胸腺肽β4在小鼠卯母细胞和早期胚胎中的表达与分布规律
胸腺肽?β4在小鼠卵母细胞和早期胚胎中的
表达与分布规律
张
岩
李树峰
杨彩荣
郑可佳
李
宁
严云勤*
(东北农业大学动物细胞与发育生物学教研室，哈尔滨150030)
摘要胸腺肽-β4(thymosin-β4，Tb4)是一种重要的G-actin 遮蔽因子(G-actin sequestering factor)，在细胞微丝活动中有着调节
G-actin 活性的作用．以往报道证实了Tb4在细胞中具有广泛的生理作用，但其在哺乳动物卵母细胞成熟和早期胚胎发育等方面的作用，迄今还没有系统的研究报道．以昆明白小鼠卵巢、卵母细胞和早期胚胎作为实验材料，以免疫(荧光)组织化学和RT-PCR 技术为主要研究方法，对Tb4的表达与分布进行了研究．结果显示，Tb4在相关发育过程中，存在差异性的表达和定位变化．结果表明，在小鼠卵母细胞成熟和早期胚胎的发育过程，Tb4能够通过表达与分布的变化对细胞微丝活动和细胞增殖活动进行调控，对小鼠卵母细胞成熟、早期胚胎发育以及胚胎着床过程有重要的作用．关键词
胸腺肽-β4，小鼠，卵母细胞，胚胎，微丝，免疫荧光组织化学，激光共聚焦扫描显微镜
学科分类号
Q2
DOI:10.3724/SP.J.1206.2009.00043
生物化学与生物物理进展
Progress in Biochemistry and Biophysics 2009,36(9):1193~1201
https://www.wendangku.net/doc/fb11941901.html,
*通讯联系人.
Tel:0451-********,E-mail:yanyunqin@https://www.wendangku.net/doc/fb11941901.html, 收稿日期：2009-01-06，接受日期：2009-03-25
胸腺肽最初是从动物胸腺组分中分离获得的一类生物活性物质，在机体免疫和神经内分泌等方面有着重要的调节功能．1972年，Goldstein 等[1,2]从小牛胸腺组分Ⅴ中分离提纯了一种分子质量5ku 、由43个氨基酸残基组成、亲水性较强的胸腺肽家族新成员———胸腺肽-β4(thymosin-β4，Tb4)．Tb4普遍存在于脊椎动物的多种组织器官[3,4]和部分无脊椎动物机体当中[5]，且具有高度的保守性[6]．Tb4具有十分广泛的生物学功能，近期研究表明，其与免疫调节[7]、神经发育[8]、伤口愈合与炎症反应[9,10]、血管发生[11]、细胞凋亡[12]以及肿瘤发生与迁移[13]等生理和病理活动均有关系．
细胞各种微丝活动的动态调整均伴随G-actin 活性的变化，Tb4能够与G-actin 以1∶1的比例结合，从而抑制其聚合成微丝[14]．细胞中接近一半的G-actin 是通过结合各种遮蔽因子(G-actin sequestering factor)而达到活性抑制与储备的目的[15]，而Tb4正是G-actin 活性遮蔽作用的主要执行者[16]．近期研究还证实，Tb4分子具有形成配体参与内分泌与细胞核内信号转导的作用[17,18]，此外，该分子本身还是谷氨酰胺转移酶的作用底物，能够参与凝血过程中纤连蛋白与胶原蛋白的合成与组装[19]．
迄今针对Tb4多样性功能性的研究已经取得了许多突破，但其在哺乳动物卵母细胞成熟与早期胚胎发育方面的作用还没有系统的研究报道．因此，本实验尝试以小鼠卵母细胞和早期胚胎为主要实验材料，初步揭示Tb4在哺乳动物卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的表达与分布规律．
1
材料与方法
1.1
实验动物
实验动物为昆明白品系小鼠，雌鼠5～8周龄，雄性适龄，由东北农业大学组织胚胎研究室提供．小鼠饲养于室温22℃，人工光控条件，保证自由取食、饮水．所用雄鼠均单笼饲养，雌性小鼠集中饲养．
1.2主要试剂和仪器
山羊抗thymosin-β4单克隆抗体与FITC 标记兔抗山羊二抗(Santa Cruz 公司)，生物素标记兔抗山羊二抗与HRP 标记链酶卵白素(北京中杉金桥公
生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.2009;36(9)
司)，罗丹明标记的鬼笔环肽(rhodanmine-phalloidin, Cytoskeleton公司)，hoechst33258(Sigma公司)，M-MLV反转录酶(Promega公司)．Taq酶和其他PCR试剂均购自宝生物公司．培养用试剂均为Sigma公司产品，实验用其他药品为分析纯级别国产试剂．
CO2培养箱(Forma公司)，电子分析天平(Mettler Toledo公司)，摄像显微镜与激光共聚焦显微镜(Leica公司)，梯度PCR仪(Bio-Rad公司)，紫外光凝胶成像仪(UVP公司)．
1.3卵母细胞和胚胎的获得
雌鼠注射5U孕马血清(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)48h后，取卵巢，扎取颗粒细胞完好、形态完整的颗粒细胞卵母细胞复合物(cumulus-oocyte complexes，COCs)．经透明质酸酶去除颗粒细胞后，选取GV期细胞进行培养，在培养过程中选取所需成熟水平的卵母细胞进行实验研究．胚胎采用雌鼠注射5U孕马血清48h后，再注射5U人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)并与雄鼠合笼交配的方法获得．依据小鼠胚胎发育日龄依次获得受精合子、2细胞胚胎直至早期着床囊胚．同时进行合子的体外培养，并挑选出不同发育时期的胚胎进行实验研究．
卵母细胞成熟培养液是添加了4g/L BSA和0.2g/L丙酮酸钠的a-MEM液体培养基(Gibco公司)，胚胎培养液为添加了2g/L BSA的自制KSOM 培养液．实验中其他用液均参考文献[20]配制．培养条件为：饱和湿度、恒温37℃、5%CO
2
．
1.4石蜡切片HE染色和免疫组织化学实验步骤
常规方法制备由孕马血清(PMSG)调控的不同生殖周期的小鼠卵巢石蜡切片，连续切片厚度为4μm．HE染色用染料为爱氏配方苏木精和1%的伊红Y水溶液．免疫组织化学方法流程为：a．常规脱蜡复水处理后，切片使用10mmol/L柠檬酸钠水溶液(pH6.0)进行抗原修复，80℃处理20min．10%过氧化氢甲醇溶液进行内源性过氧化物酶的灭活，室温10min．b．复水后切片经含有10%封闭用马血清的PBS溶液37℃封闭非特异性抗原1h．c．倾出封闭液，直接滴加1∶50体积比例稀释的一抗封闭液，200μl/片，4℃过夜．d．含0.1% Tween20的PBS清洗液清洗3次，每次5min．e．滴加1∶200体积比例由封闭液稀释的生物素标记二抗，200μl/片，37℃孵育1h．f．清洗液清洗3次，每次5min．g．滴加1∶200体积比例由封闭液稀释的HRP标记链酶卵白素，37℃孵育1h．h．清洗液清洗3次，每次5min．i．DAB显色液显色．j．常规脱水，中性树脂封片，摄像显微镜拍摄记录实验图像．
1.5小鼠卵母细胞和早期胚胎免疫荧光组织化学实验步骤
本实验免疫荧光组织化学流程为：a．各处理待研究卵母细胞和早期胚胎，首先用4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(PBS)进行室温固定30min．b．经0.1%Tween20的PBS清洗液简单清洗后，加入含0.5%Triton X-100的PBS中作室温透膜处理30min．c．清洗液清洗3次，每次5min．d．封闭：移入含1%BSA的PBS中，37℃封闭非特异抗原位点1h．e．封闭后的样本首先与含1∶50体积比例的一抗封闭液4℃共同孵育过夜．f．清洗液清洗3次，每次5min．g．加入1∶100体积比例由清洗液稀释的FITC标记抗山羊二抗孵育液室温孵育1h．h．清洗液清洗3次，每次5min．i．样本与100nmol/L由PBS稀释的罗丹明标记鬼笔环肽溶液共同室温孵育30min．j．使用钠钾生理盐水溶液清洗1次，5min．k．最后与10mg/L浓度的hoechst33258钠钾生理盐水溶液共同室温孵育15min．l．使用钠钾生理盐水溶液清洗3次，每次5min，清洗结束后使用抗荧光猝灭剂对样本进行封片．
Tb4、微丝及染色质分别通过FITC-antibody (绿色)、Rhodamine-phalloidin(红色)和hoechst 33258(蓝色)定位，使用激光共聚焦扫描显微镜观察三者分布状态，拍摄记录实验图像．
1.6卵母细胞和胚胎cDNA的获取步骤
mRNA获取步骤：a．挑选形态、大小正常的卵母细胞或胚胎放入DEPC灭菌水配制的酸性台氏液中处理1min，去除透明带．b．将去透明带的胚胎移入M2操作液中洗涤2次．c．将胚胎移入薄壁离心管中，尽量不附带多余液体．d．向离心管中加入4μl裂解液、1μl DNase、1μl DNase缓冲液和1μl RNA酶抑制剂，37℃孵育40min．e．经65℃10min灭活DNA酶，消化后的产物即为总RNA模板．裂解液配方为：NaCl10mmol/L，Tris 10mmol/L，MgCl23mmol/L，NP400.5%，DEPC 灭菌水配制，调pH值至8.0．
反转录步骤：a．取所有消化后得到的RNA，向其中加入1μl oligodt(500mg/L)．b．70℃孵育
1194··
张岩等：胸腺肽?β4在小鼠卵母细胞和早期胚胎中的表达与分布规律
2009;36(9)Fig.1Immuno ?histochemistry results:Tb4peptide expression in ovarian follicles of different mature levels
Numbers note:1:Paraffin sections with HE stained;2:Immuno-histochemistry results of Tb4expression.Letters note:A,B :Primary follicles of different maturate levels;C :Secondary follicles;D :Tertiary follicles;E :Mature follicles.
5min ，而后迅速置于冰上放置10min ．c ．向其中
加入1μl(50U)M-MLV 反转录酶、5×反转录酶缓冲液4μl 、2.5mmol/L dNTP 4μl 、0.1mol/L DTT 2μl 和Rnase 抑制剂1μl ，总体积控制在20μl ．d ．37℃孵育1h ，95℃加热5min 灭活反转录酶活性，结束反应．实验中每个获取cDNA 的实验处理重复3次．
1.7引物设计和PCR 主要参数
本实验使用Premier premier 5.0软件进行引物设计．Tb4引物设计依据GenBank 核酸序列X16053．外引物序列：正义引物，5′TGTCTGACAAAC-CCGATAT 3′，反义引物，5′GCAAGTTCTTTT-CCCTC 3′，退火温度55℃，扩增22个循环，产物699bp ；内引物序列：正义引物，5′ATCCTCT-GCCTTCAAAA 3′，反义引物，5′CCTTCCTGCT-CAGTAGTTC 3′，退火温度55℃，扩增30个循环，产物220bp ．PCR 内参为Gapdh ，引物设计依据GenBank 核酸序列XM486720．外引物序列：正义引物，5′ACCACAGTCCATGCCATCAC 3′，反义引物，5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3′，退火温度55℃，扩增20个循环，产物452bp ；内引物序列：正义引物，5′GGAAAGCTGTGGCG-TGAT 3′，反义引物，5′AAGGTGGAAGAGTG-GTGAGT 3′，退火温度53℃，扩增30个循环，产物307bp ．每个cDNA 处理进行3次重复的外引物扩增，扩增产物再分别进行3次重复的内引物扩增．实验获得扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶中EB 添加终浓度为0.5mg/L ．电泳完毕后将凝胶置于紫外光凝胶成像仪中记录实验图像．1.8数据分析与统计
免疫组织化学和激光共聚焦图像采用
Image-pro-plus 5.0软件进行灰度和荧光密度扫描，获得面积积分光密度(A IOD )数值．凝胶电泳图像采用Lab Works 3.0软件进行IOD 值扫描，因PCR 获得的数据变异性较大，故首先将各处理中的IOD 数值进行加权平行处理，然后丢弃2倍标准差以外的可疑数据．获得的数据最后使用SPSS 16.0进行单因素方差分析，获得统计结论．
2结果
2.1Tb4在不同成熟水平卵泡中表达的免疫组织化学结果
免疫组织化学试验结果显示见图1，伴随卵泡发育，Tb4蛋白在卵母细胞中的表达量逐渐增高．该分子在初级卵泡的卵母细胞核、质区域呈现较弱表达．而其在后期卵泡的卵母细胞质中表达量明显升高，尤其在核膜处表达明显，核内呈现较弱表达．同时，Tb4在有腔卵泡的颗粒细胞中呈现较弱表达，在细胞核中没有分布．该分子在卵巢皮质与髓质细胞中均有分布，而在多数皮质肌层细胞的细胞核中有较高程度表达．Tb4蛋白在不同成熟程度卵泡的卵母细胞中表达强度如图2所示．
2.2卵母细胞与胚胎发育中Tb4蛋白免疫荧光组织化学的激光共聚焦结果
激光共聚焦结果显示，以染色质构型不同划分的三类发育潜力不同的GV 期卵母细胞当中，Tb4蛋白的定位表达有所差异．在弥散状染色质构型(non surrounded nucleolus ，NSN)的卵母细胞中，该分子在胞质中分布程度略高于核区，并且在核膜处表现为集中的分布(图3-A )；在不完全环绕核仁染色质构型(partly surrounded nucleolus ，PSN)中，其在核内的分布量略有升高(图3-B )，而在核膜处
A1B1C1D1E1
A2B2C2D2E2
100μm
Bar:1195··
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GV 期卵母细胞经体外培养8h 后，多数处于M Ⅰ期，皮质区呈现微丝的高度极性凝集，Tb4蛋白在中期染色质分布处有着类似纺锤体形态的分布，而在胞质皮质下缘也有较高强度的表达(图4-A )．当M Ⅰ期染色体完成旋转之后，该分子在染色质与卵母细胞膜之间的表达水平略高于其他皮质部分(图4-B )．GV 期卵母细胞经体外培养9h 第一极体排放时，微丝与Tb4蛋白均在即将形成极
Fig.2Relative expression of Tb4peptide (x ±2s )in
oocytes from ovarian follicles of different mature levels
A ～E :The same as Figure 1.The groups with significant difference (P <0.05)were noted with different lowercase letters.
仍有明显的强烈聚集；在完全环绕核仁染色质核构型(surrounded nucleolus ，SN)中，该分子在核膜处呈现点状的表达，在核仁组织中心区域存在与环状
染色质位置重叠的表达(图3-C )．无论在哪一种核质构型的GV 期卵母细胞当中，在核仁区域内都没有明显的Tb4蛋白分布．
GV 期卵母细胞经过体外培养2.5h 后多数发生生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)，在该类卵母细胞当中，核膜轮廓呈现弥散状变化，Tb4蛋白同样以较高强度分布于正在发生破裂的核膜区域(图3-D )．经体外培养3h 后，在生发泡完全破裂的卵母细胞中，染色质高度凝集，逐渐转变为染色体状态，此时Tb4蛋白在原有核膜区域出现环状区域的阴性表达区域，而在染色体间的表达强度略高于胞质平均水平(图3-E )．体外培养5h 时，该分子在胞质中还表现为弥散状分布，而在体外培养7h 的卵母细胞中，该分子则表现为均匀分布(图3-F,G )．个别GV 期卵母细胞，经过体外培养不能发生GVBD ，该类细胞生发泡膨大，Tb4蛋白在细胞核内表达极弱，而在核膜位置仍然呈现高水平的凝集状态(图3-G )．
Fig.3
Tb4peptide expression in G Ⅴstage oocytes (with different chromatin conformation)
and oocytes of different mature levels
Numbers note:1,Chromatin stained with hoechst 33258,blue;2,The expression of Tb4,FITC-antibody tagged,green;3,The expression of microfilaments,rhodamine-phalloidin tagged,red;4,Merged figures.Letters note:A ,Non surrounded nucleolus (NSN)chromatin configuration;B ,Partly surrounded nucleolus (PSN)chromatin configuration;C ,Surrounded nucleolus (SN)chromatin configuration;D ,Early germinal vesicle breakdown (GVBD)stage,IVC 2.5h;E ,IVC 3h;F ,IVC 5h;G ,IVC 7h;H ,GVBD blocked after IVC 5h
．
50μm
A B C D E
1196··
张岩等：胸腺肽鄄茁4在小鼠卵母细胞和早期胚胎中的表达与分布规律
2009;36(9)Fig.4Tb4peptide expression in oocytes maturation (during forming polarbody )and zygotes development
Numbers note:The same as Figure 3.Letters note:A ,Metaphase Ⅰof oocytes;B ,Metaphase Ⅰof oocytes (spindle rotated);C ,Forming first polarbody (early);D ,Forming first polarbody (latter);E ,Metaphase Ⅱof oocytes;F ,Early stage of zygotes (fertilized 10h);G ,Latter stage of zygotes (fertilized 20h);H ,Metaphase of zygotes;I ,Anaphase of zygotes;J ,Telophase of zygotes.
体的皮质突起处表达(图4-C )．第一次减数分裂后
期，同源染色体分离后，Tb4蛋白在分离的染色体之间出现类似纺锤体形态的表达(图4-D )．体外培养12h 后，多数卵母细胞停留在M Ⅱ期，Tb4蛋白与微丝再次出现位置重叠的表达，共同凝集在胞质染色体聚集的皮质区域(图4-E )．
待体内受精10h 后观察，Tb4蛋白在早期合子的雌雄原核中均有较弱表达，而在合子皮质区域以及排出的极体内，该分子表达强烈(图4-F )．受精
后20h 的晚期合子中，该分子的表达规律与早期合子类似，并且在各阶段合子的核仁区域中均没有分布(图4-G )．合子第一次有丝分裂中期，胞质中该分子呈弥散状分布，在排放的极体中仍然表达强烈(图4-H )．而在合子分裂后期，除凝集于极体内部和皮质区密集分布状态外，并无特别的表达特点(图4-I )．有丝分裂末期，在新形成的核膜区域，Tb4蛋白重新出现凝集状表达(图4-J )．
试验研究了体内发育和体外培养各主要时期的胚胎，由于所获得的分布与表达规律没有显著差异，故所有结果使用体内发育胚胎的实验结果．早期2细胞胚胎(受精后30h)中，Tb4蛋白在细胞核内有明显表达，核膜处集中凝集现象不明显，核内有大量的斑块状弱染区域存在(图5-A )．而晚期2细胞胚胎(受精后40h)中，Tb4蛋白在核内呈现较弱表达，核膜处凝集现象明显(图5-B )．Tb4在4细胞胚胎中多呈现核内弱表达，部分细胞核膜处有凝集现象(图5-C )．早期8细胞(非致密化)和晚期8细胞(致密化)的表达特点与2细胞胚胎特点类似(图5-D,E )．早期桑椹胚表现为细胞核弱染类型(图4-F )，而晚期桑椹胚和早、晚期囊胚中Tb4蛋白表现为核质均一化表达．在早期和晚期囊胚中，该分子在核膜处聚集表达的细胞数量较多．晚期桑椹胚和早、晚期囊胚处于分裂中期的细胞中，Tb4蛋白在胞质中表达强烈，与其他细胞呈现明显的强度差异(图5-G,H,I )．在早期着床囊胚(受精5天)中，该蛋白质在胚胎的着床侧滋养层细胞中表达强烈，内部细胞Tb4基本为核、质均一型表达(图5-J
).
50μm
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Fig.7Tb4mRNA expression in main stages of
oocytes maturation and embryonic development
1:G Ⅴstage;2:Metaphase Ⅱof oocytes(matured in vivo );3:Metaphase Ⅱof oocytes (matured in vitro );4:GVBD blocked,IVC 5h;5:Oocytes without forming polarbody,IVC 12h;6:Zygotes;7:2-cell embryos;8:
4-cell embryos;9:8-cell embryos;10:Morular;11:Blastula;-:Negative control;+:Positive control(cDNA from mouse liver).M :DL 2000.
Fig.6Relative expression of Tb4peptide (x ±2s )in main stages of oocytes maturation and embryonic development
Numbers note:1,GV stage;2,GVBD stage,IVC 3h;3,GVBD blocked,IVC 5h;4,Metaphase Ⅱof oocytes(Matured in vivo );5,Metaphase Ⅱof oocytes (Matured in vitro );6,Zygotes;7,2-cell embryos;8,4-cell embryos;9,8-cell embryos;10,Morular;11,Blastula.The groups with significant difference (P <0.05)were noted with different lowercase letters.
Fig .5Tb4peptide expression in different stages of embryonic development and early implanted blastula
Numbers note:The same as Figure 3.Letters note:A ,2-cell embryos(early);B ,2-cell embryos(latter);C ,4-cell embryos;D ,8-cell embryos(early);E ,8-cell embryos (latter,densificated);F ,Morular (early,approximate16cells);G ,Morular (early,approximate 32cells);H ,Blastula (early);I ,Blastula (latter);J ,Early implanted blastula.
Tb4蛋白在卵母细胞和早期胚胎的几个主要时期的相对表达强度如图6所示，在卵母细胞成熟过程中，各时期Tb4蛋白的荧光平均AIOD 值无显著差异．而在胚胎发育过程中，从8细胞开始Tb4蛋白的表达量急剧增加．
2.3卵母细胞与胚胎发育过程中Tb4mRNA 表达的RT ?PCR 检测结果
卵母细胞和胚胎发育过程中Tb4mRNA 表达的RT-PCR 检测结果见图7．
依据凝胶成像系统获得IOD 数值进行统计分析，获得如下结果见图8：体内成熟卵母细胞中Tb4mRNA 表达量均值略低于GV 期，而体外成熟的表达量略高于GV 期，但差异不显著．发
Tb4220bp GAPDH 307bp
M 1
2345
M 1267891011-
+
100μm
1198··
张岩等：胸腺肽?β4在小鼠卵母细胞和早期胚胎中的表达与分布规律
2009;36(9)Fig.8Relative expression of Tb4mRNA (x ±2s )in main
stages of oocytes maturation and embryonic development
1～11:The same as Figure 7.The groups with significant difference (P <0.05)were noted with different lowercase letters.
生GVBD 阻断和不能排出极体的卵母细胞中，
Tb4mRNA 的表达量增高，与正常成熟卵母细胞有显著的差异．从受精合子发育到囊胚的过程中，Tb4mRNA 的表达量逐渐升高，其中在2细胞胚胎时期表达量出现一次高峰，而在囊胚时表达量达到最高值．
3讨论
Tb4是一类参与众多生理与病理活动的多功能小肽类因子，但其主要的作用是能够与G-actin 结合，使其失去聚合成微丝的能力，即参与G-actin 的活性遮蔽作用，因此Tb4等多肽物质常被称为遮蔽因子．细胞微环境中非遮蔽状态的G-actin 浓度水平能够直接影响微丝活动的效果，使之倾向于聚合或是解聚．当遮蔽因子与G-actin 结合后，使后者失去了重新聚合成微丝的能力，从而提高了原有微丝的解聚效率；反之去除遮蔽因子的作用有利于胞质微丝的聚合．
胸腺肽-β4不仅限于在胞质中执行G-actin 的活性遮蔽功能，而且在细胞核中也有分布．Radoslaw 等[18]研究表明，Tb4在细胞中具有广泛的定位特性，将Tb4酶解后，C 端片段只能定位于细胞质，中段能够与G-actin 结合，而N 端片段能够定位于细胞核当中．并且有相关文献报道，肌动蛋白在核内是以非常规的聚合形式存在的，其与细胞核结构组成和核功能执行密切相关[21,22]，因此与微丝相关的细胞核活动也需要G-actin 遮蔽因子的调节．另有实验证据表明，Tb4与其他一些因子共同作用，能够调节细胞核的解离、组装与形态变化，并且还与DNA 的转录和复制活动密切相关[23～25]．
Tb4还能够结合多种因子而产生配体作用，能够结合细胞膜性受体或核内受体，产生信号转导和调控DNA 转录或复制的作用，如DNA 解旋酶Ⅱ的激活就与该分子有关[17,18]．综上所述，Tb4在细胞核中的定位表达有着重要的作用与意义．
以往较多报道均证实Tb4在细胞核、质中具有广泛的表达．Yu 等[26]采用放射性自显影方法研究表明，在非洲爪蟾的卵母细胞胞质和细胞核中均有该蛋白质的分布，且分布量较为均一．而Huff 等[27]在研究MCF-7细胞系的报道中认为，Tb4的定位分布特点存在着与细胞生长状态相关的显著差异．
本试验通过小鼠卵泡免疫组织化学结果证实，
在卵母细胞体内成熟过程中，Tb4蛋白在胞质中处于积累状态．但是RT-PCR 结果显示，体外成熟过程中Tb4mRNA 的表达水平上没有显著差异，只是在发生GVBD 阻断和没有排出极体的卵母细胞中，mRNA 的表达量有所升高．说明卵母细胞在体外成熟受到影响时，Tb4mRNA 处于激活转录状态．通过激光共聚焦结果分析，Tb4蛋白在卵母细胞和早期胚胎的胞质和细胞核当中均有规律性的表达．我们认为Tb4在细胞核、质中的分布变化现象能够对核、质两处中遮蔽因子的浓度进行调节，胞质中高浓度的Tb4多与调节微丝解聚过程有关．而伴随细胞质中微丝聚合过程，Tb4往往向细胞核内转运，从而解除G-actin 活性的遮蔽作用，以促进微丝的聚合效率．Tb4的这种核、质定位差异现象与细胞所处的发育阶段和增殖状态密切相关．针对与Tb4细胞核定位的研究发现，Tb4在核膜破裂和重组的过程前后于细胞核膜处有大量的凝集，证明其在细胞核形态变化、分解和重组过程中有重要的作用．但在各阶段核仁结构中均无Tb4蛋白的表达，说明其与核仁功能执行并无密切关系．Zucotti 等[28]报道，不同染色质构型的GV 期卵母细胞的发育潜力具有差异，一般认为染色质构型的差异与细胞核成熟程度密切相关．本试验获得的相关结果证实，Tb4在不同染色质构型的GV 期卵母细胞中的表达定位也有所差异．
我们认为Tb4蛋白的表达定位规律还与细胞所处周期有关．我们在另一研究中发现，处于G1期的MEFs 细胞核中有较高水平的Tb4蛋白表达，而在S 期表达量显著降低．这一结果与本实验若干现象相符，例如Tb4在早期2-细胞与早期8-细胞胚胎细胞核中表达强度较高，而在晚期细胞核中的表
1199··
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达量降低．这可能与细胞周期有关，因为晚期细胞处于S期或G2期．
在桑椹胚和囊胚阶段，Tb4总体表达量急剧增加，并且在处于细胞分裂中期的细胞质当中，该蛋白质的表达水平极高．而在早期着床囊胚中，Tb4蛋白在着床侧细胞表达水平较高，说明Tb4能够调节胚胎着床过程中的微丝解聚活动，因此其对小鼠胚胎着床也有着重要的意义．综上所述，Tb4在小鼠卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中，存在差异性的表达和定位变化，能够对细胞微丝活动和细胞增殖等方面进行调节．因此Tb4对卵母细胞成熟、早期胚胎发育以及胚胎着床等过程均有重要的作用．
参考文献
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张岩等：胸腺肽?β4在小鼠卵母细胞和早期胚胎中的表达与分布规律
2009;36(9)Expression and Distribution of Thymosin ?β4in
Mouse Oocytes and Early Embryos
ZHANG Yan,LI Shu-Feng,YANG Cai-Rong,ZHENG Ke-Jia,LI Ning,YAN Yun-Qin *
(Department of Animal Cell and Developmental Biology,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)
Abstract Thymosin-β4(thymosin-β4,Tb4)is an important G-actin sequestering factor in cells,which could regulate the activity of G-actin in various microfilaments events.Previously,many researches have reported that Tb4has broad cellular and physiological functions,but until now,there is lack of systematic research on mammal oocytes and early embryonic development.Tb4is a small hydrophilic peptide,initially,which separated and purified from bovine thymus component Ⅴ,with a molecular mass of 5ku,and compose of 43amino acid residues.Tb4molecule is highly conservative,which has been founded in a variety of tissues and organs in vertebrates,and also exists in part invertebrates.This peptide has extensive biological functions.Recent studies have shown that it closely relate with many physiological and pathological activities,such as immune regulation,neurological development,wound healing ,inflammatory response,angiogenesis,apoptosis,tumor occurrence and migration.Dynamic events of microfilaments in cells always accompany with G-actin activity,while Tb4could bind G-actin with a ratio of 1∶1to inhibit G-actin to polymerize into microfilaments.In cells,nearly half of G-actin are bound with various of sequestering factors,which effects on both G-actin activity regulation and its reservation,while Tb4is the chief executer of G-actin sequestering factor family.The ovaries,oocytes and early embryos of Kunming mouse was used to investigate the expression and distribution of Tb4in oocytes and eary embryos.During the experiment,the immuno-histochemistry,immuno-fluorescence-histochemistry and RT-PCR technique were utilized as chief study methods.The discipline of Tb4expression and distribution in oocytes maturation and early embryonic development were studied both in vivo and vitro .The results showed that Tb4were different in expression and localization during mouse oocytes maturation and early embryonic development.Immuno-histochemistry results illustrated that,accompany with follicle growing,the expression amount of Tb4peptide in vitro oocytes is gradually increased.There are different distribution characteristics of Tb4in GV stage oocytes,which featured by chromatin configuration,such as divided the configuration into NSN,pNSN and SN type.In other stages of oocytes maturation and early embryonic development,Tb4could locate both in nuclear and cytoplasm,and the expression amount always changing regularly,which are closely related with cells growing status and the cell cycle.AIOD value of Tb4was not significantly different in the process of oocytes maturation in vivo ,but the fluorescence intensity rapidly increased form 8-cell embryos to blastula stages in the process of embryonic development.The tendency of Tb4mRNA transcription are similar to the peptide expression in those stages.Specifically,in early implantation blastula,Tb4peptide highly expresses in implanted lateral cells of blastula,indicating that Tb4can regulate the microfilaments depolymerization in embryos implantation,so Tb4plays an important role in the process of embryos implantation.The research concluded that,Tb4could regulate microfilaments events (such as polymerization and depolymerization)and proliferation of cells in the developmental processes through the changes of its expression and localization.Overall,Tb4plays an important role for mouse oocytes maturation,early embryonic development and embryos implantation.
Key words thymosin-β4,mouse,oocytes,embryos,microfilaments,immuno-fluorescence-histochemistry,confocal-laser-scanning-microscope DOI:10.3724/SP.J.1206.2009.00043
*Corresponding author.Tel:86-451-55190846,E-mail:yanyunqin@https://www.wendangku.net/doc/fb11941901.html, Received:January 6,2009
Accepted:March 25,2009
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胸腺肽-β4在小鼠卯母细胞和早期胚胎中的表达与分布规律
作者：张岩， 李树峰， 杨彩荣， 郑可佳， 李宁， 严云勤， ZHANG Yan， LI Shu-Feng， YANG Cai-Rong，ZHENG Ke-Jia， LI Ning， YAN Yun-Qin
作者单位：东北农业大学动物细胞与发育生物学教研室,哈尔滨,150030
刊名：
生物化学与生物物理进展
英文刊名：PROGRESS IN BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS
年，卷(期)：2009，36(9)
被引用次数：0次
参考文献(28条)
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相似文献(4条)
1.学位论文张岩胸腺肽-β4在小鼠卵母细胞和早期胚胎中表达与分布规律的研究2009
胸腺肽-β4（thymosin-β4, Tb4）最初是从小牛胸腺组分Ⅴ中分离提纯得到的一种分子量约为5 k Da，由43个氨基酸残基组成，亲水性较强的小肽类物质。现代研究证实了
Tb4是一种重要的G-actin活性隐蔽因子，在细胞微丝活动中有着调节G-actin活性的作用。Tb4普遍存在于脊椎动物的组织器官和部分无脊椎动物机体当中，且具有高度的保守性。该分子还具有广泛的生物学功能，其能够作用于免疫调节、神经发育、伤口愈合、炎症反应、血管发生、细胞凋亡以及肿瘤发生和迁移等众多的生理与病理活动。但针对该分子在哺乳动物卵母细胞成熟与早期胚胎发育相关领域的研究迄今还没有系统的报道。
本实验以昆明白小鼠卵母细胞和早期胚胎作为主要实验材料，应用免疫组织化学、免疫荧光激光共聚焦和RT-PCR技术，对Tb4在相关发育过程中的表达与分布的进行了较为系统的研究。因实验中发现Tb4在处于同细胞周期的早期胚胎细胞核、质中具有定位表达有所差异，故本研究同时进行了该分子在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中的相关验证实验。
本实验获得的结果表明：
1. 小鼠卵巢免疫组织化学结果显示，伴随卵泡发育，Tb4蛋白在卵母细胞中的表达量逐渐增高。该分子在初级卵泡的卵母细胞核、质区域呈现较弱表达，而在卵泡发育后期的卵母细胞质中表达量明显升高，同时在核膜处表达明显，而在细胞核内呈现较弱表达。同时Tb4蛋白在颗粒细胞中也有较弱程度的表达，在细胞核中也无分布。
2. 激光共聚焦结果表明，以染色质构型差异划分的三类发育潜力不同的GV期卵母细胞当中，Tb4蛋白的定位表达有显著差异。
3. 激光共聚焦结果揭示，Tb4蛋白在小鼠卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中，存在差异性的表达和定位变化。该分子的表达与定位规律与卵母细胞和早期胚胎所处的发育阶段和细胞所处周期密切相关。
4. 激光共聚焦结果显示在早期着床囊胚中，Tb4蛋白在着床侧细胞的表达水平较高，揭示Tb4蛋白可能通过调节微丝解聚活动对胚胎着床活动产生重要的影响。
5. 由卵母细胞成熟开始，直至早期着床囊胚的形成，Tb4蛋白的表达水平呈现上调性变化。尤其在桑椹胚、囊胚和早期着床囊胚当中Tb4蛋白具有较高水平的表达，这与此阶胚胎细胞增殖过程中的微丝活动特点相适应。
6. 在早期胚胎体外培养的过程中，Tb4 mRNA从合子时期开始出现上调性表达，直到桑椹胚和囊胚，其表达量达到峰值。而在2-细胞胚胎中，该分子mRNA的表达量出现略高于临近发育时期的表达高峰。
7. 本实验证实伴有强烈微丝聚合、解聚活动的细胞形态变化过程可以影响MEFs中Tb4蛋白的定位类型。而在MEFs增殖过程中，细胞周期因素也能够对Tb4蛋白定位类型产生显著影响，具体为G1期细胞呈现高比例的细胞核强表达（NH）定位类型，而S期表现为高比例的细胞核弱表达（NL）定位类型。该实验结果与胚胎实验中出现的核、质定位差异现象的规律是一致的。
8. 研究发现Tb4蛋白在MEFs中的定位类型还与细胞生长密度有关。在不同生长密度的MEFs集落中Tb4蛋白主要定位类型也有所差异，高密度区域细胞多呈现细胞核强表达（NH）定位类型，而低密度区域以细胞核弱表达（NL）定位类型细胞为主。
本实验结论认为Tb4主要通过执行单体G-actin活性隐蔽的功能，对相关的微丝活动进行生理性的调节，以保证细胞的形态结构变化、生长和增殖活动的顺利进行。Tb4在小鼠卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中，存在差异性的表达与分布变化，能够对细胞中的微丝活动和细胞增殖进行调解。因此Tb4对卵母细胞成熟、早期胚胎发育以及胚胎着床等生殖生理过程有着重要的作用。
2.学位论文赵晓民胸腺肽β4基因的克隆表达及活性测定2008
胸腺肽β4(thymosin β4，Tβ4)是存在于多种动物的多种组织中的一种酸性肽，分子量为4982，PI为5.1，N端丝氨酸被乙酰化，它的cDNA序列和氨基酸序列已明确，含有2个
a螺旋结构，分别位于第4-16和第30-40氨基酸残基之间，这种结构与肌动蛋白的结合相关。Tβ4在人和许多哺乳动物如羊、猪、牛、老鼠及其他脊椎动物如鸟类、两栖类的体内广泛分布，具有多方面的生物学活性。Tβ4是一种生物反应调节因子，能调节和增强人体免疫机能，促进淋巴细胞成熟、内皮细胞移动和附着、血管生成、神经再生、肿瘤转移、心肌修复、创伤愈合和抗炎症反应等。
本研究的目的是通过基因工程方法，将Tβ4基因克隆至表达载体pTXB1，在大肠杆菌中表达Tβ4，并将表达的Tβ4进行分离、纯化及生物学活性测定，以期获得能够高效表达、纯化简便的制备Tβ4方法。取得如下结果。
1.从Genebank中查得Tβ4 eDNA，将Tβ4基因序列的正义链和反义链拆分成10个互补的小片段，互为模板，由生物公司合成的10个互补的小片段，采用PCR两步法扩增出Tβ4全基因。根据Tβ4基因序列设计一对带有pTXB1的酶切位点—NdeⅠ和XhoⅠ的特异性引物，用此特异性引物扩增出Tβ4基因，然后将扩增出的目的片段连接至pMD18-T载体，连接产物转化至E．coli DH5a感受态，通过阳性克隆筛选、酶切鉴定、测序、基因比对，成功构建重组质粒pMD18-T-Tβ4。
2.将pMD18-T-Tβ4与原核表达载体pTXB1用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，pMD18-T-Tβ4被酶成两个片段，较小的片段为Tβ4基因片段，pTXB1被酶切为两个片段，较大的片段为目的片段。凝胶回收pMD18-T-T134酶切的小片段和pTXB1被酶切后的大片段，将回收的片段用连接试剂盒连接，并将连接产物转化至E．coli DH5a感受态进行阳性克隆筛选、酶切鉴定、基因测序、测序结果分析，构建重组质粒pTXB1-Tβ4。将重组质粒转化至E.coli BL21 codon plus，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，SDS-PAGE鉴定表达产物。
3.将表达产物超声裂解、几丁质(Chitin beads)柱亲和层析纯化，再经Tricine—SDS—PAGE鉴定表明，融合蛋白Tβ4在E．coli BL21 codon plus中已经高效表达，并获得较纯的重组Tβ4。将纯化产物用HiTrap Desalting脱盐柱脱盐、真空离心浓缩仪真空抽干、称重后，用PBS溶解Tβ4，BCA试剂盒测Tβ4浓度。最后用MTT法测定Tβ4对小鼠脾淋巴细胞的增殖活性，结果表明，重组Tβ4具有促进小鼠脾淋巴细胞增殖的活性，最适刺激浓度为1.6μg/mL。
通过本研究，获得Tβ4的高效表达的工程菌，并获得高纯度的重组Tβ4，探索了一种一步纯化具有生物学活性的重组Tβ4的简便方法，为进一步研究TB4的其他功能及作用机制奠定基础。
3.期刊论文赵裕光.时德.王爽胸腺肽β4提高内毒素休克小鼠存活率并下调炎症介质释放-重庆医科大学学报2005,30(3)
目的:研究胸腺肽β4(thymosinβ4,Tβ4)对内毒素休克小鼠72h存活率的影响,检测TNF-α及IL-1α变化,初步探讨Tβ4治疗内毒素休克的机制.方法:选用清洁级昆明小鼠腹腔注射脂多糖(LPS)制备内毒素休克动物模型,①观察内毒素休克前后Tβ4变化情况.②Tβ4对内毒素休克小鼠存活率的影响.动物随机分为4组,每组30只,均腹腔注射LPS(25mg/kg),Ⅰ组为LPS对照组,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别于LPS腹腔注射后0h;0h、2h;0h、2h、4h尾静脉注射Tβ4(5mg/kg),观察72h存活率.③ELISA法检测Tβ4对内毒素休克小鼠血浆TNF-α及IL-1α变化情况.结果:Tβ4在内毒素休克小鼠的血浆中明显降低,Tβ4可提高内毒素休克小鼠72h存活率,并下调TNF-α及IL-1α的释放.结论:Tβ4治疗内毒素休克应在LPS腹腔注射后0h、2h、4h连续注射Tβ4(5mg/kg),实验提示Tβ4可能是通过下调炎症介质的释放来治疗内毒素休克的.
4.学位论文梁建国棕点湍蛙皮肤分泌液中活性肽分离纯化、分子克隆以及结构与功能的研究2006
两栖类是一类具有生态、科研、经济、以及文化价值的自然资源。同时，两栖类皮肤也是具有很大开发潜力的生物资源宝库。两栖类的皮肤中含有种类繁多、功能复杂的生物活性物质，这些活性物质可用来抵御有害环境因子的侵袭。存在于两栖类皮肤分泌液中的生物活性成分引起了世界上研究人员极大的关注。迄今为止，已分离鉴定出许多具有各种生物活性的蛋白以及多肽。中国拥有丰富的两栖类资源，在284个种(亚种)中2/3是特有种，在生物活性物质开发方面具有极大的潜力。我们收集了三种两栖类动物：棕点湍蛙(Amolops loloensis)、无指盘臭蛙(Ranagrahami)以及中国林蛙(Rana chensinensis)，并对这三种两栖类的皮肤分泌液进行了一系列的生物活性筛选：1.胰蛋白酶水解活性检测；2.胰蛋白酶抑制剂活性检测；3.抗菌活性检测；4.溶血、出血及血浆凝固活性检测；5.血小板聚集活性检测；6.血小板聚集抑制活性检测。结果发现，1.三种两栖类的皮肤分泌液都不具有胰蛋白酶水解活性；2.棕点湍蛙以及无指盘臭蛙皮肤分泌液具有较强的胰蛋白酶抑制剂活性；3.棕点湍蛙以及无指盘臭蛙皮肤分泌液具有较强的抗菌活性；4.三种两栖类的皮肤分泌液不具备出血活性，但是显示较弱的溶血活性以及抗血浆凝固活性。5.三种两栖类的皮肤分泌液都不具有促进血小板聚集活性；6.棕点湍蛙皮肤分泌液具有抑制血小板聚集活性。以来源于单个棕点湍蛙(Amolops loloensis)个体皮肤中提取的mRNA为材料，我们建立了棕点湍蛙皮肤cDNA文库，得到大约为1×10<'6>个独立的克隆。通过生物化学，分子生物学手段和研究方法，在棕点湍蛙皮肤分泌液中得到一系列的皮肤活性多肽以及cDNA序列，其中包括抗茵肽，缓激肽，胸腺肽等，并对其结构，功能进行了相应的研究。通过两步分离纯化过程：Sephadex G-50凝胶过滤和反相高压液相层析(RP-HPLC)，我们从棕点湍蛙皮肤分泌物中分离纯化得到3个、2类别的抗菌肽，并命名为amolopin-1a，1b和1c。借助于质谱，我们得到这三个抗茵肽的分子量分别为2665.3、2663.7和1626.0道尔顿。这两类抗菌肽都含有多个碱性氨基酸而带有正电荷，这是首次从湍蛙属中分离纯化得到的抗菌肽，进一步丰富了两栖类抗茵肽类群。我们所得到的3个抗菌肽，其中2个由24个氨基酸残基组成，具有半胱氨酸组成的二硫键，形成Rana box。通过Genbank进行blast，发现该类抗菌肽与来源于Rana esculenta的brevinin-1E具有87％和79％的同源性。另外一个抗菌肽由16个氨基酸残基组成，不含有半胱氨酸组成的二硫键，可以形成a-螺旋。这类抗茵肽和来源于Rana temporaria的Temporin-F具有50％的同源性。根据一系列的活性检测，我们发现两类amolopin抗菌肽在一些活性上具有很大的差异。amolopin-1b具有很强的溶血活性和较弱的肥大细胞脱粒肽活性，而amolopin-2a则相反，但是两者都有较强的促进肥大细胞中组胺释放的活性。amolopin-1b和2a都具有一定的抗肿瘤活性。根据编码Rana esculenta中brevinin-1E前体保守的5’端核苷酸区域设计引物，在棕点湍蛙皮肤cDNA文库中筛选编码amolopin抗茵肽的cDNA序列的单克隆。对所得到的阳性克隆进行测序，我们筛选到编码不同amolpin抗菌肽前体的不同的cDNA序列14条，这14条cDNA序列最终编码3类、8条不同的amolopin抗菌肽。我们将这三类抗菌肽命名为amolopin-1，2，3系列。通过两步分离纯化过程：Sephadex G-50凝胶过滤和反相高压液相层析(RP-HPLC)，从棕点湍蛙皮肤分泌物中分离纯化得到一种具有12个氨基酸的缓激肽，我们将该缓激肽命名为amolopkinin。该缓激肽和来源于Rana rugosa的ranakinin R具有76％的同源性，具有增强小鼠回肠肌收缩的作用。amolopkinin在N端部分具有插入片段APV，这是首次从湍蛙属得到的缓激肽以及cDNA序列。
通过随机筛选棕点湍蛙cDNA文库，我们得到了棕点湍蛙胸腺肽-β<,4>的cDNA全序列，并命名为aT-β<,4>。该cDNA序列由698个核苷酸组成，由其开放阅读框推导出来的胸腺肽
组成为44个氨基酸，通过Genbank进行blast发现该胸腺肽和来源于Xenopuslaevis的thymosin beta 4有90％的同源性。这是首次从两栖类得到来源于皮肤的胸腺肽-β<,4>cDNA全序列。
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