微生物发酵制柠檬酸论文

微生物发酵生产柠檬酸

摘要：

柠檬酸是一种十分重要的化学物质，常用于食品和饮料以及医药、化妆品、洗涤剂以及工业领域。目前其主要通过微生物发酵进行生产，是微生物在工业上应用的代表。

关键词：

柠檬酸黑曲霉TCA循环糖酵解表面发酵固体发酵

作者：

正文：

柠檬酸（citric acid）又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，化学名称2-羟基丙三羧酸，分子式为C6H8O7，是生物体重要的代谢产物之一，在自然界中广泛存在，在植物叶子和果实中尤以柠檬、柑橘、梅、李、梨、桃等植物果实中，在动物的骨骼、血液、乳汁、唾液、汗液和尿中以游离柠檬酸状态或以金属盐形式存在。商品柠檬酸为无色半透明晶体，或白色颗粒或白色结晶性粉末，无臭，虽有强烈酸味但令人愉快，稍有一点后涩味。

生产研究历史：

早在1784年，瑞典化学家Scheel就首次从柠檬汁中提取出了柠檬酸，直到上世纪初，这种有机酸仍然绝大多数是从柠檬中提取出来的。1860年，意大利开始用向果汁中加石灰乳方法制柠檬酸，从而进行工业化生产，以意大利的西西里岛最著名。1891年，德国科学家Wehmer就从腐败的柑橘中分离出一种丝状菌，能使含钙的糖液变酸，并从中分离出柠檬酸和草酸。1913年，Zahorski

首先利用黑曲霉生产柠檬酸，1919年和1923年，比利时的一家公司和美国的Ch. Pfizer公司分别成功进行浅盘发酵法大规模生产柠檬酸。后于1952年，美国Miles公司首先采用深层发酵法大规模生产柠檬酸，并在世界上流行至今。

我国柠檬酸工业解放前是空白，1967年黑龙江平糖建立了我国第一个生产100吨的柠檬酸工厂（以甜菜糖蜜为原料，采用浅盘发酵和钙盐-离子交换法提取工艺）。1968年，用薯干为原料，采用深层发酵法生产柠檬酸的上海酵母厂投产成功。以薯干粉为原料、深层发酵法生产柠檬酸，形成了我国生产柠檬酸的一大特色。1990年，上海市工业微生物研究所完成国家七五攻关项目筛选出860菌种，发酵产酸达20%，处于世界领先水平。我国柠檬酸行业从产量上位居世界第一，从技术上，在国际上也处于领先水平，优势在于：①我国的柠檬酸发酵采用的菌种（黑曲霉）具有双重功能，淀粉原料被液化后，即可进行发酵，不需将淀粉水解成葡萄糖；②尽管采用边糖化边发酵的工艺，但发酵周期只有64h；

③柠檬酸产酸速度大大高于国外水平，平均产酸率是国外的2倍。

用处：

我国柠檬酸主要消费于食品和饮料市场，其他消费领域包括医药、化妆品、洗涤剂以及工业领域。。

发酵原料：

几乎含淀粉和可发酵糖的农产品、农产品加工品及其副产品，某些有机化合物以及石油中的某些成分都可以采用。目前，柠檬酸生产工业上使用的原料主要有以下几类：

⑴淀粉质原料甘薯、木薯、马铃薯及其薯干、薯粉、淀粉及薯渣及玉米粉等。

⑵粗制糖类粗蔗糖、水解糖、饴糖等。

⑶制糖工业副产品糖蜜、葡萄糖母液、冰糖母液等。

⑷含正烷烃（主要是10-20碳）较多的石油馏分。

⑸副原料米糠、麦芽、营养盐类、消泡剂类以及各种产酸促进剂。

几种深层发酵培养基配方如下（按1t培养基计）：

a.蔗糖发酵培养基：

蔗糖200kg NH4NO3 1.1kg

KCl（1mol/L）MgSO4·7H2O 0.25kg

HCl（1mol/L）10L水加至1t

b.水解糖发酵培养基：

还原糖170-180kg NH4NO3 2.5kg

KH2PO40.3kg MgSO4·7H2O 0.25kg

pH 3.5 加水至1t

c.糖蜜发酵培养基：

处理后的糖蜜含糖250g/L左右，pH6.8-7.0

d.薯干发酵培养基：

薯干粉220kg-280kg液化后加水至1t，pH自然

发酵微生物：

能够产生柠檬酸的微生物有很多，在石油原料发酵中主要使用酵母菌，特别是解脂假丝酵母和涎沫假丝酵母，但在工业生产上，以糖质或淀粉质原料直接发酵的主要是曲霉属，有黑曲霉、泡盛酒曲霉、米曲霉、灰绿曲霉最为重要，特别是黑曲霉。

微生物的育种：

（1）为提高葡萄糖进入细胞的代谢活力，进一步增强EMP的代谢流，采

用射线或EMS等诱变剂诱变育种（致死率为70%-80%）。通过高糖（蔗糖）14%的培养基平板筛选分离出比原株生长更好的突变株，有可能获得己糖激酶和6-磷酸果糖激酶活性更高的菌株；在纤维二糖培养基的平板筛选具有2-脱氢葡萄糖抗性的突变株，有可能获得以淀粉为原料的高产柠檬酸突变株；亦可进一步选育抗金属锰离子、锌离子能力强的突变株。

（2）为降低副产物有机酸如葡萄糖酸和草酸的能力，采用基因工程的手段，构建葡萄糖氧化酶和草酰乙酸水解酶丧失的工程菌。

生物合成途径：

普遍认为柠檬酸糖质原料发酵是经EMP途径、丙酮酸羧化和三羧酸循环而形成的。

1954年，Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢。虽然也存在HMP酶系，但HMP途径主要在孢子阶段活跃，应为它提供了核酸合成等所需的前体物质。Shu的研究表明约有40%的柠檬酸是通过柠檬酸循环中的二羧酸形成的。Cleland等则认为TCA循环受到强烈干扰。还有一种意见认为，当乌头酸酶和异拧香酸脱氢酶消失时，就出现柠檬酸。而有人却证明柠檬酸酶或需要NAD和NADP的异柠檬酸脱氢酶受到阻断。从黑曲霉的老菌丝体中分离的线粒体可以看到，在柠檬酸大量形成时，TCA循环中其呼吸作用略有减弱。因此可以证明，在柠檬酸形成的主要阶段，存在着乌头酸酶、需NAD和NADP的异柠檬酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、富马酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶，并对α-氧-戊二酸脱氢酶有抑制作用。

在柠檬酸形成的主要阶段，丙酮酸、苹果酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、顺乌头酸及异柠檬酸在细胞中的浓度有什么显著改变，只有柠檬酸本身的浓度有所改变。

有关由糖形成柠檬酸调节方面的研究并不透彻。在由黑曲霉形成的高活性糖酵解系统中，当糖的浓度很高，pH为2-4时，不存在负能量负荷的控制。另外由于存在着一条丙酮酸-羧酸酶支路，强烈的分解作用造成柠檬酸的大量积累。细胞内反应只利用了少量积累的柠檬酸。柠檬酸的外流就阻止了自身中毒的发生。在生产中采用的突变株一般具有乌头酸水化酶和异柠檬酸脱氢酶活性低的特性。

酶的调节：

柠檬酸是微生物好气代谢过程的中间产物，正常情况下在胞内不会积累，况且柠檬酸还可作为黑曲霉的碳源，因此，柠檬酸积累是代谢失调的结果。从理论上推断，积累柠檬酸必须使生成柠檬酸的有关酶系要强大，而柠檬酸后代谢的酶系要微弱，其中糖酵解的调节是柠檬酸发酵最为重要的调节。

在20世纪60年代前后陆续发现，菌体累积柠檬酸时，与合成柠檬酸有关的酶活是增高的。宇佐美等发现在整个柠檬酸发酵周期中，酵解酶系和柠檬酸合成酶始终保持较高的活力。Joshi发现，黑曲霉进入产酸期，合成乙酰CoA和合成草酸乙酰的酶活力增强，这就为柠檬酸的合成提供更多的底物。杜宇柠檬酸累积机制有关酶的调节控制研究中，主要集中在磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和顺乌头酸水合酶的调节上。

1.磷酸果糖激酶（PFK）活性调节

在黑曲霉的EMP途径中，PFK是个调节酶，是柠檬酸合成中的主要调节点。

在正常生理条件下，该酶被柠檬酸和ATP抑制，而被无机磷、AMP和铵离子激活，铵离子的存在可有效地解除PFK对胞内柠檬酸积累的敏感性。为了使PFK 不受柠檬酸的抑制，则必须变更营养成分的限制与氧的供给。

2.柠檬酸合成酶的调节

柠檬酸合成酶是TCA环的起始酶，只对CoA和ATP的调节敏感，ATP-Mg 螯合物只起微弱的抑制作用，而其它调节物则无影响，因细胞内ATP是以Mg 螯合物形式出现，所以ATP对他影响不太重要，该酶对乙酰CoA的亲和力取决于草酰乙酸的浓度，在柠檬酸积累条件下会使该酶对乙酰CoA亲和力增强。

3.乌头酸水合酶的调节

乌头酸水合酶催化柠檬酸的分解，此酶合成受阻或失活，导致TCA环阻断是柠檬酸积累的关键原因之一。

4.异柠檬酸脱氢酶的调节

在正常细胞内，柠檬酸可活化异柠檬酸脱氢酶，因而细胞内柠檬酸浓度增加时便加速异柠檬酸的分解，从而使胞内柠檬酸浓度保持稳定。柠檬酸对异柠檬酸脱氢酶的调节是黑曲霉柠檬酸发酵的基础。异柠檬酸脱氢酶还受AMP活化而受ATP的抑制，产酸期内AMP浓度降低而引起异柠檬酸脱氢酶的抑制，使TCA 循环微弱。

发酵工艺：

柠檬酸发酵工业生产工艺的发展可分为3个阶段。20世纪20年代的由青霉和曲霉的表面发酵生产为第一阶段；30年代开始的曲霉深层发酵生产为第二阶段；从50年代至今以曲霉深层发酵为主，并进行着表面和固体发酵工艺为第三阶段。但其中还有着含糖基质发酵与烷烃类基质发酵之分。

（1）表面发酵

表面发酵是利用生长在液体培养基表面的微生物之代谢作用，将原料转化为柠檬酸的发酵方式。这种柠檬酸生产工艺发明最早，1923年首先由美国Pfizer 公司实现了工业化，至今仍在沿用，主要采用糖蜜原料发酵。具体过程如下：首先将糖蜜中的有害物质除去，再加入必要的营养盐并蒸煮灭菌；调pH至2.2或稍低一点，将该灭菌的培养基放入高度为10-25cm的平盘中，置于事先经一定消毒的发酵室中发酵培养。培养温度为28-30℃，真菌在平面前板上很快形成彼此连接的菌丝体盖。发酵过程中，想培养时吹入相对湿度为45%-60%的无菌空气。2-4d后，柠檬酸快速形成，7-10d发酵结束。表面培养法产酸率一般为10%-20%，对糖转化率为70%-95%。将发酵结束的发酵液抽出，加CaCO3形成柠檬酸钙沉淀下来。采用表面发酵，每平方米浅盘每天大约可生产1kg含一个水分子的柠檬酸。

（2）固体发酵

固体发酵是将发酵原料及菌体吸附在疏松的固体支持物上，经过微生物的代谢活动，将原料中可发酵成分转化为柠檬酸的发酵方式。1953年Cahn首先发明了这种方法，但由于其劳动强度太大，未引起重视。1953年日本率先实现工业化，我国的以薯干渣为原料的固体发酵工艺是于1977年成功投产的。固体发酵又有薄层发酵法和厚层通风发酵法之分。其发酵控制规程如下：

①薄层发酵法

固体发酵过程，对温度和湿度的控制非常重要。曲醅如室的品温在30-35℃，在胞子发芽和菌丝开始发育时代谢热很少，品温逐渐下降，在此前18h内，品温应维持在27-31℃，18-48h内由于代谢热大量释放，品温可维持在38-43℃。

但不得更高，48h后品温很快将至35℃左右，直至发酵结束。

上述适宜的品温主要通过室温加以控制，一般室温控制在26-30℃，而任其品温自然变化，但一般不能超过40℃。另外，上下去盘具有温差所以在发酵40h 左右要把上下曲盘对调一下。为减小这种温差，上盘曲层的厚度可以小于下层，整个发酵期内不必翻曲。

一般曲房湿度在85%-90%即可。低温季节直接通蒸汽，高温季节在地上洒水即能起到保湿作用。

②厚层通风发酵发

固体厚层发酵是在薄层发酵的基础上发展起来的。它的特点是必须由容器的假底向上通风，以供给氧气和带走热量，机械化程度可以提高。这种工艺目前仍在日本占主要地位，但日本主要在设备方面做了改进，实现了发酵密闭化，操作机械化，和部分自动化。

厚层发酵法要求曲层更加疏松，否则厚层的压实作用会造成部分或全部底层物料板结，难以通风。鉴于此，厚层醅中的水分控制非常重要。

厚层发酵的重要控制仍是温度和湿度。温度控制程序与薄层发酵相似。湿度主要靠通风量和进风湿度加以控制，但在某些设备中可以由水冷装置协助控制。厚层进风的相对湿度都控制在接近100%，以尽量防止水分蒸发，因为厚层培养基中的水分本来就少。曲层厚度在20cm以下时无需翻料，否则一般都配有翻料装置。

主要优点是设备占地面积较小，污染杂菌的可能性较小，机械化程度高，能够形成较大规模的生产规模。

③深层发酵

深层发酵是菌体在液体培养基中，在通气的条件下通过代谢转化可发酵原料形成柠檬酸的发酵方式。该工艺是美国公司Miles首先成功工业化的，并被当今普遍应用。我国薯干深层发酵工艺相当简单，糖化液直接由连消器的维持罐输入发酵罐或种子罐中，营养盐用硫铵，种子培养基接种黑曲霉麸曲，在35℃左右通风培养20-30h，接入发酵罐。35℃通风搅拌发酵培养4d。当产酸不再上升，残糖降至0.2%以下时，发酵终止，立即进入提取。

酵母菌利用正烷烃发酵生产柠檬酸具有工业生产价值，在以烷烃为碳源的培养基中接种这些解脂假丝酵母，在26℃好氧培养7d，发酵pH5-6，对烃转化率为100%-130%。酵母菌发酵生产柠檬酸的缺点在于其发酵过程中会有较高的副产物——异柠檬酸积累，但人们可以通过育种手段选育积累异柠檬酸能力弱的突变株予以解决。

提取工艺：

我国柠檬酸提取目前普遍采用钙盐法工艺：发酵液经加热处理后，过滤，滤液中加入CaCO3或石灰乳中和，形成柠檬酸钙沉淀。再加入H2SO4酸解，使柠檬酸游离出来，硫酸根则以硫酸钙形式被滤除。获得粗柠檬酸液通过脱色和离交净化，除去色素和胶体杂质以及无机离子。净化后的柠檬酸经浓缩后形成结晶，离心分离晶体，母液则重新净化后浓缩、结晶。晶体经干燥和检验后出厂。

除了钙盐法工艺，我国还在研究其他提取工艺，主要有色谱分离技术、吸附交换法提取技术和热水洗脱色谱分离技术。

色谱分离技术由中国科学院生态环境中心研究成功的ILCS工艺，已在阜阳柠檬酸厂进行了年产2000吨工业化试验。特点是：采用对柠檬酸分子具有高效分离特性的离子交换树脂，从柠檬酸发酵液中分离柠檬酸。强化了发酵过滤液的

预处理，除去非柠檬酸杂质，使成品柠檬酸中易碳化物含量达标。提取液中柠檬酸浓度高达20%-40%，可减少其浓缩能耗，其分离液可用盐酸、磷酸、硝酸、硫酸，NaOH、KOH、NH4OH等无机酸或无机碱水溶液，因此分离废水可通过蒸发结晶工序制成化肥，生产1t柠檬酸产0.7t硫酸钠，降低了成本。总收率可达85%-90%，唯因连续串联运行进料压力较高，树脂破损率较大。

吸附交换法提取技术由天津科技大学研究成功，已在黑龙江甘南柠檬酸厂进行5000t规模的工业化试验。特点：采用吸附交换量大、抗污染活性强、不易破碎的离子交换树脂，从柠檬酸发酵液中高效率的分离出柠檬酸。通过强化发酵液的预处理，采用有效的除易碳化物的方法，使成品柠檬酸易碳化物含量低于标准。提取液中柠檬酸浓度可达20%-30%，节省蒸发能耗，副产品可制（NH4）2SO4化肥，提取总收率可超过90%，降低成本。

热水洗脱色谱分离技术由无锡江南大学和无锡分离技术研究所研制，2001年完成年产200t的中试。特点：采用对柠檬酸有很强吸附能力的弱酸弱碱两性树脂FE-41-1，以热量差为洗脱动力，洗脱液柠檬酸浓度达20%-24%。成本低，适合进行大规模工业化生产，但1t柠檬酸消耗树脂较多。

参考文献：

《微生物发酵生理学》———罗立新主编；

《现代微生物发酵及技术教程》———罗大珍、林稚兰主编；

《微生物工程》———吴松刚主编。

柠檬酸生产工艺简介

柠檬酸生产工艺简介第一节概述 一、柠檬酸的用途 （一）在食品工业的应用 1、饮料 据统计75%～80%的柠檬酸用于饮料工业。 2、果酱与果冻 3、糖果 4、冷冻食品 5、酿造酒 6、冰淇淋和酸奶 7、脂肪与油 8、腌制品 9、罐头食品和水果加工 10、豆制品和调味品 （二）柠檬酸在药物、美容品、化妆品上应用 1、药物 “999胃泰” 2、发蜡与化妆品 （三）柠檬酸在工业上应用 1、金属净化

2、去垢剂 3、无土栽培农艺 4、矿物 5、…… 二、乳酸的用途 L-乳酸聚合成聚乳酸（PLA） 三、L-苹果酸的用途 三、葡萄糖酸的用途 四、琥珀酸的用途 我国柠檬酸发展简史 1968年我国第一家以淀粉为原料深层发酵柠檬酸成功投产的厂是上海酵母厂。同期，天津工微所开展了以适合我国国情的薯干原料深层发酵柠檬酸的研究工作。之后，上海工微所用该所的“东酒2号”黑曲霉为出发菌株，用薯干粉做培养基，很快选出了我国第一代深层发酵柠檬酸生产菌种AL558，由原轻工业部立项，组织上海、天津两个工微所、上海复旦大学生物系、上海新型发酵厂(筹)、上海酵母厂、天津柠檬酸厂(筹)、南通油洒厂(南通发酵厂前身)等单位，在南通油酒厂展开了善于深层发酵、全离交提取工艺的中、大型试验工作，并取得了成功，因而推动了我国柠檬酸工业于20世纪70年代初形成了工业体系。70年代中期到80年代是我国柠檬酸菌种选育的高峰期，先后选育出5代薯干原料高产菌株和适应淀粉、木薯、葡萄糖母液、糖蜜等原料的优良菌株。上海、天津两工微所和上海复旦大学生物系为此做出了很大贡献。各生产厂的广大科技人员和生产工人通过不懈地努力，提高了柠檬酸行业的整体水平，特别在缩短发酵周期、提高单产方面成绩突出，使我国柠檬酸发酵技术处于世界领先地位。无锡轻工业学院和天津轻工业学院为柠檬酸行业培养了一大批科技力量，已成为行业发展的骨干。1995年金其荣与蚌埠柠檬酸厂共同开发了玉米去渣发酵新工艺。同年黑龙江甘南柠檬酸厂于脱胚玉米去渣发酵工艺也成功投产。玉米新工艺的成功，使我国的柠檬酸工业进入一个

实验三 柠檬酸发酵实验

实验三柠檬酸发酵实验 一、目的要求 1.了解利用黑曲霉生产柠檬酸的原理与流程，掌握柠檬酸的发酵生产工艺与发酵分析方法。 2. 通过本实验能较熟练地掌握真菌发酵的接种、培养与发酵产物的分析测定等技术。 二、基本原理 CH2—COOH ｜ 1.柠檬酸结构式：HO—C—COOH ｜ CH2—COOH 柠檬酸分子式：C6H8O7 2. 黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强；pH1.6~1.7时尚能生长，且酸度大时产生葡萄糖酸、草酸等副产物较少，故进行柠檬酸发酵时，培养液以pH2~3为宜。 用于柠檬酸生产的原料有淀粉、废糖蜜等；本实验以糖等为发酵原料，黑曲霉为产生菌（合成途径见图1）。在一般发酵中，均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂肪酸如甲酸、乙酸等称为挥发酸，而乳酸、柠檬酸等称为非挥发酸。挥发酸和非挥发酸的总和称总酸。酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法及比色法等；若待测液色泽很深，可采用外指示剂法。本试验用中柠檬酸的定性检验用Deniges试剂。 2C6H12O6+3O2→2C6H8O7+4H2O HOOCCH2C(OH)(COOH)CH2COOH+3NaOH———NaOOCCH2C(OH)(COONa)CH2COONa+3H2O 三、实验材料 1．菌种黑曲霉斜面菌种。 2．实验器材 0.1mol/L标准NaOH；0.1mol/L H2S04； Deniges试剂(HgO 1g溶于20ml 0.2L/L H2S04中)（有毒）； 酒精灯；滤纸，漏斗；烧杯：200ml，500ml；18X180试管；吸管10ml、5ml，150ml三角瓶；碱滴定管，铁台、蝴蝶夹：酚酞指示剂：200ml量筒；广范pH试纸；玻璃棒；布氏漏斗，抽滤纸，滴管，天平。 3. 柠檬酸发酵培养基：硫酸铵2.0g，KH2P04 1.0g，MgS04 ·7H2O 0.25g，蔗糖150g，水1000ml；pH控制在5.5~6.5左右，加1mol／L NaOH约2滴。取50ml上述培养液，加入250 mL三角瓶中，包扎灭菌，待用。 四、实验步骤（实验内容） 1．菌种活化：

柠檬酸及生产工艺

柠檬酸及生产工艺 一.柠檬酸的简介 1. 柠檬酸的理化性质 柠檬酸（Citric acid），又称枸椽酸，是一种三元羧酸,其学名为3-羟基-3-羧基戊二酸，分子式C6H8O7(无水物)，在自然界中存在于柠檬、柑桔、梅、子、梨、桃、无花果等水果中。柠檬酸具有无毒，无色，无臭特性，一般为半透明结晶或白色粉末，易溶于水、乙醇、乙腈、乙醚等[1]，不溶于苯，微溶于氯仿。相对密度1.542g/cm3，熔点153℃(失水)。柠檬酸结晶形态因结晶条件不同而不同，有无水柠檬酸，也有含结晶水的柠檬酸。在干燥空气中微有风化性，在潮湿空气中有潮解性，175℃以上分解放出水及二氧化碳。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H＋可以电离；水溶液呈酸性，加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。 2. 柠檬酸的用途 柠檬酸具有令人愉悦的酸味，入口爽快，无后酸味，安全无毒，被广泛用作食品和饮料的酸味剂；能与二价或三价的阳离子形成络合物，被用作金属加工的鳌合剂和洗净剂（起软化水作用的洗净力补充剂）；还能衍生形成许多衍生物，可用作有机化学工业的原料。因此被广泛用于食品饮料、医药化工、清洗与化装品、有机材料等领域，是目前世界需求量最大的一种有机酸[2]，到目前还没有一种可以取代柠檬酸的酸味剂。 二.生产技术 柠檬酸的生产方法共可分为 3 种: 水果提取法,化学合成法, 生物发酵法三种[17]，目前以发酵法生产柠檬酸为主[18]。发酵法又分为固体发酵法和液体深

层发酵法。固态发酵能耗小但劳动力大，占地面积大，不适合大规模的生产应用。深层通风发酵法采用不锈钢罐体，机械搅拌通风，微生物在液体相中分布均匀，发酵时不生成孢子，全部菌体细胞用于代柠檬酸，发酵速度高，实现了机械化或自动化操作，利于大规模生产。 三.生物发酵法制取柠檬酸 1.本工艺选择的原料及生产方法 本次生产工艺设计以薯干为原料，采用直接粉碎、调浆、液化，进行好气液体深层发酵，钙盐法提取，最后结晶、干燥得到柠檬酸 2.工艺流程 接收糖浆后，根据糖浆组成作适当的处理或配制，配成发酵原料，进行连续杀菌并冷却后，进入发酵罐，加入菌种和净化压缩空气后进行发酵；发酵液经升温、过滤处理后，进入中和罐，用中和处理；再经过过滤洗涤，得到柠檬酸钙固体，送入酸解罐，再添加酸解，并加入活性炭进行脱色；然后，通过带式过滤机过滤、酸解过滤，除去及废炭；酸解过滤液经离子交换处理后，进行蒸发、浓缩，再进行结晶；结晶后，用离心机进行固液分离，对得到的湿柠檬酸晶体进行干燥与筛选，最后得到成品柠檬酸。

柠檬酸液态发酵及提取工艺

柠檬酸液态发酵及提取工艺 0802班生物科学饶慧 （指导教师：胡远亮） 0前言 柠檬酸(citric acid）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸(2-hydroxytricarboxylic acid)或2-羟基丙烷-l，2，3-三羧酸(2-hydroxy propane-1，2，3-triearboxylic acid)是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。分子式：C6H8O7（相对分子质量：192.13），无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大；从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质，加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。 柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。 柠檬酸循环(citric acid cycle)又称三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle)，克雷布斯循环(Krebs cycle)。体内物质糖、脂肪或氨基酸有氧氧化的主要过程。通过生成的乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成三羧酸（柠檬酸）开始，再通过一系列氧化步骤产生CO2、NADH及FADH2，最后仍生成草酰乙酸，进行再循环，从而为细胞提供了降解乙酰基而提供产生能量的基础。 实验发酵机理： 1）以薯干粉、玉米粉或淀粉等糖类为原料经黑曲霉柠檬酸产生菌（我们采用黑曲霉M288）糖化后产生高浓度的葡萄糖。 2）黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸：葡萄糖以EMP（糖酵解途径或者）、HMP

柠檬酸生产工艺

柠檬酸及生产工艺 摘要：柠檬酸广泛应用于食品工业、医药工业和化学工业等方面。它可利用糖质原料如土豆、地瓜中的淀粉等，在多种霉菌及黑曲菌的作用下，控制较低的温度和pH值、较高的通气量和糖浓度，用发酵法制得。 关键词：柠檬酸化工产品发酵法 1 产品说明 柠檬酸又名枸橼酸，学名3-羟基-3-羧基戊二酸，分子式C6H8O7为无色、无臭、半透明结晶或白色粉未，易溶于水及酒精。加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。 柠檬酸主要应用于食品工业，因为柠檬酸有温和爽快的酸味，普遍用于各种饮料、汽水、葡萄酒、糖果、点心、饼干、罐头果汁、乳制品等食品的制造。柠檬酸在化学工业上可作化学分析用试剂，用作实验试剂、色谱分析试剂及生化试剂，用作络合剂，掩蔽剂，配制缓冲溶液。采用柠檬酸或柠檬酸盐类作助洗剂，可改善洗涤产品的性能，可以迅速和沉淀金属离子，防止污染物重新附着在织物上，保持洗涤必要的碱性，使污垢和灰分散和悬浮，提高表面活性剂的性能，是一种优良的鳌合剂。 2 生产原理 2.1 生产方法简介 中国现有柠檬酸生产厂近百家，总年产能力约80万吨，是全球最大的柠檬酸生产国和出口国。目前，柠檬酸生产方法有水果提取法，

化学合成法和生物发酵法三种。水果提取法是指柠檬酸从柠檬、橘子、苹果等柠檬酸含量较高的水果中提取，此法提取的成本较高，不利于工业化生产。化学合成法的原料是丙酮，二氯丙酮或乙烯酮，此法工艺复杂，成本高，安全性低。而发酵法发酵周期短，产率高，节省劳动力，占地面积小，便于实现仪表控制和连续化，现已成为柠檬酸生产的主要方法。 2.2 反应方程式 C12H22011 +H20+302→2C6H8O7+4H2O (蔗糖) （柠檬酸） 3 工艺过程及流程图 3.1工艺过程 3.1.1菌种培养 在4～6波美度的麦芽汁内加入25％至30％的琼脂，然后接入黑曲霉菌种（无茵操作），在30～32℃条件下培养4天左右。这种培养方法称为“斜面培养”。将麸皮和水以1：1的比例掺拌，再加入10％的碳酸钙、0．5％的硫酸铵，拌匀后装入容量为250毫升的三角瓶中，用1．5公斤压力灭菌60分钟。接人斜面培养法培养出的菌种，培养96～120小时后即可使用。 3.1.2原料处理 湿粉渣必须经过压榨脱水，使含水量在60%左右；干粉渣含水量低，应按60％的比例补足水分；结块的粉渣需粉碎成二至四毫米颗粒。然后加入2%碳酸钙、10％至11％的米糠，掺匀后，堆放2小时，

柠檬酸发酵课程设计

《生物化学工程》课程设计 柠檬酸发酵生产及其生物反应器的设计 目录 一、引言 (3) 1.1柠檬酸简介 (3) 1.2柠檬酸生产的发展历史 (3) 1.3柠檬酸的应用 (4) 1.4柠檬酸的发酵方法 (5) 二、柠檬酸的生产 (5) 2.1原料 (5) 2.2菌种 (5) 2.3生产发酵机理 (6) 2.4生化过程 (7) 2.5工艺流程 (9) 2.6工艺流程图 (10) 三、生物反应器 (11) 3.1生物反应器构造图 (11)

3.2生物反应器的应用 (12) 3.3发酵生产中的条件控制 (16) 四、柠檬酸生产的后提取技术 (17) 4.1提取技术 (17) 五、深层液体柠檬酸发酵技术需改进方面 (19) 六、参考文献 (19) 一、引言 1.1柠檬酸简介 柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基-丙烷-1， 2，3羧酸，英文名称： citric acid，分子量： 192.14檬酸是一种含羟基的三元梭酸, 其化学 式为, 学名为一羟基一羧基戊二酸, 为无色半 透明晶体, 或白色颗粒, 或白色结晶粉末, 它 的结晶形态因结晶条件不同而不同, 虽有强烈酸味但令人愉快, 稍有一点后涩味。商品柠檬酸主要有无水柠檬酸C6H8O7和一水柠檬酸C6H8O72H2O 。柠檬酸易溶于水, 能溶于乙醉, 而不溶于醚、苯、甲苯、氯仿等有机溶剂。 1.2柠檬酸的发展简史

随着生物技术的进步，柠檬酸工业有了突飞猛进的发展,全世界柠檬酸产量已达0.4Mt。在柠檬酸发酵技术领域，由于高产菌株的应用和新技术的不断开拓，柠檬酸发酵和提取收率都有明显提高，每生产1t柠檬酸分别消耗2.5～2.8t糖蜜,2.2～2.3t薯干粉或1.2～1.3t蔗糖。人们正在大力开发固定化细胞循环生物反应器发酵技术 1.3柠檬酸的应用 柠檬酸由于具有无毒、安全、溶解性好、酸味可口、以及调节pH 值和对金属离子的鳌合作用等特点，传统用途以食用为主，作为酸味剂和抗氧化剂应用于食品与饮料工业。70 年代以后，柠檬酸在其他工业领域也得到了广泛应用，特别是在洗涤剂中代替磷酸盐作为增效助剂，在生产无磷洗涤剂中担任了重要角色。 1.3.1 用于食品与饮料 柠檬酸及其钠盐、钾盐，广泛地应用于各种饮料与食品中，作为酸味剂加入果酱、果冻、蜜饯、糖果、糕点和各种饮料中。在海产品、罐头水果和蔬菜中加

发酵过程的工艺控制

第十章发酵过程的工艺控制 ●知识要点和教学要求 （1）、理解微生物发酵的动力学 （2）、掌握补料分批培养 （3）、掌握连续培养 （4）、掌握发酵工艺控制最优化 （5）、掌握温度对发酵过程的影响及其控制 （6）、掌握PH值对发酵过程的影响和控制 （7）、掌握泡沫对发酵过程的影响和控制 ●能力培养要求 通过本章节的学习，学生能理解微生物发酵的分类及温度、PH值、泡沫等对发酵过程的影响和控制。 ●教案内容 10.1 微生物发酵的动力学 一般来说，微生物学的生长和培养方式可以分为分批培养、连续培养和补料分批培养等三种类型。 1. 分批培养 分批培养又称分批发酵，是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。 在分批培养过程中，随着微生长细胞和底物、代谢物的浓度等的不断变化，微生物垢生长可分为停滞期、对数生长期、稳定期和死亡期等四个阶段，图10-1为典型的细胞菌生长曲线。 2. 停滞期 停滞期是微生物细胞适应新环境的过程。

实际上，接种物的生理状态和浓度是停滞期长短的关键。如果接种物处于对数生长期，那么就很有可能不存在停滞期，微生物细胞立即开始生长。反过来，如果接种物本身已经停止生长，那么微生物细胞就需要有更长的停滞期，以适应新的环境。 3. 对数生长期 处于对数生长期的微生物细胞的生长速度大大加快，单位时间内细胞的数目或重量的增加维持恒定，并达到最大值。其生长速度可用数学方程表示： 式中，x---细胞浓度（g/l）；t---培养时间（hr）；---细胞的比生长速度（1/h）。如果当t=0时，细胞的浓度为x0(g/l)，上式积分后就为：于是，用微生物细胞浓度的自然对数对时间作图，就可得到一条直线，该直线的斜率就等于。 微生物的生长有时也可用“倍增时间”(td)来表示，“倍增时间”(td)定义为微生物细胞浓度增加一倍所需要的时间，即： 3. 稳定期 由于细胞的溶解作用，一些新的营养物质，诸如细胞内的一些糖类、蛋白质等被释放出来，又作为细胞的营养物质，从而使存活的细胞继续缓慢地生长，出现通常所称的二次或隐性生长。 4. 死亡期 当发酵过程处惊天动地死亡期时，微生物细胞内所储存的能量已经基本耗尽，细胞开始在自身所含的酶的作用下死亡。 5. 微生物分批培养生长速度的动力学方程

柠檬酸生产工艺

柠檬酸生产工艺介绍 摘要：柠檬酸应用广泛，在食品、医药等方面都占有重要位置。制取所用材料价格低廉，条件要求适中，且采用的深层发酵法具有普遍、经济的特点。 关键词：柠檬酸发酵 1.柠檬酸简介 柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸。柠檬酸是无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，无臭，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有后涩味。柠檬酸是生物体主要代谢产物之一，它在植物体内常与酒石酸、苹果酸、草酸等有机酸共存，在动物组织中柠檬酸以游离状态或以金属盐的形式存在。商品柠檬酸主要有一水化合物和无水物。 柠檬酸用途极其广泛，在食品工业广泛用于酸味剂、增溶剂、抗氧化剂、缓冲剂、除腥脱臭剂等。在其他工业中，可作金属净化剂、去垢剂、分散剂、电镀缓冲剂和配位剂、胶粘剂，并可用于治理工业废气、废水、回收金属等。在药物中可产生泡腾，使药物中活性配料迅速溶解并提高味觉能力。 制取柠檬酸可以从水果中提取、化学合成法和生物发酵。其中发酵是最常用和最有经济价值的方法。 2.柠檬酸发酵菌种及原材料。 2.1菌种及原材料 柠檬酸发酵工艺中，具有工业生产价值的微生物有黑曲霉、棒曲霉、文氏曲霉、芬曲霉、丁烯二酸曲霉、橘青霉、解脂假丝酵母等，其中黑曲霉和文氏曲霉在深层液态发酵生产柠檬酸最具有商品竞争优势。 凡能通过微生物代谢而产生柠檬酸的物质，都可以作为柠檬酸的发酵原料。如乙醇、木质素、纤维素、淀粉、蔗糖、乳糖、正烷烃和脂肪等。黑曲霉生产菌可以在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、糖蜜等多种培养基中生长、产酸，而且产量在微生物中最高。 2.2黑曲霉 在米曲汁或麦芽汁培养基上菌丝白色，不是绒球状，凸起。边缘整齐，菌落较小，带皱折。在麦芽汁培养基上生长4d成熟的孢子呈黑褐色。在察氏培养基上生长较慢，菌落边缘整齐，分生孢子梗短，分生孢子着生较密。菌丝顶端着生稀疏的大型的黑褐色孢子德，成熟后呈开花状而崩裂。分生孢子是串珠状着生，黑褐色，表面粗糙且有明显的刺状突起，4.7-5.2μm，成熟后遇振动易散落。黑曲霉具有多种活力较强的酶系，能利用淀粉质物质，并且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等具有一定的分解能力。所以黑曲霉可以边生长、边糖化、边发酵产酸的方式生产柠檬酸。 3.设备 发酵生产过程中主要的设备有发酵罐、种母罐、抽滤桶、脱色柱、结晶锅、浓缩锅等。 其中发酵罐是用来对微生物进行发酵之用，罐中有搅拌浆，罐身有传感器，用来控制发酵中各条件的变化。种母罐用来串培养种母醪。抽虑桶采用真空和加压过滤，用于固液分离。 4.柠檬酸深层液态发酵工艺 4.1工艺流程：培菌--发酵--中和--酸解--浓缩结晶 原料粉碎培养基制备实罐液化原始菌种环境空气 实罐灭菌试管斜面过滤 麸取菌种空气机

年产30000吨柠檬酸发酵设计..

生物工程设备课程设计 年产30000吨柠檬酸发酵设计学院：化工与材料学院 专业：姓名：指导老师： 生物工程 学号： 职称：高级工程师 中国·珠海 二○一五年十一月

北京理工大学珠海学院课程设计 诚信承诺书 本人郑重承诺：我所呈交的课程设计《年产30000吨柠檬酸发酵设计》是在指导教师的指导下，独立开展研究取得的成果，文中引用他人的观点和材料，均在文后按顺序列出其参考文献，设计使用的数据真实可靠。 承诺人签名： 日期：年月日

北京理工大学珠海学院12级生化工程设备课程设计 任务书 题目：年产30000吨柠檬酸发酵设计 专业学院：化工与材料学院 专业：生物工程 学生姓名： 指导教师：

一、主要研究内容： 1、设备所担负的工艺操作任务和工作性质，工作参数的确定。 2、容积的计算，主要尺寸的确定，传热方式的选择及传热面积的确定。 3、动力消耗、设备结构的工艺设计。 二、主要任务及目标： 1、工艺设计和计算 根据选定的方案和规定的任务进行物料衡算，热量衡算，主体设备工艺尺寸计算和简单的机械设计计算，汇总工艺计算结果。主要包括： （1）工艺设计 ①设备结构及主要尺寸的确定（D，H，H L ，V，V L ，Di等） ②通风量的计算 ③搅拌功率计算及电机选择 ④传热面积及冷却水用量的计算 （2）设备设计 ①壁厚设计（包括筒体、封头和夹套） ②搅拌器及搅拌轴的设计 ③局部尺寸的确定（包括挡板、人孔及进出口接管等） ④冷却装置的设计(包括冷却面积、列管规格、总长及布置等) 2、设计说明书的编制 设计说明书应包括设计任务书，目录、前言、设计方案论述，工艺设计和计算，设计结果汇总、符号说明，设计结果的自我总结评价和参考资料等。 3、绘制设备图一张 设备图绘制，应标明设备的主要结构与尺寸。 指导教师签字：年月日 工作小组组长签字：年月日

综合实验1：柠檬酸发酵及产物提取

综合实验1：柠檬酸发酵及产物提取 （一）柠檬酸发酵 一、实验原理 柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羧生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。但就柠檬酸产生菌而言，由于其顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式： 2 C6H12O6 + 3 O2→2 C6H8O7 + 4 H2O 国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。 二、实验器材 （一）材料 1．菌种：黑曲霉2．蔗糖、硫酸铵等 （二）主要仪器设备 1．旋转式摇床、超净工作台、15L发酵罐等 三、操作步骤 1．种子培养基制备： 马铃薯培养基配方:(1000ml) 马铃薯（去皮）200g 葡萄糖（或蔗糖）20g 琼脂15~25g 水1000ml 自然pH 2．种子液培养：将已灭菌的种子培养基接入一环斜面孢子于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养24~36h。 3．种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1~2万之间，无异味、无杂菌污染；pH2~2.5；酸度1.5~2.0%。 4．发酵培养基制备：蔗糖15%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.1%，7水合硫酸镁0.025%。 5. 上罐灭菌（操作同实验一） 5．发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的5%接入到已灭菌的发酵培养基中，于35℃±1℃、200r/min条件下发酵4天。 6.分别在0，24，48，72，96小时测定一下参数。 四、实验结果 1．对种子液进行镜检，画下菌丝形态，并测定菌球直径及粗略估算每ml种子液中的菌球数。 2．测定成熟发酵液的酸度，并就发酵结束后的菌体形态作出描述。 3．计算柠檬酸发酵的转化率，即每100克葡萄糖经转化所能生成的柠檬酸克数，柠檬酸酵的理论转化率按下列反应计算应为106.7%。 总反应式：2C6H12O6+3O2→2C6H8O7+4H2O 180 192 理论转化率=192/180=106.7%

柠檬酸及生产工艺

艺工及生产柠檬酸柠檬酸的简介.一 1. 柠檬酸的理化性质 柠檬酸（Citric acid），又称枸椽酸，是一种三元羧酸,其学名为3-羟基-3-羧基戊二酸，分子式C6H8O7(无水物)，在自然界中存在于柠檬、柑桔、梅、李子、梨、桃、无花果等水果中。柠檬酸具有无毒，无色，无臭特性，一般为半透明结晶或白色粉末，易溶于水、乙醇、乙腈、乙醚等[1]，不溶于苯，微溶于氯仿。相对密度cm3，熔点153℃(失水)。柠檬酸结晶形态因结晶条件不同而不同，有无水柠檬酸，也有含结晶水的柠檬酸。在干燥空气中微有风化性，在潮湿空气中有潮解性，175℃以上分解放出水及二氧化碳。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H＋可以电离；水溶液呈酸性，加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。 2. 柠檬酸的用途 柠檬酸具有令人愉悦的酸味，入口爽快，无后酸味，安全无毒，被广泛用作食品和饮料的酸味剂；能与二价或三价的阳离子形成络合物，被用作金属加工的鳌合剂和洗净剂（起软化水作用的洗净力补充剂）；还能衍生形成许多衍生物，可用作有机化学工业的原料。因此被广泛用于食品饮料、医药化工、清洗与化装品、 有机材料等领域，是目前世界需求量最大的一种有机酸[2]，到目前还没有一种可以取代柠檬酸的酸味剂。 二.生产技术 柠檬酸的生产方法共可分为3 种: 水果提取法,化学合成法, 生物发酵法

三。发酵法又分为固体发酵法和液体深[18]，目前以发酵法生产柠檬酸为主[17]种 不适合大规模的生产应用。固态发酵能耗小但劳动力大，占地面积大，层发酵法。深层通风发酵法采用不锈钢罐体，机械搅拌通风，微生物在液体相中分布均匀，发酵时不生成孢子，全部菌体细胞用于代谢柠檬酸，发酵速度高，实现了机械化或自动化操作，利于大规模生产。 生物发酵法制取柠檬酸.三 本工艺选择的原料及生产方法1. 本次生产工艺设计以薯干为原料，采用直接粉碎、调浆、液化，进行好气液体深层发酵，钙盐法提取，最后结晶、干燥得到柠檬酸 工艺流程2. 接收糖浆后，根据糖浆组成作适当的处理或配制，配成发酵原料，进行连续杀菌并冷却后，进入发酵罐，加入菌种和净化压缩空气后进行发酵；发酵液经升中和处理；再经过过滤洗涤，得到柠檬酸钙固温、过滤处理后，进入中和罐，用酸解，并加入活性炭进行脱色；然后，通过带式过滤机体，送入酸解罐，再添加浓缩，酸解过滤液经离子交换处理后，及废炭；进行蒸发、过滤、酸解过滤，除去 再进行结晶；结晶后，用离心机进行固液分离，对得到的湿柠檬酸晶体进行干燥与筛选，最后得到成品柠檬酸。 淀粉筛配 酸

发酵工艺过程控制样本

第七章发酵工艺过程控制 教学目的: 1、熟悉发酵过程的主要控制参数; 2、掌握各因素对发酵过程的影响、过程控制方法和原理; 3、熟悉几种发酵操作类型。 教学方法: 讲授 教学手段: 使用多媒体课件 教学内容: 第一节发酵过程中的代谢变化与控制参数 一、发酵工艺过程控制的重要性 从产物形成来说, 代谢变化就是反映发酵中的菌体生长、发酵参数的变化( 培养基和培养条件) 和产物形成速率这三者之间的关系。 二、发酵过程的代谢变化规律 这里介绍分批发酵、补料分批发酵、半连续发酵及连续发酵四种类型的操作方式下的代谢特征。 1、分批发酵 指在一个封闭的培养系统内含有初始限制量的基质的发酵方式。即一次性投料, 一次性收获产品的发酵方式。 在分批培养过程中根据产物生成是否与菌体生长同步的关系, 将微生物产物形成动力学分为 ( 1) 生长关联型 产物的生成速率与菌体生长速率成正比。这种产物一般是微生物分解基质的直接产物, 如酒精, 但也有某些酶类, 如脂肪酶和葡萄糖异构酶 对于生长关联型产品, 可采用有利于细胞生长的培养条件, 延长与产物合成有关的对数生长期。 ( 2) 非生长关联型 产物的生成速率与菌体生长速率成无关, 而与菌体量的多少有关。

对于非生长关联型产品, 则宜缩短菌体的对数生长期, 并迅速获得足够量的菌体细胞后, 延长稳定期, 从而提高产量。 2、补料-分批发酵 是指分批培养过程中, 间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。 与传统的分批发酵相比, 优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。低基质浓度的优点: ( 1) 能够除去快速利用碳源的阻遏效应, 并维持适当的菌体浓度, 使不至于加剧供氧的矛盾; ( 2) 克服养分的不足, 避免发酵过早结束。 ３、半连续发酵 是指在补料－分批发酵的基础上, 间歇地放掉部分发酵液的培养方法。 优点: ( 1) 能够除去快速利用碳源的阻遏效应, 并维持适当的菌体浓度, 使不至于加剧供氧的矛盾; ( 2) 克服养分的不足, 避免发酵过早结束; ( 3) 缓解有害代谢产物的积累。 ４、连续发酵 又称连续流动培养或开放型培养, 即培养基料液连续输入发酵罐, 并同时放出含有产品的发酵液的培养方法。在这样的环境中培养, 所提供的基质对菌的生长就受到限制, 培养液中的菌体浓度能保持一定的稳定状态。 与传统的分批发酵相比, 连续培养有以下优点: ( 1) 维持低基质浓度: 能够除去快速利用碳源的阻遏效应, 并维持适当的菌体浓度, 使不至于加剧供氧的矛盾; ( 2) 避免培养基积累有毒代谢物; ( 3) 能够提高设备利用率和单位时间的产量, 节省发酵罐的非生产时间; ( 4) 便于自动控制。 但连续培养也有缺点:

实验室生产柠檬酸

实验五黑曲霉发酵生产柠檬酸 柠檬酸(citric acid)又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸(2-hydroxytricarboxylic acid)或2-羟基丙烷-l，2，3-三羧酸(2一hydroxy propane-1，2，3一triearboxylic acid)。商品柠檬酸 有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为C 6H 8 O 7 ·H 2 O，相对分子 质量为210.14。另一种为无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为C 6H 8 O 7 ，相对分子质量 192.13。柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、 医药、化工、化妆品、清洗(洗涤)、建筑等工业部门。其中食品和饮料业占56％，清洗(洗涤剂)业占20％，医药和化妆品占11％，其他工业占13％。 1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。．1893年后发现微生物可产生柠檬酸，1951年美国Miles公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法生产柠檬酸。 能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。最具商业竞争优势的是采用黑曲霉、文氏曲霉和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸。 本实验以薯干粉或玉米粉为原料，采用黑曲霉，通过深层液体(摇瓶)发酵产生柠檬酸。柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加入碳酸钙中和，生成柠檬酸钙沉淀。将获得柠檬酸钙再用稀硫酸酸解生成柠檬酸和硫酸钙沉淀而制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性炭脱色、离子交换脱盐制得精制柠檬酸液。精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP－98版标准的无水或一水柠檬酸。 一、实验目的 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及中间分析方法。 二、实验原理 黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过糖酵解途径（EMP）和HMP途径转变为丙酮酸； 丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO 2 ，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶）的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的α－酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬酸处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为： C 6H 12 O 6 +1.5O 2 C 6 H 8 O 7 +2H 2 O 柠檬酸理论得率为106.7％，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7％。

柠檬酸液态发酵及提取工艺

柠檬酸液态发酵及提取工艺综述 摘要:发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵3种方法。液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。国内目前有很多人研究了MgCl2、普鲁兰酶、植酸钠、磷浓度、菌种、木薯原料、纤维素糖化液、玉米粉淀粉混合原料、接种量和碳氮比、溶解氧、发酵罐搅拌系统、尿素、乙醇等添加剂、初始含糖量、温度、pH、发酵时间等等对黑曲霉发酵产酸的影响，从而改良提取工艺。 关键词：柠檬酸液态发酵提取工艺 一、前言 柠檬酸(citric acid）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸(2-hydroxytricarboxylic acid)或2-羟基丙烷-l，2，3-三羧酸(2-hydroxy propane-1，2，3-triearboxylic acid)是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。分子式：C6H8O7（相对分子质量：192.13），无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大；从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质，加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。 柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。 二、柠檬酸液态发酵 1、柠檬酸发酵机理 柠檬酸循环(citric acid cycle)又称三羧酸循环[5］(tricarboxylic acid cycle)，克雷

发酵工艺控制

发酵工艺控制 2.1概述 一. 发酵体系的主要特征 1. 细胞内部结构和代谢反应的复杂性 2. 细胞所处环境的复杂性 3. 过程系统状态的时变性及参数的多样性和复杂性 影响因素多，有的因素未知，主要影响因素变化。 发酵水平主要取决于：生产菌种的特性；对工艺条件的控制（适合程度） 必须了解：菌体的生理代谢规律工艺条件对发酵过程的影响及其控制发酵过程的有关变化规律 常规发酵的工艺控制参数：温度、pH、搅拌转速与功率、空气流量、罐压、液位、补料速率及补料量等。 二. 发酵过程的参数检测 1.直接状态参数 指能直接反映发酵过程中微生物生理代谢状况的参数 包括：pH、DO、溶解CO2、尾气O2、尾气CO2 、黏度、基质和产物浓度、菌体浓度（OD、DCW、湿重）等 参数的检测 在线检测各种传感器：pH电极、DO电极、温度电极、液位电极、泡沫电极尾气分析仪：测尾气O2和CO2含量 离线检测分光光度计、pH 计、温度计、气相色谱（GC)、液相色谱（HPLC)、色质连用（GC-MS)等 2.间接状态参数 指利用直接状态参数计算求得的参数 包括：比生长速率μ、摄氧率OUR、CO2释放率CER、呼吸商RQ、氧的得率系数YX/O 、氧体积传质系数KLa、基质比消耗速率QS、产物比生成速率Qp等 综合各种状态参数，获得代谢过程的各种信息，从而对发酵过程做出相应的调整和控制，以获得最经济的发酵生产。 三. 发酵过程的代谢调控和优化 1. 代谢调控 以代谢（流）的调节最重要 调节酶的合成量，称为“粗调”调节酶的催化活性，称为“细调” 工艺控制和过程优化的实质，就是利用各种方法和手段，使细胞的外部和内部环境最适合基质和能量流向产物合成的生物途径，以获得最大的产量。 2. 发酵过程优化的一般步骤 确定反映发酵过程的各种理化参数及其检测方法 研究这些参数的变化对发酵过程的影响及其机制，获得最佳的范围和最适的水平 建立数学模型定量描述个参数间随时间的变化关系，为过程优化控制提供依据 通过计算机实施在线自动检测和控制，验证各种控制模型的可行性及其适用范围，实现发酵过程的最优控制 2.2基质浓度对发酵的影响及其控制 先进的培养基组成是充分支持高产、稳产和经济的发酵过程的关键因素之一。 一. 基质种类 一般包括：碳源、氮源和无机盐 前体

柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点,如何控制备课讲稿

1、柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如何控制? 答：（1）EMP畅通无阻：控制Mn2+、NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制；控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。 （2）通过CO 2固定反应生产C 4 二羧酸，强化这一反应的方法：适量的生物素。 （3）控制培养基中的Fe2+的浓度，使顺乌头酸水合酶失活。 2、说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。 答：乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为： (1)氧是发酵过程生成的NADH 2 重新氧化的氢受体。 (2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链。 当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。 3、简述CO2固定反应对提高柠檬酸产率的意义？ 答：（1）无CO2固定反应的产率 合成1分子柠檬酸需要3分子乙酰 辅酶A，也就是需要 1.5分子的葡萄 糖。 理论产率为： 192 /( 180×1.5) = 71.1%

（2）通过CO 2固定反应提供C 4 二羧酸 葡萄糖生成柠檬酸的全过程中，在碳平衡方面没有碳原子的损失，在乙酰COA 和草酰乙酸缩合时还从水中引进一个氧原子，总反应式为： C6H12O6+1.5O2→C6H8O7+2H2O 可见柠檬酸发酵对糖的理论转化率为106.7％，以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7％ 4、简述黑曲霉柠檬酸高产菌的生理特征？ 答：（1）能耐高浓度的柠檬酸（15%以上）而不利用和分解柠檬酸。 （2）耐高浓度葡萄糖，能产生和分泌大量的酸性淀粉酶和酸性糖化酶 （3）能抗微量金属离子，尤其能抗较高浓度的锰、Mn2+、Cu2+。 （4）在深层液体发酵培养时，能形成大量的细小球体，球体直径为0.1mm。（5）在以葡萄糖为唯一碳源的合成培养基上。生长不好，生成小菌落，包子形成能力弱。 （6）在生长、繁殖期，细胞内具有较高水平的氨基酸，NH 4 +，水平高 （7）菌丝体中含有底水平的甘油三酯和磷酸酯。 （8）细胞壁几丁质含量高，但β-葡聚糖和聚半乳糖含量低。 （9）在生长和产酸期，细胞内蛋白质、核酸水平低。 （10）具有很强的侧系呼吸链活性，此侧系呼吸链不产生ATP。 5、详述黑曲霉柠檬酸生产菌的分离、选育原理与操作过程？

实验24-黑曲霉发酵生产柠檬酸

黑曲霉发酵生产柠檬酸 柠檬酸（citric acid ）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid ）、2--羟基丙烷-1，2，3-三羧酸（2-hydroxy propane-1，2，3-tricarboxylic acid ）。商品柠檬酸有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为C 6H 807·H 2O,相对分子质量为210.14。另一种为无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为C 6H 8O 7，相对分子质量192.13。柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、清洗（洗涤）、建筑等工业部门。1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。1893年后发现微生物可产生柠檬酸，1951年美国Miles 公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法生产柠檬酸。 能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。至今世界上消费的柠檬酸主要采用发酵法，而最具商业竞争优势的是采用黑曲霉（Asp.niger ）、文氏曲霉(Asp.Wentii )和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸。 本实验以薯干粉或玉米粉为原料，采用黑曲霉，通过深层液体（摇瓶）发酵产生柠檬酸。柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加入碳酸钙中和，生成柠檬酸钙沉淀。将获得柠檬酸钙再用稀硫酸酸解生成柠檬酸和硫酸钙沉淀而制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性碳脱色、离子交换脱盐制得精制柠檬酸液。精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP-98版标准的无水或一水柠檬酸。 5.3.1 柠檬酸发酵 1、 实验目的 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及发酵过程中生化指标的分析方法。 2、实验原理 黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP ）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO 2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A ，然后在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶）的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的ɑ-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄型”,代谢流汇集于柠檬酸处,使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为: O H O H C O O H C 27862612625.1+→+ 柠檬酸理论得率为106.7%，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。 3、实验装置材料与流程 （1） 实验装置与材料 ① 实验装置 旋转式摇床、恒温培养箱、高速离心机（4000-6500r/min ）。 ② 菌种 黑曲霉（Asp.niger ）柠檬酸生产菌株Co8-27。 ③ 材料 麸皮、马铃薯 、薯干粉、蔗糖、玉米粉、大麦芽、大米、琼脂、淀粉酶（中温酶与高温酶）。 ④ 器皿 15mL 试管、100mL 三角瓶、2000mL 烧杯、500mL 三角瓶、离心管若干。 ⑤ 试剂 0.1429mol/L NaOH 、1%酚酞试剂、斐林甲、乙溶液、0.01%标准葡萄糖溶液。 （2） 试剂

黑曲霉发酵生产柠檬酸生产工艺的优化

黑曲霉发酵生产柠檬酸生产工艺优化 摘要 柠檬酸（2-羟基丙烷三羧酸），是重要的工业原料。可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。实验研究了不同硫酸铵浓度分别对黑曲霉摇瓶发酵和实罐发酵生产柠檬酸的影响。在菌浓度、发酵过程PH、酸度、残糖、温度在发酵过程中的变化几个方面对实罐和摇瓶发酵进行了相关比较。结果表明：1）摇瓶发酵的最适硫酸铵浓度为0.4%；实罐发酵最适硫酸铵浓度为0.5%，实罐发酵时硫酸铵浓度过高将产生大量泡沫不利发酵；2）实罐发酵与摇瓶发酵在起始含糖量、菌浓度及发酵温度相同的情况下，随发酵进行，摇瓶发酵的温度更稳定，两者的菌浓度、残糖、PH值变化规律高度一致，酸度变化规律基本一致。另外实验还就温度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响作用进行了探讨，结果表明实罐发酵的最适温度约为35℃，温度过高会导致发酵液水分流失过多而使发酵失败。 关键词：黑曲霉，柠檬酸，硫酸铵，实罐，摇瓶 Abstract Citric acid(2-hydroxytricarboxylic acid), is an important industrial raw material. It can be extracted from plant materials or be obtained by fermentation of sugar. In this treatise, we studied the different impacts to the fermentations in erlenmeyers and fermenters which were made by the different concentration of the ammonium sulfate. We compared the differences between the fermentation in erlenmeyers and fermenters by analyzing the concentration of the bacteria, the PH during the fermentation process, acidity, residual sugar and the temperature changes during the fermentation process. The results showed that: 1) the optimum concentration of ammonium sulfate for the fermentation in erlenmeyer is 0.4% while the optimum concentration of ammonium sulfate for the fermentation in fermenters is 0.5%.when the concentration of ammonium sulfate is too high, the fermentation cannot be succeed for the large number of foam. 2) when the initial sugar content, bacteria concentration and fermentation temperature are under the same circumstances, the fermentation in the erlenmeyer has more stable fermentation temperature. Both the two methods of fermentations have the same variation in the concentration of the bacteria ,residual sugar, PH value and changes of acidity. Another experiment also studied the influence to the fermentation in the fermenter made by temperature. The result showed that the production of citric acid from the fermentation of Aspergillus niger is the highest when the temperature is 35℃,when the temperature is too high , fermentation will fail for the excessive loss of water. Keywords：citric acid, Aspergillus niger, fermentation, erlenmeyer, fermenter, ammonium sulfate 1. 课题背景 1.1柠檬酸简介[1]