细胞骨架答案详解
第七章细胞骨架
一、填空题
A-七-1.细胞骨架是指存在于真核细胞中的蛋白纤维网架体系，狭义的骨架系统主要包括微丝、微管和中间丝。
A-七-2. 构成微管的蛋白有两类：α微管蛋白和β微管蛋白。
A-七-3. 微管在细胞中有三种存在形式：单管、二联管和三联管，其中主要分布在纤毛和鞭毛杆状部位的是二联管。
A-七-4. 装配时具有“踏车现象”的细胞骨架是微丝和微管。
A-七-5. 紫杉醇是作用于微管的特异性药物，而鬼笔环肽是作用于微丝的特异性药物。
A-七-6.微丝的基本组成单位是肌动蛋白，其在细胞中也有两种存在方式：①球状肌动蛋白②纤丝状肌动蛋白。
A-七-7. 在细胞骨架系统中较为稳定的一种骨架纤维是中间纤维。
A-七-8.中间纤维蛋白分子八聚体之间在纵向端对端首尾相连组成一条原纤维，四条原纤维侧向相互作用最终形成中间纤维。
A-七-9. 细胞骨架中具有极性的为微丝和微管。
B-七-10. 鞭毛和纤毛内部是由微管组成的轴丝构成的结构。其基部的结构式为__三联管__，而其杆部的结构式为二联管。
B-七-11. 微管是由异二聚体组装成的 13 条原丝依靠共价键排列而成。一些药物如__秋水仙素__可以抑制微管的组装。
B-七-12. 秋水仙素是作用于微管的特异性药物，破坏纺锤体的形成，使细胞停滞在分裂中期。
B-七-13. 细胞中微管组织中心包括中心体、纤毛和鞭毛的基体。
B-七-14. 微管在体内装配时，微管的_负极_附着在微观组织中心上而受保护，因此在细胞内微管的延长或缩短变化大多发生在另外一端。
？B-七-15. 纺锤体微管包括动粒微管和。
B-七-16. 马达蛋白可分为三个不同的家族，其中驱动蛋白家族和动力蛋白家族以微管作为运行轨道，而肌球蛋白家族以肌动蛋白纤维作为运行轨道。
B-七-17. 微丝的组装过程分成三个阶段：成核期是微丝组装的起始限速过程，其余两个阶段是生长期和平衡期。
B-七-18. 中间纤维是由中间纤维蛋白单体组成，每个蛋白单体由三个区域组成：其中_杆状区__是中间纤维分子聚合成中间纤维的结构基础，而两侧是 _头部和__尾部__，这两个结构域的氨基酸组成是高度可变的。
B-七-19. 与微丝相连的细胞间锚定连接包括黏着带、黏着斑
和隔状连接，而中间纤维相连的锚定连接包括桥粒和半桥粒。
C-七-20. 微管的滑动必不可少的结构是动力蛋白，它具有ATP酶的活性。
C-七-21. 细胞质分裂中收缩环发生收缩是因肌动蛋白和肌球蛋白相对滑动而造成的。
？C-七-22. 在神经轴突的物质转运过程中，由两种马达蛋白介导：介导运输小泡由轴突顶端运向胞体；介导小泡由胞体运向轴突顶端。C-七-23.组成细肌丝主要的三种蛋白质是：纤丝状肌动蛋白、
肌钙蛋白、原肌球蛋白。
C-七-24. 肿瘤细胞在转移后仍表达其原发肿瘤的中间纤维类型，如皮肤癌以表达角蛋白为特征，肌肉瘤表达结蛋白，神经胶质瘤表达波形蛋白等，因此可用于鉴别肿瘤细胞的组织来源及细胞类型。
二、选择题
（一）单项选择题
A-七-1微管蛋白的异二聚体上有核苷三磷酸（ C ）的结合位点。
A UTP
B CTP
C GTP
D ATP
?A-七-2对微管的超微结构叙述错误的是（ B ）。
A 微管是中空的圆筒状结构
B 微管可根据细胞的生理需要组装和去组装
C 微管由同种微管蛋白亚单位所构成
D 微管有13根原纤维构成
A-七-3能阻止微管去组装的药物是（ A ）。
A 紫杉酚
B 秋水仙素
C 细胞松弛素B
D 鬼笔环肽
A-七-4能抑制微管组装的药物是（ B ）。
A 紫杉酚
B 秋水仙素
C 细胞松弛素B
D 鬼笔环肽
A-七-5 下列哪种结构不是微管组成的（ D ）。
A 鞭毛
B 纺缍丝
C 中心粒
D 变形运动时的伪足
A-七-6组成微丝最主要的化学成分是（ A ）。
A 肌动蛋白
B 肌球蛋白
C 交联蛋白
D 波形蛋白
A-七-7肌动蛋白需要与（ A ）结合后才能装配成微丝。
A ATP
B ADP
C GTP
D GDP
A-七-8能够专一抑制微丝组装的药物是（ C ）。
A Mg2+
B 秋水仙素
C 细胞松弛素B
D 鬼笔环肽
A-七-9能够专抑制微丝解聚的药物是（ D ）。
A Mg2+
B 秋水仙素
C 细胞松弛素B
D 鬼笔环肽
A-七-10下列成分中，参与收缩环形成的为（ B ）。
A 微管蛋白
B 肌动蛋白
C 中间纤维蛋白
D 微管结合蛋白
A-七-11对中间纤维的叙述错误的是（ C ）。
A 直径介于微管与微丝之间
B 是形成核纤层的纤维状结构物质
C 是构成细胞运动器官鞭毛和纤毛的组成成分
D 中间纤维没有极性
A-七-12对于中间纤维的组装，下列说法错误的是（ C ）。
A 首先由中间纤维单体以平行且相互对齐的方式形成双股超螺旋二聚体
B 二聚体再以反向平行和半分子交错的方式组装成四聚体
C 四聚体又进一步以反向平行方式形成八聚体的原纤维
D 最终由四根原纤维互相缠绕形成中间纤维
A-七-13一根完整的中间纤维，其横切面上有（ D ）个蛋白分子
A 4
B 8
C 16
D 32
A-七-14结构较稳定的细胞骨架是（ C ）。
A 微管
B 微丝
C 中间纤维
D 微梁网络
A-七-15细胞骨架中（ C ）没有极性。
A 微管
B 微丝
C 中间纤维
D 三者均是
B-七-16下列结构中（ B ）的微管蛋白不是以二联管的形式存在。
A 纤毛
B 中心粒
C 鞭毛
D 纺锤体
B-七-17中心粒和鞭毛的基体（ B ）。
A 都是9×3+0的结构
B 前者是9×3+0，后者是9×2+2
C 都是9×2+2的结构
D 前者是9×2+2，后者是9×3+0
B-七-18 纤毛主杆部的微管结构图式是（ D ）。
A 9+0
B 9×2+0
C 9×3+0
D 9×2+2
B-七-19在电镜下，中心粒的结构是（ C ）。
A 由9组单管微管环状斜向排列
B 由9组二联管微管环状斜向排列
C 由9组三联管微管环状斜向排列
D 由9组外围微管和2个中央微管排列而成
B-七-20微管的踏车运动发生在（ A ）
A 正端的聚合率大于负端的解聚率
B 正端的聚合率小于负端的解聚率
C 正端的聚合率等于负端的解聚率
D 微管既不聚合也不解聚，处于稳定状态
B-七-21如果用阻断微管的药物如秋水仙碱处理细胞，将会出现（ D ）。
A 细胞形态将会被破坏
B 有丝分裂和减数分裂不能进行
C 细胞器在细胞内的分布会被破坏
D 上述所有情况
B-七-22下列马达蛋白中（ A ）以微管作为运行轨道？(驱动蛋白和运动蛋白)
A 驱动蛋白
B 动力蛋白
C 肌球蛋白
D A与B
B-七-23下列（ D ）与微管的功能无关。
A 细胞内物质运输
B 支持功能
C 细胞运动
D 胞质分裂
?B-七-24下列哪项不能说明微丝具有维持细胞形态的作用（ A ）。
A 蝾螈红细胞的圆盘状外形
B 细胞膜下的细胞皮层结构
C 细胞内的应力纤维结构
D 小肠上皮游离面的微绒毛
B-七-25只有肌动蛋白（无肌球蛋白）的情况下，可以发生的细胞运动是（ D ）。
A 骨骼肌收缩
B 胞质分裂
C 卵细胞受精前的顶体反应
D 无（所有涉及肌动蛋白的运动都需要肌球蛋白）
B-七-26 下列中（ D ）是由微丝为主要成分构成的细胞结构。
A 肌肉的细肌丝，肌肉的粗肌丝，微绒毛，stress fiber
B 肌肉的细肌丝，微绒毛，纤毛，细胞皮层
C 肌肉的粗肌丝，微绒毛，stress fiber，胞质分裂环
D 细胞皮层，微绒毛，stress fiber，胞质分裂环
B-七-27成纤维细胞所特有的中间纤维蛋白是（ B ）。
A 角蛋白
B 波形蛋白
C 结蛋白
D 胶质纤维酸性蛋白
B-七-28下列有关三种细胞骨架的比较，说法不正确的是（ D ）。
A 微丝、微管有极性，中间丝没有极性。
B 微丝、微管的组装需要结合核苷酸，中间丝的组装不需要核苷酸。
C 微丝、微管的组装可被特异性药物所破坏，中间丝的结构则非常稳定。
D 微丝、微管和中间丝的组装过程都存在“踏车行为”。
B-七-29细胞骨架中（ C ）的组装没有踏车现象。
A 微管
B 微丝
C 中间纤维
D 三者均是
B-七-30下列中（）的成员都是分子马达。
A 驱动蛋白，胞质动力蛋白，轴丝动力蛋白，γ-微管蛋白
B 驱动蛋白，胞质动力蛋白，轴丝动力蛋白，Ⅱ型肌球蛋白
C 驱动蛋白，胞质动力蛋白，Ⅴ型肌球蛋白，γ-微管蛋白
D 驱动蛋白，轴丝动力蛋白，Ⅰ型肌球蛋白，连接蛋白
C-七-31 细胞变形足运动的的本质是（）。
A 细胞膜迅速扩张使细胞局部伸长
B 胞内微管迅速解聚使细胞变形
C 胞内微丝迅速重组装使细胞变形
D 胞内中间丝重聚合使细胞变形
C-七-32 在下列微管中对秋水仙素最敏感的是（）。
A 细胞质微管
B 纤毛微管
C 中心粒微管
D 鞭毛微管
C-七-33与粘着斑（黏合斑）相连的细胞骨架是（）。
A 微丝
B 微管
C 中间纤维
D 以上都不对
C-七-34 中间纤维分子结构模式中保守部分为（）。
A 分子的头部
B 分子的尾部
C 分子的杆状部
D 全分子
C-七-35 中间纤维之所以没有极性是因其组装至（）时便已经没有极性。
A 单体
B 二聚体
C 四聚体
D 八聚体
（二）多项选择题
A-七-1 微丝的主要功能有（）。
A 参与构成细胞支架
B 参与肌肉收缩
C 参与胞质环流
D 参与细胞分裂
E 参与蛋白质合成
A-七-2 下列结构中（）是由微管参与组成的。
A 着丝粒
B 中心体
C 纺锤体
D 鞭毛
E 神经元轴突
A-七-3 微管在细胞中存在的形式主要有（）。
A 单管微管
B 二联管微管
C 三联管微管
D 九联管微管
E 十三联管微管
B-七-4 一般意义上的细胞骨架包括（）。
A 微管
B 桥粒
C 中间纤维
D 微丝
E 核骨架
B-七-5 下列结构中（）具有微管组织中心的功能。
A 染色体着丝点
B 染色体端粒
C 中心体
D 随体
E 鞭毛的基体
C-七-6 关于动力蛋白叙述正确的是（）。
A 动力蛋白具有ATP酶活性
B 动力蛋白以微丝作为运行轨道
C 动力蛋白能将化学能转化为机械能
D 缺乏动力蛋白的人易患上呼吸道感染
E 动力蛋白可参与细胞分裂
细胞增殖及细胞活力检测方法
细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA 的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，
所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。 图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书） 在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。 Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一
Brdu细胞增殖检测实验
Brdu检测细胞增殖实验 实验操作: 孵箱中培养72h（细胞密1．铺细胞，每个3.5cm dish 10万个，在37℃、5%CO 2 度至50-60%左右）。 2．Brdu（5-溴-2′-脱氧尿苷）加入培养细胞中，1mg/ml，标记48h。(量：Brdu 以铺满整个dish底面为准。) 3．固定：PBS洗细胞爬片3次，每次5min，在摇床上晃动清洗，4%PFA固定30min。4．变性：将固定好的细胞爬片用PBS洗3次，每次5min，2mol/L的HCl在37℃条件下变性5min，可放置于37℃恒温孵箱，应用封口膜把培养皿封好。（120r/m）5．中和：0.1mol/L的硼酸钠（PH8.3）中和10min，PBS洗3次，每次5min。（50r/m）6．加入1ml的0.2%TritonX-100，10min。 7．吸出TritonX-100，用PBS洗3次，每次5min。 8．加入1ml 3%的BSA封闭，室温1h，可在摇床上晃动。 9．吸出BSA，用PBS洗3次，每次5min。 10．加一抗（尿嘧啶脱氧核苷Brdu（鼠单抗）1:200），用1%BSA稀释，4度过夜。11．将孵好一抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 12．加二抗（羊抗鼠IgG/Alexa Fluor 594 1: 100），用1%BSA稀释，避光室温孵育1h。（60 r/min） 13．将孵好二抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 14．加DAPI染细胞核，储存浓度为1mg/ml，应将DAPI完全混匀，可用手弹几下，一般稀释比例为1:1000（用PBS稀释），避光室温反应10min。 15．将DAPI染好的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 16．中性树胶封片，荧光显微镜观察，200×镜下取5个视野，计数Brdu阳性细
细胞质+细胞骨架
1. 真核细胞核糖体的大亚基是60S，小亚基是40S，一个完整的核糖体是（）(0.0分) A.50S B.70S C.80S D.90S E.100S 2. 核糖体小亚基的功能是（）(0.0分) A.以上都不是 B.激活转肽酶 C.提供部分tRNA结合部位 D.提供反密码子识别部位 395160E.将mRNA结合到核糖体上 3. 核糖体主要由（）构成(0.0分) 395159A.蛋白质和rRNA B.DNA和RNA C.蛋白质和tRNA D.蛋白质和DNA 4. 下列哪种细胞器的膜上分布有大量的核糖体？ (0.0分) A.过氧化物酶体 B.溶酶体 395158C.粗面内质网 D.滑面内质网 E.高尔基体 5. 核糖体的大、小亚基是在细胞的（）内合成的(0.0分) A.线粒体 395157B. 核仁 C.溶酶体 D.内质网 6. 下列细胞结构中，在光镜下不能观察到的是（）(0.0分) A.高尔基复合体 395156B.核糖体 C. 中心体 D.细胞骨架 7. 真核细胞中核糖体大亚基是由（）组成(0.0分) A.1个23S rRNA、1个5S rRNA 和30多种r蛋白 B.1个23S rRNA、1个5.8S rRNA 和50多种r蛋白 C. 1个28S rRNA、1个5.8S rRNA 和30多种r蛋白 395155D.1个28S rRNA、1个5.8S rRNA、1个5S rRNA和50多种r蛋白 8. 核糖体上肽酰基位点的作用是（）(0.0分) A.接受并结合新掺入的氨酰基-tRNA 395154B.结合延伸中的肽酰基-tRNA C.在肽链延伸过程中催化氨基酸残基之间形成肽键 D. 供给催化肽酰基-tRNA转位时所需的能量 9. 内质网最重要的标志酶是（）(0.0分) 395176A.葡萄糖-6-磷酸酶 B.ATP酶 C.蛋白激酶 D.碱性磷酸酶 E.酸性水解酶 10. 新生肽链的折叠与装配是在下列哪种细胞器内完成的？(0.0分) A.溶酶体 B.粗面内质网 C.高尔基体
细胞培养各种培养基简介
DMEM、RIPA1640、F12、L15等细胞培养基的基本知识 培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。 一、基础培养基 绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM 含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。 在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。 原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。 二、血清 细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在特殊类型的细胞培养中必须提供某些 痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。基础培养基常常要添加血清，血清终浓度多为5~20%。特殊用途的血清来源须用经验确定，广泛应用的血清种类有马血清与胎牛血清。胎牛血清中富含有丝分裂因子，常选其作增殖细胞用的血清，也用于细胞系和原代培养。而马血清常常用来作有丝分裂后的神经元培养。然而，很多人也将胎牛血清
细胞骨架习题及答案
细胞骨架习题及答案 Revised by BLUE on the afternoon of December 12,2020.
第九章细胞骨架 本章要点：本章阐述了细胞骨架的基本涵义、细胞中存在的几种骨架体系的结构、功能及生物学意义。要求重点掌握细胞质骨架的结构及功能。 一、名词解释 1、细胞骨架：细胞骨架(Cytoskeleton)是指存在于真核细胞质内的中的蛋白纤维网架体系。包括狭义和广义的细胞骨架两种概念。广义的细胞骨架包括：细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管和中间纤维。 2、应力纤维：应力纤维是真核细胞中广泛存在的微丝束结构，由大量平行排列的微丝组成，与细胞间或细胞与基质表面的粘着有密切关系，可能在细胞形态发生、细胞分化和组织的形成等方面具有重要作用。 3、微管：在真核细胞质中，由微管蛋白构成的，可形成纺锤体、中心体及细胞特化结构鞭毛和纤毛的结构。 4、微丝：在真核细胞的细胞质中，由肌动蛋白和肌球蛋白构成的，可在细胞形态的支持及细胞肌性收缩和非肌性运动等方面起重要作用的结构。 5、中间纤维：存在于真核细胞质中的，由蛋白质构成的，其直径介于微管和微丝之间，在支持细胞形态、参与物质运输等方面起重要作用的纤维状结构。 6、踏车现象：在一定条件下，细胞骨架在装配过程中，一端发生装配使微管或微丝延长，而另一端发生去装配而使微管或微丝缩短，实际上是正极的装配速度快于负极的装配速度，这种现象称为踏车现象。 7、微管组织中心（MTOC）：微管在生理状态及实验处理解聚后重新装配的发生处称为微管组织中心。动物细胞的MTOC为中心体。MTOC决定了细胞中微管的极性，微管的（-）极指向MTOC，（+）极背向MTOC。 8、胞质分裂环：在有丝分裂末期，两个即将分裂的子细胞之间产生一个收缩环。收缩环是由大量平行排列的微丝组成，由分裂末期胞质中的肌动蛋白装配而成，随着收缩环的收缩，两个子细胞被分开。胞质分裂后，收缩环即消失。 二、填空题 1细胞质骨架__是一种复杂的蛋白质纤维网络状结构，能使真核细胞适应多种形状和协调的运动。 2、肌动蛋白丝具有两个结构上明显不同的末端，即__正极___极和__负极___极。 3、在动物细胞分裂过程中，两个子细胞的最终分离依赖于质膜下带状肌动纤维束和肌球蛋白分子的活动，这种特殊的结构是___收缩环__。 4、小肠上皮细胞表面的指状突起是_微绒毛____，其中含有__微丝___细胞质骨架成分。 5、微管由__微管蛋白___分子组成的，微管的单体形式是___α微管蛋白和β微管蛋白__组成的异二聚体。 6、基体类似于__中心粒___，是由9个三联微管组成的小型圆柱形细胞器。 7、驱动囊泡沿着轴突微管从细胞体向轴突末端单向移动的蛋白质复合物是__驱动蛋白___。 8、细胞骨架普遍存在于真核细胞中，是细胞的支撑结构，由细胞内的蛋白质成分组成。包括微管、微丝和中间纤维三种结构。
第九章_细胞骨架习题及答案
第九章细胞骨架 本章要点：本章阐述了细胞骨架的基本涵义、细胞中存在的几种骨架体系的结构、功能及生物学意义。要求重点掌握细胞质骨架的结构及功能。 一、名词解释 1、细胞骨架：细胞骨架(Cytoskeleton)是指存在于真核细胞质内的中的蛋白纤维网架体系。包括狭义和广义的细胞骨架两种概念。广义的细胞骨架包括：细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管和中间纤维。 2、应力纤维：应力纤维是真核细胞中广泛存在的微丝束结构，由大量平行排列的微丝组成，与细胞间或细胞与基质表面的粘着有密切关系，可能在细胞形态发生、细胞分化和组织的形成等方面具有重要作用。 3、微管：在真核细胞质中，由微管蛋白构成的，可形成纺锤体、中心体及细胞特化结构鞭毛和纤毛的结构。 4、微丝：在真核细胞的细胞质中，由肌动蛋白和肌球蛋白构成的，可在细胞形态的支持及细胞肌性收缩和非肌性运动等方面起重要作用的结构。 5、中间纤维：存在于真核细胞质中的，由蛋白质构成的，其直径介于微管和微丝之间，在支持细胞形态、参与物质运输等方面起重要作用的纤维状结构。 6、踏车现象：在一定条件下，细胞骨架在装配过程中，一端发生装配使微管或微丝延长，而另一端发生去装配而使微管或微丝缩短，实际上是正极的装配速度快于负极的装配速度，这种现象称为踏车现象。 7、微管组织中心（MTOC）：微管在生理状态及实验处理解聚后重新装配的发生处称为微管组织中心。动物细胞的MTOC为中心体。MTOC决定了细胞中微管的极性，微管的（-）极指向MTOC，（+）极背向MTOC。 8、胞质分裂环：在有丝分裂末期，两个即将分裂的子细胞之间产生一个收缩环。收缩环是由大量平行排列的微丝组成，由分裂末期胞质中的肌动蛋白装配而成，随着收缩环的收缩，两个子细胞被分开。胞质分裂后，收缩环即消失。 二、填空题 1细胞质骨架__是一种复杂的蛋白质纤维网络状结构，能使真核细胞适应多种形状和协调的运动。 2、肌动蛋白丝具有两个结构上明显不同的末端，即__正极___极和__负极___极。 3、在动物细胞分裂过程中，两个子细胞的最终分离依赖于质膜下带状肌动纤维束和肌球蛋白分子的活动，这种特殊的结构是___收缩环__。 4、小肠上皮细胞表面的指状突起是_微绒毛____，其中含有__微丝___细胞质骨架成分。 5、微管由__微管蛋白___分子组成的，微管的单体形式是___α微管蛋白和β微管蛋白__组成的异二聚体。 6、基体类似于__中心粒___，是由9个三联微管组成的小型圆柱形细胞器。 7、驱动囊泡沿着轴突微管从细胞体向轴突末端单向移动的蛋白质复合物是__驱动蛋白___。 8、细胞骨架普遍存在于真核细胞中，是细胞的支撑结构，由细胞内的蛋白质成分组成。包括微管、微丝和中间纤维三种结构。 9、中心体由 2 个相互垂直蛋白排列的圆筒状结构组成。结构式为 9×3+0 。主要功能是与细胞的分裂和运动有关。 10、在癌细胞中，微管数量减少，不能形成束状。在早老性痴呆患者脑组织细胞中微管大量变形。 三、选择题1、D；2、D；3、E；4、C；5、A；6、B；7、C；8、B；9、A； 1、细胞骨架是由哪几种物质构成的（）。 A、糖类 B、脂类 C、核酸 D、蛋白质 E.以上物质都包括 2.下列哪种结构不是由细胞中的微管组成（）。 A、鞭毛 B、纤毛 C、中心粒 D、内质网 E、以上都不是 3.关于微管的组装，哪种说法是错误的（）。 A、微管可随细胞的生命活动不断的组装与去组装 B、微管的组装分步进行 C、微管的极性对微管的增长有重要意义
细胞增殖MTT检测经验总结
细胞增殖检测：MTT实验经验总结 MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。 MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 一、步骤 1、接种细胞 用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。 2、培养细胞 同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3、呈色 培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。 4、比色 选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 二、注意事项 1、选择适当得细胞接种浓度。 2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。 3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。 MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系， IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！ 三、举例 各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：
细胞骨架答案
第七章细胞骨架 一、填空题 A-七-1.细胞骨架是指存在于真核细胞中的蛋白纤维网架体系，狭义的骨架系统主要包括微丝、微管和中间丝。 A-七-2. 构成微管的蛋白有两类：α微管蛋白和β微管蛋白。 A-七-3. 微管在细胞中有三种存在形式：单管、二联管和三联管，其中主要分布在纤毛和鞭毛杆状部位的是二联管。 A-七-4. 装配时具有“踏车现象”的细胞骨架是微丝和微管。 A-七-5. 紫杉醇是作用于微管的特异性药物，而鬼笔环肽是作用于微丝的特异性药物。 A-七-6.微丝的基本组成单位是肌动蛋白，其在细胞中也有两种存在方式：①球状肌动蛋白②纤丝状肌动蛋白。 A-七-7. 在细胞骨架系统中较为稳定的一种骨架纤维是中间纤维。 A-七-8.中间纤维蛋白分子八聚体之间在纵向端对端首尾相连组成一条原纤维，四条原纤维侧向相互作用最终形成中间纤维。 A-七-9. 细胞骨架中具有极性的为微丝和微管。 B-七-10. 鞭毛和纤毛内部是由微管组成的轴丝构成的结构。其基部的结构式为__三联管__，而其杆部的结构式为二联管。 B-七-11. 微管是由异二聚体组装成的 13 条原丝依靠共价键排列而成。一些药物如__秋水仙素__可以抑制微管的组装。 B-七-12. 秋水仙素是作用于微管的特异性药物，破坏纺锤体的形成，使细胞停滞在分裂中期。 B-七-13. 细胞中微管组织中心包括中心体、纤毛和鞭毛的基体。 B-七-14. 微管在体内装配时，微管的_负极_附着在微观组织中心上而受保护，因此在细胞内微管的延长或缩短变化大多发生在另外一端。 ？B-七-15. 纺锤体微管包括动粒微管和。 B-七-16. 马达蛋白可分为三个不同的家族，其中驱动蛋白家族和动力蛋白家族以微管作为运行轨道，而肌球蛋白家族以肌动蛋白纤维作为运行轨道。
细胞增殖实验(MTT assay)
MTT实验 一．实验原理 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm(可参比630nm)波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）二．溶液配制 将MTT粉末用PBS配制成5mg/ml的储液，0.22μm的小滤头过滤除菌后，分装到灭菌的EP管中1ml/管，-20℃避光保存；使用时，将其用DMEM+10%FBS的培养基稀释10倍至终浓度0.5mg/ml进行细胞活性试验测定。 三．实验步骤 1.细胞的准备：选择接近对数期生长的细胞，胰酶消化终止后，离心沉淀细胞去上清， 正常培养基重新悬浮细胞；细胞计数板计数，对MDA-MB-231细胞，利用培养基将细胞浓度调整至20000个/ml，然后利用八连排移液器，依次取100μL细胞悬液加入96孔板中，此时每孔的细胞数约为2000个，根据实验的组数及需要测定的天数接种适当的孔数和板数，通常每个实验组设置3-6个重复。 2.细胞的培养与处理：当进行加药处理时，通常选择接种12h后，进行首次细胞活性 测定，作为本底值；同时将相应的实验组加入对应的处理，根据药物作用时间选择合适的点进行选择时间进行细胞的活性测定。（在进行TGF-beta对细胞增殖的抑制试验时，选择5ng/ml的TGF-beta持续处理4d，并每天选择一块板进行测量，来绘制细胞的增值曲线；实验中注意根据细胞的生长状况选择两天换液一次。） 3.MTT的反应与结晶的生成：测定时，先将MTT原液用DMEM+10%FBS的培养基 稀释至工作浓度0.5mg/ml，然后用移液器吸出原来的培养基，每孔加入含 0.5mg/ml MTT的培养基；37℃，5%CO2条件下，继续对细胞培养3-5h，待结 晶的生成。 4.结晶的溶解及吸光值测定：结晶生成后，轻轻吸出原培养基，加150μLDMSO溶解， 室温轻轻震荡5min，以保证结晶完全溶解；迅速取出96孔板，在酶联免疫检测仪，选择波长490nm测定每孔的吸光值。 5.根据实验设置的需要，每隔一定时间重复测定细胞的活性，收集数据；同时进行重复 实验，以保证结果的准确性。
细胞cck 检测实验
细胞增殖-毒性实验步骤 1、细胞复苏、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤： 实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂[细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、胎牛血清（FBS）、双抗]，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。 1）从液氮中取出细胞株,37-40℃温水迅速复苏，常规培养于含10%FBS、80U/ml 青霉素及0.08mg/ml链霉素的培养基中，放入３７℃、５％ＣＯ２、饱和湿度的培养箱中培养，每２天换液１次。 2）倒去培养瓶内的培养液； 3）加入PBS2ml洗涤培养瓶内细胞2次； 4）加入胰酶500ul/0.5ml2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）； 5）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶；6）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜； 7）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm3分钟，倒去上清液； 8）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液； 9）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数； CCK-8实验： 10）在96孔板中，给每孔加100μL（约10000个细胞）的细胞悬液，每组设５个复孔，将培养板放在培养箱预培养24-72小时（37℃，5%CO2），使细胞贴壁；11）向培养板中加入100ul含药物培养基 12）将培养板在培养箱干预24、48、72ｈ后，每孔加入20ulCCK-8液，在培养箱继续培养0.5-２ｈ，酶标仪检测450nm处吸光值（A），计算抑制率 抑制率＝（阴性对照A值－二甲双胍各浓度A值）／阴性对照A值×100% 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 13）若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下24小时内测定，吸光度不会发生变化。 CCK8对照组的设置及测定的注意事项
MTS细胞增殖检测方法
MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒 产品组成： 产品编号BB-4204-1 BB-4204-2 BB-4204-3 规格250 assays 500 assays 1000 assays MTS溶液 2.5ml 5ml 10ml 产品简介： BestBio贝博MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒是应用新型的水溶性甲臢化合物[3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（金翁），内盐；MTS]快速高灵敏度检测细胞增殖和细胞毒性的比色检测产品。 MTS被细胞生物还原成一种可溶于组织培养基的甲臢化合物，新陈代谢活跃的活细胞内的脱氢酶类将MTS转化成液态可溶的甲臢化合物，这种甲臢化合物在490nm的吸收值可以直接在96孔板上测量，而不需要另外作处理。由490nm测量的吸收值所表示的甲臢产物的数量与培养物中活性细胞的数量成正比。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数量呈线性关系。 活性测定使用方法： 1、收集细胞，加细胞悬液100ul（约5000-10000个细胞）到96孔板（边缘孔用无菌水或PBS填充）。每板设对照（加100 l培养基）。 2、置37℃，5% CO2孵育过夜，倒置显微镜下观察。 3、每孔加入10 ul 待检测药物溶液， 37℃孵育。 4、每孔加入10 ul MTS溶液，37℃孵育1-4 小时。 5、测定490 nm各孔的吸光值。 5、同时设置空白孔（培养基和MTS溶液，无细胞），对照孔（不加药培养基和MTS溶液，有细胞），每组设定3-5复孔。 结果分析 ： 细胞活力计算： 将各测试孔的OD值减去调零孔OD值或对照孔OD值。各重复孔的OD值取平均数。 细胞活力% =（加药细胞OD-空白OD/对照细胞OD-空白OD）×100 数量测定使用方法： 1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。 2、按比例(例如：1/2比例) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5 个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。 3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加MTS试剂培养一定时间后测定O.D值， 制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，O.D值为纵坐标(Y轴) 的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入MTS后的培养时间)。
细胞骨架
第九章细胞骨架 选择题： 1.细胞骨架是由哪几种物质构成的 A.糖类 B.脂类 C.核酸 D.蛋白质 E.以上物质都包括 2.下列哪种结构不是由细胞中的微管组成 A.鞭毛 B.纤毛 C.中心粒 D.内质网 E.以上都不是 3.关于微管的组装，哪种说法是错误的 A.微管可随细胞的生命活动不断的组装与去组装 B.微管的组装分步进行 C.微管的极性对微管的增长有重要意义 D.微管蛋白的聚合和解聚是可逆的自体组装过程 E.微管两端的组装速度是相同的 4.在电镜下可见中心粒的每个短筒状小体 A.由9组二联微管环状斜向排列 B.由9组单管微管环状斜向排列 C.由9组三联微管环状斜向排列 D.由9组外围微管和一个中央微管排列 E.由9组外围微管和二个中央微管排列 5.组成微丝最主要的化学成分是 A.球状肌动蛋白 B.纤维状肌动蛋白 C.原肌球蛋白 D.肌钙蛋白 E.锚定蛋白 6.能够专一抑制微丝组装的物质是 A.秋水仙素 B.细胞松弛素B C.长春花碱 D.鬼笔环肽 E.Mg+ 7.在非肌细胞中，微丝与哪种运动无关 A.支持作用 B.吞噬作用 C.主动运输 D.变形运动 E.变皱膜运动 8.对中间纤维结构叙述错误的是 A.直径介于微管和微丝之间 B.为实心的纤维状结构 C.为中空的纤维状结构 D.两端是由氨基酸组成的化学性质不同的头部和尾部 E.杆状区为一个由310个氨基酸组成的保守区 9.在微丝的组成成分中，起调节作用的是 A.原肌球蛋白 B.肌球蛋白 C.肌动蛋白 D.丝状蛋白 E.组带蛋白 10.下列哪种纤维不属于中间纤维 A.角蛋白纤维 B.结蛋白纤维 C.波形蛋白纤维 D.神经丝蛋白纤维 E.肌原纤维 对应题 A.微管 B.微丝 C.微梁网格 D.微粒 E.核骨架 11.鞭毛和纤毛的主要成分是 12.主要由肌球蛋白和肌动蛋白构成的结构是 13.与染色质包装有关的结构是 14.对游离核糖体有支持作用的是 15.可被秋水仙素抑制的结构是 16.可被细胞松弛素B破坏的结构是 A.单管 B.二联管 C.三联管 D.四联管 E.中央管
细胞增殖实验word版
细胞增殖检测方法 细胞增殖检测通常是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化。目前细胞增殖检测主要分为五类：DNA合成检测、代谢活性检测、细胞数量检测、细胞增殖相关抗原检测和ATP 浓度检测。在这些方法中作何选择，主要取决于所研究的细胞类型和研究方案。 1.DNA合成检测 这是目前实验室中检测细胞增殖最准确可靠的方式。该法是将放射性标记的3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育，这样新增殖细胞的DNA中就会掺入放射性标记，经洗脱后可用闪烁计数器检测。该方法耗时长，而且有个明显的弊端就，即使用和处理放射性物质既麻烦又不安全。不过，可以使用5-溴-2-脱氧尿苷BrdU来进行类似实验，因为BrdU也同样可以掺入到新合成的DNA中。但这样就需要进行额外的实验步骤，先孵育特异性BrdU单抗和带标记的二抗，然后再进行比色法、化学发光检测或荧光信号检测等步骤。该方法的优点就是不再需要放射性物质。BrdU标记很适合免疫组化IHC、免疫细胞化学IC、细胞内ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。 2.代谢活性检测 检测细胞群体的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。在细胞增殖过程中脱氢酶的活性会增加，因此其底物四唑盐或Alamar Blue在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。可以通过低配置或高配置的分光光度计和酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。 四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS和WST1。MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶体需要溶解在DMSO或者异丙醇中。因此，MTT 主要作为终点检测方法。其他三种盐与Alamar Blue一样，都是可溶且无毒。它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。其中XTT的效率较低，需要添加额外的因子；WST1更灵敏有效，与其他盐相比能够更快显色；Alamar Blue 的灵敏度也很高，只要微孔板的孔中有100个细胞就能够检测到。四唑盐和Alamar Blue氧化还原染料能够用于多种仪器和高通量研究，非常方便。它们适用的检测仪器包括：标准分光光度计、
细胞增殖检测MTT法
细胞增殖检测：MTT法 MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO 来溶解。 MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 一、步骤 1、接种细胞 用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。 2、培养细胞 同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3、呈色 培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。 4、比色
选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 二、注意事项 1、选择适当得细胞接种浓度。 2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。 3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。 MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系， IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！ 三、举例 各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式： Pm=0.95 Pn=0.06 P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1 lgI=lg0.1/0.01=1 lgIC50=-1-1*（3.1-（3-0.95-0.06）/4）=-3.6025 IC50=0.00025
Brdu细胞增殖检测实验
B r d u细胞增殖检测实验 Document serial number【LGGKGB-LGG98YT-LGGT8CB-LGUT-
Brdu检测细胞增殖实验 实验操作: 1．铺细胞，每个 dish 10万个，在37℃、5%CO2孵箱中培养72h（细胞密度至50-60%左右）。 2．Brdu（5-溴-2′-脱氧尿苷）加入培养细胞中，1mg/ml，标记48h。(量：Brdu以铺满整个dish底面为准。) 3．固定：PBS洗细胞爬片3次，每次5min，在摇床上晃动清洗，4%PFA固定30min。4．变性：将固定好的细胞爬片用PBS洗3次，每次5min，2mol/L的HCl在37℃条件下变性5min，可放置于37℃恒温孵箱，应用封口膜把培养皿封好。（120r/m）5．中和：L的硼酸钠（）中和10min，PBS洗3次，每次5min。（50r/m） 6．加入1ml的%TritonX-100，10min。 7．吸出TritonX-100，用PBS洗3次，每次5min。 8．加入1ml 3%的BSA封闭，室温1h，可在摇床上晃动。 9．吸出BSA，用PBS洗3次，每次5min。 10．加一抗（尿嘧啶脱氧核苷Brdu（鼠单抗）1:200），用1%BSA稀释，4度过夜。11．将孵好一抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 12．加二抗（羊抗鼠IgG/Alexa Fluor 594 1: 100），用1%BSA稀释，避光室温孵育 1h。（60 r/min） 13．将孵好二抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 14．加DAPI染细胞核，储存浓度为1mg/ml，应将DAPI完全混匀，可用手弹几下，一般稀释比例为1:1000（用PBS稀释），避光室温反应10min。 15．将DAPI染好的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。
细胞骨架习题及答案
第九章细胞骨架本章要点：本章阐述了细胞骨架的基本涵义、细胞中存在的几种骨架体系的结构、功能及生物学意义。要求重点掌握细胞质骨架的结构及功能。 一、名词解释 1、细胞骨架：细胞骨架(Cytoskeleton)是指存在于真核细胞质内的中的蛋白纤维网架体系。包括狭义和广义的细胞骨架两种概念。广义的细胞骨架包括：细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管和中间纤维。 2、应力纤维：应力纤维是真核细胞中广泛存在的微丝束结构，由大量平行排列的微丝组成，与细胞间或细胞与基质表面的粘着有密切关系，可能在细胞形态发生、细胞分化和组织的形成等方面具有重要作用。 3、微管：在真核细胞质中，由微管蛋白构成的，可形成纺锤体、中心体及细胞特化结构鞭毛和纤毛的结构。 4、微丝：在真核细胞的细胞质中，由肌动蛋白和肌球蛋白构成的，可在细胞形态的支持及细胞肌性收缩和非肌性运动等方面起重要作用的结构。 5、中间纤维：存在于真核细胞质中的，由蛋白质构成的，其直径介于微管和微丝之间，在支持细胞形态、参与物质运输等方面起重要作用的纤维状结构。 6、踏车现象：在一定条件下，细胞骨架在装配过程中，一端发生装配使微管或微丝延长，而另一端发生去装配而使微管或微丝缩短，实际上是正极的装配速度快于负极的装配速度，这种现象称为踏车现象。 7、微管组织中心（MTOC）：微管在生理状态及实验处理解聚后重新装配的发生处称为微管组织中心。动物细胞的MTOC为中心体。MTOC决定了细胞中微管的极性，微管的（-）极指向MTOC，（+）极背向MTOC。 8、胞质分裂环：在有丝分裂末期，两个即将分裂的子细胞之间产生一个收缩环。
EDU-细胞增殖检测
荧光显微镜检测方法(以96孔板，A549贴壁细胞为例) 细胞培养 取对数生长期细胞，以每孔4×103~1×105细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。 药物处理 (可选)客户可以根据实验需要进行各种药物处理。 EdU标记 1.1 用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU培养基； 注：1)EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育(<2h)宜采用高浓度(10~50 μM)，长时间孵育(>24h)宜采用低浓度(1~10μM)； 2)如果需配置10μM EdU培养基，需调整为5000：1稀释比例； 3)配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质。 表1 EdU培养基及染色反应液的使用量参考 注：1)*表示贴壁细胞通常采用的培养容器，EdU培养基与染色反应液用量以覆盖细胞为宜； 2)悬浮细胞EdU用量依据培养体积而定。 1.2 每孔加入100μL 50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基； 注：1)最佳孵育时间与细胞周期相关(表2)，大多数细胞系均可采用2小时孵育时间； 2)EdU培养基用量以没过细胞为宜，但需要保证EdU孵育时间内的营养物质持续供给(表1)； 1.3 PBS清洗细胞1~2次，每次5分钟。 注：清洗目的是将未渗入DNA的EdU洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁不牢的细胞请降低清洗强度。 表2 EdU孵育时间设定参考
注：1)EdU孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的1/10至1/5，但大多数细胞系均可采用2h孵育时间。孵育时间越长，细胞增殖数量就越多； 2)*考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响，具体实验的细胞群体细胞周期会有所变化。 表3细胞实验EdU孵育浓度及时间参考 注：如果您有采用BrdU进行实验的经验，可以参照BrdU实验的相关参数进行EdU实验。细胞固定化 2.1 每孔加入50μL 细胞固定液(即含4% 多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟，弃固定液；注：1)低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持，当需要抗体染色时，需采用Triton X-100透化细胞以利于抗体进入细胞内。 2)可采用其他方式进行细胞固定。 2.2 每孔加入50μL 2 mg/mL 甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；
WST-1细胞增殖检测方法
WST-1细胞增殖、细胞毒性检测试剂盒 产品组成： 产品编号BB-4203-1 BB-4203-2 BB-4203-3 规格250 assays 500 assays 1000 assays WST-1溶液 2.5ml 5ml 10ml 产品简介： WST-1是广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂。WST-1是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。WST-1是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-1和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-1产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。再次，WST-1比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-1和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测等。WST-1使用时无须同位素，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外步骤去溶解formazan。WST-1对细胞无明显毒性。加入WST-1显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间。 图1、WST-1检测原理图 (EC=electron coupling reagent，即电子耦合试剂) 使用方法： 1、加细胞悬液100ul（约5000-10000个细胞）到96孔板（边缘孔用无菌水或PBS填 充）。每板设对照（加100 l培养基）。 2、置37℃，5% CO2孵育过夜，倒置显微镜下观察。 3、每孔加入10 ul 待检测药物溶液， 37℃孵育。 4、每孔加入10 ul WST-1溶液，37℃孵育1-4 小时。 5、测定450 nm各孔的吸光值，如无450nm滤光片，可以使用430-480nm的滤光片。 5、同时设置空白孔（培养基和WST-1溶液，无细胞），对照孔（不加药培养基和WST-1 溶液，有细胞），每组设定3-5复孔。