麝香保心丸对自发性高血压大鼠肾脏炎症状态的改善作用_田登科
第11卷 第6期 2009 年 6 月
辽宁中医药大学学报
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
Vol. 11 No. 6 Jun . ，2009
肾脏是高血压的重要靶器官之一。最近研究表明，炎症反应不仅参与了高血压疾病的发生发展，更
是与高血压心、脑、肾等多个靶器官损害密切相关[1]
。
炎症反应不仅可导致肾脏纤维化和肾单位的损伤，同时也参与了肾小球滤过膜的破坏，因此抗炎相关治疗已经成为防治高血压肾脏疾病新的重要环节。1972年，戴瑞鸿教授在原中药苏合香丸的基
础上开始HMP 组方的研制工作，经过多年实验及临
床研究证实HMP 可显著改善心肌缺血，治疗冠心病
心绞痛有明显疗效[2]
，最近发现HMP 对高血压肾脏损害和心肌纤维化具有显著的治疗作用[3-4],然而对相关作用机理尚缺乏探讨。本研究将观察HMP 对SHR 肾脏炎症状态的影响，进一步明确其作用环节和机理，为开拓其在防治高血压肾脏疾病方面的临
麝香保心丸对自发性高血压大鼠肾脏炎症状态的改善作用
田登科1，陈刚领1，李亚娟1，胡送友1，刘 俊1，卞 卡1，
2
（1.上海中医药大学穆拉德中药现代化研究中心，上海 201203；2.美国德克萨斯大学休斯顿医学院综合生物及药理学系，
德克萨斯大学分子医学研究所，美国）
摘 要：目的：观察麝香保心丸（HMP）对自发性高血压大鼠（SHR）肾脏炎症状态的影响，探讨其对高血压
肾脏疾病的防治作用及机制。方法：将6周龄SHR 分为HMP 治疗组和高血压模型对照组，以同周龄的Wistar-Kyoto (WKY) 大鼠为正常对照，在3个时间点（给药6周，给药14周，停药9周）研究HMP 对SHR 血压值、肾脏炎性因子表达和氧化应激水平的影响。结果：在整个实验过程中HMP 对SHR 无明显降压作用(P >0.05)。HMP 在mRNA 和蛋白水平抑制了细胞间粘附分子-1（ICAM-1）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在SHR 肾脏的高表达(P <0.05)，在mRNA 水平抑制了肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的高表达(P <0.05)。HMP 在给药14周和停药9周时降低了过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）的mRNA 表达(P <0.05)，而在给药6周和给药14周时明显降低了PPARγ的蛋白表达(P <0.05)。HMP 给药14周及停药9周后均可显著提高SHR 肾脏组织总抗氧化能力(P <0.05)，给药14周时能显著降低SHR 肾脏组织蛋白羰基化水平(P <0.05)。结论：HMP 给药后能够显著减轻SHR 肾脏炎症反应，并且伴随着肾脏氧化应激水平的降低，这可能是HMP 在防治高血压肾病方面具有应用潜能的作用机理。
关键词：麝香保心丸；自发性高血压大鼠；高血压肾脏疾病；炎症反应
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-842X (2009) 06- 0005- 04收稿日期：
2009-02-11基金项目：
国家科技部十一五支撑计划（2006BAI11B08-03）；上海市科委基础研究重点项目（05JC14056）作者简介：
田登科（1981-），男，河南许昌人，博士研究生，从事心血管药理和炎症医学研究工作。通讯作者：
卞卡，教授，博士生导师，博士，Tel:021-********,E-mail:Ka.Bian@https://www.wendangku.net/doc/f014722525.html, Anti-inflammatory Effects of Heart-protecting Musk Pill on
Kidney of Spontaneously Hypertensive Rat TIAN Deng-ke 1，
CHEN Gang-ling 1，LI Ya-juan 1，HU Song-you 1，LIU Jun 1，BIAN Ka 1,2（1. Murad Research Institute for Modernized Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 2. Department of Integrative Biology and Pharmacology,
Institute of Molecular Medicine,Houston Medical School of Texas University, USA）
Abstract ：
Objective : To investigate the effect of Heart-protecting Musk Pill（HMP）on inflammatory status of the kidney from spontaneously hypertensive rat (SHR), and to explore preventive and therapeutic usage of HMP on hypertensive nephropathy. Methods : SHR of 6 weeks old were divided into HMP group, high blood pressure model group, and age-matched Wistar-Kyoto rats were used as normal control. The effects of HMP on systolic blood pressure, expression of inflammation-related factors and level of oxidative stress were determined at 3 time points: 6 weeks of treatment; 14 weeks of treatment; and 9 weeks post-treatment. Results : HMP did not inference the elevation of blood pressure of SHR through period of treatment(P >0.05). However, the TCM compound inhibited the expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) at both mRNA and protein levels (P <0.05). HMP also inhibited the mRNA expression of tumer nerosis factor-α (TNF-α) in SHR kidney (P <0.05). At the time points of 14 weeks of treatment and 9 weeks post-treatment, HMP significantly attenuated peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPARγ) mRNA expression(P <0.05). The protein level of PPARγ was also inhibited by HMP markedly after 6 and 14 weeks of treatment(P <0.05). After 14 weeks of treatment, HMP increased total anti-oxidant capacity of renal tissue from SHR (P <0.05) and this elevated anti-oxidant capacity was even maintained for 9 weeks post-treatment (P <0.05). In addition, HMP 14 week of treatment significantly reduced protein carbonyl contents of SHR kidney (P <0.05). Conclusion : HMP can improve the inflammatory status of SHR kidney independent of interfering with blood pressure. The anti-inflammatory effect of HMP was also acccmpanied by the decreasing level of oxidative stress, which may serve base for the advanced therapeutic utility of HMP in hypertensive renal disease.
Key words ：
Heart-protecting Musk Pill(SHR); Spontaneously hypertensive rat (SHR); Hypertensive
nephropathy; Inflammation
辽宁中医药大学学报11卷
床应用提供科学依据。
1 材料和方法
1.1实验动物与药物
SPF级SHR48只，WKY大鼠24只，均为雄性，6周龄，购自中科院上海实验动物中心，动物合格证号：SCXK（沪）2007-0005。HMP由上海和黄药业有限公司生产(成分：麝香、人参提取物、人工牛黄、肉桂、苏合香、蟾酥、冰片；每丸22.5mg，批号G060601)。
1.2试剂与仪器
Trizol 试剂购自美国Sigma-Aldich 公司；RT-PCR 试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限公司；引物合成自上海生工生物工程技术有限公司；抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology Inc公司。PCR扩增仪：德国Biometra 公司；GIS凝胶图像分析系统：上海天能科技有限公司；无创尾动脉血压测定分析系统：上海奥尔科特生物科技有限公司；酶标仪Spectra Max 190：美国Molecular Devices公司；分光光度计UV-1700：日本Shimadzu公司。其它试剂为国产分析纯。
1.3动物分组及给药
将48只SHR随机分为HMP组和高血压模型组，每组24只，以24只同周龄的WKY大鼠为正常对照。将HMP溶于蒸馏水中灌胃给药，药物浓度为1.35mg/ ml，日用药量为13.5mg/kg,SHR模型组和WKY对照组大鼠每日按10ml/kg灌胃蒸馏水。分别在给药6周、给药14周和停药9周后分3批处理动物。
1.4检测指标
1.4.1 血压测定 采用无创测量大鼠血压的装置进行尾动脉收缩压测定。测定前将大鼠置于35℃恒温箱中预热10min，然后测量大鼠在安静、清醒状态下的尾动脉压4~6次，取其平均值。每周定时进行测定一次。
1.4.2 动物处理及肾脏组织总RNA 蛋白提取 大鼠腹腔注射40mg/kg戊巴比妥钠麻醉，颈椎脱臼处死，取出肾脏组织液氮速冻后-80℃保存，用于总RNA、蛋白样品制备。取大鼠冻存肾脏组织50~100mg，加1ml Trizol试剂，按照试剂使用说明提取总RNA，所用RNA的A260/A280均在1.8~
2.0之间。取大鼠肾脏组织约200mg，在2mL中含有蛋白酶抑制剂的 PBS（pH7.4）中匀浆组织，4℃离心15min两次，取上清即为总蛋白样本。
1.4.3 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）按照RT试剂盒说明书进行cDNA的合成，PCR扩增所需引物序列及反应条件如表1所示，β-actin作为内参照。扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳，以上海天能图像分析系统对所得条带光密度进行扫描分析。
1.4.4 蛋白质印迹（Western-blot）分析 用Lowry 法测定蛋白浓度后，按照每孔50ug蛋白样品上样。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离总蛋白，电转移蛋白至硝酸纤维素膜，5%的脱脂奶粉室温下封闭1h，加入一抗ICAM-1（1：200）、iNOS（1：400）、β-actin（1：1000）4℃过夜。PBS-T洗膜3×5min 后，以辣根过氧化物酶（HRP）标记的相应二抗（1：5000）室温孵育1h，化学发光法进行显色反应，最后在暗室中显影定影。
1.4.5 肾脏组织总抗氧化能力测定 采用高铁还原抗氧化能力（FRAP）测定法。5μL肾脏组织蛋白样品和245μL FRAP工作液在37℃反应10min后，分别以PBS 和水溶性维生素-E（Trolox）作为空白和标准对照，于593nm处测定吸光度值。
表1 PCR反应所需引物序列及条件
目的基因引物序列退火
温度
扩增碱
基对iNOS
正义：5-CCAACCGGAGA-
AGGGGACGAACT-3
反义：5- GGAGGGTG-
GTGCGGCTGGAC -3
59℃521bp ICAM-1
正义：5-GCGGCCTTG-
GAGGTGGAT-3
反义：5’- GGAGGC-
GGGGCTTGTACC -3’
63℃485bp TNF-α
正义：5-CCCTCACACTCA-
GATCATCTTCTCAA-3
反义：5-TCTAAGTACTT-
GGGCAGGTTGACCTC-3
55℃433bp PPARγ
正义：5-GAGATGCCATTCTG-
GCCCACCAA CTTCGG -3
反义：5-TATCATAAATA-
AGCTTCAATCGGA TGGTTC -3
55℃421bp β-actin
正义：5-AGCTGAGA-
GGGAAATCGTGCG -3
反义：5-GTGCCACCAGA-
CAGCACTGTG -3
53℃204 bp
1.4.6 肾脏组织蛋白羰基化水平测定 采用2,4-二硝基苯肼（DNPH）法测定肾脏组织蛋白羰基化水平[5]。蛋白质被氧化后形成的羰基可与DNPH 反应生成红棕色的沉淀2,4-二硝基苯腙，将沉淀用盐酸胍溶解后于370nm处读取吸光度值,从而测定蛋白质的羰基含量。羰基浓度以摩尔消光系数2
2.0mmol/（L·cm）计算，羰基含量用每毫克蛋白中含有多少nmol的羰基来表示。
1.5统计分析
所有数据以平均数±标准差（x—±s）表示，数据分析采用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析。
2 结 果
2.1HMP对SHR血压值的影响
见表2。模型组SHR收缩压较正常对照WKY 大鼠明显升高(P<0.05)。给药HMP 6周，14周及停药9周后，SHR的收缩压与模型组大鼠比较无明显差异(P>0.05)。
表2 HMP对SHR血压值的影响（n=8，x—±s）组别给药6周
SBP（mmHg）
停药9周
给药14周
WKY组135.7±7.2141.4±6.1138.5±4.9 SHR模型组185.2±9.4▲197.6±5.6▲208.5±7.4▲HMP组187.6±5.8■194.9±8.9■212.7±8.3■注：与WKY组比较，▲P<0.05；与SHR模型组比较，■P>0.05。
2.2HMP对SHR肾脏iNOS和ICAM-1表达的影响
如图1(a)、1(b)、1(c)所示，模型组大鼠肾脏 iNOS、ICAM-1的mRNA表达显著高于正常组(P<0.05)，HMP治疗后(给药6周，给药14周，停药9周)可显著降低SHR肾脏iNOS、ICAM-1的mRNA表达水平(P<0.05)。
如图2(a)、2(b)、2(c)所示，与WKY大鼠比较，12周龄的模型组SHR肾脏iNOS的蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)，而SHR在20,29周龄时可见iNOS的高表达(P<0.05)；在各处理周龄模型组大鼠ICAM-1的蛋白表达均有明显提高(P<0.05)。HMP给药6周时iNOS的蛋白表达无明显变化(P>0.05)，给药14周和停药9周后iNOS的表达明显降低(P<0.05)。在各处理批次（给药6周，给药14周，停药9周）HMP均能够显著降低ICAM-1的蛋白表达水平(P<0.05)。
11卷 辽宁中医药大学学报
PPAR
A
B C
iNOS
ICAM-1 β-ac tin
TNF- W S H W S H
W S H
1(b) 1(c)
1(d) 1(e)
1 (a)：RT-PCR 反应条带；1(b) iNOS作图；1(C) ICAM-1作图；1(d) PPARγ作图；1(e) TNF-α作图。A ：给药6周；B ：给药14周；C ：停药9周。W ：WKY 组；S ：SHR 模型组；H ：HMP
组。与WKY 组比较，#P <0.05；
与SHR 模型组比较，*P <0.05。图1 HMP 对SHR 肾脏炎症相关因子mRNA 表达的影响（n ≥3）
2.3 HMP 对SHR 肾脏TNF-α和PPARγ表达的影响
见图1(a)、1(d)、1(e)，模型组大鼠肾脏PPARγ、TNF-α的mRNA 表达显著高于正常组(P <0.05)。HMP 给药6周后对PPARγ的表达无明显影响(P >0.05)，在给药14周和停药9周后可明显降低其mRNA 水平（P <0.05）。HMP 治疗后(给药6周，给药14周，停药9周)可显著降低SHR 肾脏TNF-α的mRNA 表达水平(P <0.05)。
如图2(a)、2(d)所示，与WKY 大鼠比较，在各处理周龄模型组大鼠PPARγ的蛋白表达均有明显提高 (P <0.05)。HMP 给药6周，14周时可抑制PPARγ的高表达(P <0.05)，而在停药9周后对其表达无明显影响(P >0.05)。
2.4 HMP 对SHR 肾脏总抗氧化能力的影响
见表3。模型组SHR 在20、29周龄时肾脏总抗氧化能力相对于WKY 大鼠明显降低(P <0.05)。HMP 给药6周后，SHR 总抗氧化能力与模型组大鼠比较有提高趋势(P >0.05)，在给药14周和停药9周时SHR 肾脏总抗氧化能力明显提高 (P <0.05)。
2.5 HMP 对SHR 肾脏蛋白羰基化水平的影响
见表4。与WKY 组比较，SHR 模型组肾脏蛋白羰基化水平显著提高(P <0.05)。HMP 给药6周和停药9周后，SHR 蛋白羰基化水平与模型组大鼠比较
无显著差异(P >0.05)，
而在给药14周时SHR 肾脏蛋白羰基化水平明显降低(P <0.05)。
表3 HMP 对SHR 肾脏总抗氧化能力的影响（n =8，x —
±s ）
组别
总抗氧化能力(nmol Trolox/mg 蛋白)
给药6周 给药14周 停药9周
WKY 组8.31±0.2712.40±0.1412.13±0.66
SHR 模型组7.94±0.35 6.66±0.17▲
7.25±0.21▲
HMP 组8.48±0.32 12.66±0.25● 11.76±0.43●
注：与WKY 组比较，▲P <0.05；与SHR 模型组比较，●
P <0.05。
表4 HMP 对SHR 肾脏蛋白羰基化水平的影响 （n =8，x —
±s ）
组别
蛋白羰基化水平(nmol/mg 蛋白)
给药6周 给药14周 停药9周
WKY 组 3.78±0.44 5.04±0.81 7.19±0.84SHR 模型组 7.50±0.68▲ 9.87±0.60▲ 10.81±1.10▲
HMP 组7.07±0.57 6.14±0.43●10.38±0.65
注：与WKY 组比较，▲P <0.05；与SHR 模型组比较，●
P
<0.05。
2(a)
A
B C
W S H
W S H
2(c) 2(d)
2(a)：Western-blot 反应条带；2 (b)：ICAM-1作图；2 (c)：iNOS 作图；2 (d)：PPARγ作图。A ：给药6周；B ：给药14周；C ：停药9周。W ：WKY 组；S ：SHR 模型组；H ：HMP 组。与
WKY 组比较，#P <0.05；
与SHR 模型组比较，*P <0.05。图2 HMP 对SHR 肾脏炎症相关因
子蛋白表达的影响（n ≥3）
3 讨 论
肾脏是高血压的重要靶器官之一,高血压肾病
可导致很高的高血压病致死、致残率。目前关于高血压肾脏损伤的发病机理有许多学说和解释，国际最新研究表明发生于肾脏的慢性炎症反应是高血压肾脏损伤的重要病变因素。成年SHR 肾间质纤维化、蛋白尿和肌酐清除率降低明显，同时伴随着肾脏炎性因子的高表达和氧化应激的发生[6-7]。临床及动物实验结果显示HMP 具有显著的抗炎、抗氧化作用，并且有研究证明HMP 可有效防治高血压时肾脏
损伤[8-9，3]
。本研究将通过观察HMP 对SHR 肾脏炎症状态的影响，进一步明确和探讨其对高血压时肾脏的保护作用及机理。
ICAM-1
iNOS PPARγβ-actin
辽宁中医药大学学报11卷
动脉压增高是高血压时肾脏病变发生的重要诱因。然而研究表明，在血压未升高的幼龄SHR肾间质中便存在着单核/巨噬细胞的浸润和NADPH 氧化酶的活化，这表明炎症反应和氧化应激可能不依赖于血压值的增高而引发肾脏损伤[10]。而且在不影响血压值的情况下，HMP对SHR心肌纤维化的改善作用已经得到证明[4]，这也说明药物对高血压靶器官的保护作用可独立于血压值的降低。
肾脏炎症反应发生时，肾小管上皮细胞ICAM-1 和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）表达增加，二者可能介导了白细胞从小管周围毛细血管内皮细胞到肾脏间质的迁移[11]。成年SHR肾小球细胞和血管内皮细胞ICAM-1蛋白表达明显提高，大量单核细胞浸润肾小球，24h尿蛋白量增多，并且核转录因子-κB（NF-κB）的活化与ICAM-1的表达及单核细胞浸润、尿蛋白量均呈明显正相关[12]，提示原发性高血压时活化的NF-κB可通过上调肾组织ICAM-1 基因表达，促进单核细胞浸润肾组织从而引发肾脏损害。iNOS的激活可产生高浓度的一氧化氮（NO），NO和超氧阴离子反应生成过氧化硝酸盐（ONOO-），ONOO-可通过蛋白质酪氨酸残疾的亚硝基化导致组织损伤。ONOO-还可与CuZn-SOD分子结构域中的Cu发生反应，形成具有亚硝酸根（NO2-）反应活性的中间产物，NO2-可在SOD分子上将酪氨酸残基硝基化，SOD自身硝基化后其清除ROS的能力会显著降低[13]。在本研究中，HMP在mRNA和蛋白水平降低了SHR肾脏ICAM-1、iNOS 的表达，提示HMP对发生于SHR肾脏的慢性低度炎症反应具有显著的抑制作用，HMP可能在防治高血压肾脏炎性损害方面具有一定疗效。
在肾脏疾病过程中，TNF-α具有促有丝分裂和纤维母细胞趋化的作用，TNF-α受体基因敲除小鼠在单侧输尿管接扎后较野生型小鼠肾脏间质的纤维化程度明显减轻[14]，在本研究中HMP降低了SHR 肾脏TNF-α的mRNA高表达。PPARγ具有抗炎和抗氧化作用。在Fischer 344大鼠肾脏中PPARγ通过抑制p65核易位和NF-κB的结合活性，从而降低了iNOS, 环氧合酶-2（COX-2）, IL-1β, IL-6和VCAM-1的表达[15]。在原代培养的血管内皮细胞中PPARγ可同时上调铜锌超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）的表达和下调还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶亚单位phox22的表达[16]。在本研究中HMP治疗后对于PPARγ的mRNA和蛋白表达虽有降低作用，但没有出现同步变化。考虑到PPARγ的转录活性不仅与其mRNA及蛋白表达水平有关，还与PPARγ翻译后修饰如泛素化和N-末端磷酸化、抑制剂调节等多种因素密切关联[17]，HMP对PPARγ活性的具体影响及机制尚有待进一步研究，而我们推测HMP 对炎症反应和氧化应激的抑制可能是下调PPARγ表达的作用机理。
炎症发生时多伴随氧化应激水平的增高。活性氧（ROS）可通过直接氧化修饰蛋白质、脂质、糖类和DNA造成组织损伤；ROS还可上调NF-κB的活性和转化生长因子-β（TGF-β）的表达，进而引发局部的炎症反应和纤维化过程[18-19]；ROS是eNOS 脱偶联发生的最关键原因并可由此导致血管内皮功能损伤[20]。研究表明在转基因Ren-2大鼠肾脏中，NADPH氧化酶的活化和ROS的过量产生造成了足细胞足突消失和微动脉纤维化等肾脏损害[21]。总抗氧化能力可以反映机体的氧自由基代谢状况——总抗氧化能力降低表明机体氧自由基清除不足，生成相对过量，而蛋白羰基化含量可用来衡量蛋白质氧化损伤的程度。动物实验研究表明，HMP能够增加高脂血症兔血浆中SOD的浓度[8]；也有临床研究证实HMP可显著提高冠心病患者血清SOD的活性，降低氧自由基水平[9]。本研究发现HMP给药后明显提高了SHR肾脏组织的总抗氧化能力，同时降低了蛋白质氧化损伤程度，提示HMP可通过抗氧化应激作用保护高血压肾脏损伤。
总之，本研究证明HMP对SHR血压值无明显影响，然而能够通过抑制SHR肾脏炎性因子的表达，减轻氧化应激改善高血压时发生于肾脏的炎症反应，提示HMP在高血压肾脏疾病的防治方面具有一定的应用潜能。关于HMP对SHR肾脏纤维化、硬化及肾小球滤过膜包括血管内皮细胞、基膜和足细胞裂孔形态学的影响尚需进一步研究和观察。◆
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