明胶酶谱及MMP2免疫组化

⑶RIPA 蛋白裂解液：

称取Tris 0.605g、NaCl 0.8775g、TritonX-100 1g、1%脱氧胆酸钠1g、SDS

0.1g，加入60ml 去离子水，盐酸调pH7.5，定容100ml。

⒂明胶酶谱试验孵育液

Tris 2.97g，CaCl2 0.353g，NaN3 0.1g，去离子水400ml，pH7.6，定容500ml。

⒃明胶酶谱试验复性液

2.5ml TritonX-100 加入去离子水100ml。

⒄明胶酶谱试验脱色液

甲醇50ml、去离子水40ml、冰醋酸10ml，混匀，室温保存。

⒅10%明胶储备液

明胶5g，去离子水40ml，加热、磁力搅拌至完全溶解，定容50ml，4℃冰

箱备用。

⒆考马斯亮蓝R250 染液

取甲醇50ml、去离子水40ml、冰醋酸10ml、0.1g 考马斯亮蓝R250，混匀，

室温保存。

⑵BCA 法测定组织提取液的蛋白浓度。

采用Pierce 蛋白测定BCA 法试剂盒，按照说明书进行操作。同第一部分。A．制作蛋白浓度标准曲线

生理盐水稀释蛋白标准溶液，配成梯度蛋白标准溶液浓度分别为：0.00、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mg/ml 作液。10μ l 不同浓度的蛋白溶液分别加入96 孔板，加入200μ l 工作液，室温放置30 分钟，测定OD562。以不同浓度蛋白溶液测得OD562 数值为纵坐标，对应标准蛋白浓度为横坐标，制备蛋白浓度标准曲线。

B．待测样品蛋白浓度测定

待测样品用生理盐水稀释50 倍。取稀释样品10μl 置96 孔板，与200μl 蛋

白浓度测定工作液（A:B=50:1）混合，室温放置30 分钟，测定OD562，利用蛋

白质浓度标准曲线计算待测样品蛋白浓度。

3.5 明胶酶谱法检测MMP2、9 活性

3.5.1 蛋白样品准备

上述UTMD 后3 天（缺血再灌注后6 天）收集大鼠心脏梗死和边缘区及远

端非梗死区组织匀浆，加入组织裂解RIPA 液（不含蛋白酶抑制剂cocktail），混匀，置冰上2 小时，13000rpm/分钟、4℃离心20 分钟，取上清获得组织提取液。BCA 法进行蛋白浓度测定，同前。

3.5.2 明胶酶谱试验

⑴SDS-PAGE（含1%明胶）电泳

取50μg 上述蛋白提取液（不含蛋白酶抑制剂）加入适量5×SDS-PAGE 电

泳上样缓冲液（不含β 巯基乙醇），混匀，至55℃变性10min，室温冷却。取20μg

蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳（8%分离胶、含1%明胶，见表4），100V，90 分钟。

表4 SDS-PAGE（含1%明胶）凝胶配制

5%浓缩胶8%分离胶

水 2.82 3

30%丙烯酰胺0.83 3.3

0.5M pH6.8 Tris 1.25 -

1.5M pH8.8 Tris -

2.5

10%明胶- 1ml

10%SDS 0.05 0.1

10%APS 0.05 0.1

TEMED 0.005 0.004

总体积5ml 10ml

⑵凝胶复性、孵育

取出上述SDS-PAGE 胶，置明胶酶谱复性液（2.5% TritonX-100）15 分钟，

两次。胶至孵育液，室温15min 后，置37℃、20 小时。

⑶凝胶固定、染色、脱色和拍照分析

取出凝胶置脱色液中固定15 分钟，放入考马斯亮蓝染色30 分钟，然后凝胶

脱色直至

免疫组织化学染色：采取热修复抗原SABC染色程序，切片浸入0．01 mol／L 枸橼酸缓冲液，微波炉加热100E 15 min热修复，冷却后0．1 mol／L磷酸盐缓冲液洗涤2次，滴加第二抗体及血清封闭液，室温20 rain，滴加稀释第一抗体，4"C 冰箱保存过夜，滴加SABC试剂，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水、透明、封片，显微镜观察。采用SP免疫组织化学方法染色组织切片，每次染色时用试剂公司提供的TGF p 1、MMP一2、TIMP一2阳性片作阳性对照，磷酸盐缓冲液代替第一抗体作为阴性对照。TGF D 1、MMP一2、TIMP一2免疫组织化学结果均使用美国IPP5．0专业图像分析软件测定平均吸光度值，用背景的吸光度值减去阳性部位的吸光度值即为阳性部位的吸光度值。

明胶酶谱法检测步骤

明胶酶谱法检测步骤 1、明胶酶谱溶液配制 1.1.1洗脱液（1×）： 1.1.2Triton X-100， 2.5%（v/v）in water 配法：量取Triton X-10025ml，加去离子水定容至1000ml即可。 1.1.2孵育液（1×）：50mM Tris-HCl，5mM CaCl2·2H2O，0.02%Brij-35，0.2M NaCl，pH7.6。 配法： 1)称取Tris碱6.06g，CaCl2·2H2O0.74g（或CaCl20.555g），Brij-350.2g，NaCl11.7g； 2)加水至800ml； 3)用浓HCl调pH至7.6； 4)定容至1000ml。 1.1.32×上样缓冲液（不含β巯基乙醇） 0.5M Tris-HCl，pH6.8 2.5ml 甘油 2.0ml 10%（w/v）SDS 4.0ml 0.1%溴酚蓝0.5ml dH2O1ml Total10ml 1.1.45×上样缓冲液（不含β巯基乙醇） 配法： 1)量取下列试剂，置于15ml塑料离心管中

a)1M Tris-HCl（pH6.8） 2.5ml b)SDS1g c)溴酚蓝0.05g d)甘油5ml 2)加dH2O定容至10ml，Vortax振荡混匀； 3)小份分装（1ml/管），-20℃保存。 1.1.50.5%（w/v）考马斯亮蓝R-250400ml 配法： 1)称取2g考马斯亮蓝R-250，置于1L烧杯中； 2)量取100ml异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解； 3)加入40ml冰醋酸，搅拌均匀； 4)加入260ml去离子水，搅拌溶解； 5)用滤纸过滤除去颗粒物质后，室温保存。 1.1.6考马斯亮蓝脱色液（400ml） 配法甲醇：乙酸：水=200：40：160=5：1：4。 1.1.7明胶储液（10mg/ml in water） 配法：称取明胶（Sigma，猪皮来源）0.1g，加去离子水10ml，溶解。配好后储存于4℃。若凝固成胶冻状可用55℃水浴解冻。 1.1.810%SDS-PAGE凝胶之分离胶（含1.0mg/ml明胶） 配法： dH2O3ml 30%丙烯酰胺溶液 3.3ml

明胶酶谱实验方法

明胶酶谱实验 72kD（MMP-2）和92kD（MMP-9） 抽提缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 20 mmol/L CaCl2, 1μmol/L ZnSO4, 0.01% (v/v) Triton X-100, （0.5% PMSF）。 10mmol/LPMSF 溶液：取PMSF 粉末17.4mg, 加异丙醇溶解, 定容至100ml，置-20℃备用。 注意：PMSF在临提取组织时再加入，使终浓度为0.5%，配制时不加，不然易失效。 先用新鲜肾组织，蛋白量尽量加至最大。如果按这个还做不出来，那就是你的实验技术问题了 明胶酶是锌依赖的蛋白酶. EDTA是金属离子络合剂.加了就把明胶酶的锌离子络合了，完全抑制MMP的活性。你加了这个我保证你一辈子也做不出来。 蛋白浓度一般是先摸索一个量。就是分别上10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ug 跑一下电泳，先看结果。条带看不见的，或者太透明的，都不能选。就是要半明半暗的那种。看是哪个道分解的，我们就选其中几个量上样。

(1)、5%浓缩胶(现配现用)： d3H2O 2.1ml 30%丙烯酰胺溶液0.5ml 1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml 10% SDS 30μl 10%过硫酸铵(AP) 30μl TEMED 3μl 3ml (2)、10%分离胶(现配现用)： d3H2O 2.1ml 30%丙烯酰胺溶液 2.31ml 1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml 10% SDS 70μl 10%过硫酸铵(AP) 70μl TEMED 5.6μl 1%明胶0.7ml 7ml (3)、4×上样缓冲液（4o C保存）： 0.32% Tris-HCL 6.4ml 4%SDS 8ml 50%甘油 3.2 ml 溴酚蓝0.024g d3H2O 2.4ml 20ml

Transwell实验 超详细之欧阳歌谷创作

Transwell侵袭实验总结 欧阳歌谷（2021.02.01） 第一节概念 这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1.Transwell 关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。 更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。 但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一

样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 下图是一个Transwell装置的纵切面 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。 我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择 3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。

酶谱法检测金属蛋白酶活性

原理 酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。 复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min/次，做2次或15min/次，4次。静置于Trition中是不妥的。）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。 2试剂的配制 （1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高） A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量） 10% SDS聚丙烯酰胺凝胶10ml（包括） ddH2O 4.5ml 30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）2ml 1.5mol/l Tris（PH 8.8） 2.5ml 10% SDS 100ul 10%过硫酸铵（APS）100ul TEMED 8ul 1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解）0.5ml B.浓缩胶的配制 浓缩胶6ml ddH2O 4.5ml 30%储备胶0.75ml 1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml 10% SDS 60ul 10%过硫酸铵60ul TEMED 6ul

明胶酶谱分析法

明胶酶谱分析法 一。用品 1.细胞培养或者提取组织 2.试剂的配制 （1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶） A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大下确定配制胶的量）10% SDS聚丙烯酰胺凝胶5ml（包括） ddH2o 1.5ml 15ml 30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）1.65ml 4.95ml 1.5mol/l Tris（PH 8.8）1.25ml 3.75ml 10% SDS 50ul 150 ul 10%过硫酸铵50ul 150 ul TEMED 4ul 12 ul 1%明胶0.5ml 1.5 ml B.浓缩胶的配制 浓缩胶3ml ddH2o 2.1ml 6.3ml 30%储备胶0.5ml 1.5ml 1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.38ml 1.14ml 10% SDS 30ul 90 ul 10%过硫酸铵30ul 90 ul TEMED 3ul 9 ul （3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液 0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3） （4）4 ×上样缓冲液 0.32% Tris-HCL 6.4ml 4%SDS（PH7.2）8ml 16%甘油3.2 ml 溴酚蓝0.024g ddH2o 2.4ml (5) 洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，1μmol/L ZnCl2，pH7. 6 漂洗液；50mmol/L Tris -HCl，5mmol/L CaCl2，1μmol/L ZnCl2，pH7. 6 （7）孵育液：50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 1μmol/L ZnCl2, 0. 02% Brij-35 ,pH7.6 （8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸

明胶酶谱法操作

明胶酶谱法操作 明胶酶谱法 原理： 酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含 0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品 中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶， 最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带， 条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。 复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。静置于Trition中是不妥的。）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。 试剂的配制 （1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高） A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量） 10% SDS聚丙烯酰胺凝胶10ml（包括） ddH2O 4.5ml 30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）2ml 1.5mol/l Tris（PH 8.8） 2.5ml 10% SDS 100ul 10%过硫酸铵（APS）100ul TEMED 8ul 1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解）0.5ml

B.浓缩胶的配制 浓缩胶6ml ddH2O 4.5ml 30%储备胶0.75ml 1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml 10% SDS 60ul 10%过硫酸铵60ul TEMED 6ul （3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液 0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3） （4）4 ×上样缓冲液 0.32% Tris-HCL 6.4ml 4%SDS（PH7.2）8ml 16%甘油3.2 ml 溴酚蓝0.024g ddH2O 2.4ml (5)洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ，5mmol/L CaCl2<0.5549g/L>，pH7. 6 （40分钟两次，中间换液） （6）漂洗液：50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L CaCl2，pH7. 6 （20分钟2次） （7）孵育液：50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3（孵育42小时） （8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸（染色3小时） （9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5% （分别30min、1h、2h脱色）

凝胶电泳

凝胶电泳

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论文题目：凝胶电泳 专业：化学 年级：10级 学号：10101550203 姓名：马慧 摘要 凝胶电泳（Gel electrophoresis）或称胶体电泳，也可称为扁平式电泳法，是一大类技术，被科学工作者用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子。它是以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法。凝胶电泳通常用于分析用途，但也可以作为制备技术，在采用某些方法，如质谱、聚合酶链式反应、克隆、DNA测序或者 免疫印迹检测之前，进行部分提纯分子。通过学习，了 解凝胶电泳的类别、原理、特点及其应用范围。 关键词：制备，类别，定义，原理，特点，应用范围 正文 一、凝胶制备 1、设备与试剂：琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝胶，而且制胶与加样都比较方便，故应用比较广泛。核酸分离一般用连续缓冲体系，常用的有TBE（0.08mol/L Tris?HCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/L EDTA）和THE（0.04mol/L Tris?HCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸钠，0.0018mol/L EDTA）。 2、凝胶制备：用上述缓冲液配制0.5％-0.8％琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波炉加热使之融化，冷至55℃时加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5μg/ml，然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脱凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1mm处。

Gel Zymography 明胶酶谱法

明胶酶谱法原理：酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺 （SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2（基质金属蛋白酶-2）和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。 复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。静置于Trition中是不妥的）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs 恢复了活性。 试剂的配制 (1)配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高） A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量）10% SDS聚丙烯酰胺凝胶 10ml（包括） ddH2O 4.5ml 30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）2ml 1.5mol/l Tris（PH 8.8） 2.5ml 10% SDS100ul 10%过硫酸铵（APS）100ul TEMED8ul 1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解）0.5ml B.浓缩胶的配制 浓缩胶6ml ddH2O 4.5ml 30%储备胶0.75ml 1mol/l Tris-HCL( PH 6.8)0.76ml 10% SDS60ul 10%过硫酸铵60ul TEMED6ul (2)5×Tris –甘氨酸电极缓冲液 0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3） (3)4 ×上样缓冲液 0.32% Tris-HCL 6.4ml 4%SDS（PH7.2）8ml 16%甘油 3.2 ml

细胞生物学实验及研究方法 (2)

研究生课程考核试卷 （适用于课程论文、提交报告） 科目：细胞生物学实验及研究方法教师：宋关斌姓名：学号： 专业：生物学类别：学硕上课时间：年月至年月 考生成绩： 卷面成绩平时成绩课程综合成绩阅卷评语： 阅卷教师(签名) 重庆大学研究生院制

重庆大学生物工程学院2014级硕士生 《细胞生物学实验及研究方法》课程考核 1.试结合你感兴趣的领域，以某种细胞为研究对象，依据本学院的实验条件设计一个1年期的小课题。请简述立题依据和拟选取的研究内容和研究方法。（20分） 答：目前癌症的发病率越来越高，其中肺癌的发病率更是居高不下，因而以人肺癌细胞A549为研究对象。立题依据：核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一种作用十分广泛的真核细胞转录因子。近年来的研究显示核因子-κB （nuclear factor-κB，NF-κB）的活化能够调节肿瘤细胞的侵袭和转移。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）由肿瘤细胞分泌，能够分解细胞外基质中的Ⅳ型胶原。肿瘤细胞在侵袭的过程中必须穿过富含Ⅳ型胶原的细胞外基质，才能扩散到身体其他部位，因此MMPs 在肿瘤细胞的侵袭和转移中发挥重要的作用。但是对于NF-κ B 活性的改变对肺癌细胞株A549 细胞侵袭能力是否也有影响，目前尚无相关研究报道。研究内容：用表达IκBα的真核表达质粒pcDNA3.1（+）/IκBα转染体外培养的A549 细胞，以抑制A549 细胞的NF-κ B 活性，观察NF-κB活性降低A549 细胞侵袭能力以及对MMPs 表达的影响。研究方法：①构建表达NF-κ B 抑制物α同分异构体（inhibitor of NF-κB，αisoform，IκBα）的真核表达重组质粒pcDNA3.1（+）/IκB α。②体外培养A549 细胞，分为未转染组（不转染质粒）、转染pcDNA3.1（+）组、转染pcDNA3.1（+）/IκBα组，分别转染相应的质粒。③应用RT-PCR、Western blot检测各组细胞IκBα的表达情况，应用凝胶电泳迁移率改变实验（electrophoreticmobility shift assay，EMSA）检测各组细胞NF-κ B 的活性，应用Transwell 侵袭小室检测各组细胞的侵袭能力，应用RT-PCR 方法检测各组细胞MMP-2、MMP-9 的mRNA 水平，应用明胶酶谱法检测各组细胞基质金属蛋白酶-2 （matrixmetalloproteinase-2，MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的活性。

基质金属蛋白酶(MMP)明胶酶谱法电泳分析试剂盒产品说明书

基质金属蛋白酶（MMP）明胶酶谱法电泳分析试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 基质金属蛋白酶（MMP）明胶酶谱法（gelatin-zymography）电泳分析试剂是一种旨在通过明胶聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，在分离、蛋白复性、底物水解、染色等一系列步骤下，观察并半定量深蓝色背景中的无色清晰的基质金属蛋白酶条带，根据分子量确定特异基质金属蛋白酶及其活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞萃取样品（动物、人体、植物、昆虫等）、培养上清悬液、血清和关节滑液或脑脊液等基质金属蛋白酶-2，9，以及13等活性及其抑制剂的检测。产品即到即用，性能稳定，操作便捷，敏感度高，条带清晰，重复性好。 技术背景 基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。其功能在于分解细胞外基质成分。迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。明胶酶谱法（gelatin-zymography）电泳分析技术具有简便，无需抗体，同步观察多种酶以及活化与否的优势 产品内容 胶体液（Reagent A）毫升 凝结液（Reagent B）毫升 促进液（Reagent C）微升 胶顶液（Reagent D）毫升 电泳液（Reagent E）毫升 上样液（Reagent F）毫升 复性液（Reagent G）毫升 消化液（Reagent H）毫升 染色液（Reagent I）毫升 祛色液（Reagent J）毫升 终止液（Reagent K）毫升 产品说明书1份 保存方式

明胶酶谱法详解

Zymography Provided by Hsu suo-wen 一。用品 1.细胞培养或者提取组织 2.试剂的配制 （1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶） A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大下确定配制胶的量） 10% SDS聚丙烯酰胺凝胶 5ml（包括） ddH2o 1.5ml 30%储备胶 （0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺） 1.65ml 1.5mol/l Tris（PH 8.8） 1.25ml 10% SDS 50ul 10%过硫酸铵（AP） 50ul TEMED 4ul 1%明胶 0.5ml(or 100ul) (注意：天气如果较冷除TEMED，其他成分按顺序加完后要置于37度温育，最后加TEMED) B.浓缩胶的配制-同Western Blot 浓缩胶 3ml ddH2o 2.1ml 30%储备胶 0.5ml 1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.38ml 10% SDS 30ul 10%过硫酸铵 30ul TEMED 3ul （3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液 0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3） （4）4 ×上样缓冲液20ml(不同于Western)

0.32% Tris-HCL 6.4ml 50mM Tris 0.606g 4%SDS（PH7.2） 8ml 2% SDS 0.2g 16%甘油 3.2 ml 10%甘油 10ml 溴酚蓝 0.024g 0.1%溴酚蓝 0.01g ddH2o 2.4ml(20ml) (10mlsystem) (5) 洗脱液（1L）:2.5% Triton X-100（25ml），50mmol/L Tris –HCl（6.06g），5mmol/L CaCl2（or 10mMol 1.11g），1μmol/L ZnCl2，pH7. 6 漂洗液（相比洗脱液，少了Triton）： 50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，1μmol/L ZnCl2，pH7. 6 注意：洗脱液不能重复使用，必须现配，尽可能多加洗脱液，温育摇动时注意Triton有毒。 （7）孵育液（相比洗脱液，少了Triton，增加了Brij）：50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 1μmol/L ZnCl2（不影响PH）, 0. 02% Brij-35（or0.02%NaN3，W/V,剧毒） ,pH7.6 （8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝 R-250，30%or40%甲醇，10%乙酸 （9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5% 二：步骤 1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。 2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中 2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。1h 3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。与4×上样缓冲液（4%SDS，0.25 mmol/L Tris-HCl，40%甘油，0.1% 溴酚蓝）按照1∶3混合。 4.配制分离胶和浓缩胶，15ul/孔上样，注意所有操作必须在冰上操作，不能煮沸。（根据表达强忍和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v恒压跑至分离胶和浓缩胶交界处改为90毫安恒流，直至溴酚蓝跑出胶外。（1小时左右）。

明胶酶谱法

明胶酶谱法 原理： 酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使 样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明 胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色 条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。 复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。静置于Trition中是不妥的。）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。 试剂的配制 （1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高） A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量） 10% SDS聚丙烯酰胺凝胶10ml（包括） ddH2O 4.5ml 30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）2ml 1.5mol/l Tris（PH 8.8） 2.5ml 10% SDS 100ul 10%过硫酸铵（APS）100ul TEMED 8ul 1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解）0.5ml

B.浓缩胶的配制 浓缩胶6ml ddH2O 4.5ml 30%储备胶0.75ml 1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml 10% SDS 60ul 10%过硫酸铵60ul TEMED 6ul （3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液 0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3） （4）4 ×上样缓冲液 0.32% Tris-HCL 6.4ml 4%SDS（PH7.2）8ml 16%甘油3.2 ml 溴酚蓝0.024g ddH2O 2.4ml (5)洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ，5mmol/L CaCl2<0.5549g/L>，pH7. 6 （40分钟两次，中间换液） （6）漂洗液：50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L CaCl2，pH7. 6 （20分钟2次） （7）孵育液：50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3（孵育42小时） （8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸（染色3小时） （9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5% （分别30min、1h、2h脱色）

Transwell实验原理与操作步骤

Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 1

蛋白酶活性电泳实验

蛋白酶活性电泳 活性电泳(明胶酶谱法) 一、实验原理 明胶酶谱法的基本过程是先将样品进行非还原性SDS-PAGE（含0.1%明胶）电泳分离，然后在缓冲系统中使样品中的酶恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与酶的量和比活成正比。 复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的酶结合（可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使酶不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Triton中震荡洗脱时，由于SDS被Triton结合而去除，从而使酶恢复了活性，此步注意上样缓冲液中不能含有DTT等还原性物质。 通过不同孔径凝胶电泳达到分离蛋白的目的，而活性电泳又能保证蛋白的活性，在孵育条件下，酶对明胶的水解使后期染色出现白色条带，得以定位目的酶。通过对该位置酶的回收与质谱鉴定，得到该酶部分氨基酸序列。 二、材料与方法 1试剂与溶液配制 1.1试剂和仪器： 酪氨酸，酪蛋白，明胶（猪源），Tris，Glycine，TEMED，SDS，过硫酸铵，考马斯亮蓝R250购自sigma公司，为电泳纯；Triton X-100，CaCl2·2H2O，Brij-35（十二烷基聚乙二醇醚），NaCl，乙酸，乙酸钠，碳酸钠，甲醇，乙酸，盐酸，三氯乙酸，福林试剂均为国产分析纯；30%丙烯酰胺溶液（29:1），非还原性5×蛋白上样缓冲液，预染彩虹蛋白marker等购自康为世纪公司。水为去离子水或超纯水。 主要仪器：紫外分光光度计电泳仪垂直电泳槽高速离心机milipore超滤管等1.2溶液配制 1.2.1 5×SDS-PAGE电泳缓冲液 配法：称取Tris 15.1g，Glycine 94g，加适量去离子水溶解，加入SDS 5.0g，加水至约800ml，注意尽量减少气泡生成，完全溶解后定容至1000ml，室温保存。使用时用去离子水稀释至1×，新配置的电泳液可重复使用1-2次，最好使用新鲜配制的电泳液。 1.2.2 明胶储液（10 mg/ml） 配法：称取明胶0.1 g，加去离子水10 ml，溶解，配好后储存于4℃。若凝固成胶冻状可用温水浴解冻。 1.2.3 10 %过硫酸铵（W/V）

IL-35诱导中性粒细胞N2表型极化促进肿瘤生长

IL-35诱导中性粒细胞N2表型极化促进肿瘤生长目的:IL-35是新近发现的具有促肿瘤生长和转移作用的细胞因子,研究显示IL-35能够诱导调节性T细胞产生抑制抗肿瘤免疫应答,然而在缺乏成熟T、B淋巴细胞的Rag1/2-/-小鼠体内过表达IL-35也能促进肿瘤的生长和转移。因此,这意味着IL-35也可能通过调控先天性免疫细胞功能发挥促瘤作用。中性粒细胞在肿瘤的发生发展过程中具有重要作用,一方面可以通过释放细胞毒性物质来破坏肿瘤细胞,另一方面,炎性因子诱导的中性粒细胞N2极化又能够促进肿瘤的发生发展。本研究旨在探讨IL-35是否能够通过影响中性粒细胞极化进而影响肿瘤的发生发展。方法:(1)通过肌肉注射转染pIL-35质粒制备体内表达IL-35小鼠模型,然后接种H22或B16F0肿瘤细胞,10天后取外周血及剥离肿瘤,流式细胞分析外周血和肿瘤组织中性粒细胞数量,实时荧光定量PCR检测肿瘤组织内中性粒细胞趋化因子CXCL1,CXCL2,CXCL5,CXCL15,CCL2,CCL3,CCL4,CCL5 和 VEGF 表达,探讨IL-35对小鼠骨髓中性粒细胞动员及在肿瘤微环境募集的影响及机制。(2)进一步分析IL-35是否能够通过影响中性粒细胞极化促进肿瘤生长,在正常对照、pUN01空载质粒对照、pIL-35实验组小鼠采用转染pCXCL1质粒的方式在肿瘤接种部位募集中性粒细胞,并观察募集的中性粒细胞对小鼠肿瘤生长的影响。在混合接种试验中,采用Percoll密度梯度离心法分离小鼠骨髓及腹腔来源的中性粒细胞,然后与肿瘤细胞混合接种,10天后剥离肿瘤称取瘤重以评价中性粒细胞对肿瘤生长的影响。(3)采用免疫组化和免疫荧光的方法检测肿瘤

改良明胶酶谱测定明胶酶活性

·简 报· 改良明胶酶谱测定明胶酶活性① 710032　西安　第四军医大学细胞工程研究中心　骞爱荣　商　澎　陈志南② 关键词　明胶酶谱;基质金属蛋白酶;电泳;聚丙烯酰胺凝胶 中图分类号　R965.2 基质金属蛋白酶(M MPs)是能降解细胞外基质和基底膜成分 的酶家族成员之一。这个蛋白家族包括胶原酶、明胶酶、基质素和 膜型基质金属蛋白酶(M T-M MP)等5大类。MMPs家族成员目前 已鉴定出28种[1]。M MP的基因表达水平和酶活性的高低与许多 生理或病理过程及其恶性程度相关,如肿瘤转移、血管浸润、骨质 疏松、组织纤维化等,尤其是明胶酶A和B(MMP-2,9)在肿瘤的转 移和血管生成方面起重要的作用[2]。 目前,测定明胶酶活性的方法多用明胶酶谱法(gelatin zymog- raphy),即收集待测样本,处理后在含有明胶-聚丙烯凝胶中进行 SDS-PAGE。但是,传统的方法样品处理费时、费事。因此,从方法 学的角度,寻找简便实用的检测MM Ps活性的方法有重要的意 义。本文介绍一种改良的明胶酶谱方法,较好地解决了实验中遇 到的一些难题,且简单、实用、结果可靠。尤其是在筛选MM Ps的 抑制剂时,该方法省时,省实验药物。 1　材料与方法 1.1　常规仪器和试剂　垂直电泳槽和电泳仪(美国B io-Rad公司),图像分析系统(上海复日科技有限公司),96孔板(瑞典Nunc 公司),培养瓶,CO2培养箱(德国Heraeus公司),超净工作台,震荡器等。明胶,Triton X-100(购自华美生物技术公司)。 1.2　酶谱电泳专用梳子和边条　自制专用梳子和边条的厚度1.2mm,齿孔宽度为13.3mm,每个梳子有5个孔。 1.3　试剂配制　1%明胶溶液;2×电泳载样缓冲液(5%SDS,2%蔗糖,0.2%溴酚蓝,50mmol/L Tris-HCl,pH6.8);电泳缓冲液25mmol/L Tris,250mmol/L甘氨酸,pH8.3,0.1%SDS;聚丙烯酰胺凝胶电泳贮液:①30%的丙烯酰胺溶液;②1.0mol/L Tris-HCl (pH6.8);③1.5mol/L Tris-HCl(p H8.8);④10%SDS;⑤10%过硫酸铵;⑥10%TEM ED; 2.5%Triton X-100溶液;明胶酶缓冲液50mmol/L Tris,10mmol/L CaCl2,200mmol/L NaCl,1μmol/L ZnCl2 (pH7.5);染色液0.1%考马斯亮蓝R-250;脱色液甲醇∶水∶冰醋酸=45∶45∶10. 1.4　样品制备　①人成纤维细胞(Fb)和人肝癌细胞(HHCC)培养至对数期,用0.25%胰酶消化,以105/孔的密度接种于96孔板中,培养24h;②第二天,弃去培养上清,用PBS洗2次后,加300μl 无血清培养液,培养24h;③收集无血清培养细胞上清,低速离心(200g)去除细胞碎片后,4℃备用。 1.5　明胶酶谱　①根据胶板大小配制一定体积的8%分离胶和5%浓缩胶,分离胶中加入明胶溶液使明胶终浓度为0.1%,灌胶及电泳操作与普通SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳相同。②凝胶制好后,取备用的培养上清(80～100μl),与1/2体积的样品缓冲液混合均匀,大约体积为150μl,需要特定的上样孔,上样初始,以8V/cm 电泳至溴酚蓝前沿进入分离胶,然后将电压加至10V/cm,继续电泳至溴酚蓝前沿离分离胶前端约2cm时,停止电泳(1～2h);③取下凝胶,移入2.5%Triton X-100溶液中,在摇床上洗脱2次(45min/次),加入明胶酶缓冲液,在37℃恒温中孵育12～16h。④凝胶用染色液染色4h;在脱色液中脱色1～2h,至对照出现明显,清晰的负染酶带,用蒸馏水漂洗后观察。 1.6　结果评价　肿瘤细胞和间质细胞无血清培养上清中通常含有72kD和92kD两种明胶酶,即MMP-2和MMP-9。电泳后负染酶带亮度的强弱和面积大小可以半定量地表征明胶酶的活性大小。负染带面积越大、亮度越大,表明明胶酶的活性越强;反之则弱。 2　结　果 2.1　改良明胶酶谱染色后所显示的明胶酶条带　图1是未经饱和硫酸铵沉淀、透析及浓缩直接上样结果。上样量为100μl所获得的结果,深蓝色背景上显示清晰可见的透明条带,说明该条带所代表的酶水解活性是明胶特异性的,该条带是MMP-2。其他染色的蓝色条带为其他非明胶酶类蛋白质。 图1　样品经改良明胶酶谱染色后所显示的透明带 2.2　动态明胶酶谱　图2是采用该方法在不同时间点采样,进行的酶谱分析。测定了给予M MPs抑制性药物5、10、15h时间点明胶酶的变化。其中1、3、5条带分别为给药组,2、4、6条带为对照组。从该图可发现给药组各时间点明胶酶的含量均低于对照组各时间点,且随着时间的延长,明胶酶的量也在逐渐增加。 图2　不同时间点(5、10、15h)明胶酶的变化 骞爱荣,在读博士生。主要从事肿瘤细胞生物学和肿瘤药物学。已发表论文5篇,参与申请专利2项,其中1项是国际PCT专利。 ①国家自然科学基金(编号39989002)和国家高技术研究发展(863)计划资助课题(编号2001AA215061);②通信作者

植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳实验指导

植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳 【目的】 1．掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作过程。 2．了解聚丙烯酰胺圆盘电泳的实际应用，利用此法分离植物过氧化物同工酶。 【概述】 1．聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支承物的一种电泳技术。其凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构。凝胶网孔的大小可通过改变单体浓度和交联剂浓度的比例加以调节，常用的所谓标准凝胶是指含丙烯酰胺7%～7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能达到满意的结果。 聚丙烯酰凝胶电泳过程中除了一种电泳所具有的电荷效应外，还具有“分子筛”效应；不连续的凝胶电泳过程中具有电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。不连续凝胶电泳体系的不连续性体现在： （1）凝胶由上、下两层组成，两层胶孔孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 （2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH 值不同。如常用的碱性系统中，电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl 缓冲液，分离胶为pH8.9的Tris-HCl 缓冲液。 （3）在电场中形成不连续的电位梯度。 在这种不连续的系统中有三种物理效应起作用，使样品分离效果好、分辨率高。这三种效应是电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。 ① 电荷效应 由于各种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而在一定电场作用下迁移率不同。承载有并效电荷多的，泳动的快，反之则慢。 CH 2CH C=O NH 3CH 2=CH C=O NH CH 2 NH C=O CH 2+CH 2CH C=O NH 3CH 2CH C=O NH 3 C=O NH CH 2NH C=O CH 2CH 2CH [[]]n n 催化剂

热点实验：明胶酶谱MMP活性检测实验案例介绍

大鼠心脏组织明胶酶谱MMP活性检测实验 实验仪器泳电源Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)；电泳仪及附件Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301) 实验标本大鼠心脏组织20个 实验试剂 1、凝胶试剂：30%丙烯酰胺溶液；Tris-Base（SIGMA）；10%SDS（SIGMA）；10%过硫酸铵；TEMED （sigma） 2、常用溶液及缓冲液：制备含MMP底物蛋白SDS-PAGE凝胶：采用8%分离胶。将20Xsubstrater 融化，并90℃加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中加入20Xsubstrate并使之稀释20倍，混匀，然后再加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。 A．5%积层胶所用溶液 按总体积2.5ml： ddH2O： 1.575ml 30%丙烯酰胺溶液： 0.42ml 1.0mol/L Tris (PH=6.8)： 0.315ml 10%SDS： 25ul 20Xsubstrate： 125ul 10%过硫酸铵： 25ul TEMED： 3ul B．8%分离胶溶液 按总体积10ml： ddH2O： 4.1ml 30%丙烯酰胺溶液： 2.7ml 1.0mol/L Tris (PH=8.8)： 2.5ml 10%SDS： 100ul 20Xsubstrate： 500ul 10%过硫酸铵： 100ul TEMED： 6ul C．电泳缓冲液，1L 3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、1g SDS，加蒸馏水至IL，pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液，在室温下长期保存。 检测步骤 A、阳性对照及待检测样品的前处理及上样阳性对照：取5ul positive mixture与2XSDS-PAGE non-reducing buffer 等体积混合。待测样品5ul则1：1稀释于2XSDS-PAGE non-reducing buffer，混合后直接上样。不加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。每孔点样10ul。 B、电泳 30mA恒流电泳45min，溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。 C、洗涤凝胶驱除凝胶，去除压缩胶。放入容器中，先用适量蒸馏水冲洗凝胶。然后加入10ml