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孚尔根

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染色体变异与孚尔根核反应染色法

实验日期:11月24日——12月8日

成员:周赛赛、傅林美、颜燕何、何洪菲、丁小娟

实验研究方向:分别用秋水仙素和紫外线处理植物根尖,对照组为未处理的植物根尖。观察和鉴定DNA的存在情况和染色情况

一、实验目的

1.学习和掌握孚尔根反应染色法。

2.鉴定植物细胞核内染色体上DNA的存在。

二、实验原理

DNA是主要的遗传物质,集中于染色体上。1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验,鉴定了染色体上DNA的存在,故称为孚尔根染色法。孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关,此试剂的基本成分是碱性品红,偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。

碱性品红原为桃红色,当与亚硫酸作用时还原,使醌型变为苯型,由桃红色变为无色透明的N-亚磺酸亚硫酸副品红碱,当它与醛基作用时,其分子式又恢复为醌型结构,呈现紫红色。

利用1N HCl 、60℃下水解时,可将DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断,使嘌呤脱下,并使去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应,因此利用孚尔根反应,可以鉴定DNA的存在。并广泛应用于核及染色体的研究中。

水解的时间很重要,因为核酸的水解有两个过程,第一,嘌呤碱很快被除掉,脱氧核糖中潜在的醛基显露出来,第二,组蛋白和核酸愈来愈多的被除掉。在短时间的水解作用以后,第一个过程占优势,这个时候用希夫试剂进行染色,染色体的染色作用最强。随着水解作用的继续进行,第二个过程逐渐变成优势,因此水解液中希夫反应最强,而染色体中的希夫应减弱。最后,第二个过程超过第一个过程时,染色体也随之停止反应。

三、实验材料

蚕豆根尖

四、实验器具和药品试剂

显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、冰箱、温箱、天平、载玻片、盖玻片、吸水纸、青霉素瓶、吸管、烧杯、量筒、切片架、切片盒、小口瓶。

95%乙醇、冰醋酸、碱性品红、偏亚硫酸氢钠、盐酸、活性炭、亮绿。

五、实验方法和步骤

1、材料准备:培养小麦和蚕豆的根尖。大约4-5天,根长到1-2cm

2、处理:分别用0.05%的秋水仙素以及超净工作台中的紫外灯在相同距离(距离紫外灯40cm)下照射1min,2min,3min,4min来处理根尖。另外一组不做处理。然后将紫外照射的蚕豆根尖恢复培养24个小时。

3、固定:将根尖取下,加入卡诺氏固定液固定。固定液配置的比例是无水乙醇:冰醋酸=3:1

4、水解:实验时,取出固定的根尖根尖,分装到若干个青霉素瓶中,用清水洗三次,换1N HCl 洗一次,倾去,换入预热60℃的1N HCl 3ml,放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10min(视材料而定,水解时间可以从10min延长至30min)。然后吸去热1N HCl,换入冷1N HCl洗一次,再用清水将根尖洗三次。

5、染色:吸净水分,加入Schiff试剂避光染色30min,然后用漂洗液漂洗2~3次,经水洗准备压片。

6、压片观察:取一根尖置于载玻片上,切下生长区部位(染成紫红色),加一滴0.1%亮绿水溶液对染1min,吸去亮绿液,加一滴清水或45%醋酸水溶液压片镜检。

六、注意事项

1、注意水解的温度,控制好水解的时间,防止水解过度

2、Schiff试剂染色时要注意避光

3、秋水仙素处理和紫外灯处理时要注意安全

七、实验结果

用紫外灯处理过的蚕豆根尖细胞用秋水仙素处理的蚕豆根尖细胞

用紫外灯处理过的蚕豆根尖对照组蚕豆根尖细胞

1、在实验结果中,我们可以观察到用秋水仙素处理后形成的染色体加倍

2、用紫外照射处理的蚕豆,染色体有损伤断裂的现象,还有一些微核的形成

七、结果分析

1、紫外设置了不同的照射时间,但是肉眼不能辨别出之间的差别。

2、用紫外照射处理形成的染色损伤断裂,这可能导致在恢复培养过程中导致微核的产生。

3、水解是本实验成败的关键之一。重要的是温度,应保持在60±0.5℃之间。如果温度过高或时间过长,造成水解过度,醣与醛基之间的键被破坏,醛基流失到水解液中,反之,不能出现潜在的醛基,都不能呈现颜色反应。

八、心得体会

实验虽然不是很圆满,但还是成功了。刚开始我们泡了蚕豆和小麦种子,但是几天过去,蚕豆发芽发的很好,而小麦却没有发芽的迹象,我们只好放弃的小麦,把全部精力都放在了蚕豆上。由于蚕豆根尖比较多,我们就做了秋水仙素和紫外两种处理方法。实验的几天,大家都很积极认真,实验中我们也学到了很多东西,加强了我们的动手能力。偶尔遇到问题,大家都积极讨论,分析原因,最终找出出错的原因,然后改正。我们付出还是看到了成果,当我们看到一个个漂亮的细胞、染色体时,是多么的欣慰。实验过程培养了我们在实践中研究问题,分析问题和解决问题的能力以及培养了良好的实验素质和科学道德,例如团体能力、交流能力、独立思考,还提高了我们的创新意识,我们也得到了更好的锻炼。

孚尔根染色法

孚尔根染色法 DNA是主要的遗传物质,集中于染色体上。1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验,鉴定了染色体上DNA的存在,故称为孚尔根染色法。孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关,此试剂的基本成分是碱性品红,偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。 实验原理:细胞中的DNA受1NHC1,60℃水解作用以后,核酸中的嘌呤碱很快完全被除掉,使脱氧核糖中潜在的醛基获得自由状态。水解后,组织要经水洗再移至希夫(Schiff)试剂中,希夫试剂即同露出来的醛基发生反应,呈现紫红色。这个反应是Feulgen在1942年提出来的,是DNA的一个特异性检查法。 水解的时间很重要,因为核酸的水解有两个过程,第一,漂呤碱很快被除掉,脱氧核糖中潜在的醛基显露出来,第二,组蛋白和核酸愈来愈多地被除掉。在短时间的水解作用以后,第一个过程占优势,这时候用希夫试剂染色,染色体的染色作用最强。随着水解作用的继续进行,第二个过程逐渐变成优势,因此水解液中的希夫反应增强,而染色体中的希夫应减弱。最后,第二个过程超过第一过程时,染色体也随之停止反应。 希夫试剂是碱性品红———亚硫酸溶液,呈无色。与DNA醛基反应后,使碱性品红恢复原来的红色。 二、实验目的:观察蚕豆根尖细胞或其它根尖细胞内染色体中的DNA,以及染色体在有丝分裂中的行为,掌握Feulgen染色方法。 三、实验材料:上次实验制成了石蜡切片。 四、实验准备: 1.用具立式染色缸一套,镊子,盖玻片,小漏斗,铁架,毛边纸,玻璃棒,显微镜,恒温水浴锅,温度计,烧杯,棕色瓶,黑纸。 2.玻璃器皿的清洗主要是染色缸的清洗,一般用肥皂粉洗,用水冲净即可,如不能洗净时,要用洗液浸泡后,再冲洗,自来水洗后,再用少量蒸馏水过洗一次。盛放100%酒精、二甲苯的染色缸必须干燥,缸盖内缘必须涂以几士林,以防止蒸发和收水分,影响浓度。染色缸上要贴上标签。 3.实验所需药口及配制 浓盐酸(36—38%),碱性品红,偏重亚硫酸钠(Na2S2O5); 亚硫酸钠(Na2SO3),固绿(fast green),加拿大中性树胶乙醇(30—100%),二甲苯。 药品配制: 1各种浓度的乙醇配制. 21NHCI配制:取浓HCI 82.5毫升加蒸馏水至1000毫升,摇匀。 3Sciff 试剂的配制 0.5克碱性品红,加到已经煮沸的100毫升蒸馏水中,再煮沸3—4分钟,待溶液冷却到50℃时过滤,再等溶液冷到25℃以下时,加入10毫升的1NHCI和1。5克偏重亚硫酸钠,装在棕色瓶中,塞紧瓶子,用黑纸包好,放在暗处,第二天观察,溶液还是淡红色就不能用,只得重配。 偏重亚硫酸钠与1NHCI反应,放出SO2,SO2与碱性品红反应,生成碱性品红--亚硫酸溶液,呈无色。 4漂染液的配制 先配10%的亚硫酸钠溶液。

蚕豆多倍体诱导和鉴定实验设计方案

蚕豆多倍体诱导和鉴定实验设计方案 一、实验目的 初步认识化学诱发植物多倍体的过程,学习利用孚尔根反应(染色)鉴定多倍性细胞的方法。 二、实验材料:蚕豆根尖 三、实验药品及工具:生物显微镜、剪刀、镊子、解剖针、载玻片、 小玻璃瓶、小酒杯、培养皿、恒温箱、0.1%-0.2%秋水仙碱溶液、希夫氏试剂(是一种将碱性复红在酸性溶液中以过剩的亚硫酸(亚硫酸氢钠等)脱色的试剂)、纯净水、1mol 1-1盐酸等四、实验原理:多倍体的发生,尤其是异源多倍体的产生是生物进化 的重要途径之一。正常细胞的有丝分裂,在中期已复制为两的染色体,都集中于中央赤道板上,染色单体由于纺锤丝的牵引至后期分别趋向细胞两级。纺锤丝主要化学组成为蛋白质。一般认为蛋白质分子中的二硫键可以被细胞中辅酶的-SH(巯基)还原,于是由分子内的二硫键转变为分子间的二硫键,从而使蛋白质分子聚合。凡是能抑制巯基作用又能保持细胞活性的物质,就能阻止蛋白质分子聚合或使已构成纺锤丝的蛋白质分子间发生解聚作用,致使纺锤丝不能形成或断裂,从而消失,造成染色单体不能分向细胞两极,细胞质也不分离,复制的染色体仍存在于一个细胞中,结果染色体倍增。如果该细胞在下一次细胞分裂时又经药剂作用,则可产生更高倍数的细胞,(一般成等比级数增加,但也会出现奇数倍或非整倍现象,且由于药物的毒性作用染色体

不会无限止的增多),这样就形成了多倍性细胞。在药剂作用的过程中,由于同一组织中的不同细胞有丝分裂的不同步性,而出现加倍程度不一的表现,这种现象称为混倍性(混倍现象)。经加倍了的细胞,一旦停止药剂作用,仍能进行正常的有丝分裂。 由此而产生的子细胞,一般说都是多倍性细胞,从这种细胞分化出来的植株,就是多倍体。人工诱发多倍体的方法很多,分为物理的(变温、机械损伤、射线处理等)和化学的,我们常采用秋水仙素来进行诱导,这是诱发多倍体最有效的方法,此外还有六氯代苯、a-溴代萘、对-二氯代苯、申苯磺硫苯胺基苯汞(富民隆的主要成分)等化学物质均有此作用。 鉴定多倍体,可采用间接和直接的方法。间接方法包括形态学和细胞学的观察,直接法是直接对试材检测染色体的数目。一般来讲,多倍体植物在形态学和细胞学上的特征表现为: 气孔、花器、花粉粒、种子、果实甚至叶片等明显变大,单位面积叶片上的气孔数目减少而密度降低等。考虑到染色体观察、记数较为烦琐,首先对试材从形态学和细胞学上来初步判断是否为多倍体,然后把初步断定为多倍体的试材再观察、记录染色体数目是否真正地发生了倍性的变异,从而最终确定为多倍体。 五、实验步骤:1、将根长为0.5厘米左右的发芽蚕豆,投入0.2%的秋水仙碱溶液内,处理3-6小时,取出继续培养24小时。以上过程均需在恒温(25℃ ___28℃)下进行。

生物化学 核酸名词解释

1、Ribozyme:具有高效特异催化功能的RNA。 2、自杀性底物:Kcat型不可逆抑制剂不但具有与天然底物相似的结构,而且本身也是酶的底物,可被酶催化而发生类似底物的变化。 因此称之为“自杀性底物” 3、酶的活性部位(活性中心):与底物接触并且发生反应的部位就称为酶的活性中心,也称为酶的活性部位。 4、变构酶又称别构酶,酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后,引起酶的构象的改变,进而改变酶的活性状态 5、卫星DNA:主要分布在染色体着丝粒部位,由非常短的串联多次重复DNA序列组成,因为它的低复杂性又称简单序列DNA,又因其不同寻常的核苷酸组成,常在浮力密度离心中从整个基因组DNA中分离成一个或多个“卫星”条带,故称卫星DNA。 6、Southern印迹:将凝胶上分离的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上,再通过同位素标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA 片段的方法。步骤:限制性酶切DNA分子、琼脂糖凝胶电泳分离、碱变性、转膜、探针杂交、洗膜除去未杂交的探针、放射性自显影。 Nouthern印迹:将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素膜上,然后进行核酸杂交的一种那个实验方法。Wouthren:将蛋白质从电泳凝胶中注意到硝酸纤维素膜上,然后与放射性同位素i125标记的特定蛋白质的抗体进行反应。7、酶活力:指酶催 化某化学反应的能 力,其大小可以用 在一定条件下所催 化的某一化学反应 的反应速率来表 示,两者呈线性关 系。 8、1)、可逆抑制作 用:抑制剂与酶以 非共价键结合,用 透析、超滤或凝胶 过滤等方法可以除 去抑制剂,恢复酶 活性。 主要包括:竞争性 抑制、非竞争性抑 制和反竞争性抑制 作用三种。 竞争性抑制是I与 S竞争E的结合部 位,影响了S与E 的正常结合。 非竞争抑制是I与 S同时与E结合,但 三元复合物不能进 一步分解为产物, 酶活性下降。 反竞争抑制是E只 有与S结合后,才 能与I结合,三元 复合物不能进一步 分解为产物。 2)、不可逆抑制作 用:抑制剂通常以 共价键与酶的必须 基团进行不可逆结 合,从而使酶失去 活性。按其作用特 点又可以分为专一 性不可逆抑制作用 和非专一性不可逆 作用。 非专一不可逆抑 制:抑制剂与酶分 子中一类或几类基 团作用,不论必须 基团与否,符合共 价结合,由于必须 基团也被共价结 合,从而导致酶的 抑制失活。 专一不可逆抑制作 用:抑制剂专一地 作用于酶的活性中 心或其他必须基 团,进行了共价结 合,从而抑制酶的 活性。 9、cDNA文库:以 mRNA为模板,经反 转录酶催化,在体 外反转录成cDNA, 与适当的载体(常 用噬菌体或质粒载 体)连接后转化受 体菌,则每个细菌 含有一段cDNA,并 能繁殖扩增,这样 包含着细胞全部 mRNA信息的cDNA 克隆集合称为该组 织细胞的cDNA文 库。 10、DNA指纹:在人 类vntrs位点是 1-5kb,但人的总 DNA提取后用限制 性内切酶切成不同 的片段,然后以 vntrs中的特异序 列为探针进行 southerm杂交,可 发现阳性片段的大 小各不相同。由于 不同个体的这种串 联重复的数目和位 置各不相同,所以 vntrs的southern 杂交带谱就具有高 度的个体特异性, 称DNA指纹。 11、后生遗传(外 遗传):指不处于 DNA自身的核苷酸 序列中可影响DNA 活性的任何可遗传 的性质。 11、多克隆位点: 多克隆位点是包含 多个(最多20个)限 制性酶切位点的一 段很短的DNA序列 12、亲和层析:蛋 白质分子能对配基 专一性地结合成复 合物,改变条件, 又能分离,利用这 种特性而设计的一 种层析技术。 13、疏水吸附层析: 使用适度疏水性的 分离介质,在含盐 的水溶液体系中, 借助于分离介质与 蛋白质分子之间的 疏水作用达到吸附 活性蛋白分子的目 的 14、抗体酶:用没 反应中间产物为抗 原诱导产生的具有 催化能力的免疫球 蛋白称为抗体酶 15、蛋白质完全水 解:即将所有的肽 键都打断,使蛋白 质完全裂解为氨基 酸。 蛋白质部分水解: 即将蛋白质的部分 肽键打开,进而部 分地分离出所需氨 基酸。 16、DNS-cl-Edman 测序法: 将高度灵 敏的DNS技术与能 连续降解的Edman 反应有机结合起来 测定氨基酸排列顺 序的方法。 17、基因芯片:固 定有寡核苷酸、基 因组DNA或cDNA等 的生物芯片。利用 这类芯片与标记的 生物样品进行杂 交,可对样品的基 因表达谱生物信息 进行快速定性和定 量分析。 18、密度梯度区离 心:蛋白质颗粒的 沉降速度与分子大 小和密度相关,在 具有密度梯度的介 质中离心时。质量 和密度大的颗粒比 质量和密度小的颗 粒沉降的快,并且 每种蛋白质颗粒沉 降到与自身密度相 等的介质密度梯度 中。 19、穿梭载体:既 能在原核生物中复 制,又能在真核生 物中复制的载体。+ 20、SiRNA:RNA干 涉现象中,介入细 胞中特定双链rna 加工裂解成的 21-23nt的正义和 反义链组成等干扰 基因表达的小分子 RNA,其引发的RNAi 是转录后基因沉默 现象的机制之一 21、RNAi:即RNA 干涉,是近年来发 现的在生物体内普 遍存在的一种古老 的生物学现象,是 由双链RNA(dsRNA) 介导的、由特定酶 参与的特异性基因 沉默现象,它在转 录水平、转录后水 平和翻译水平上阻 断基因的表达。 22、蛋白质组学: 以蛋白质组为研究 对象,分析细胞内 动态变化的蛋白质 组成成分、表达水 平和修饰状态,了 解蛋白质间的相互 作用与联系,在整 体水平上研究蛋白 质的组成与调控的 活动规律。 蛋白质组:一个细 胞或组织或机体所 包含的所有蛋白 质,现定义为基因 组表达的全部蛋白 质。具有三种含义:

果蝇唾腺染色体的几种染色方法比较

果蝇唾腺染色体的几种染色方法比较 双翅类昆虫如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的唾腺染色体(Salivary chromosome)比普通染色体大的多,处于体细胞同源染色体的配对状态,是由于唾腺染色体经过多次复制而并不分开形成的,大约有1000~4000根染色体丝的拷贝,故又称为多线染色体(Poly-tene chromosome)。它是观察染色体形态、研究染色体结构变异等的好材料。制作果蝇唾腺染色体标本的染色方法一般有3种:醋酸洋红法、苯酚品红法和孚尔根(Feuglen)染色法(除此之外还有其他方法)、各种方法都有其自身的特点及适用的条件,因此没有1种染色方法是普遍适用完美无缺的。现将3种常用方法的优缺点分述如下,并提出1个实用的永久封片制作方法。 一、醋酸洋红法 洋红的常用浓度为0.5%~1.0%,醋酸常用浓度为45%~50%,一般现配挪用较好。洋红是从胭脂虫(Coccrs cacti)的雌虫中提取的作为染料的提取物,提取物的品质因胭脂虫的种类而异,是一种混合物,其中具有染色活性的是洋红酸。洋红酸是一种二元弱酸,如果溶于碱性溶液中,则具有酸性染料的性质,可使细胞质着色;如果溶于酸性溶液中,则具有磁性染料的性质,可使染色质(体)着色。此法多用满架法,快速简便,为改进其染色效果,也可采用浸染法,并辅以火焰微热(即滴加醋酸洋红盖片后在酒精灯火焰上微热),增加本底清晰度,加大反差。 醋酸洋红的配制和染色都比较简中,对细胞穿透力较强,这是其主要优点,此外它对染色体和核仁均对染色,故也适用于减数分裂的细胞染色。但其染色强度和分色效果不及其他染色剂,通常只作临时染色观察,不用于制作永久性装片。 也可以用醋酸地衣红替代洋红,这样细胞质着色较少,效果较好。 二、孚尔根染色法 孚尔根染色法是常用于鉴别细胞中DNA的一种组织化学方法,细胞核经过温和的盐酸的水解作用(I mol HCI,60℃而破坏了脱氧核糖与嘌呤碱之间的糖苷键,这样嘌呤碱脱掉而使脱氧核糖的第1个碳原子上潜在的醛基获得自由状态。自由醛基能够与脱色的碱性品红即Schiff试剂反应生成紫红色复合物。 孚尔根染色法的优点是通常只对细胞核和染色体着色,染色均匀一致,背景清晰,组织软化较好,易于压片。缺点是染色体经过染色后,由于染色时间较长(一般在1~2h,动物细胞略短一些),Schiff试剂中所含的盐酸往往使其过度软化。因此在压片时染色体不易分散而易于重叠或粘连,这是它不如苯酚品红染色的主要缺点。另外一个主要缺点是水解条件必须严格控制,l mol HCI水解温度应在60士1℃(某些情况下需要控制在60士0.5℃),因为温度过高或时间过长会造成水解过度,糖与醛基之间的键破坏过大,醛基流失到水解液中,则染色体不均匀着色或染色稍深但细胞质着色,或者出现大小不等的红色小粒;反之,染色体着色浅淡、细胞质中可能有其他醛基存在而呈现扩散的红色。可见,只有水解合适才能使染色体着色较深而细胞质不显示任何颜色。 染色反应须在低温(10℃左右)、黑暗、尽可能减少氧化的条件下进行,否则氧化生成SO也会影响反应的颜色表现,因此孚尔根染色法宜用浸染法,而不宜用液染。此外染的 2 色后一般还需用漂洗液和蒸馏水漂洗,这些操作对于较小的果蝇唾腺来说不太适宜,因为材料容易在染色、漂洗等操作过程中丢失。 三、苯酚品红染色法 现常用改良的苯酚品红染色法,它是卡宝品红(Carbol fuchsin)经过山梨醇改良的,也是目前应用最为广泛的一种优良的核和染色体的染色剂。它既具有醋酸洋红的染色简便、快

核酸细胞化学

Feulgen反应 原理介绍 自从1924年Feulgen等人建立了DNA-Feulgen染色方法以来,至今这种方法仍是DNA定量测定的主要染色方法之一.Feulgen染色是经典显示去氧核糖核酸的方法,该法要求用Carnay氏液固定的新鲜组织效果最好,酒精-甲醛液次之,单纯甲醛固定欠佳,效果不满意. 自Feulgen等发明该显示DNA的Feulgen反应法以来,其作用机制也久经研究和讨论,现已取得一致意见。其具体反应原理是,标本经稀盐酸水解后,DNA分子中的嘌呤碱基被解离,从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应,形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团,故可呈现出紫红色。也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基,具有还原作用,可与无色品红结合形成紫红色化合物,从而显示出DNA的分布。 2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3 DNA是主要的遗传物质,集中于染色体上。1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验,鉴定了染色体上DNA的存在,故称为孚尔根染色法。孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关,此试剂的基本成分是碱性品红,偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。 碱性品红原为桃红色,当与亚硫酸作用时被氧化,使醌型变为苯型,由桃红色变为无色透明的N-亚磺酸亚硫酸副品红碱,当它与醛基作用时,其分子式又恢复为醌型结构,呈现紫红色 利用1M HCl 、60℃下水解时,可将DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断,使嘌呤脱下,并使去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应,因此利用孚尔根反应,可以鉴定DNA的存在。并广泛应用于核及染色体的研究中。 Feulgen反应步骤 标本需经固定后方可染色,Carnoy固定液可按无水乙醇:三氯甲烷:冰醋酸为6:3:1比例配制。固定后石蜡切片即可。尽量不用新鲜组织恒冷箱切片,因胞质中存在的缩醛磷脂会出现非特异染色。若必须使用恒冷箱切片,需做切片后固定。用已固定的组织石蜡切片可消除缩醛磷脂。减少非特异染色,具体操作如下: 1.切片脱蜡入水; 2.用lmol/L HCl浸洗; 3.切片放人预热到60℃1mol/LHCi内6分钟,(固定的标本为10~15分钟.Susa固定的标本为18分钟,水解时间因固定液不同而有差异); 4.入室温lmol/LHCl洗; 5.蒸馏水洗; 6.人Schiff液,于室温暗处(或外包黑纸)30~60分钟; 7.人亚硫酸钠水溶液漂洗3次,每次1~2分钟; 亚硫酸钠水溶液配法: 10%NaHS03 5ml 1mol/L HCl 5ml 加蒸馏水至 100ml 8.蒸馏水洗; 9.脱水、透明、封固。 结果:细胞核内DNA染成紫红色 对照实验: 虽然Feulgen法是DNA 的特异染色方法,但如果延长水解时间并在室温下进行反应, Schiff试剂也与醛、酮、醇和缩醛磷脂起反应,因此用Feulgen法检测DNA时必须严格控制盐酸水解的时间和温度。为

微核实验-毒理学-洋葱根尖染色体观察

微核试验 摘要:利用大蒜根尖细胞微核染色与计数技术测定不同浓度6价铬和1.2,4-三氯苯以及它们的不同浓度混合液对大蒜根尖分生区细胞微核率和细胞分裂各期的影响。以蒸馏水为对照组,设置的实验组为3组不同浓度的6价铬和三氯苯以及它们的混合液。用孚尔根染液法对不同试剂及各浓度的处理的根尖进行染色。在显微镜下观察各试剂各浓度处理下的微核率以及不同分裂期细胞的比例。 关键字:孚尔根染色法、微核、微核率、分裂期细胞 Abstract:Use of garlic root tip cell micronucleus dyeing and counting technology . Different concentrations of chromium 6 and 1,2, 4 - t hree hlorobenzene as well as their different concentration mixture to garlic root tip meristematic cells in the areas of micronucleus rate and the influence of each stage of cell division.With distilled water as control group, the group set up for the three groups of different concentrations of chromium 6 and 3 chlorobenzene and their https://www.wendangku.net/doc/fc13472489.html,efu's root dye solution for different reagent and the concentration of the treatment of root tip for dyeing. Under the microscope to observe the reagent concentration under the treatment of micronucleus rate and different proportion of split phase cells Key Words:Fu's root staining method、micronucleus、Micronucleus rate、Split phase cells 一、研究的目的与意义: 1:知道微核产生的原理。 2:学会识别微核以及计算微核率。 3:学用微核试验来评价药物、放射线、有毒物质等对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤。 4:了解不同化学试剂对细胞各个分裂期的影响。 由于大量新的化合物的合成,原子能应用,各种各样工业废物的排出,使人们很需要有一套高度灵敏,技术简单的测试系统来监视环境的变化。真核测试系统能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害。利用微核实验这种遗传毒性试验方法可以检测检测染色体或者有丝分裂器损伤,计数细胞的微核率。检测已存在或潜在的危害。 二、研究进展 微核( micronucleus, 简称MCN) , 是真核生物细胞中的一种异常结构, 是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。一般认为, 微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体片断产生的。在细胞有丝分裂时, 受到有害理化因子的损伤, 染 色体发生断裂, 在下一次分裂后期, 丧失着丝粒的染色体片断行动滞后, 不能进

遗传学-北京师范大学生命科学学院

遗传学实验 Experiments of Genetics 【课程编号】1410012【课程类别】学科基础课 【学分数】1.5学分【适用专业】生物科学、生物技术 【学时数】48学时【编写日期】2009年6月 一、教学目标 根据北京师范大学生物科学和技术学专业的培养目标,学生应符合基础理论扎实、专业技能娴熟、综合素质过硬的高要求,实验课程应建设成为知识与技能相结合、理论与实际相联系的教学体系;要求实验教学活动注重学生的观察、动手能力,培养学生的分析、思维能力。本课程要求将经典遗传学规律同现代遗传学内容有机结合,在基本规律、基础理论的基础上,用体现基本知识点、充分利用所需实验技术、有助于理解概念和解决实际问题的实验内容训练学生,使学生习得理论知识和应用技能。 二、教学内容和学时分配 模块1:基本遗传规律(实验1-4) 实验一、果蝇的表型观察与性别鉴定2学时基础性 主要内容:果蝇的表型观察、性别鉴定。 教学要求:了解果蝇的生长和遗传特性,果蝇的科学研究价值;理解利用果蝇进行遗传分析的方法;掌握果蝇的基本形态、果蝇的遗传特征和遗传方式。 重点、难点:生长不良果蝇的性别鉴定,特殊性状的准确鉴别、各代之间的时间把握。 其它教学环节:讲授观察方法、实验基本原理,研讨准确判断果蝇特征的方法技巧。 实验二、果蝇杂交实验设计及结果统计分析6学时综合性 主要内容:果蝇的培养和基本实验体系建立,设计杂交实验方案,对杂交结果的统计与分析,研究与验证单基因位点、多基因位点和伴性基因的遗传规律。 教学要求:了解果蝇的基本遗传学规律;理解利用果蝇进行遗传分析的方法,杂交设计的基本原理——与研究的规律相符,准确、简便、科学;掌握果蝇杂交实验的全部过程和注意事项。 重点、难点:果蝇的培养和基本实验体系建立,果蝇杂交实验的设计与操作。 其它教学环节:讲授实验基本原理,小组实验经验交流(果蝇杂交实验的设计、方法、杂交结果分析)。

孚尔根染色

孚尔根染色法中Schiff试剂配方的研究 一、实验目的 1、进一步深入了解孚尔根染色的基本原理 2、探究尝试用非传统的方法配置Schiff试剂并观察其染色效果 二、实验原理 DNA是遗传的物质基础,应用Feulgen反应法显示细胞DNA是常用的组化染色技术,其中Sehitt试剂是染色成败的关键因素。Sehiit试剂(希夫试剂),又称品红醛试剂,与醛类反应呈紫红色。它有多种不同的配制方法,归结起来有经典热配法以及冷配法。实验室经常采用的热配法,配制过程繁琐,常会因一个步骤的偏差而造成配制失败,实验中尝试改用冷配法,可收到与热配法同样的染色效果。 Schiff试剂的主要成分是碱性品红,属三氨基三苯甲烷类,它由副品红、品红、二号碱性品红组成四。碱性品红在酸性环境下与亚硫酸盐作用,生成无色品红。其配制方法有2种:热配法(将碱性品红加热煮沸)是通过热效应来加速分子运动,使染料溶解与脱色;冷配法(室温下采用振荡或搅拌的方法)是通过增加分子间的碰撞,促进染料溶解与脱色。2种方法的反应机制相同。 三、实验器材 实验材料:蚕豆根尖 实验器具:显微镜、载玻片、盖玻片、电炉、滤纸、烧杯、纱布、量筒、锥形瓶、标签、刀片、容量瓶 实验药品:蒸馏水、卡诺氏液、0.1mol/L的盐酸、碱性品红、盐酸、偏重亚硫酸钠、活性炭。 四、实验方法 1.浸种催芽 选择无虫、饱满、大小均匀的蚕豆种子50粒放入蒸馏水的烧杯中, 25℃浸泡24h,其中换水1次。种子吸胀后,在培养皿中铺一层脱脂棉,倒入足量的蒸馏水,将种子置于其中25 ℃培养2至3天,期间随时补充水分,大部分初生根长至1~2cm左右。 2.不同试剂配置 1. 热配法(常规法) 称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中(用三角瓶),时时振荡,继续煮5min(勿使之沸腾),充分溶解。然后冷却致50℃时用滤纸过滤,滤液中加入10ml1mol/L HCl,冷却致25℃时,加入0.5g偏重硫酸钠,充分振荡后,塞紧瓶塞,在室温暗处静置至少24h(有时需要2至3天),使其颜色退至淡黄,然后加入0.5g 活性碳,用力振荡一分钟,最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中,封瓶塞,外包黑纸。滤液应为无色也无沉淀,贮于4℃冰箱中备用。如有白色沉淀,就不能再使用,如颜色变红,可加入少许偏生亚硫酸钠或钾,使之再转变为无色时,仍可再用。 2.冷配法 (1) Kodousek法将1g碱性品红溶于10rnl无水乙醇中,放入250ml烧瓶振荡10min 使之溶解,再加入186ml蒸馏水和5g偏重亚硫酸钠。然后加入34fnl浓盐酸,振荡至完全溶解后溶液呈浅黄色,加500mg活性炭,振荡3min,用0.2mol/L盐酸把容

实验二孚尔根染色法

实验二孚尔根染色法 一、实验原理 染色体是遗传物质的载体,它的主要化学成分是脱氧核糖核酸(DNA),DNA系核苷酸的多聚体,核苷酸又由碱基脱氧核糖和磷酸所组成,当细胞经60℃、1mol·1-1HCl处理后,不仅使分生组织的细胞彼此分离,而且可以破坏核内DNA链上的嘌呤碱与脱氧核糖之间的糖苷键,嘌呤脱下,脱氧核糖上的醛基暴露,形成含醛基的无嘌呤结构物,醛基与希夫试剂反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应,因此所以根据紫红色出现的部位就可鉴定脱氧核糖核酸(DNA)的存在,并广泛应用于核及染色体的研究中。 二、实验目的 学习和掌握孚尔根反应染色法,鉴定植物细胞核内染色体上DNA的存在。 三、实验材料、用具及药品 1.材料:洋葱或大蒜的根尖 2.用具显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、冰箱、温箱、天平、载玻片、盖玻片、吸水纸、吸管、烧杯、量筒、 3.药品希夫氏试剂(无色碱性品红液)、漂洗液、1mol·1-1 HCl、45%醋酸等。 四、实验步骤 1. 取材与固定:待大蒜根尖长1cm 时,于上午8时剪下根尖,经过预处理后投入卡诺固定液中固定2-24h。固定后,保存在70%的酒精中,放入冰箱中冷藏供用。 2.水解试管1:取大蒜根尖数条,投入试管,先用清水洗3次,换1N HCl洗一次,倾去,换入预热60℃的1N HCl 浸没根尖,放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10分钟(视材料而定,水解时间可以从10分钟延长至30分钟)。然后吸去热1N HCl,换入冷1N HCl洗一次,再用清水将根尖洗三次。试管2(对照)取大蒜根尖数条,投入试管,先用清水洗3次,入预热60℃的蒸馏水浸没根尖,放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10分钟。以下各步骤两试管相同。(水解是本实验成败的关键之一。重要的是温度,应保持在60±0.5℃之间。如果温度过高或时间过长,造成水解过度,醣与醛基之间的键被破坏,醛基流失到水解液中,反之,不能出现潜在的醛基,都不能呈现颜色反应。) 3. 染色两试管中均滴加希夫试剂,浸没根尖,立即置于暗处处理0.5—1h,然后用漂洗液换洗3次,每次2min;再用蒸馏水换洗2次,每次2min。 4. 压片镜检。分别取上述两试管中的根尖,置于载玻片上,滴加1滴45%醋酸,然后压片镜检。 〖注意事项〗注意水解时间和温度。 五、作业 1.经孚尔根染色的压片,用指甲油将盖玻片的四周封固成临时片,储于冰箱中。 2.比较根尖经盐酸水解处理与否所获得的结果,并作出解释。 附试剂配制 1.Schiff试剂称1g碱性品红于200ml煮沸的蒸馏水中,5分钟后断电使其冷却至55~50℃,过滤到一个棕色的试剂瓶中,加入1N HCl 20ml,继续冷却至25℃,加入3g偏重亚硫酸钠,摇动瓶子使其溶解。密闭瓶口,置黑暗低温处或冰箱内(4℃左右),18~24小时后检查,试剂如透明无色或呈浅黄色时即可使用。如有不同程度的红色未褪,可加入1g活性炭,强烈震荡一分钟,仍在低温下静置过夜,然后用滤纸过滤后使用。密封瓶口,包以黑纸,在5℃以下冰箱内可以保存半年。 2.漂洗液在200ml蒸馏水中,加入10ml 1N HCl 和10ml 10%亚硫酸钠溶液。此液在临用前配制。 3.1N HCl 准确量取86.2ml浓盐酸(比重1.18)加入到913.8ml蒸馏水中。

实验6 孚尔根反应

中国海洋大学实验报告 姓名:常天易系年级:海洋生命学院2012级专业:生物科学 科目:分子细胞生物学实验学号:12050011006 孚尔根反应 一、实验目的 1.熟悉并掌握孚尔根反应的原理及其实验操作方法 2.对细胞的组织化学研究方法有一初步的认识 二、实验原理 DNA的嘌呤碱基经稀HCl水解后产生的醛基,具有还原作用。Schiff试剂(脱色碱性品红试剂)中的无色品红可与醛基反应,形成含有醌基的化合物分子,显现出紫红色,进而显示出DNA的分布情况,而且可以通过DNA被染色的颜色的深度显示其含量的多少。细胞质会亮绿染液被染成绿色,已显示出富含DNA的细胞核的位置。 三、实验材料

①实验试剂 1、Schiff 试剂 2、1mol/L 盐酸 3、1%亮绿染液 4、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ 5、30%、50%、70%、85%、95%、100%的乙醇水溶液 6、亚硫酸水(现配现用) ②实验材料 用carnoy 固定液固定的鱼肝脏切片; ③实验设备 显微镜、立式染色缸、恒温水浴锅、镊子、擦镜纸,盖玻片; 四、实验步骤 1、 取3个已制备的鱼肝脏切片,经二甲苯Ⅰ浸泡20分钟 ,二甲 1、 取3个已制备的鱼肝脏切片,经二甲苯Ⅰ浸泡20分钟 ,二甲苯Ⅱ浸泡 10分钟。 2、 依次经100%(Ⅰ)、95%、85%、70%、50%、30%的乙醇溶液浸泡5分钟。

3、将标本放入蒸馏水浸泡5分钟。 4、将标本放入1mol/L 盐酸的染缸5~10秒。 5、将标本放入60℃的1mol/L 盐酸水解8分钟。 6、将标本放入1mol/L 盐酸的染缸5~10秒。 7、将标本用蒸馏水浸泡,3次。 8、将标本放入Schiff 试剂中染色1小时。

孚尔根反应

孚尔根反应 实验目的 1. 熟悉并掌握Feulgen反应的原理及其实验操作方法 2. 对细胞的免疫组化研究方法有一初步的认识 实验原理 标本中DNA经稀酸水解后产生的醛基,具有还原作用,可与Schiff试剂中无色品红结合形成紫红色化合物(含醌基),从而显示出细胞中DNA的分布。 2HCl+Na 2S 2 O 5 →2NaCl+SO 2 +H 2 SO 3 实验用品 一、器材显微镜、立式染色缸、水浴锅 二、材料香柏油,擦镜纸,镊子,盖玻片,用carnoy's固定液固定的肝脏切片。 三、试剂 1. schiff氏试剂 2. 亚硫酸水(洗涤剂,现配现用) 用200ml普通自来水(不要用蒸馏水, 以免引起误差)、10ml 10%的偏重亚硫酸钠水溶液和10ml 1mol/L HCl,三者在使用前混合。 3. 1mol/L HCl(水解用) 取82.5ml比重为1.19的盐酸加蒸馏水1000ml即成(应将盐酸缓缓加入水中)。 4. 1%亮绿(light green) 亮绿1g,溶于100ml蒸馏水中。 5. 30%、50%、70%、85%、95%、100%的梯度酒精及二甲苯。 实验方法 1. 取材与固定 2. 脱水 3. 制片(已完成) 4. 脱蜡将制片经二甲苯I(20 min)和二甲苯II(分别10 min、12min、14min)将石蜡脱净,再经 100%、95%、85%、70%、50%、30%的酒精5各min,最后放入蒸馏水中(10 min)。

5. 水解先将制片放入一盛有1 mol/L HCl的染色缸内,清洗一下,然后将载片放入已温浴 至60℃的1 mol/L HCl溶液中水解8 min。水解后很快将标本取出,放入室温1 mol/L HCl 溶液中。 注意: 这个步骤非常重要,必须用1 mol/L稀盐酸冲洗,因为它可以洗去贴在切片上的试剂的痕迹。如用蒸馏水冲洗,则试剂本身也可以水解,所释放出的碱性品红,可以使切片 内一切嗜碱性物质皆染色从而引起严重的错误。 若切片较厚,可延长其水解时间,而且每次均需更换洗涤剂。 6. 水洗用蒸馏水冲洗3次(每次5min),使水解停止。 7. 染色将标本放入Schiff试剂中染色0.5 h。 8. 洗涤在染色缸中用亚硫酸水洗3次,每次洗3 min。 9. 水洗流水冲洗5 min,再用蒸馏水洗片刻。 10. 复染用1%亮绿复染(20s、30s、40s)。 11. 水洗、脱水与封片用蒸馏水洗3次, 每次5 min;再经过30%、50%、70%、85%、95%、 100%(I)、100% (II)的酒精各3min,二甲苯透明(II和III各8min),中性加拿大树胶封片。 实验结果 大部分细胞核(DNA)为紫红色(颜色深浅不一,可见DNA在细胞核中分布不均匀),核仁绿色。细胞质被亮绿复染成绿色,但也略带红色。 脱蜡时间比较:染色效果脱蜡时间14min的样品最好,其次12min,10min的效果最差。 复染时间比较:复染20s的效果最好,随时间加长染色变深,影响观察。 思考题 1总结Feulgen反应染色结果的影响因素。 1)样品的厚度。若样品较厚则相同条件下厚片染色较不完全。 2)脱蜡的时间。脱蜡时间如果过短则会脱蜡不完全,染料很难与材料接触,使染色效果变差。 3)水解前用1 mol/L HCl冲洗。冲洗可以除去贴在切片上的试剂的痕迹。若用蒸馏水冲洗,则试剂本身也可以水解,所释放出的碱性品红,可以使切片内一切嗜碱性物质皆染色。 4)水解时间。若水解时间不够, 反应就会变弱;如水解时间过长。或水解地过于剧烈,则脱氧核糖也易掉下来,反应也会减弱。 5)水解后用蒸馏水冲洗。若没有把盐酸冲洗干净,则会导致残留盐酸继续水解DNA,使脱氧核糖容易掉下来,反应减弱。 6)用Schiff试剂染色剂的质量。只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红,Schiff 试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。 7)染色后用亚硫酸水洗片。可洗去非特异性染来及多余的染料,防止染色过度。

期末实验 孚尔根染色法和植物染色体标本的制备

期末实验孚尔根染色法和植物染色体标本的制备207.12.1 6.结果与分析 6.1结果 (1)孚尔根染色结果 图1.洋葱根尖分生区孚尔根DNA染色结果(10×10倍) 图2.洋葱根尖分生区孚尔根DNA染色结果(10×40倍) ①结果描述:在光学显微镜下,洋葱根尖细胞被均匀地压成了单层细胞,细胞分布较为均匀,变形细胞较少。DNA成功被染上紫色,染色较深,视野背景为白色无红色颗粒较为清晰,视野中无气泡。处于分裂时期的细胞约占10%,分裂期的细胞染色体染色较深,而分裂间期的染色较浅,中间有1-3个白斑为核仁。 ②结果评价:较成功 ③结果分析:在物镜10倍观察下可以清晰反映出压片的结果与染色的情况。在压片前要注意用亚硫酸水把染液冲洗干净,防止背景一片红,不利于观察,压片时先把根尖捣碎,防止细胞堆积;在压片时要固定好盖玻片防止盖玻片与载玻片之间发生摩擦,防止细胞变形,同时也要注意力度的把握和敲击的方向,垂直敲打,且从中间到边缘。染色的时间要足够长,这是我实验时制作的第二张装片,染色时间为18min,第一张为10min,染色较浅,不利于观察。视野中,由于分裂

期的染色质高度螺旋为染色体,DNA浓度较高,所以分裂期的染色体染色较深,而分裂间期的细胞,DNA分裂较为均匀,所以染色较为均匀且相对浅,中间的白斑为核仁,因为核仁中主要为rRNA,所以不被染成紫色。 A B C D E F G H I J K L M N O P 图2.洋葱根尖分生区孚尔根DNA染色有丝分裂过程(10×40倍)

①结果描述: A间期:DNA均匀分部于细胞核中,核仁明显,为透明发亮圆形,可见1—3个。B-E前期:细胞核膨大,染色质缩短变粗,晚前期(D、E)核仁、核膜消失。 F-G中期:染色体缩短变粗,形成姐妹染色单体,整齐排列与赤道板上。 H-L后期:着丝粒分裂,姐妹染色单体分离,分别移向细胞两极。 M-P末期:染色体解旋为染色质,核仁核膜重新出现,细胞中间形成细胞板。②结果分析:由于细胞的有丝分裂是一个动态变化过程,所以各个时期之间都存在一个过度的过程。间期细胞DNA分布均匀,所以染色均匀,核仁主要为rRNA 所以为透明白色;前期细胞变化较为明显,核纤层被磷酸化,核膜解体,早前期是染色质的状态,晚前期则为染色体状态。晚前期到后期均为染色体状态,所以染色都较深;后期也是一个很明显的动态时期,所以在压片中会有许多不同程度的两套染色体分离情况。末期时,核仁组织区DNA解凝聚,rRNA合成重新开始,所以,核仁重新出现,细胞板最终形成细胞壁。 6.2染色体制备 ①结果描述:该染色体制备的结果为其他同学所制备的,视野中染色体没有很好的分散开,有些还处于重叠的状态不能很好地分辨出16条染色体,但总体还算成功,染色较深,背景较清晰,染色体性状多成弧形。 ②结果评价:不够理想 ③结果分析:由于染色体制备所用的是标准中期的染色体,所以染色体能很好地分离且保持中期时的弧形状态。但制片的结果中并不能完全数到16条染色体,而是多于16条,可能是由于在压片时用力过度把染色体压断了,可以利用铅笔的橡皮头敲打。且制片结果染色体并没有很好分散,可能是因为在制备时装片内的水分过少,导致染色体无法分离,可以在压片时用刀片轻轻掀开盖玻片,滴加1-2滴亚硫酸水后再压片。

孚尔根

课程名称:细胞生物学指导老师:成绩:__________________ 实验名称:孚尔根染色同组学生姓名: 一、实验目的和要求(必填)二、实验内容和原理(必填) 三、实验材料与试剂(必填)四、实验器材与仪器(必填) 五、操作方法和实验步骤(必填)六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析(必填)八、讨论、心得 一、实验目的 1.以Feulgen染色法为例学习细胞化学方法检测细胞核DNA的原理和方法; 2.观察DNA在细胞内的分布。 二、实验原理 孚尔根反应分为水解和显色两个步骤。 在水解过程中,细胞中DNA经1N60℃盐酸水解后,DNA双螺旋结构中的嘌呤与脱氧核糖之间的连接打开,使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基,这些醛基与Schiff氏试剂作用,形成紫红色的三苯甲烷衍生物。 Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用,形成无色的品红液,当无色品红与醛基结合形成紫红色的化合物。紫红色的产生,是由于反应产物的分子内含有醌基,醌基是一个发色基团,所以具有颜色。因此凡有DNA的地方,都能显示紫红色。但是,细胞中除了DNA酸解会产生醛基之外,多糖等物质也会产生醛基,此外细胞中可能还有自由醛基,但多糖的醛基不会再该反应条件下裸露,而且自由醛基可被盐酸消除;此外,细胞中的RNA也不被染色。目前认为,RNA的N-糖苷键较为稳定,在孚尔根反应的酸解条件下,其嘌呤碱基不会易被脱去。故只有DNA不完全水解出来的醛基才能与Schiff试剂反应生成紫红色产物;由于线粒体,叶绿体的结构原因,内部的DNA也不被染色。从而,孚尔根反应时对细胞中核DNA高度专一的一种检测手段。材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理,得到的反应是阴性的,从而证明了Feulgen反应的专一性。

实验7 细胞化学——鉴定DNA的Feulgen反应

实验7 细胞内核酸的原位显示和染色方法 核酸是细胞中的重要组分,主要包括DNA和RNA。DNA是遗传信息的载体,主要存在于细胞核中;RNA传递DNA的遗传信息,指导细胞合成各种蛋白质。核酸的细胞化学研究已有近一个世纪的历史,1924年Feulgen和Rossenbeck于1924年创立显示DNA的特异性反应,1940年Brachet发明了甲基绿一派洛宁染色方法用以区别细胞中的DNA和RNA。这些经典方法目前仍被广泛应用,并得到不断改进和发展。研究细胞中核酸的含量及其动态变化,对于理解生长、发育、分化及凋亡等生物学基本问题具有重要的价值。 孚尔根反应(Feulgen reaction)是特异性显示DNA的最经典方法,得到了非常广泛的应用。其原理是DNA经过稀盐酸水解后的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开,脱氧核糖的C 端形成游离的醛基。游离的醛基再同Schiff试剂的无色品红反应形成紫红色化合物,使细胞内含有DNA的部位呈现紫红色阳性反应。 甲基绿和派洛宁是2种碱性染色料,二者分别属于三芳基甲烷和氧杂蒽衍生物,与酸性的核酸具有亲和力,可以形成盐键而呈现出特殊的颜色反应。在pH4.6时甲基绿与派洛宁跟核酸发生竞争性结合。甲基绿分子具有2个正电荷,与聚合程度高的DNA具有较强的亲和力,与DNA双螺旋外侧的磷酸根基团结合从而阻止派洛宁从碱基之间插入,甲基绿与DNA的结合产物呈绿色;派洛宁只有1个正电荷,与低聚分子RNA具有较强的亲和力,中和RNA的磷酸基团,阻止甲基绿染色,派洛宁与RNA的结合物呈红色。根据颜色的部位可以判断DNA和RNA的定位并且判断两种核酸的相对含量。这一反应对pH敏感,脱水过程、染料的纯度和染料的结合力都影响到染色效果。 【实验目的】 学习DNA的Feulgen染色方法,并了解Feulgen反应原理及其DNA在细胞中的分布。 掌握甲基绿-派洛宁法(methyl green-pyronin method)并了解DNA和RNA在细胞中的分布。 【实验器材、材料和药品】 1.器材 显微镜、剪刀、镊子、解剖针、染色缸、载玻片、盖玻片、吸水纸、恒温水浴箱、小烧杯(10ml) 2.材料 洋葱鳞茎 3.试剂及其配制 Carnoy固定液:3份95%乙醇:1份冰醋酸

孚尔根

染色体变异与孚尔根核反应染色法 实验日期:11月24日——12月8日 成员:周赛赛、傅林美、颜燕何、何洪菲、丁小娟 实验研究方向:分别用秋水仙素和紫外线处理植物根尖,对照组为未处理的植物根尖。观察和鉴定DNA的存在情况和染色情况 一、实验目的 1.学习和掌握孚尔根反应染色法。 2.鉴定植物细胞核内染色体上DNA的存在。 二、实验原理 DNA是主要的遗传物质,集中于染色体上。1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验,鉴定了染色体上DNA的存在,故称为孚尔根染色法。孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关,此试剂的基本成分是碱性品红,偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。 碱性品红原为桃红色,当与亚硫酸作用时还原,使醌型变为苯型,由桃红色变为无色透明的N-亚磺酸亚硫酸副品红碱,当它与醛基作用时,其分子式又恢复为醌型结构,呈现紫红色。 利用1N HCl 、60℃下水解时,可将DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断,使嘌呤脱下,并使去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应,因此利用孚尔根反应,可以鉴定DNA的存在。并广泛应用于核及染色体的研究中。 水解的时间很重要,因为核酸的水解有两个过程,第一,嘌呤碱很快被除掉,脱氧核糖中潜在的醛基显露出来,第二,组蛋白和核酸愈来愈多的被除掉。在短时间的水解作用以后,第一个过程占优势,这个时候用希夫试剂进行染色,染色体的染色作用最强。随着水解作用的继续进行,第二个过程逐渐变成优势,因此水解液中希夫反应最强,而染色体中的希夫应减弱。最后,第二个过程超过第一个过程时,染色体也随之停止反应。 三、实验材料 蚕豆根尖 四、实验器具和药品试剂 显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、冰箱、温箱、天平、载玻片、盖玻片、吸水纸、青霉素瓶、吸管、烧杯、量筒、切片架、切片盒、小口瓶。 95%乙醇、冰醋酸、碱性品红、偏亚硫酸氢钠、盐酸、活性炭、亮绿。 五、实验方法和步骤 1、材料准备:培养小麦和蚕豆的根尖。大约4-5天,根长到1-2cm 2、处理:分别用0.05%的秋水仙素以及超净工作台中的紫外灯在相同距离(距离紫外灯40cm)下照射1min,2min,3min,4min来处理根尖。另外一组不做处理。然后将紫外照射的蚕豆根尖恢复培养24个小时。 3、固定:将根尖取下,加入卡诺氏固定液固定。固定液配置的比例是无水乙醇:冰醋酸=3:1 4、水解:实验时,取出固定的根尖根尖,分装到若干个青霉素瓶中,用清水洗三次,换1N HCl 洗一次,倾去,换入预热60℃的1N HCl 3ml,放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10min(视材料而定,水解时间可以从10min延长至30min)。然后吸去热1N HCl,换入冷1N HCl洗一次,再用清水将根尖洗三次。 5、染色:吸净水分,加入Schiff试剂避光染色30min,然后用漂洗液漂洗2~3次,经水洗准备压片。 6、压片观察:取一根尖置于载玻片上,切下生长区部位(染成紫红色),加一滴0.1%亮绿水溶液对染1min,吸去亮绿液,加一滴清水或45%醋酸水溶液压片镜检。

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