NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)试剂盒说明书

货号:QS1004 规格:50管/48样NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)试剂盒说明书

可见分光光度法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

NOX(EC 1.6.99.3)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,可在氧气存在下,直接将NADH氧化为NAD。该酶不仅参与NAD的再生,而且与免疫反应密切相关。

测定原理:

NOX能够将NADH氧化为NAD,NADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝(DCPIP)的还原相偶联,蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP,在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。

自备实验用品及仪器:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水

试剂的组成和配制:

试剂一:液体50mL×1瓶,-20℃保存。

试剂二:液体10mL×1瓶,-20℃保存。

试剂三:液体1mL×1瓶,-20℃保存。

试剂四:液体50mL×1瓶,4℃保存。

试剂五:液体6 mL×1瓶,4℃保存。

试剂六:粉剂×2瓶,-20℃保存;临用前每瓶加入5mL蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

①准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或

研钵匀浆。

②将匀浆600g,4℃离心5min。

③弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。

④上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的NOX(此步可选做)。

⑤步骤④中的沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率

20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于NOX活性测定。

血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

1、分光光度计预热30min以上,调节波长至600nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)试剂四、试剂五和试剂六于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min。

(2)在1mL石英比色皿中加入40μL样本、700μL试剂四、100μL试剂五和160μL试剂六,混匀,记录600nm处20s时吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。

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