DNA印迹原理

DNA印迹原理：用合适的限制性内切酶消化DNA，电泳分离DNA片段，利用毛细作用，使液体经过凝胶，使DNA片段由液流携带而从凝胶转移并结合在固体支持物表面（NCM），然后进行杂交。作用：检测待定基因的大小、拷贝数、变异等。

步骤：DNA的抽提、质量检测；限制性内切酶操作；DNA的琼脂糖凝胶电泳分离、0.4N NaOH 变性；转膜（毛细管渗吸或电转移）；80℃处理或紫外线照射将DNA固定在膜上；探针制备、检测等。

应用/意义：①特定基因定性定量检测；②基因突变分析；③酶切图谱分析；④基因重排和丢失检测。

Northern blotting

步骤：RNA(mRNA)提取，限制性内切酶消化，变性凝胶电泳分离RNA片段，转膜，预杂交，杂交，放射自显影。应用：RNA的定性定量研究，mRNA表达高低，癌基因、抑癌基因活化。补充：

southwestern blotting：该方法结合了western blot和Southern blot两种试验方法而发展起来的检测与特意DNA序列相结合的DNA结合蛋白的方法。基本原理：细胞核蛋白提取物经过SDS-PAGE后，转移至NCM上，然后用标记的DNA探针检测转移至膜上的蛋白质。Immunochemistry：基本原理：应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞或组织中多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。

PCR基本工作原理？反应三步骤？应用？在医学上具体应用？成败的关键因素？

PCR聚合酶链反应：又叫无细胞分子克隆、体外基因扩增技术。利用人工合成的一对引物，在被扩增DNA模板链的两端形成双链，由DNA聚合酶催化一对引物之间的聚合反应。PCR基本原理：是以体外酶促反应的方式，模拟天然的DNA复制过程。以待扩增DNA片段为模版，根据其5’-3’端的核苷酸顺序，设计一对与之互补的寡核苷酸为引物，模版DNA高温变性解链，低温退火，引物与摸板DNA单链的互补顺序结合，中温条件下，通

过Taq DNA聚合酶作用，以四种dNTP为原料，单链DNA模版逐步延伸，合成新的DNA 互补链。这样的三步反应为一个周期，每一周期产物又可作为新模板进行新的合成反应。n 次循环后，拷贝数增加2n倍。一般经过25~30个循环，拷贝数可扩增上百万倍。经过电泳、染色，可直接观察待测基因存在与否，不需要与基因探针分子杂交。常见几种PCR：逆转录PCR（RT-PCR）；巢式 PCR；RACE；反向PCR；定量PCR--real time PCR；半定量PCR。 PCR 的基本反应步骤：高温变性、低温退火、中温延伸。

①高温变性：将双链DNA加热（95℃）使之变性，DNA双链变成单链；

②低温退火/复性：降低温度至37~56℃（Tm-5℃）使引物与模板DNA单链结合；

③中温延伸：将温度升至72℃，Taq DNA聚合酶以dNTP为底物，催化合成一条与模板互补的新链（在引物3’端进行延伸），使原模板DNA的一条链变成两条链。

PCR应用：扩增基因，cDNA文库及筛选，直接测序，染色体特异区带片段克隆，检测突变，简并引物扩增未知序列，标记探针。

医学上具体应用：病原体的检测，遗传病基因诊断，肿瘤相关基因诊断，组织配型，法医、亲子鉴定。成败的关键因素：

实时PCR/荧光定量PCR？原理？优点？与普通PCR的不同及优势？ Realtime PCR/实时PCR/荧光定量PCR：是在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对位未知的模板进行定量分析的方法。原理： 1、在Taqman 寡核苷酸探针的5’端标记一个报告荧光染料，3’端标记一个猝灭染料。当光源照射到探针时，被激活的报告荧光染料发射的荧光信号被猝灭染料吸收→不发光。

2、PCR产物扩增时，Taq酶遇到了结合在模板上的Taqman寡核苷酸探针，其5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，荧光报告染料与猝灭染料分离，荧光共振能量转移不再发生，报告荧光发射的荧光强度与被切掉的

探针成正比。实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，由此可以计算PCR产物的含量。

3、如果用相同模板量的不同样本进行Taqman PCR扩增时，相同时间分析荧光强度可以发现产物含量的差异，这实际上是基因模板含量不同所致，由此可以推测基因拷贝数的变化情况。

优点：准确定量结果；特异性更高；闭管操作防止污染；全自动化反应、数据收集和分析；无需凝胶电泳；高通量；阳性内参照防止假阴性结果。

基因治疗的主要策略？步骤？基因治疗：是指从DNA水平所采取的一切治疗措施和新技术。例如向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷；或采用特定方式关闭、抑制异常表达的基因从而达到治疗的目的。

途径：生殖细胞基因治疗（存在伦理学障碍，不考虑人类）；体细胞基因治疗（主要是转基因治疗）。主要策略：

1、基因标记：解决：①外源基因能否安全转移到患者体内；②从患者体内取出的细胞能否检测到转移基

因的存在。

2、基因置换/矫正：将特定目的基因导入特定细胞，通过定位重组或同源重组纠正缺陷基因或异常序列。

3、基因添加：导入外源基因，使靶细胞表达其本身不表达的基因。

4、基因干预：是指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治

疗疾病的目的。基因干预的主要方法：①反义RNA；②RNAi；③核酶裂解特异的靶mRNA；

④三链DNA。

基因治疗的步骤：①克隆治疗基因；②选择合适靶细胞；③通过载体将治疗基因导入靶细胞；

④目的基因在受体细胞内的有效表达。

癌基因？抑癌基因？激活机制？癌基因与肿瘤发生的关系？

癌基因：细胞基因组中具有能使正常细胞发生恶性转化的基因，称为癌基因。癌基因是细胞内控制细胞生长的基因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性，在癌基因异常表达时，其产物可使细胞无限分裂。抑癌基因/抗癌基因/肿瘤易感基因/隐性癌基因：是指存在于正常细胞内的一大类可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因。当这类基因发生突变、缺失或失活时，可引起细胞恶性转化而导致肿瘤发生。

在正常细胞的增殖调控信号中，原癌基因起正调控作用，抑癌基因起负调控作用，抑制细胞增殖，促进细胞成熟，朝向终末分化和凋亡，维持基因稳定。原癌基因激活机制：

1. 原癌基因点突变：原癌基因的表达产物多有促进细胞增殖的功能，当点突变发生后：①该蛋白质的活性可大大增强，对细胞增殖的刺激作用也增强；②该蛋白质的稳定性可能增加，导致其在胞内浓度增加，对增殖刺激的时间和强度也随之增加；③可能会引起RNA的错误剪接而改变蛋白质的结构与功能。

2. 原癌基因获得启动子与增强子；

3. 原癌基因扩增：原癌基因通过某些机制在原染色体上复制出多个拷贝→表达产物异常增多→加速细胞增殖。

4. 原癌基因移位或重排：癌基因从所在染色体的正常位置易位到另一染色体的某一位置上，使其调控环境发生改变，从相对静止状态转为激活状态。

基因工程的操作过程？/重组DNA技术的基本步骤？意义？分—切--接—转—筛。 1、目的基因和载体的分离纯化：

目的基因的获取：化学合成法、基因组DNA文库、cDNA文库、PCR。

载体：质粒、噬菌体、病毒三大类载体均经人工构建，除去致病基因，有筛选标志、单一限制酶切点. 2、目的基因和载体的切断：通常用限制性核酸内切酶分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组. 3、重组DNA连接：目的基因与载体连接，构建重组DNA分子：①粘性末端连接：同一种限制酶酶切目的基因和载体，产生相同粘性末端，DNA连接酶将两者连接。②平头末端连接：T4 DNA连接酶。两个具有平头末端的双链DNA分子链接。问题：低效率、串珠现

象。若要提高平末端DNA分子连接的效率：加入大分子凝聚剂、加大连接酶的量；

③同聚物加尾法：末端转移酶TTE。在载体及外源双链DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸，制成人

工粘性末端，然后在DNA连接酶作用下连接成为重组DNA分子；

④人工接头连接法：合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割，产生粘性末端→连接。 4、重组DNA导入宿主细胞进行增殖和表达/重组DNA的转化和扩增。

受体为细菌时---电击法、热击法（氯化钙）；受体为真核生物时----电击法、基因枪、显微注射法。导入的类型：①转化transformation：以质粒作载体的重组体导入受体细胞的过程。

②转染transfectim：以病毒作载体……。③转导conduction：以噬菌体作载体……

5、重组DNA的筛选与鉴定：筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法：①平板筛选：插入失活筛

选、蓝白斑筛选；②限制酶切图谱筛选；③ PCR筛选；④原位杂交技术。 6、受体细胞中目的基因的功能表达，表达产物的检测和分离纯化。

意义：填平了生物种属间不可逾越的鸿沟；缩短了生物进化的时间；使人们能够对生物进行定向改造。举例说明两种重组DNA转化的方法？

1、基因枪转化/微粒轰击法：外源基因导入组织或细胞的一种物理学转化方法。将载有外源基因的μm或

亚微米级的金属微粒（钨或金粉）加速，高速轰击并射入受体靶细胞的方法。

2、电击法/电穿孔转化：利用高压电脉冲的电激作用将外源基因导入细胞的转化方法。

3、显微注射法：在显微镜下将DNA经同细胞玻璃针直接注入细胞，该法适用于各种培养生长的细胞，但

需要一定设备和操作技巧。补充：常用工具酶：

限制性内切酶II型：仅需要Mg2+作为催化反应的辅助因子（I,III型需要Mg2+，A TP，SAM）。能识别由4~6个核苷酸组成的特定核苷酸序列（即限制性内切酶的识别序列/位点），并在识别序列切割DNA分子。这些识别序列的共同特点是具有双螺旋对称结构。II型限制性内切酶不具有甲基化修饰活性（这一功能由相应的修饰酶承担）（I,III型有甲基化酶活性，兼具修饰、切割功能）。有一些来源不同的限制性内切酶能识别同样的核苷酸序列，这类酶称为同裂酶。产生同样的切割，形成同样的末端。有一些酶虽然来源各异，识别的核苷酸序列也不相同，但能产生相同的粘性末端，称为同尾酶。由同尾酶切割产生的DNA片段，是可以通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的---在基因工程操作中有重要价值。

DNA聚合酶：能将脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合。 DNA pol I：5’-3’聚合活性、5’-3’外切活性（被前者抑制）、3’-5’外切活性。用途：探针标记；补平3’末端。 Klenow大片段酶：DNA聚合酶I的水解产物之一，保留了5’-3’聚合活性、3’-5’外切活性。 T7DNA聚合酶：有很强的聚合能力，聚合长度比其他聚合酶大得多。

DNA连接酶：将来源不同的DNA片段连接并封闭起来组成新的重组DNA分子。催化连接反应时，需要一条DNA链3’末端有一游离羟基（-OH），另一条DNA链5’末端有一个磷酸基团（-P），这样相邻的3’-OH与5’-P之间可形成3’-5’磷酸二酯键。吸能反应，需要NAD或ATP提供能量。只能封闭缺口（nick，失去磷酸二酯键），不能封闭缺口（gap，失去一个或数个核苷酸而形成的单链断裂）。 T4 DNA连接酶较大肠杆菌DNA连接酶更常用，即可催化粘性末端连接，又可催化平头末端连接。

逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶；RNA指导的DNA聚合酶。使用最为普遍的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒AMV的逆转录酶。主要用途：cDNA合成；制备杂交探针。

T4多核苷酸激酶：催化ATP的γ-磷酸转移到DNA或RNA的5’-OH末端。可用于探针标记DNA的5’末端，还可用于使缺失5’-P末端的DNA发生磷酸化作用。

TTE末端转移酶：5’-3’聚合活性，当反应体系仅有一种dNTP时，可形成3’末端同聚物尾巴。 APE碱性磷酸酶：切除末端磷酸基团。使5’-P →5’-OH。

标记探针：5’-P 通过APE变成5’-OH，再通过T4多核苷酸激酶，变为5’-P（标记）。 分析一个基因的功能，你认为可以从那几方面着手？采用哪些方法？

象。若要提高平末端DNA分子连接的效率：加入大分子凝聚剂、加大连接酶的量；

③同聚物加尾法：末端转移酶TTE。在载体及外源双链DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸，制成人

工粘性末端，然后在DNA连接酶作用下连接成为重组DNA分子；

④人工接头连接法：合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割，产生粘性末端→连接。 4、重组DNA导入宿主细胞进行增殖和表达/重组DNA的转化和扩增。

受体为细菌时---电击法、热击法（氯化钙）；受体为真核生物时----电击法、基因枪、显微注射法。导入的类型：①转化transformation：以质粒作载体的重组体导入受体细胞的过程。

②转染transfectim：以病毒作载体……。③转导conduction：以噬菌体作载体……

5、重组DNA的筛选与鉴定：筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法：①平板筛选：插入失活筛

选、蓝白斑筛选；②限制酶切图谱筛选；③ PCR筛选；④原位杂交技术。 6、受体细胞中目的基因的功能表达，表达产物的检测和分离纯化。

意义：填平了生物种属间不可逾越的鸿沟；缩短了生物进化的时间；使人们能够对生物进行定向改造。举例说明两种重组DNA转化的方法？

1、基因枪转化/微粒轰击法：外源基因导入组织或细胞的一种物理学转化方法。将载有外源基因的μm或

亚微米级的金属微粒（钨或金粉）加速，高速轰击并射入受体靶细胞的方法。

2、电击法/电穿孔转化：利用高压电脉冲的电激作用将外源基因导入细胞的转化方法。

3、显微注射法：在显微镜下将DNA经同细胞玻璃针直接注入细胞，该法适用于各种培养生长的细胞，但

需要一定设备和操作技巧。补充：常用工具酶：

限制性内切酶II型：仅需要Mg2+作为催化反应的辅助因子（I,III型需要Mg2+，A TP，SAM）。能识别由4~6个核苷酸组成的特定核苷酸序列（即限制性内切酶的识别序列/位点），并在识别序列切割DNA分子。这些识别序列的共同特点是具有双螺旋对称结构。II型限制性内切酶不具有甲基化修饰活性（这一功能由相应的修饰酶承担）（I,III型有甲基化酶活性，兼具修饰、切割功能）。有一些来源不同的限制性内切酶能识别同样的核苷酸序列，这类酶称为同裂酶。产生同样的切割，形成同样的末端。有一些酶虽然来源各异，识别的核苷酸序列也不相同，但能产生相同的粘性末端，称为同尾酶。由同尾酶切割产生的DNA片段，是可以通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的---在基因工程操作中有重要价值。

DNA聚合酶：能将脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合。 DNA pol I：5’-3’聚合活性、5’-3’外切活性（被前者抑制）、3’-5’外

切活性。用途：探针标记；补平3’末端。 Klenow大片段酶：DNA聚合酶I的水解产物之一，保留了5’-3’聚合活性、3’-5’外切活性。 T7DNA聚合酶：有很强的聚合能力，聚合长度比其他聚合酶大得多。

DNA连接酶：将来源不同的DNA片段连接并封闭起来组成新的重组DNA分子。催化连接反应时，需要一条DNA链3’末端有一游离羟基（-OH），另一条DNA链5’末端有一个磷酸基团（-P），这样相邻的3’-OH与5’-P之间可形成3’-5’磷酸二酯键。吸能反应，需要NAD或ATP提供能量。只能封闭缺口（nick，失去磷酸二酯键），不能封闭缺口（gap，失去一个或数个核苷酸而形成的单链断裂）。 T4 DNA连接酶较大肠杆菌DNA连接酶更常用，即可催化粘性末端连接，又可催化平头末端连接。

逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶；RNA指导的DNA聚合酶。使用最为普遍的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒AMV的逆转录酶。主要用途：cDNA合成；制备杂交探针。

T4多核苷酸激酶：催化ATP的γ-磷酸转移到DNA或RNA的5’-OH末端。可用于探针标记DNA的5’末端，还可用于使缺失5’-P末端的DNA发生磷酸化作用。

TTE末端转移酶：5’-3’聚合活性，当反应体系仅有一种dNTP时，可形成3’末端同聚物尾巴。 APE碱性磷酸酶：切除末端磷酸基团。使5’-P →5’-OH。

标记探针：5’-P 通过APE变成5’-OH，再通过T4多核苷酸激酶，变为5’-P（标记）。 分析一个基因的功能，你认为可以从那几方面着手？采用哪些方法？

如欲在转录水平检测某种基因的表达，应该用哪些方法？举例说明其原理。

选择个别基因在何种特定的组织或细胞、特定的体内外条件或发育阶段进行表达。主要涉及3种因素的相互作用： RNA聚合酶；顺式调控元件；反式作用因子顺式调控元件的研究方法：

1、报告基因(reporter gene)：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。

2、转染（transfection）：通过生物学、物理学、化学等方法使外源DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为转染。

3、5’缺失突变实验：鉴定真核基因DNA上游转录调控序列的调控元件：1个位于2与3之间；另一个位于4与5之间。

反式作用因子的研究方法：转录因子活性谱芯片

生物样品(组织或细胞)；抽提核蛋白，蛋白浓度测定；核蛋白与转录因子结合序列的混合物共同孵育分离回收与核蛋白中转录因子发生结合的探针；扩增并荧光标记；芯片杂交和扫描；数据分析生物信息学方法： TRANSFAC数据库，这个数据库从发表的文献中收集了转录因子、转录因子结合部位及结合部位序列信息。 Horsman S等设计出一个BLAST搜索工具，称之为TF target mapper。此软件能够快速提取靶点附近基因的注解信息，有助于全面分析调控信息，并有利于弄清楚特异转录因子的作用机制，最终了解这些转录因子在生物体的哪些途径中发挥作用。

DNA损伤修复的机制？

（一）直接修复：修复酶识别出损伤部位直接修复，不用切除DNA或切除碱基。

1. 光修复----针对嘧啶二聚体。高等哺乳动物没有。

过程：①UV照射下，形成嘧啶二聚体；②光复活酶与T=T结合形成复合物；③酶被可见光所激活（最佳波长400mm），切断T=T之间的共价键，二聚体变为单体；④修复后释放酶。 2. 链断裂的重接---针对DNA单链断裂。DNA连接酶。普遍存在，容易进行。双链断裂几乎不能修复。 3. 碱基的直接插入---针对AP位点。DNA嘌呤插入酶。（二）切除修复 最普遍的修复形式，针对多种DNA损伤：AP位点、嘧啶二聚体、链断裂、碱基烷基化等。

多步骤多酶参与的过程：DNA内切酶、外切酶、连接酶、聚合酶等共同作用下，将受损部位切除，并以另一条链为模板合成修复。

特点：暗修复；复制前修复；修复对象为亲代DNA。

过程：①内切酶识别损伤位点，并在其两侧切开；②外切酶除去两个切口之间的核苷酸；

③聚合酶催化DNA合成；④连接酶连接。

（三）重组修复

当DNA损伤较大，无法及时修复or缺乏切除修复酶系，可跳跃损伤部位复制，子链形成缺口，复制结束后在重组基因rec编码的酶（rec蛋白）、DNA聚合酶、DNA连接酶作用下，进行重组修复。 特点：复制后修复。模版上伤疤始终留着，只是随重组修复次数↑逐步稀释。修复对象为子代DNA。 过程：①复制：损伤母链复制时，跳过损伤部位，子链对应位点留下缺口，无损母链复制成完整双链。②重组：有缺子链与无损母链发生重组，缺口转移至无损母链，使损伤母链的互补链完整，损伤母链依然保留。③再合成：转移后的母链缺口以新的互补链为模板聚合补齐。

（四） SOS修复

DNA受到严重损伤难以继续复制，或DNA复制系统受抑制的紧急情况下，为了保证DNA 链的完整性，应急产生校对功能较低的修复酶，采用填补任意碱基的方式修复。这是具有差错的修复，是对极为不利的外界环境的应急反应，故称为SOS修复，也称差错倾向修复。广泛存在于原核生物与真核生物。细胞能存活，但变异率高，DNA保留错误较多，会引起广泛、长期的突变，自然界也因此而变的物种繁多。

基因突变？其后果（意义）？

基因突变（gene mutation）：由于DNA分子中发生碱基对的替换、插入、缺失等,从而引起基因结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因突变的时间：DNA复制时期，即细胞分裂间期（有丝分裂和减数分裂）基因突变若发生在体细胞，则影响其功能和生存。可导致疾病甚至癌变或死亡---不遗传；若发生在生殖细胞，则可能影响后代---可遗传。基因突变的特性：普遍性、随机性、低频性、可逆性、多害少利性。基因突变的形式：替换、缺失、插入、重排。

(一)点突变/ 替换：指DNA分子上一个碱基对的变异：

1. 转换 (transition)：同型碱基间的置换: 嘌呤代替另一嘌呤，嘧啶代替另一嘧啶。

2. 颠

换 (transversion)：异型碱基间的置换：嘌呤变嘧啶，嘧啶变嘌呤。

(二)插入(insertion)；缺失(deletion)：

引起三联体密码阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变----框移突变。正常 5′……GCA GUA CAU GUC ……缺失 C 5′……GAG UAC AUG UC ……丙缬组缬谷酪蛋丝 (三)重排(rearrangement) / 重组：

指DNA分子内发生较大片段的交换，也称为重组。移位的DNA可以在新位点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体之间发生交换重组。突变的意义：

1、突变是进化、分化的分子基础：产生新基因的途径；生物变异根本来源；为生物进化提供原始材料。

2、突变导致基因型改变：仅改变基因型而无可察觉的表型改变；本质上来讲，多态性的产生在于基因突变，一般发生在基因序列中非编码区。对个体而言，基因多态性碱基序列终生不变，并世代相传。

3、突变导致死亡：突变若发生在对生命至关重要的基因上，可导致个体或细胞的死亡。

4、突变是某些疾病的发病基础：包括遗传病、肿瘤及有遗传倾向的疾病。

点突变：镰刀型红细胞贫血。

血红蛋白HB基因发生碱基对置换→红细胞形状改变。

衰老细胞的生物学和形态学特征？

生物学特征：1、细胞阻滞于G1期，无法进入S期；2、不可逆丧失对有丝分裂原的反应能力；3、调控细胞生长的关键基因的表达发生变化，正向转录因子抑制，负向转录因子过量表达；4、细胞功能“脱分化”；5、发生凋亡的能力下降。

形态学特征：1、细胞核增大，核内出现包含物，核膜内陷，染色质凝聚；2、细胞质内色素积累，脂褐质积累，影响细胞正常功能，细胞工作效率降低，出现衰老。3、细胞膜流动性降低，干扰了膜蛋白的正常结构与功能。4、线粒体数目减少，体积增大；5、高尔基体囊泡肿胀，出现扁平囊泡断裂崩解，分泌及运输功能衰退。6、内质网排列无序，膜腔扩大甚至崩解，膜上核糖体数目减少.

建立转基因动物模型的基本原理和应用？

凋亡

凋亡：多细胞生物为调控机体发育、维持内环境稳定，由基因控制的细胞主动的的有序性的自我消亡，又称细胞程序性死亡PCD。从严格意义上来说，凋亡与PCD有很大区别。PCD：多细胞生物个体发育过程中，预定的并受到严格程序控制的细胞死亡。是一个功能性概念、发育学概念。仅存在于发育细胞。而凋亡是形态学概念，可存在于发育细胞及成体细胞。大部分凋亡是PCD，但某些凋亡明显是非程序性，如细胞毒物诱导的凋亡。

凋亡的形态学特征：

①早期：胞浆脱水浓缩，胞膜空泡化，染色质固缩成新月形，边集于核膜下。②晚期：凋

亡小体形成（内含有结构完整的细胞器）；③最后：凋亡小体被邻近细胞或吞噬细胞所吞噬清除。凋亡的生化特征：

①染色质DNA片段化：内源性核酸内切酶活化，将核小体间的连接DNA降解，形成长度为180~200bp整倍数的寡聚核苷酸片段，在琼脂糖凝胶电泳中呈现特征性的梯状条带—ladder；

②内源性核酸内切酶激活，凋亡中执行DNA切割，作用位点在核酸内部磷酸二酯键；

③凋亡蛋白酶caspase激活：caspase是一类促凋亡的蛋白水解酶，活性中心富含半胱氨酸Cys，对底物的天冬氨酸部位Asp有特异性水解作用。Caspase蛋白酶的级联反应是导致凋亡结构改变的主要环节。④钙离子浓度上升：外钙流入，内钙释放，启动凋亡。

⑤线粒体改变：膜通透性上升，释放Cyto-C启动凋亡。（Cyt-C，AIF均为线粒体释放的促凋亡蛋白）细胞凋亡的4阶段：

①凋亡信号转导（凋亡诱导因素 + 受体 + cAMP , Ca2+，神经酰胺）；②凋亡相关基因激活；

③细胞凋亡的执行（caspase激活，DNase激活）；④凋亡细胞的清除（巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞）细胞凋亡的信号转导：多样性、偶联性、同一性、多途性。

①死亡受体通路：死亡配体（细胞外）→死亡受体（细胞膜）→相关蛋白（中介蛋白，细胞内）→激活caspase8→激活caspase3→细胞凋亡。死亡受体：膜蛋白，如TNFR、Fas、DR3、DR4、DR5等。

②线粒体通路：凋亡复合体形成，激活caspase9；凋亡诱导因子AIF释放，激活DNase，促进Cyt-C释放；释放Smac/Diablo，阻断凋亡抑制蛋白IAPs的作用。③内质网通路：内质网应激→未折叠蛋白堆积，线粒体bcl-2下调，cyt-c释放；Ca2+释放；激活caspase12。④氧化损伤学说：可激活p53基因；可导致膜损伤，Ca2+内流↑；可激活Ca2+/Mg2+依赖型核酸内切酶；可活化核转录因子NF-kB和AP-1，加速细胞凋亡相关基因的表达。

⑤钙稳态失衡学说：可激活Ca2+/Mg2+依赖型核酸内切酶（降解DNA）、谷氨酰胺转移酶（利于凋亡小体形成）、核转录因子；Ca2+在A TP配合下使DNA链舒展，有利于切割DNA。凋亡相关基因：

①抑制凋亡：Bcl-2 、 EIB 、 IAP

②促进凋亡：Fas和FasL系统、 p53 、 Bax 、 ICE ③双向调控：c-myc

Bcl-2：第一个被确认的抑凋亡基因。机制：为抗氧化剂，直接抑制过氧化物诱导的凋亡；抑制线粒体释放促凋亡蛋白（AIF, Cyt-c）；抑制促凋亡因子Bax、Bak的细胞毒作用；抑制凋亡蛋白酶激活；维持钙稳态。 P53：诱导凋亡。G1期发挥卡点功能。DNA损伤→p53活化↑→G1阻滞，DNA损伤修复。损伤不能修复→细胞凋亡。突变型p53会导致损伤DNA 继续复制，引起更多突变积累，细胞癌变。 Fas/FasL系统：主要涉及免疫系统细胞死亡。参与CTL细胞的杀伤机制。

c-myc基因：表达产物myc是DNA结合蛋白。c-myc的表达是一个启动细胞增生和细胞凋亡的共同信号：

c-myc↑、生长因子存在→细胞增殖； c-myc ↑、生长因子不存在→细胞凋亡； c-myc不表

达、生长因子不存在→生长抑制。

凋亡vs坏死？

凋亡坏死细胞形态皱缩肿胀细胞膜始终完整破裂细胞器形态改变较轻肿胀、破裂细胞核染色质凝集、断裂固缩、核膜破裂凋亡小体有无 DNA 断裂有规律、梯形条带随机降解分子机制多基因参与、有序控制无基因调控炎性反应无细胞内容物流出，引起周围炎症

补充：

cDNA芯片技术 : RT-PCR产生荧光标记的cDNA →与芯片杂交孵育→扫描分析结果 PAGE （Polyacrylamide gel electrophoresis）：根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。

2D-PAGE（2 Dimensional-PAGE）二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术：结合了IEF等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS-PAGE（根据蛋白质的大小进行分离）。

抗体芯片技术：从50~200mg组织或细胞、体液中抽提蛋白质→Cy5和Cy3两种不同颜色的荧光分子→分别标记两个样品→洗去多余的标记分子→与芯片杂交孵育→扫描分析结果。抗体芯片Antibody chip ：微型化、集成化、高通量化

RNAi的作用机制？

表观遗传学 基因组印记

表观遗传学
第五章 基因组印记
Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTC

内容纲要
r1. r2. r3. r4. r5. r6.
基那印印配印因些记记子记组基是基发的印 因 如 因 育 维生记 是 何 的 过 持物印 判 介 程 和w秀w记 读 绍 中 修-w基 的 印 改专.b因 ？ 记心b？ 机i做o制o生.c是物o如m何启动的？
Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTC

基因印记
物 r1. 由表观遗传修饰决定的，来源于双亲 (Parent生 of-origin) 的特异性表达的基因。 心做 .com |A. 两个等位基因中只有一个印记基因表达 -专 ioo |B. 可遗传的修饰，并且不改变基因序列的组成
生物w秀ww.bb r2. 由双亲基因组功能的不对称性所决定
Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTC

基因印记
r1. 父系印记基因:
物 |来自父系的等位基因的表达被抑制 做生om |来自母系的等位基因表达 (mono-allelic) -专心bioo.c r2. 母系印记基因: 秀 .b |来自母系的等位基因的表达被抑制 生物www |来自父系的等位基因表达 (mono-allelic)
Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTC

印记基因
物 r1. 在小鼠中已发现>80个印记基因 生 |一般认为在人中具有大致相等数量的印记基因 做 om |基因表达谱的分析结果表明可能有更多的印记基因
-专心bioo.c r2. 主要功能: 出生前的生长发育; 秀 .b |父系基因的表达 à 胚胎发育能力增强 生物 ww |母系基因的表达 à 胚胎发育能力削弱
w r3. 在特定细胞系及神经发育方面有重要功能
Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTC

基因组的印记机制与胚胎发育的关系

基因组的印记机制与胚胎发育的关系 基因组印记(Genomic Imprinting) 使一个基因的两个亲本拷贝只有一个被表达, 是一种不遵循孟德尔遗传规律的亲本等位基因差异表达现象, 即DNA 甲基化修饰通过启动子附近的差异甲基化区域控制等位基因的不对称表达, 不对称表达的基因称为印记基因。配子发生和早期胚胎形成过程中,基因组印记经历了擦除和重建, 并在此后的生命过程中维持印记, 其中任何一个环节出现错误都可能导致胚胎发育缺陷, 甚至死亡。 1．基因印记的主要执行者——DNA甲基转移酶 基因印记的建立和维持依赖于DNA甲基转移酶(DNAMethylationTransferase, DNMT)的参与, DNMT的缺失或功能异常导致的印记异常会严重阻碍正常的胚胎发育。哺乳动物的DNMT 家族主要成员有: Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b 和Dnmt3L等。Dnmt1、Dnmt3a 和Dnmt3b 能够催化甲基到CpG 二核苷酸的胞嘧啶5 位上; Dnmt3L不具有催化活性, 但可协同Dnmt3a和Dnmt3b发挥功能, 也是印记建立的必需因子。DNMT家族的各个成员在不同的发育阶段有不同的表达谱, 分别在甲基化的维持和建立过程中发挥重要作用。 Dnmt1 是哺乳动物最主要的甲基转移酶, 表达于复制状态的增殖细胞, 能够优先催化复制后半甲基化的DNA 双链,使低甲基化的子链完全甲基化, 在甲基化的维持中具有重要作用。因转录过程中第一个内含子的选择性不同, Dnmt1 的转录物有3 种亚型, Dnmt1s、Dnmt1o、Dnmt1p。Dnmt1o 表达于卵母细胞和植入前的胚胎细胞, 直至胚泡期被其他亚型所取代。研究发现干预Dnmt1o 的表达对胚胎印记的影响远远大于卵母细胞印记。母鼠卵母细胞Dnmt1o 的启动子和第一个外显子敲除后, 卵母细胞印记不受影响, 后代于妊娠晚期死亡。死亡胚胎的基因印记出现错误,H19、Snrpn 呈异常双等位基因表达。同样, 胚胎死亡也可以来自于Dnmt1 基因过度表达引起的基因组DNA 超甲基化和印记丢失。最近有学者以基因芯片大范围研究发现, 体外培养的小鼠胚胎与自然状态没有明显的基因表达差别, 但其中Dnmt1 的表达有增加现象, 其原因和对胚胎发育可能的远期影响还有待进一步研究。 Dnmt3a、Dnmt3b 作用于未甲基化的DNA 双链, 两者在催化功能上相互补充, Dnmt3a 优先使核小体之外裸露部分的DNA 甲基化, 而Dnmt3b 使核心区甲基化。胚胎发育过程中两者的表达部位也有所不同, Dnmt3a 在胚胎外胚层中度表达、中胚层弱表达( 7. 5 d 胚胎) , 而Dnmt3b 高表达于胚胎的外胚层、神经外胚层和滋养层。Dnmt3a-/-小鼠出生时无明显异常, 之后发育迟缓、体型矮小, 于4 周龄死亡。Dnmt3b-/-小鼠宫内死亡, 伴有多种孕晚期发育缺陷。Dnmt3a、Dnmt3b同时缺失的胚胎没有体节, 发育和表型停滞于原肠胚后期。

实验六 印记基因v1(1)

实验六印记基因 一．实验目的 学习印记基因的鉴定方法。 二．实验原理 （一）背景知识 基因组印记是指组织或细胞中，基因的表达具有亲本选择性的现象，即只有一个亲本的等位基因表达，而另一亲本的等位基因不表达或很少表达，相应的基因则称为印记基因。只表达父本而不表达母本等位基因的印记基因称为母本印记基因；只表达母本而不表达父本等位基因的印记基因称为父本印记基因。 B830012L14Rik是一个非编码RNA基因，位于12号染色体上的印记基因簇中，目前该基因功能尚不明确。在该基因的第一外显子序列中存在一个SNP位点，在B6小鼠中该位点为A（AA），在ICR小鼠中则为碱G（GG）。而B6与ICR小鼠的子代杂交个体中则为AG。 若该基因非印记表达，则在子代个体的cDNA基因型为AG。而该基因若印记表达，则在子代杂合个体的cDNA基因型为OA或OG。通过对比父本或母本的基因型，便可判断该印记基因的表达模式。 （二）技术原理： 1. PCR 聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是一种分子生物学技术，用于体外扩增特定的DNA片段。 PCR技术主要过程是，通过人类合成的一小断单链DNA片段（叫做引物）与模板DNA特定的区域特异性结合，进而以四种dNTP为底物，通过DNA聚合酶沿着引物和模板形成的双链部分的3’端聚合形成DNA片段实现DNA体外扩增的过程。其中，最重要的是热稳定的DNA聚合酶，由于该酶在97度以上的高温也能保持稳定，所以我们可以通过94～97度这个温度范围内处理DNA形成单链，然后降温（根据引物不同而有差异，一般为50-55度）直至适量的引物结合到模板上。最后温度提升至72度，聚合酶聚合形成双链DNA。

印迹基因的概念及重要意义

1.印迹基因的概念及重要意义 概念:基因组印迹是特指来源于亲本的等位基因进行不对称后成修饰后而导致的单等位基因表达的现象。这种在生物进化中形成的、有规律而又受控的基因失活是机体中基因表达调节的一种重要方式。 2. 研究印迹基因的重要意义: 已有的资料显示，印迹基因对胎儿生前的生长及其谱系发育起着重要的作用，动物的发育过程、某些遗传疾病及癌症的发生过程都与基因印迹密切相关；印迹基因在哺乳动物配子中总是优先表达，这就开启了一个与发育相关的重要开关，使哺乳动物能依据环境的特点向最优化的种系方向发育。进一步筛选出和克隆出更多新的印迹基因，并进行印迹机制的深入研究对于进一步理解个体发育、遗传疾病及癌症的发生机制具有重要的意义。 3. 印迹机制 在哺乳动物中所发现的印记基因大都具有如下几个特点： ⑴很少是单独存在的，大约有80%以上都是与其他的印记基因呈簇排列； ⑵所有的印记基因都有一个或几个印记中心IC（imprinting center, IC），也即差异甲基 化区DMR（differentially methylated region, DMR）； ⑶在印记基因的DMR内，有富含CpG 的CpG 区（CpG island）； ⑷基因印记是可以逆转的。 4. 哺乳动物印迹基因的生命周期（如附图1）： 哺乳动物印迹基因的生命周期大致可概括为 印迹的建立 印迹的维持 印迹的去除 通过实验分析证明DMR对印迹具有首要的重要性，一个DMR也可称之为印迹调控区（ICR),ICR是如何对体细胞中单等位基因表达进行调节的呢？(附图2. ) (1) ICR作为基因调控的元件，必须通过顺式作用明显地能影响基因的表达。 (2) 这些ICR调控元件能通过甲基化或甲基化缺失使一个亲本的等位基因处于“关”的状 态，而另一个亲本的等位基因则处于“开”的状态，这种效应能通过配子遗传。这就产生了等位基因的反式活化或失活，即单等位基因的表达。 (3) 含有多个印迹基因的大基因蔟需要通过一个双向印迹中心来调控双亲的等位基因5. 印迹基因研究模型 研究基因研究模型主要有: (1) 干细胞 (2) 利用平衡易位（如相互易位和罗伯逊易位）获得的杂合胚胎 (3)大片断DNA转基因动物 干细胞作为印迹基因研究模型所具有的优良特性: (1) 干细胞是二倍体，他们仅含有父源或母源的染色体并可诱导分化，使其最终分化为孤雌胚胎、孤雄胚胎或不对称的父母源染色体区； (2) 进行嵌合体发育潜能评估实验时，它能保留印迹； (3) 能提供一个基本的胚胎和嵌合体体外分化体系；

基因印记与遗传性疾病

基因印记与遗传性疾病 原文地址:https://www.wendangku.net/doc/fa6593043.html,/biotech/exp/bioexp/2008/g8223825102.html 朱喜科王振宇李强作者单位：110004 沈阳，中国医科大学第二临床学院遗传研究室（朱喜科），中心实验室（李强），基础医学解剖教研室（王振宇）通信作者：朱喜科E-Mail: xikezhu@https://www.wendangku.net/doc/fa6593043.html, [摘要] 基因印记是等位基因依赖双亲性别表达的不符合孟德尔遗传定律的特殊遗传现象。基因印记异常调节可引起一些遗传性疾病。在人类染色体11p15.5和15q11-13存在两个印记基因聚集区，两个区域的基因印记异常调节引起前者为贝-威综合征，后者为普-威综合征和安格尔曼综合征。作者对最近几年在这方面的最新研究进展进行了综述。从这些研究结果可以了解以前遗传学不能解释的某些遗传疾病的发病机制，从而为这些疾病的预防和治疗带来希望。 [关键词] 基因印记；遗传性疾病；贝-威综合征；普-威综合征；安格尔曼综合征 Gene Imprinting and Genetic Diseases Zhu Xike Wang Zhenyu Li Qiang Laboratory of Medical Genetics, Central Laboratory; The Second Clinical College, China Medical University, Shenyang 110004, China. E-Mail: xikezhu@https://www.wendangku.net/doc/fa6593043.html, The Department of Anatomy, The Basic Medical College, China Medical University, Shenyang, 110001, P.R.China [Abstract] Gene imprinting is a special genetic phenomenon out of line with Mendel’s law, in which the transcription and expression of alleles depend on parental sex. It was reported that abnormal adjustment of gene imprinting may result in some genetic diseases. There are two clusters of imprinting genes in human chromosome, one is 11p15.5 related to Beckwith-Wiedemann syndrome and another is 15q11-13 related to Prader-Willi syndrome and Angelman syndrome. This paper reviewed the research progress in these fields. These studies provide important basis for understanding the mechanism of causing the genetic diseases that could not be explained by previous genetics and for preventing and treating the genetic diseases. [Key words] gene imprinting; genetic disease; Beckwith-Wiedemann syndrome; Prader-Willi syndrome; Angelman syndrome 1 介绍高等动物的基因组为两倍体，受精卵从双亲中各继承了一套基因组。每一个常染色体均为双拷贝，父源和母源常染色体基因都能有均等的机会表达或受到抑制，这是孟德尔遗传定律的基本要素。上世纪90年代开始，发现了不符合这个定律的遗传现象。某些基因呈单等位基因表达，即父源与母源的基因拷贝不能同时表达，并且，父源或母源等位基因通过某种特异的基因修饰机制，特异性地抑制另一母源或父源染色体等位基因表达。例如：胰岛素样生长因子2基因（insulin-like growth factor 2, IGF2）只表达源自父亲的等位基因，母源等位基因被抑制。相反的例子，胰岛素样生长因子2受体基因（insulin-like growth factor 2 receptor, IGF2R）为源自父亲的等位基因不表达，只表达母源等位基因。这种现象可能是在父母受精卵形成过程中，特异性地对源自父亲或源自母亲的等位基因做一印记使其只表达父源或母源等位基因。这种现象被称作基因印记（gene imprinting）或基因组印记（genomic imprinting）。临床上很早就发现父源和母源等位基因不均等表达的类似基因印记的现象，如睾丸性畸胎瘤和卵巢性畸胎瘤。睾丸性畸胎瘤细胞的两套基因组都是来自孤雌生殖发生的父源染色体，表现为肿瘤无胎儿成分。而卵巢性畸胎瘤细胞有两套雌核生殖发生的母源基因组，肿瘤有胎儿成分。这说明，人类在发育初期来自父母双方的基因组也不是均等的，也有基于父母性别的类似基因组印记现象的存在。基因印记的机制现在还不完全了解，从到目

DNA 甲基化与基因组印迹的研究进展

基因组印迹的研究进展 [摘要]基因组印迹（g e n o m i c i m p r i n t i n g）是指在配子或合子发生期间，来自亲本的等位基因或染色体发育过程中产生专一性的加工修饰，导致后代体细胞中两个亲本来源的等位基因有不同的表达活性。为一种后生论修饰。目前在人类和小鼠中坚定的印迹基因已超过25个，它们具有一些共同的特点，如印迹基因分布的群集性，复制的不同步性，表达的时空特异性，遗传的保守性及编码R N A s等。基因组印迹的分子机理与印迹基因的甲基化尤其是C p G岛甲基化密切相关，特异性甲基化区域在印迹基因的表达中具有重要作用。基因组印迹基因与胎儿和胎盘的生长发育及细胞增值有关，正常印迹的改变可引起包括肿瘤在内的多种遗传性疾病。 [关键词]基因组印迹印迹基因甲基化C p G岛 基因组印迹是一种非孟德尔遗传现象,经典孟德尔遗传学认为所有父系及母系等位基因有同等表达，但随着对遗传学研究的深入，人们发现了一种被称为基因组印迹的非孟德尔遗传现象，它是指在配子和合子发生期间，来自亲本的等位基因或染色体在发育过程中产生专一性的加工修饰，导致后代体细胞中的两个亲本来源的基因有不同的表达活性，又称遗传印迹或亲代印迹或配子印迹。它是一种伴有基因组改变的非孟德尔遗传形式，可遗传给子代细胞，但并不包括D N A序列的改变，至今，在人类和小鼠中鉴定的印迹基因已超过25个，它们具有一些共同的特征，印迹基因的甲基化可能是基因组印迹的分子机制，特异性甲基化区(D M R s)是控制印迹表达得的重要因素[1]。印迹基因中大多数在生长和分化中起重要作用，而且可引起一些人类遗传性疾病和肿瘤发生。我想从基因印迹的发现，印迹基因的特征及其生物学意义上谈一下我的认识。 1基因组印迹基因的发现 基因组印迹基因的发现最初开始于对全基因组的研究，接着是对个别染色体和染色体区域的研究，最终到鉴定特异的印迹基因。1989年，S w a i n和L e n d e等人发现了一个特异的印迹基因，但它并不是一