，而细胞在给定离心场中沉降的速度与其半径的平方成正比，因此可用离心的方法分离。其优点是可用于任何悬浮培养的细胞，缺点是同步化程度较低。 2．诱导同步化 1）DNA合成阴断法：选用DNA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成，而不影响其他时期细胞的运转，最终可将细胞群阻断在S期或G/S交界处。5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高浓度ADR、GDR和TDR，均可抑制DNA合成使细胞同步化。其中高浓度TDR 对S期细胞的毒性较小，因此常用TDR双阻断法诱导细胞同步化：

细胞研究进展概述

细胞研究进展概述——干细胞技术 20092358 谢芬霏16120901 生物技术 摘要：干细胞是人体及各种组织细胞的最初来源，具有高度自我复制、高度增殖和多项分化的潜能。干细胞的研究正在向现代生命科学和医学等各个领域交叉渗透，干细胞的研究也成为了生命科学的热点，本篇就几个干细胞的研究方向的进展展开一些介绍。 关键词：干细胞；多能性；神经干细胞；造血干细胞 引言： 干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotent stem cell,TSC)、多能干细胞（pluripotent stem cell）和单能干细胞（unipotent stem cell）。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。干细胞的形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。胚胎干细胞(Embrtibuc stem cell)的发育等级较高，是全能干细胞（Totipotent stem cell），而成体干细胞的发育等级较低，是多能干细胞或单能干细胞。据最新研究发现，成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础。在胚胎的发生发育中，单个受精卵可以分裂发育为多细胞的组织或器官。在成年动物中，正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复再生。胚胎的分化形成和成体组织的再生是干细胞进一步分化的结果。胚胎干细胞是全能的，具有分化为几乎全部组织和器官的能力，而成体组织或器官内的干细胞一般认为具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。 1 胚胎干细胞 1.1 胚胎干细胞的概念和生理学特性 胚胎干细胞（Embryonic Stem cell，ES细胞）。胚胎干细胞当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团（Inner Cell Mass）的细胞即为胚胎干细胞。胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。胚胎干细胞的生物学特性有：①全能性，在体外培养的条件下, 胚胎干细胞可以诱导分化为机体的任何组织细胞。全能性的标志是细胞表面有胚胎抗原和Oct4蛋白【1】。②无限增殖性。胚胎干细胞在体外适宜条件下, 能在未分化状态下无限增殖。③胚胎干细胞具有种系传递的功能。④胚胎干细胞易于进行基因改造操作。⑤细胚胎干胞保留了正常二倍体的性质且核型正常。早在1970年Martin Evans已从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养【2】，而人的胚胎干细胞的体外培养直到最近才获得成功。进一步说，胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。ES细胞的研究可追溯到上世纪五十年代，由于畸胎瘤干细胞（EC细胞）的发现开始了ES细胞的生物学研究历程。目前许多研究工作都是以小鼠ES细胞为研究对象展开的，如：德美医学小组在去年成功的向试验鼠体内移植了由ES细胞培养出的神经胶质细胞。此后，密苏里的研究人员通过鼠胚细胞移植技术，使瘫痪的猫恢复了部分肢体活动能力。随着ES细胞的研究日益深入，生命科学家对人类ES细胞的了解迈入了一个新的阶段。在98年末，两个研究小组成功的培养出人类ES细胞，保持了ES细胞分化为各种体细胞的全能性。这样就使科学家利用人类ES细胞治疗各种疾病成为可能。然而，人类ES 细胞的研究工作引起了全世界范围内的很大争议，出于社会伦理学方面的原因，有些国家甚至明令禁止进行

细胞固定化技术的发展历程和主要应用

细胞固定化技术的发展历程和主要应用 早在 1 9世纪初叶，人们发现某些微生物细胞具有一种吸附在固体物质表面的天然倾向和特殊功能，并以这种方式被束缚和固定起来。从20世纪印年代开始，国际上固定化酶的研究迅速发展起来;到70年代，作为发酵源的微生物菌体本身的固定化，即固定化微生物，也引起了人们极大的关注。固定化技术是将酶或细胞通过物理或化学方法固定在不溶性或水溶性的膜状、颗粒状、管状的载体上，一般能明显地提高酶对热和酸碱度的稳定性。固定化技术在连续反应过程中不会流失，可用简单的方法回收再生，可使生产连续化，具有节约能耗、降低成本、简化环保措施等诸多优点，使其在生产中被迅速推广。 固定化细胞在食品工业中的应用 目前，世界各国都把固定化细胞研究的成果很快地运用于工业生产过程中，其应用范围远远超出食品加工、轻化工业和制药工业，现已扩展到化学分析、环境保护,能源开发等领域。 一、生产果葡萄糖浆利用微生物的a一淀粉酶和葡萄糖淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖，再用葡萄糖异构酶将葡萄糖转变为较蔗糖更甜的果糖。经提纯、浓缩，即可制得替代蔗糖的新糖源，即含葡萄糖、果糖的果葡糖浆。 1966年日本在工业规模上利用微生物菌体生产果葡糖 浆，首次获得成功，并正式投人生产。1969年又采用菌 体热固法制成的固定化细胞，实现了生产的连续化，产量 达11万t,1978年产量达到100万t以上。其制得的固 定化异构酶微生物生物反应器半衰期289 d1131。 二、柑桔类果汁的脱苦柠檬苦素类脱苦酶，其最适PH值都偏向碱性，而影响其在柑桔加工中的使用，但可以将产生这些酶的细菌细胞固定化，以用于柑桔果汁的脱苦。球形节杆菌含有柠檬苦素D一环水解酶和柠檬酸A一环内醋脱氢酶，可将柠檬苦素转化成17一脱氢柠檬酸A一环内醋;球形节杆菌n含有柠檬苦素醇脱氢酶，可将柠檬苦素转化成柠檬苦素醇.2001年，张惟广等研究了用于柑桔汁脱苦的固定化醋酸杆菌细胞的特性，研究表明，固定化细胞脱苦最佳供氧为:摇床转速160r./min，最适声为4.5,最适温度为25℃;而游离细胞脱苦的相应条件分别为160 r/min,州为5.5，最适温度为25℃。低浓度NaCl对固定化细胞和游离细胞的脱苦都有强烈的抑制作用;固定化细胞在柠碱浓度达到30 mg/纯后，柠碱降解速度趋于饱和，而游离细胞的柠碱浓度则为35mg/kg，固定化细胞的热稳定性比游离细胞好。 三、酱油生产采用固定化细胞技术生产酱油，生产周期缩短。酱油风味改善，速酿优质酱油。Iwasaki等人比较研究了海藻凝胶、圆柱陶瓷和陶瓷颗粒等3种固定化细胞体系在分批发酵过程中的性能。发现3种固定化细胞的产酸能力大致相同，分别为5.2, 5 .3和 4.8k g/衬·d，高于游离细胞的0.5一1.0 kg/衬"d。并提出了一种新的酱油生产工艺，将细胞截留在一个搅拌罐反应器与超滤装置相结合的膜生化反应器中〔161。结果表明，通过膜装置连续移出发酵，产品风味良好，生产效率提高。在酱油的制作过程中，结合酵母和假丝酵母发酵产生多种重要的风味物质，赋予大豆酱油独特的风味。北京金狮酿造六厂选用聚乙烯醇作

细胞周期同步化讲课稿

细胞周期同步化 在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂活动，其余细胞分别处于G1、S和G2各期。不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会影响实验的重复性，因此，需要获得周期一致性的细胞。利用细胞同步化技术可使细胞大 量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体。细胞周期同步化(synchronization)是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相( 除了G0期的细胞)的现象。细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群和使细胞进入同步化生长的两层含义。 DNA 合成抑制法是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。高浓度TdR(胸腺嘧啶核苷)双阻断法是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法。它可逆地抑制DNA 合成，而不影响其他时期细胞的转运，最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处。其原理是: TdＲ是细胞DNA 合成不可缺少的前体，但向培养基中加入过量TdＲ，可形成过量的三磷酸腺苷，后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，从而抑制DNA 合成。它将细胞同步于G1 /S 期交界处，同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化，但是容易产生非均衡生长，个别细胞体积增大。TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤和高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂，它们与TdR作用相似，均可通过抑制DNA合成达到同步化的目的。 中期阻断法是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法，常用的药物有秋水仙素等。秋水仙素通过抑制微管的聚合，进而抑制有丝分裂装置的形成，将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。中期阻断法非平衡生长问题不明显，但可逆性比较差，当阻断时间过长时，许多细胞产生异常分裂。过去研究中也发现，同步后的细胞的生长能力明显不如撤去阻断剂后得到的S期细胞旺盛。秋水仙胺、Nocodazole也是目前常用的中期阻断剂。 经过同步化之后的细胞可以通过流式细胞术对其周期进行分析。将细胞用PI（碘化丙啶）染液进行染色，使用流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。由于细胞的DNA含量在不同时期有显著的差异，因此可以将细胞分成 G1/G0期（1倍），S期（1-2倍）和G2/M期（2倍）。流式细胞仪可以根据DNA含量在不同时间内的变化,从而确定细胞周期的长短,也可以直接标记DNA复制（放射性同位素标记）,统计细胞数量与标记细胞的百分比,对细胞周期进行综合分析. 连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程为细胞周期(cell cyc1e)。细胞周期包含四个阶段：①G1期(first gap),又称合成前期，指前一次有丝分裂完成到DNA复制前的一段时期；②S期(synthesis phase),即DNA合成期，为真核细胞分裂(cell pision)间期中进行DNA合成的阶段；③G2期(second gap),为DNA合成后期，指DNA合成结束至有丝分裂开始之间的一个阶段；④M期 (mitosis or pision) ,又称D期，是染色体真正开始分离时期。细胞周期又可分为有丝分裂期（M期）和分裂间期(即G1→S→G2)两个时期。尽管细胞周期中各期的持续时间因不同细胞类型而异，但相对而言M期最短，S期较长。流式细胞仪（flow cytometer；FCM）的工作原理是在样品管中放入待测细胞，在气体的压力下使待测细胞进入充满鞘液的流动室。在细胞流动室里单细胞悬液被鞘流液包绕通过流动室内一定孔径的孔，形成细胞柱。然后通过对流动液体中单列的细胞进行逐一检测，得到单个细胞的光散射和荧光指标，在功能水平上定量分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等的物理、化学特征等多个参数。流式细胞

细胞培养基种类

细胞培养基的选择及常用数据库 日期：2012-04-13来源：未知作者：网友点击：次细胞实验技术 经典的培养基有很多种，Invitrogen(GIBCO)、Thermo Fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的培养基。其他如M199、IMDM、L15培养基等也用于某些细胞的培养。 ◆MEM是由Eagle’s基础培养基(BME)发展而来的，其中增加了组分的范围及 浓度。 ◆ Dulbecco改良的BEM(DMEM)培养基是为小鼠成纤维细胞设计的，现在常用于 贴壁细胞的培养。DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍，维生素浓度是MEM的4倍，采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。最初的配方中葡萄糖含量为1000 mg/L，后来为了某些细胞的生长需要，将葡萄糖含量又调整为4500 mg/L，这就是大家常说的低糖和高糖了。 ◆ aMEM含有附加的氨基酸、维生素以及核苷和脂肪酸，它可广泛应用于各种细 胞类型，包括对营养成分要求苛刻的细胞。 ◆ Ham’s F12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的，现在也广泛应用于 克隆形成率的分析及原代培养。F12还可以与DMEM等体积混合使用，得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物，这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。 ◆ RPMI 1640培养基是专为淋巴细胞培养而设计的，现在已广泛应用于悬浮细胞 的培养。 以前经常听到有人问，这种细胞该用哪一种培养基呢?其实这个问题的答案可以很简单，也可以好复杂。此话怎讲?如果这种细胞是购自ATCC或其他的细胞库，那很简单，问供应商就行了。或者找到相关的文献，作为参考。Invitrogen网站上有一个Cell Line Database的工具，也很好用。选择你感兴趣的细胞类型，它就会弹出推荐的培养基、血清和转染试剂等，有时还有优化好的转染步骤，很方便。Sigma网站上也有一个Media Expert，包括了培养基所有成分的功能描述、使用推介和参考文献等，它还

细胞生物学研究方法

细胞由于体积小，一般需在显微镜下观察，显微镜一般分为光学显微镜与电子显微镜。显微镜的放大倍数由目镜与物镜决定：放大倍数=物镜×目镜。清晰与否由分辨率（指能够分辨出相邻两质点间的最小距离，距离越小，分辨率越高）决定。一般来说，光镜分辨率为0.2微米，电镜分辨率为0.2纳米。分辨率的限制因素为：入射光波长，介质折射率，物镜镜口角。 光学显微镜结构为：光学显微系统，光源，机械支撑系统，有些还有图像采集系统。常见有三种：复式显微镜，相差显微镜以及荧光显微镜。 复式显微镜分为单筒显微镜，双筒显微镜。复式光学显微镜较为简单，照明系统为可见光，光学系统为玻璃透镜（目镜，物镜以及聚光镜），另外还有机械与支架系统。普通复式显微镜的缺点：由于光的干涉，衍射现象，光线通过样品时，两个相邻焦点的图像可能发生重叠，进而无法分辨，导致存在分辨极限。 相差显微镜是指利用光线的干涉，衍射特征，时相位差转变为振幅差，增强样品的明暗对比，从而观察无色透明样品的装置。相差显微镜的特殊构件为相差板，环状光阑。相差显微镜的特点：样品无需染色，可观察活细胞及细胞器动态。 荧光原理：荧光分子吸收入射光能量以后，电子由基态跃迁到激发态。激发态电子不稳定，会自发跃迁回基态，并辐射荧光。荧光显微镜原理：利用短波长电磁波为光源，激发样品辐射荧光，之后利用样品产生的自发荧光或诱发荧光，对细胞内特异性蛋白质进行定性与定位研究的装置。荧光显微镜的优点：荧光显微镜主要用于定性，定位研究细胞内特异性蛋白质，可以观察活细胞。缺点：无法排除来自样品焦平面以外的荧光，使得图像的反差与分辨率降低。 光学显微镜样品的制备：固定，包埋，切片，染色 固定：目的是杀死细胞，稳定细胞成分，以便进一步处理和切片是不受破坏。

工作细胞和自律细胞

1.普肯耶细胞的跨膜电位及其形成机制 普肯耶细胞动作电位波形、分期和形成原理与心室肌细胞基本相同，其不同点在于4期膜电位并不稳定，出现自动地缓慢去极化，当去极化达阈电位水平时即引发下一个动作电位。 普肯耶细胞4期自动除极的机制：目前认为4期有一种随着时间而逐渐增强的内向电流（If），主要是Na+内流，从而导致自动除极。另外，4期内导致膜复极化的外向K+电流（Ik）逐渐减弱，亦有助于膜去极化。 2.窦房结细胞的跨膜电位及其形成机制 窦房结含有丰富的自律细胞，动作电位复极后出现明显的4期自动除极，但它是一种慢反应自律细胞，其动作电位具有许多不同于心室肌（快反应细胞）和普肯耶快反应自律细胞的特征： （1）窦房结细胞的最大复极电位（-60～-65mV）和阈电位（-40mV）的绝对值均小于普肯耶细胞； （2）0期是由于细胞膜上慢钙通道被激活，Ca2+内流而形成。0期除极结束时，动作电位幅值约70mV，超射小； （3）其除极幅度（70mV）小于普肯耶细胞（为120mV），而0期除极时程（7ms 左右）却比后者（1-2ms）长得多。因此，动作电位升支远不如后者那么陡峭； （4）没有明显的复极1期和平台期； （5）4期自动除极速度（约0.lV/s）比普肯耶细胞（约0.02V/s）快。 窦房结细胞4期自动除极机制： （1）进行性衰减的K+外流是窦房结细胞4期除极的重要离子基础之一； （2）进行性增强的内向离子流If（主要是Na+内流。但它不同于心室肌0期除极的Na+内流。此钠流可被铯所阻断）； （3）T型钙通道被激活，Ca2+内流。在自动除极过程的后半期，窦房结细胞上的T型钙通道被激活，Ca2+内流使膜电位进一步减小，当除极达-40mV时，激活L型钙通道，引起下一个自律性动作电位。 因此，根据0期去极的速度可将心肌细胞分为快反应细胞与慢反应细胞；根据4期有无自动去极化可分为自律细胞与非自律细胞。如心室肌细胞为快反应非自律细胞，窦房结细胞为慢反应自律细胞。

细胞同步化方法

Cell synchronization of Drosophila cell line Cell synchronization of Drosophila Kc cells Kc cells were cultured in 15-cm plates at a density of 1×106cells/mL in Schneider’s Media (Invitrogen 11720034) supplemented with 10% FCS and penicillin/streptomycin. The cells were arrested in G2 by the addition of the hormone Ecdysone (Sigma H5142, 蜕皮激素, C27H44O6) at a final concentration of 1.7 μM. To arrest the cells at the G1/S transition, the cells were released from Ecdysone into 1 mM HU. For replication timing, cells were pulsed with 50 μg/mL BrdU (Roche 280 879) for 1 h at either 0 or 6 h following release from HU. For identification of early origins, cells were released from G2 into medium containing both BrdU and HU at the same concentrations as above. Cell cycle progression was monitored by FACS. Molecular formula of Ecdysone Cell synchronization of Drosophila S2 cells: Briefly, log-phase (2x106/ml) cells were first incubated with 0.2 nM ponasterone (甾酮A, C27H44O6) A for 24 h to obtain G2 cells. Cells were then rinsed with phosphate-buffered saline (PBS) three times, resuspended in fresh Schneider’s Drosophila medium (GIBCO) containing 5% each of Fetal Bovine Serum and Bovine Calf Serum (JRH Biosciences), along with 1.5 mM hydroxyurea (HU, 羟基脲, CH4NO), and cultured for 18 h to obtain G1/S cells. Afterwards, these cells were rinsed with PBS three times, cultured in the above-specified medium without HU and harvested at various time points for analyses. Molecular formula of ponasterone BrdU-FACS or FACS analyses : Cells grown in 6-well plates were treated with BrdU (10 μM) for 45-60 min, fixed with 80% cold ethanol, treated with 3N HCl, washed and incubated with anti-BrdU MAb (Becton Dickinson) for 60 min. After washing, cells were incubated with Alexa Fluor ? 488 goat anti-mouse IgG (Invitrogen) for 30 min. These cells, or ethanol-fixed cells (for direct FACS assays), were treated with propidium iodide and RNase A for 30 min before FACS analyses. Reference: Lee et al.,2010, JBC. Drosophila Octamer Elements and Pdm-1 Dictate the Coordinated Transcription of Core Histone Genes. David M. MacAlpine., 2004, Genes Dev., Coordination of replication and transcription along a Drosophila chromosome.

细胞研究论文

细胞研究论文 骨缺损的治疗，由局部伤情复杂和缺乏理想的修复材料，一直是困扰临床医生和基础医学工作者的一大难题，而寻找一种尽可能达到或接近自体骨移植效果的理想的骨替代材料更是无数学者热切探索、孜孜以求的目标。近年来日趋活跃的骨组织工程技术为这一课题的研究带来了新的亮点和希望。目前动物实验已能从骨膜、骨髓等定向性骨祖细胞密集处分离培养出成骨细胞，经体外扩增并与载体结合，回植体内骨缺损处取得骨缺损修复的成功［1］。与此同时，基于对患者易接受性、可操作性和更简单易行性等方面的考虑，研究者又开始把目光投向诱导性骨祖细胞。其中，在体内分布广泛、数量巨大、部位表浅、取材方便、培养传代易行、分裂增殖迅速的成纤维细胞首先成为了研究的焦点。由于目前许多相关研究尚处于实验阶段，为此，本文着重就成纤维细胞的生物学特性及其成骨作用等作一综述。 1 成纤维细胞的及其生物学特性 成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。 不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔

组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位［2，3］。 成纤维细胞形态多样，常见的有梭形、大多角形和扁平星形等，其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。成纤维细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松着色浅，核仁明显。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，表明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成与成骨细胞合成分泌的胶原原纤维一样具有64nm周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘合形成胶原纤维。经检测，这两种细胞合成分泌的胶原纤维均是Ⅰ型胶原纤维，在形态和生化结构上完全相同［4,5］。 处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。另外，在结缔组织中，仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞，它们在创伤修复等情况下可增殖分化为成纤维细胞。 2 成纤维细胞在一般创伤修复中的表现

细胞爬片免疫组化

固定液配方（细胞免疫组化，用的是4%多聚甲醛固定的）： 我们用的4%多聚甲醛是先配制成12.5%的，然后再用0.1m PB稀释的。 0.1m PB配方（PH值7.4）1000ml 磷酸氢二钠48.693g 磷酸二氢钠 5.023g 三蒸水1000ml 12.5%多聚甲醛（PH值7.4）1000ml 多聚甲醛125g 三蒸水1000ml 磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60℃以下，如仍不溶，加NaOH （三蒸水先放800ml，10小时左右，再补加200ml） 4%多聚甲醛（PH值7.4）1000ml 12.5%多聚甲醛320ml 0.1m PB 680ml 步骤： 1 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，按2*104/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。 2 PBS清洗标本3次各1 min。 3 冰丙酮固定15 min。 4 空气干燥5min。 5 PBS清洗标本3次各2 min。

6 0.5%Triton X-100( DPBS配) 孵育1次20 min。 7 PBS清洗标本3次各2 min。 8 3%H2O2孵育15 min。 9 DPBS清洗标本3次各2 min。 10 封闭血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液）20min。 11一抗孵育（PBS配，滴度1：200，湿盒）4OC 过夜或37OC 60 min。阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液 12 PBS清洗标本3次各5 min。 13 二抗工作液孵育（湿盒）37OC 30 min。 14 PBS清洗标本3次各5 min。 15 C液（湿盒）37O C30 min。 16PBS清洗标本3次各5 min。 17DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约3~10min。 18蒸馏水洗2次1 min。 19苏木素复染0.5~1min。 20自来水洗30min。 21树胶封片。 注意事项： 1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下： （1）对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上，这样细胞爬片才较牢固，冲洗时不易脱片； （2）接种的细胞密度适中，以2*104/ml为宜，若细胞密度太高，5天后细胞连接成片冲洗时易脱片； 2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4O C冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。 3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片） 4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜 5、Triton X-100（屈立通）表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。

分子克隆及细胞培养基本实验方法

分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）

①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应

干细胞研究发展历程.

1950：将骨髓细胞移植到遭受致死剂量辐射的动物，发现能够挽救生命，重建骨髓造血免疫系统 1960：真正认识和了解人和哺乳动物干细胞始于20世纪60年代 1961：Till 和Mc Culloch 提出多能干细胞概念 1967：多纳尔–托马斯完成第一例骨髓移植，后于1990年获得诺贝尔医学和生理学奖 1980：造血干细胞移植成为治疗多种疾病的重要手段 1981：Evans等首次成功建立小鼠胚胎干细胞系 1981：胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）的分离和培养首先在小鼠中获得成功 1988：美国科学家James Thomson分离出人类胚胎干细胞 1998：美国两个科研小组分别报告从胚胎和生殖脊成功建立人类胚胎干细胞系，使人类胚胎干细胞能在体外生长和增殖 同年，美国科学家在《美国科学院院刊》上报告：小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化为血液细胞”。此后，世界各国科学家相继证实，包括人类的成体干细胞具有可塑性，从而掀起了全球成体干细胞研究高潮。干细胞研究进展被《科学》杂志评选为该年度世界十大科学成就之首。人类ES (hES)细胞建系获得成功，由此推动了干细胞研究的兴起。 2000： 日本把以干细胞工程为核心技术的再生医疗列为“千年世纪工程”之一，当年投资108亿日元；同年，全世界有10622例造血干细胞移植。 成体干细胞移植使糖尿病大鼠恢复正常 神经干细胞能够进入脑组织并修复脑损伤 角膜干细胞有助于恢复视力 发现成人骨髓干细胞形成肝细胞 成人骨髓干细胞可以在合适的条件下转化为神经细胞 成人骨髓干细胞可以在体外大规模培养 证实成人骨髓干细胞可以形成多种类型组织

细胞免疫组化常用试剂配制

免疫细胞化学常用试剂 一、固定剂 大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。 目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。 1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3） 试剂：多聚甲醛40g 0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml 配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。 该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。 2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠 试剂：A液：多聚甲醛40g 蒸馏水400ml B液：Na2HPO4·2H2O16.88g 蒸馏水300ml C液：NaOH 3.86g 蒸馏水200m

配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。 该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。 3．Bouin’s液及改良Bouin’s液 试剂：饱和苦味酸 40%甲醛250ml 冰醋酸50ml 配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。 该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。 4．Zamb oni’s(Stefanini’s)液 试剂：多聚甲醛20g 饱和苦味酸 150ml Karasson-Schwlt’s PB至1000ml 配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。 该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。固定时间为6～18h。 5．PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液 （Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）