蛋白质沉淀反应实验

蛋白质的沉淀反应

一、目的和要求

1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识

2、掌握几种沉淀蛋白质的方法

3、了解蛋白质变性与沉淀的关系

二、沉淀反应

（一）原理

在水溶液中，蛋白质分子的表面上由于有水化层和同性电荷的作用，所以成为稳定的胶体颗粒。但这种稳定的状态是有条件的。在某些理化因素的作用下，蛋白质分子表面带电性质发生变化、脱水甚至变性，则会以固态形式从溶液中析出，这个过程就称为蛋白质的沉淀反应。蛋白质的沉淀反应可分为以下两种类型：

1、可逆沉淀反应

沉淀反应发生后，蛋白质分子内部结构并没有发生大的或者显著变化。在沉淀因素去除后，又可恢复其亲水性，这种沉淀反应就是可逆沉淀反应，也叫做不变性沉淀反应。属于这类沉淀反应的有盐析作用、等电点沉淀以及在低温下短时间的有机溶剂沉淀法等。

2、不可逆沉淀反应

蛋白质在沉淀的同时，其空间结构发生大的改变，许多副键发生断裂，即使除去沉淀因素，蛋白质也不会恢复其亲水性，并丧失生物活性，这种沉淀反应就是不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、强酸、强碱、加热、强烈震荡、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。

（二）盐析

1、材料与试剂

（1）10%的卵清蛋白溶液（要求新鲜配制）、浓蛋白溶液（2）饱和硫酸铵溶液（3）固体硫酸铵（4）滤纸、玻棒

2、操作方法

（1）取试管一支，加入浓蛋白溶液2ml，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置10分钟将出现沉淀。此沉淀物为球蛋白。

（2）取上清液于另一支试管。

（3）向上清液液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻棒搅拌，直至粉末不再溶解为止。静置数分钟后，沉淀析出的是清蛋白。

（4）向两支试管中分别加水，观察其沉淀是否溶解。

（三）重金属盐沉淀

重金属离子如Pb 2+、Cu 2+、Hg 2+、Ag 2+ 等可与蛋白质分子上的羟基结合生成不溶性金属盐而沉淀： Pr

-3

+-Pr COO -NH 2Ag +Pr NH

2

重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，特别是在碱金属盐类存在时。因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质；临床上用蛋白质解除重金属盐引起的食物中毒。

1、材料与试剂

（1）10%的卵清蛋白溶液（2）0.1mol/L 氢氧化钠溶液

（3）3%硝酸银溶液 （4）0.1%硫酸铜溶液 （6）试管3支

2、操作方法

（1）取试管2支，分别编号后各加入1ml 10%的卵清蛋白溶液。

（2）各管再加入一滴0.1mol/L 氢氧化钠溶液。

（3）向1管加3%硝酸银溶液3～4滴；向2管加0.1%硫酸铜溶液3～4滴。混匀后观察沉淀的生成。

（四）生物碱试剂沉淀反应 生物碱试剂能与蛋白质分子中的氨基结合生成不溶性沉淀，反应如下： Pr

NH 3

+COO -

3Pr NH

3COOH .+

OOCCCl 3 1、材料与试剂 （1）10%的卵清蛋白溶液 （2）5%三氯乙酸溶液

2、操作方法

取试管一支，加10%的卵清蛋白溶液20滴后再加入5%三氯乙酸溶液10滴，混匀后观察沉淀的出现。

（五）有机溶剂沉淀反应

1、材料与试剂

（1）10%的卵清蛋白溶液（2）95%乙醇溶液

2、操作方法

取试管1支，加10%的卵清蛋白溶液10滴后，再加入95%乙醇溶液20滴，边加边混匀。静置片刻后观察结果。

习题

1、盐析时为什么分别用饱和硫酸铵溶液和硫酸铵粉末？

2、重金属盐沉淀蛋白质注意什么？

实验二、沉淀反应

实验二沉淀反应 一、实验目的 1、了解沉淀的生成、溶解和沉淀的转化条件，掌握沉淀平 衡，同离子效应以及溶度积原理。 2、学习离子分离操作和同离子效应和电动离心机的使用。 二、实验的内容 1、沉淀的生成和溶解 ①查表得：PbI2的ksp为7.1×10-9 取1d 0.1mol/L的Pb（NO3）2+9d水，取1d+9d水，配成1×10-3mol/L的Pb（NO3）2溶液 取1d 0.1mol/L的kI+9d水，取其中1d+9d水，再取1d+1d 水+首先配好的1×10-3mol/L的Pb（NO3）2溶液2d→不出现黄色沉淀，溶液无变化。 计算：Q=【pb2+】·【I-】2=25/8×10-11﹤ksp 计算值也不应该有沉淀。 反应方程：pb2++ 2I-≒pbI2 实验结论：1、计算结果与实际相符，Q﹤ksp，不出现沉淀 2、没看到pbI2黄色沉淀，不等于不存在pbI2，溶液中还是存在少量的pbI2 ②查表得：pbs的ksp=8×10-28 pbcro4ksp=2.8×10-13 取1d 0.1mol/L的Na2S+1d0.1mol/L的k2cro4,稀释至2.5mL 取1d上述溶液+1d 0.1mol/L的Pb（NO3）2→有棕黄色的混

合沉淀出现。 计算：Q﹙pbs﹚=【S2-】【pb2+】=4×10-6﹥其ksp Q﹙pbcro4﹚=【S2-】【cro42-】=4×10-6﹥其ksp 反应方程：pb2++ S2-≒pbs pb2++ cro42-≒pbcro4 实验结论：只要Q﹥ksp，就会出现沉淀，在同一溶液中也不会因沉淀的ksp的大小而出现沉淀的先后，而是同时沉淀。如随着某离子的加入，Q先达到某个沉淀的ksp，后达到另一个沉淀的ksp，这是才会出现沉淀的先后之分。 2、沉淀的溶解和转化 1d 0.1mol/L Pb（NO3）2+2d 0.1mol/L NaCL→Pbcl2↓（白色）+2d 0.1mol/L kI溶液→pbI2↓(黄色) {离心，去掉上清液→稀释至0.5mL}+饱和Na2so4晶体→ pbso4↓(白色) +0.1mol/L k2cro4→pbcro4↓（黄色）+2~3d 0.1mol/L k2S→pbs↓(黑色) {离心，取上清液，颜色为粉红色} ★查表得：ksp（Pbcl2）=1.6×10-5 ksp（pbI2）=7.1×10-9 ksp（pbso4）=1.6×10-8ksp（pbcro4）=2.8×10-13 ksp（pbs）=8×10-28 ★计算：例Pbcl2转化为pbI2的过程： Pbcl2+ 2I-≒pbI2+2cl- K°=【cl-】2/【I-】2=【pb2+】【cl-】2/【pb2+】【I-】2= ksp （Pbcl2）/ ksp（pbI2）=1.6/7.1×104 K°值越大，沉淀转化的越完全，对同一类型的沉淀

常用蛋白质沉淀方法有哪些

P13三、5 、常用蛋白质沉淀方法有哪些？列举沉淀应用的实例 蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀(precipitation)，变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。 常用蛋白质沉淀的方法有： (一)盐析(Salting Out) 在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来，盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。 (二)重金属盐沉淀蛋白质 蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀。重金属沉淀的蛋白质常是变性的，但若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。如临床上利用蛋白质能与重金属盐结合的这种性质，抢救误服重金属盐中毒的病人，给病人口服大量蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。 (三)生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质 蛋白质又可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀。如临床血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。 (四)有机溶剂沉淀蛋白质 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。

蛋白质沉淀反应实验

蛋白质沉淀反应实验集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-

蛋白质的沉淀反应 一、目的和要求 1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 2、掌握几种沉淀蛋白质的方法 3、了解蛋白质变性与沉淀的关系 二、沉淀反应 （一）原理 在水溶液中，蛋白质分子的表面上由于有水化层和同性电荷的作用，所以成为稳定的胶体颗粒。但这种稳定的状态是有条件的。在某些理化因素的作用下，蛋白质分子表面带电性质发生变化、脱水甚至变性，则会以固态形式从溶液中析出，这个过程就称为蛋白质的沉淀反应。蛋白质的沉淀反应可分为以下两种类型： 1、可逆沉淀反应 沉淀反应发生后，蛋白质分子内部结构并没有发生大的或者显着变化。在沉淀因素去除后，又可恢复其亲水性，这种沉淀反应就是可逆沉淀反应，也叫做不变性沉淀反应。属于这类沉淀反应的有盐析作用、等电点沉淀以及在低温下短时间的有机溶剂沉淀法等。 2、不可逆沉淀反应 蛋白质在沉淀的同时，其空间结构发生大的改变，许多副键发生断裂，即使除去沉淀因素，蛋白质也不会恢复其亲水性，并丧失生物活性，这种沉

淀反应就是不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、强酸、强碱、加热、强烈震荡、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。 （二）盐析 1、材料与试剂 （1）10%的卵清蛋白溶液（要求新鲜配制）、浓蛋白溶液（2）饱和硫酸铵溶液（3）固体硫酸铵（4）滤纸、玻棒 2、操作方法 （1）取试管一支，加入浓蛋白溶液2ml，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置10分钟将出现沉淀。此沉淀物为球蛋白。 （2）取上清液于另一支试管。 （3）向上清液液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻棒搅拌，直至粉末不再溶解为止。静置数分钟后，沉淀析出的是清蛋白。 （4）向两支试管中分别加水，观察其沉淀是否溶解。 （三）重金属盐沉淀 重金属离子如Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag2+等可与蛋白质分子上的羟基结合生成不溶性金属盐而沉淀： 重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，特别是在碱金属盐类存在时。因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质；临床上用蛋白质解除重金属盐引起的食物中毒。 1、材料与试剂 （1）10%的卵清蛋白溶液（2）0.1mol/L氢氧化钠溶液 （3）3%硝酸银溶液（4）0.1%硫酸铜溶液（6）试管3支

蛋白质的沉淀与变性反应

實驗3 蛋白質的沉澱與變性反應 目的 (1)瞭解蛋白質的沉澱反應、變性作用和凝固作用的原理及它們的相互關係。 (2)學習鹽析和透析等生物化學的操作技術。 原理 在水溶液中，蛋白質分子的表面，由於形成水化層和雙電層而成為穩定 的膠體顆粒，所以蛋白質溶液和其他親水膠體溶液相類似。但是，蛋白質膠 體顆粒的穩定性是有條件的，相對的。在一定的物理化學因素影響下，蛋白 質顆粒失去電荷，脫水，甚至變性，則以固態形式從溶液中析出，這個過程 稱為蛋白質的沉澱反應。這種反應可分為以下兩種類型: 一、可逆澱汲反應 在發生沉澱反應時，蛋白質雖已沉澱析出，但它的分子內部結構並未發 生顯著變化，基本上保持原有的性質，沉澱因素除去後，能再溶於原來的溶 劑中。這種作用稱為可逆沉澱反應，又叫作不變性沉澱反應。屬於這一類的 反應有鹽析作用; 在低溫下，乙醇、丙酮對蛋白質的短時間作用以及利用等 電點的沉澱等。 二、不可逆沉澱反應

在發生沉澱反應時，蛋白質分子內部結構、空間構象遭到破壞，失去原來的天然性質，這時蛋白質已發生變性。這種變性蛋白質的沉澱不能再溶解於原來溶劑中的作用叫作不可逆沉澱反應。重金屬鹽、植物鹼試劑、過酸、過鹼、加熱、震盪、超聲波，有機溶劑等都能使蛋白質發生不可逆沉澱反應。試劑和器材 一、試劑 1．蛋白質溶液 取5m1雞蛋蛋白蛋清，用蒸餾水稀釋至100ml，攪拌均勻後用4-8層紗布過濾，新鮮配製。 2．蛋白質氯化鈉溶液 取20ml蛋清，加蒸餾水200ml和飽和氯化鈉溶液100ml，充分攪勻 後，以紗布濾去不溶物(加入氯化鈉的目的是溶解球蛋白)。 硫酸銨粉末，飽和硫酸銨溶液，3%硝酸銀，0.5% 醋酸鉛，10% 三氯醋酸，濃鹽酸，濃硫酸，濃硝酸，5% 磺基水楊酸(sulfosalicyclic acid)，0.1% 硫酸銅，飽和硫酸銅溶液，0.1% 醋酸，10% 醋酸，飽和氯化鈉溶液，10% 氫氧化鈉溶液。 二、器材 試管，試管架，小玻璃漏斗，濾紙，玻璃紙，玻璃棒，500ml 燒杯，10 ml量筒。

实验三 蛋白质的颜色反应和沉淀反应

实验三蛋白质的颜色反应和沉淀反应 一、目的： 1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应及其机理。 二、原理： (一)蛋白质的颜色反应原理 蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。 (二)蛋白质的沉淀反应原理 蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。 蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。 三、仪器、试剂和材料 1. 卵清蛋白液：将鸡蛋白用蒸馏水稀释20～40倍，2～3层纱布过滤，滤液冷藏备用。 2. 饱和硫酸铵溶液：称硫酸铵850g 加于1000mL 蒸馏水中，在70～80℃下搅拌促溶，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。 3. 1%醋酸铅溶液 4. 1%硫酸铜溶液 5. 0.1%茚三酮溶液：0.1g 茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。 6. 浓硝酸：比重1.42。 7.试管及试管架、吸管、量筒、布氏漏斗。

实验一 蛋白质的沉淀及变性

实验一蛋白质的沉淀及变性 发布时间：2010-12-23 浏览次数：850 一、实验目的 1．熟悉蛋白质的沉淀反应。 2．进一步掌握蛋白质的有关性质。 二、实验原理 蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生 物学活性的现象称为蛋白质的变性作用。变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构 的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。 引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。化学因素 有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。不同蛋白质对各种因 素的敏感程度不同。 用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影 响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或 用水稀释时又可溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及pH有关。 分子量大的蛋白质(如球蛋白)比分子量小的(如白蛋白)易于析出。改变盐浓度，使不同分子量的蛋白质分别析出。 三、实验材料 1．新鲜蛋清或血清，蛋白质溶液。 2．固体硫酸铵及饱和硫酸铵溶液。 3．95％乙醇，1％CuSO4，饱和苦味酸，0.1mol/LHAC，NaCl, 4．试管，三角漏斗、玻棒，滤纸，试管架酒精灯，移液管。 四、操作方法 1．卵清蛋白的分离

(1)、取卵清约2 ml于试管中，加等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，蛋白质析出，静置，用滤纸过滤致滤液澄清，沉淀为卵球蛋白，将此沉淀用2 ml半饱和硫酸铵洗涤一次。 (2)、将析出卵清球蛋白后的滤液放人试管中，再加人固体硫酸铵使之达饱和，观察有无沉淀产生，若有沉淀，则过滤之，滤出的沉淀却为卵清白蛋白。 2．乙醇沉淀蛋白质（乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体质的水化层而使其沉淀析出）。 取蛋白质滤液1ml，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全）。带溶解后再加入95％乙醇2ml混匀，观察有无沉淀析出。 3．重金属盐沉淀蛋白质。蛋白质与重金属离子结合成不容性盐类而沉淀。取试管1支加蛋白质溶液2ml，滴加1％CuSO4溶液，至有沉淀生成。 4．生物碱试剂沉淀蛋白质。植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如苦味酸。生物碱试剂能和蛋白质结合生成沉淀，可能因蛋白质和生物碱含有相似的含氮基团。2ml蛋白质溶液及1％醋酸溶液4－5滴，加5％苦味酸数滴。

沉淀反应实验报告材料

实验蛋白质的沉淀反应与颜色反应 一、实验目的 掌握鉴定蛋白质的原理和方法。熟悉蛋白质的沉淀反应，进一步熟悉蛋白质的有关反应。 二、实验原理 蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨 基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物 质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。另 外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的 稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生 了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。 三、实验仪器 1、吸管 2、滴管 3、试管 4、电炉 5、ph试纸 6、水浴锅 7、移液管 四、实验试剂 1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏 备用。 2、 0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。 3、millon’s试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体 积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存。 4、尿素晶体 5、1%cuso：1g cuso晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml 44 6、10%naoh：10g naoh溶于蒸馏水，稀释至100ml 7、浓硝酸 8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml. 9、冰醋酸 10、浓硫酸 11、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。 12、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。 13、95%乙醇。 14、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml 15、氯化钠晶体 16、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml 17、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。 18、1%醋酸溶液。 五、实验步骤 蛋白质的颜色反应 （一）米伦（millon’s）反应 1、苯酚实验：取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加millon’s试剂0.5ml，电炉小心加热 观察颜色变化。 2、蛋白质实验：取2ml蛋白液，加millon’s试剂0.5ml，出现白色的蛋白质沉淀，小 心加热，观察现象。 （二）双缩脲反应 1、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热熔化，至重新结晶时冷却。然后加 10%naoh溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% cuso4溶液，混匀，观察现象。 2、取蛋白液1ml，加10%naoh溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% cuso4溶液，混匀，观察 现象。

沉淀蛋白质的常用方法

沉淀蛋白质的常用方法（TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步骤） 2010-08-18 15:19 TCA-DOC For precipitation of very low protein concentration 1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxy cholate, detergent). 2) Vortex and let sit for 30min at 4oC. 3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4oC (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4oC.Be careful, use gloves!!!). 4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). [OPTION: Wash pellet twice repellet samples 5min at full speed between washes]. 5) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air. For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.) Normal TCA To eliminate TCA soluble interferences and protein concentration 1) To a sample of protein solution add Trichloroacetic acid (TCA) 100% to get 13% final concentration. Mix and keep 5min –20oC and then 15min 4oC; or longer time at 4oC without the –20oC step for lower protein concentration. Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low. (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4oC.Be careful, use gloves!!!). 2) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). 3) For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.) Acetone Precipitation To eliminate acetone soluble interferences and protein concentration

有机溶剂蛋白质沉淀

蛋白质纯化方法 蛋白质浓缩有多种方法，有盐析，超滤，离子交换，有机溶剂沉淀等方法。 有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法，称“有机溶剂分段沉淀法”，它常用于蛋白质或酶的提纯。使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。由此法析出的沉淀一般比盐析容易过滤或离心沉降，分离后的蛋白质沉淀，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度。操作时的pH值大多数控制在待沉淀蛋白质的等电点附近，有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性，提高分离的效果，在有机溶剂中添加中性盐的浓度为0.05mol/L左右，中性盐过多不仅耗费有机溶剂，可能导致沉淀不好。沉淀的条件一经确定，就必须严格控制，才能得到可重复的结果。医学教育`网搜集整理有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度表示。有机溶剂沉淀蛋白质分辨力比盐析法好，溶剂易除去；缺点是易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对于某些敏感的酶和蛋白质，使用有机溶剂沉淀尤其要小心。 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。

蛋白质浓缩技术是免疫学中常用的手段，现介绍几种常用的浓缩技术。 （一）透析袋浓缩法 利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋（无透析袋可用玻璃纸代替），结扎，把高分子（6 000－12 000）聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成30％－40％浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后，可放入温箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。 （二）冷冻干燥浓缩法 这是浓缩蛋白质的一种较好的办法，它既使蛋白质不易变性，又保持蛋白质中固有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下冰冻，然后移置干燥器内（干燥器内装有干燥剂，如NaOH、CaCl2和硅胶等）。密闭，迅速抽空，并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白质保存方便，应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷冻干燥。 （三）吹干浓缩法 将蛋白溶液装入透析袋内，放在电风扇下吹。此法简单，但速度慢，且温度不能过高，最好不要超过15℃。 （四）超滤膜浓缩法 此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出，而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。有两种方法进行浓缩：一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内，在不断搅拌之下过滤；另一种是将蛋白液装入透析袋内置于真空干燥器的通风口上，负压抽气，而使袋内液体渗出。 （五）凝胶浓缩法 选用孔径较小的凝胶，如SephadexG25或G50，将凝胶直接加入蛋白溶液中。根据干胶的吸水量和蛋白液需浓缩的倍数而称取所需的干胶量。放入冰箱内，凝胶粒子吸水后，通过离心除去。 （六）浓缩胶浓缩法 浓缩胶是一种高分子网状结构的有机聚合物，具有很强的吸水性能。每克干胶可吸水120ml～150ml。它能吸收低分子量的物质，如水、葡萄糖、蔗糖、无机盐等，适宜浓缩10 000分子量以上的生物大分子物质。浓缩后，蛋白质的回收率可达80％～90％。比浓缩胶应用方便，直接加入被浓缩的溶液中即可。必须注意，浓缩溶液的pH值应大于被浓缩物质的等电点，否则在浓缩胶表面产生阳离子交换，影响浓缩物质的回收率。 选择材料及预处理 以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。

蛋白质沉淀法

蛋白质沉淀法 在生化制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂： 1．盐析法多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 2．有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 3．等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。 4．非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子。 5．生成盐复合物沉淀用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 6．热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。 第一节盐析法 一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫b分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。 一．影响盐析的若干因素 1．蛋白质浓度 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近，若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋

白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。 2．离子强度和类型 一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。 离子种类对蛋白质溶解度也有一定影响，离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱，下面为几种盐的盐析能力的排列次序：磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁。 3．PH值 一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。为提高盐析效率，多将溶液PH值调到目的蛋白的等电点处。但必须注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶液PH值，以达到最好的盐析效果。 4．温度 在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。 二．硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓溶液，通入H2S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离子，浓缩结晶，100℃烘干后使用。另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。 硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；2）加入饱和溶液法用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；3）透析平衡法先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，透析袋内硫酸铵饱和

蛋白质沉淀

蛋白质沉淀(Protein Precipitation)浓缩方法原理及详细解析 在生化制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂： 1．盐析法多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 2．有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。3．等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。 4．非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子。 5．生成盐复合物沉淀用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 6．热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。 第一节盐析法 一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫Kb分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。 一．影响盐析的若干因素 1．蛋白质浓度 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近，若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。 2．离子强度和类型 一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。 离子种类对蛋白质溶解度也有一定影响，离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱，下面为几种盐的盐析能力的排列次序：磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁。

蛋白质沉淀浓缩方法原理及详细解析

蛋白质沉淀浓缩方法原理及详细解析 令狐采学 在生化制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂： 1．盐析法多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 2．有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 3．等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。 4．非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子。 5．生成盐复合物沉淀用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 6．热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。 第一节盐析法 一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫Kb分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。 一．影响盐析的若干因素 1．蛋白质浓度 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近，若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。

蛋白质的颜色反应与沉淀反应

蛋白质的颜色反应和沉淀反应 一、目的 （1）掌握鉴定蛋白质的原理和方法。 （2）熟悉蛋白质的沉淀反应。 （3）进一步掌握蛋白质的有关性质。 二、原理 蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。 多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。 三、实验仪器 1、鸡或鸭蛋白 2、吸管1.0ml(×4）、0.50ml(×1)、2.0ml(×4)、5.0ml(×2) 3、滴管 4、试管1.5cm×15cm(×14) 5、电炉 6、漏斗 四、实验试剂 （1）卵清蛋白液 0.5%苯酚溶液米伦试剂 0.1%茚三酮溶液尿素 10%氢氧化钠溶液比重1.42的浓硝酸 1%硫酸铜溶液 （2）硫酸铵晶体 95%乙醇结晶氯化钠 1%醋酸铅 5%鞣酸溶液饱和苦味酸溶液 1%醋酸溶液 五、实验步骤 A、米伦氏反应 1、用苯酚做试验：取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加米伦试剂约0.5ml，小心加热，溶液即出现玫瑰红色。 2、用蛋白质溶液做实验：取2ml蛋白质溶液，加0.5ml米伦试剂，此时出现蛋白质的沉淀。小心加热，凝固的蛋白质出现红色。 B、双缩脲反应 1、取少量结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩脲，至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10%氢氧化钠溶液1ml摇匀，再加两滴1%硫酸铜溶液，混匀，观察有无紫色出现。 2、另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10%氢氧化钠溶液10滴及1%硫酸铜溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。 C、黄色反应 1、于一试管内，置蛋白质溶液10滴及浓硝酸3~4滴，加热，冷却后再加10%氢氧化钠溶液5滴，观察颜色变化。 D、茚三酮反应 1、取1ml蛋白质溶液置于试管中，加2滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。 E、蛋白质盐析作用

蛋白质沉淀法详解

蛋白质沉淀法详解 蛋白质通过盐析的办法沉淀的原理是降低蛋白质的溶解度，使蛋白质凝聚而从溶液中析出。 蛋白质的沉淀（protein precipitation），沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。蛋白质从溶液中析出的现象，称为蛋白质的沉淀。蛋白质沉淀常用的方法有盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、生物碱试剂与某些酸（如三氯醋酸）沉淀等。 在生化制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂： 1．盐析法多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 2．有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 3．等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。 4．非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子。 5．生成盐复合物沉淀用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 6．热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。 第一节盐析法 一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫b分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。 一．影响盐析的若干因素 1．蛋白质浓度 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近，若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较

蛋白质的沉淀和变性实验

蛋白质的沉淀与变性反应 目的 (1)了解蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的原理及它们的相互关系。 (2)学习盐析和透析等生物化学的操作技术。 原理 在水溶液中，蛋白质分子的表面，由于形成水化层和双电层而成为稳定 的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。但是，蛋白质胶 体颗粒的稳定性是有条件的，相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白 质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程 称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可分为以下两种类型: 一、可逆淀汲反应 在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部结构并未发 生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于原来的溶 剂中。这种作用称为可逆沉淀反应，又叫作不变性沉淀反应。属于这一类的 反应有盐析作用; 在低温下，乙醇、丙酮对蛋白质的短时间作用以及利用等 电点的沉淀等。 二、不可逆沉淀反应 在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原 来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解 于原来溶剂中的作用叫作不可逆沉淀反应。重金属盐、植物碱试剂、过酸、 过碱、加热、震荡、超声波，有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。 试剂和器材 一、试剂 1．蛋白质溶液 取5m1鸡蛋蛋白蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用4-8层纱 布过滤，新鲜配制。 2．蛋白质氯化钠溶液 取20ml蛋清，加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液100ml，充分搅匀 后，以纱布滤去不溶物(加入氯化钠的目的是溶解球蛋白)。 硫酸铵粉末，饱和硫酸铵溶液，3%硝酸银，0.5% 醋酸铅，10% 三氯醋 酸，浓盐酸，浓硫酸，浓硝酸，5% 磺基水杨酸(sulfosalicyclic acid)，0.1% 硫酸铜，饱和硫酸铜溶液，0.1% 醋酸，10% 醋酸，饱和氯化钠溶液，10% 氢氧化钠溶液。

肥达试验和沉淀反应实验报告

实验报告

二者均在正常值内，患伤寒的可能性小； H抗体效价超过正常值，O抗体效价正常，可能是接种了伤寒菌苗或者是接种的回忆反应；O抗体效价超过正常值，H抗体效价正常，可能是伤寒早期或者其他沙门氏菌感染； 一般间隔1~2周复查，若抗体效价比前次结果增高2~4倍，则具有诊断价值。 六、教师评价 实验报告 实验名称沉淀反应实验日期 院系专业班级 姓名学号 一、实验目的 掌握对流免疫电泳的原理和方法，了解其用途。 二、实验器材 器材： 电子天平、锥形瓶、200ml量筒、药匙、称量纸、水浴锅、微波炉、洗耳球、玻片、移液管、

任务二：打孔 1.待琼脂板凝固后在琼脂板中间部分打四个孔，孔径3mm，孔距10mm。在左上角打一个孔作为标记。用胶头滴管吸去空上废液。 提示： （1）打孔时要小心，勿使琼脂层脱离载玻片或琼脂板底层开裂，以免加样时顺裂缝或底部散失。一旦出现裂缝或脱离现象，可向孔内滴加少许温琼脂加以弥补或将琼脂板在火焰高处来回通过几次补底。 （2）在琼脂板左上角打上标记孔，有助于确定正负极方向和样本上样位置，通常情况下，有标记孔侧，放置于正极端。 任务三：加样 1.如下图所示加样，用移液枪每个孔加10微升对应液体： C：人待测血清；D：人阳性血清；E：抗人血清抗体/诊断血清 提示： （1）抗原和抗体在一定的pH条件下，由于带电荷量的多少及分子量大小不同，在电场中以不同的速度作定向移动。在pH8.6的缓冲液中，多数蛋白质抗原物质带负电荷，在电场作用下向阳极移动，而其抗体大多为Y球蛋白，等电点较高，带负电荷较少，且分子量较大，电泳速度慢，受电渗作用影响向负极移动。 （2）加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。 （3）抗原、抗体的量应相接近时容易出现沉淀带，反之不易发生，如抗原过多，可造成假阴性结果，可通过稀释抗原加以解决。 任务四：正确放置琼脂板至电泳槽 1.向电泳槽中加入约2/3体积的pH8.6 0.05mol/L巴比妥溶液，将加好样的琼脂板放入电泳槽，有标记孔的一侧放在正极端。 2.用纱布条搭在琼脂板两侧，以便电泳。 提示： （1）电泳时抗原、抗体电极方向不可放反。 （2）搭桥时应注意与凝胶接触紧密，否则会使电流不均匀，致使沉淀线歪斜、不均匀。 任务五：确定电泳电压 1.设置电泳仪Us=6V，Is=4mA，Ts=60：00 提示： 电压、电流增大时，电泳时间可更短。但电压过高则孔径变形，可将琼脂融化，电流过大抗原抗体蛋自易变性，干扰实验结果；电压过低时沉淀线出现的时间会延长。 五、实验总结

蛋白质的沉淀和变性实验.

实验五蛋白质的沉淀和变性实验 一、实验目的 1.加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 2.了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 3.了解蛋白质变性与沉淀的关系。 二、实验原理 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。 1.可逆的沉淀反应。 此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解在原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。 2.不可逆沉淀反应。 此时蛋白质分子内部结构发生大改变，蛋白质常因变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。如加热引起的蛋白质沉淀于凝固，蛋白质于重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类反应。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷）并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 三、实验材料、器材与试剂 1.材料 鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清：水=1：9）。 2.器材 （1）试管及试管架； （2）吸量管； （3）滴灌； （4）小烧杯； （5）容量瓶。 3.试剂 （1）3%硝酸银溶液； （2）5%三氯乙酸溶液 （3）95%乙醇；

（4）饱和硫酸铵溶液； （5）硫酸铵结晶粉末。 四、实验方法 1. 蛋白质的盐析 中性无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析是可逆的过程。 加蛋清溶液5mL于试管中，再加入等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量浑浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤液中加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。 2.重金属离子沉淀蛋白质。 重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。 取一支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加3%硝酸银溶液1～2滴，振荡试管有沉淀生成，放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？ 3.某些有机酸沉淀蛋白质。 取一支试管，加入蛋白质溶液2mL再加入1mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。 4.有机溶剂沉淀蛋白质。取一支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL95%乙醇，混匀，观察沉淀的生成。 五、实验结果 略