M13噬菌体
M13噬菌体
M13 phage
一种丝状噬菌体，可感染含F因子的大肠杆菌细胞。
遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）
M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子，长6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。M13DNA的复制起始位点定位在基因间隔区内。但是基因间隔区的有些核苷酸序列即使发生突变、缺失活插入外源DNA片段，也不会影响M13DNA的复制，这为M13DNA
构建克隆载体提供了条件。
其中M13mp系列对野生型M13加以改造，插入了多克隆位点和
LacZ基因，可容纳外源DNA300-400bp，可用于制备DNA测序时用的单链模板和核酸探针。
它是一种质粒载体。
M13噬菌体在感染雄性大肠杆菌（F+或Hfr）时，都是以一端吸附在F型菌毛的顶端，所以称为F特异性丝状噬菌体。而对雌性大肠杆菌（F-）不敏感。所以Hfr型的大肠杆菌和携带F'质粒的大肠杆菌都能被感染
相关应用配置：M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒
相关例子：兔抗M13噬菌体酶标抗体的制备，M13噬菌体已被广泛地应用于噬菌体展示技术。M13的酶标抗体,是在噬菌体展示技术筛选结果ELISA检测中不可缺少的试剂。我们制备了兔抗M13抗血清,其效价高于1:6000;经两步饱和硫酸铵沉淀,初步纯化了兔抗M13抗体;用过碘酸钠法对抗体进行了辣根过氧化酶的标记,酶标记抗体活性为1:6400。
噬菌体释放方式： M13噬菌体溶源性，不裂解宿主菌。极大地简化了每轮淘选过程中的噬菌体纯化步骤，只用简单的PEG沉淀方法即可。
融合方式：M13噬菌体N端与pIII蛋白融合，不适合克隆cDNA，因为cDNA中为oligo d(T))常位于翻译终止密码子的下游。
融合序列大小：M13噬菌体展示肽库为7肽、12肽和环7肽
NEBM13噬菌体展示肽库可用于定位抗原决定簇，确定蛋白质相互作用位点，鉴定酶的底物或抑制物，鉴定受体激活物或抑制剂，研制多肽药物，开发新药，肿瘤治疗和疫苗制造，用途广泛
M13噬菌体感染雄性大肠杆菌需要完整的F菌毛，通过F因子编码的性菌毛进入宿主细胞内，如果噬菌体DNA通过感染导入细菌，那么也可以感染雌性大肠杆菌，但是通过转染产生的子代颗粒不能感染培养基中的其他细菌，所以病毒的产量很少
单链和双链M13噬菌体DNA的大规模制备：这个方案主要用于制备大量M13噬菌体的双链DNA，因在实验室中M13噬菌体经常被用作克隆载体，以及在某些特殊用途时需要制备大量的单链噬
菌体DNA，如当一个特定的重组体被多次用于制备反射性标记探针或构建大量定点突变体时。也许最重要的是，大规模制备和单链DNA可以分为小份，被实验室中所有人用作双脱氧测序反应和转染的标准对照。
方法:
M13噬菌体RF DNA制备:
1、将2.5ml铺板菌液转移至无菌试管（13*100mm或17*100mm）。加0.5mlM13噬菌体原液（约5*1011pfu），轻拍试管壁混合，室温放置5min。
2、将感染细胞用装在2L摇瓶中的250ml预热至37℃的含5mmol/L MgCl2的LB或YT培养基稀释。37℃持续振荡培养5h。
3、4℃4000g（Sorvall GSA 转头为5000r/min）离心15min收集感染细胞。回收上清可用于按以下步骤7-17的方法大规模制备M13噬菌体的单链DNA.
4、细菌沉淀用100ml冰冷的STE重悬，4℃4000g（Sorvall GSA 转头为5000r/min）离心15min回收洗后的细胞。
5、用碱裂解法分离噬菌体闭合环状RF DNA。适当增大裂解液的体积。纯化DNA可用PEG沉淀或层析柱纯化或CsCl梯度离心。
6、用分光光度法测定DNA浓度，并用凝胶电泳法确定其完整性。将闭合环状DNA分成小份-20℃冻存。
M13噬菌体单链DNA制备:
7、从感染细胞培养液中的噬菌体颗粒中分离单链DNA，将步骤3的上前转移至一家有磁搅拌子的500ml 烧杯。
8、上清中加入10gPEG和7.5gNaCl，室温搅拌30-60min。
9、4℃10000g（Sorvall GSA 转头为7800r/min）离心20min收集沉淀。倒置离心瓶2-3min，使上清流净，用Kimwipes纸巾吸去瓶壁和颈上残留的上清。
10、瓶中加入10ml 10mmol/L的Tris-HCl(PH8.0),搅动瓶中溶液，并用巴斯德吸干充分冲洗瓶壁，当噬菌体沉淀溶解后，将溶液移至30mlCorex离心管中。
11、在噬菌体悬液中加入等体积的酚，用硅橡胶塞塞紧后剧烈振荡2min，混匀内容物。
12、室温以3000g（Sorvall GSA 转头为5000r/min）离心5min，上层水相转移至一个心管，再用10ml 酚：氯仿抽提。
13、用等量的水相转移至两个30mlCorex离心管中，各加入3mol/L乙酸钠（ph5.2）0.5ml和乙醇11ml。充分混合后室温放置15min。
14、4℃12000g（Sorvall SS-34 转头为10000r/min）离心20min回收单链DNA陈丹，小心移去上清。
15、每个管中加入30ml 4℃70%乙醇，4℃12000g（Sorvall SS-34转头为10000r/min）离心10min，小心尽可能移去上清，倒置离心管使沉淀中的残液流尽，用Kimwipes纸巾吸干管颈处。
16、室温放置，使残余乙醇蒸发，用1ml TE（ph8.0）溶解沉淀，-20℃贮存。
17、用分光光度法测定DNA浓度，并用琼脂糖电泳法确定其完整性，将闭合环状DNA分为小份（10-50ug）-20℃贮存。
M13噬菌体特点是：①都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA 一起复制；②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化；③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或
是置换这一段DNA而不影响载体的复制。根据这一特点，载体又可分成插入型和置换型两大类。
M13噬菌体
大肠杆菌的m13噬菌体
当噬菌体进入细菌细胞后，单链的噬菌体DNA转变成双链复制型（RF）。从细胞中分离的RF可用作克隆双链DNA的载体。当每个细菌细胞里积聚了200到300份RF型拷贝时，M13开始不对称的合成，即只大量合成DNA双链中的一条链。单链DNA掺入成熟的噬菌体颗粒，颗粒不断地从感染细胞上芽生。M13感染虽不杀死细胞，但细胞的生长受到一定的抑制，所以形成混浊的噬菌斑。
M13的基因组中除有一段507个核苷酸，其余都含有与其复制有关的遗传信息。因此，只有在这一段中可插入外源DNA而不致影响噬菌体的活性。用M13
作为分子克隆载体的优点是从细菌中释放出来的噬菌体颗粒只含单链DNA，其中包含了克隆DNA片段的二条互补链中的一条，因此可用来作为对DNA测序的模板。另外，可用来产生单链的DNA探针以选择和分离互补的RNA。M13的RF型是双链DNA，便于限制酶的识别和切割，克隆进双链的外源DNA。从细菌培养液中大量抽取单链DNA。问题是插入M13的外源DNA超1000bp时就不稳定，在噬菌体增殖时会出现缺失。一般说，插入300～400bp是相当稳定的
2. M13 噬菌体的生物学
M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞
中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。
M13 噬菌体的基因组为单链DNA （+DNA），由6407 的碱基组成。基因组90% 以上的序列可编码蛋白质，共有11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因Ⅷ和基因Ⅲ以及基因Ⅱ和基因Ⅳ之间，其间有调节基因表达和DNA 合成的元件。
M13 噬菌体基因组可编码3 类蛋白质，包括复制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ），形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ），结构蛋白（基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ）。所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中。基因组DNA 为正链，按基因Ⅱ至基因Ⅳ方向合成，与噬菌体的mRNA 序列同
义。
图4-9 M13噬菌休
在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体DNA （正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链DNA ，用于DNA 的复制，因此这种双链DNA 称为复制型DNA （replicative form DNA），即RF DNA 。通过θ 复制方式，RF DNA 进行扩增，基因的转录也随即开始。基因组中的任意一个启动子都可以启动基因的转录，单方向地终止于下游的终止子。启动子和终止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频
繁。
当基因Ⅱ蛋白在亲代RF DNA 的正链特定位点上产生一个切口时，便启动噬菌体基因组进行滚环复制。此时，在大肠杆菌的DNA 聚合酶Ⅰ的作用下，以负链为模板在切口的3' 末端加入核苷酸，并持续DNA 的合成，用新合成的DNA 替换原有的正链。当复制叉环绕模板整整一周时，被取代的正链由基因Ⅱ产物切去，经环化后形成单位长度的噬菌体基因组DNA 。在感染开始的15～20 分钟内，这些子代正链在宿主细胞酶的作用下，又转变成RF DNA ，然后以之为模板继续转录并继续合成子代正链DNA 。当感染细胞内累计有100-200 个RF DNA 时，细胞内也产生了足够的单链DNA 结合蛋白，即基因Ⅴ蛋白。该蛋白可以抑制翻译活性，特别是抑制基因ⅡmRNA 的翻译，并且强烈地结合在新合成的正链DNA 上，阻止其转化成RF DNA 。此时，DNA 的合成几乎只产生子代正链DNA 。另外，基因Ⅹ蛋白和基因Ⅴ蛋白也是噬菌体特异DNA 合成的强力抑制子，从而限制感染细胞内RF DNA 的数量。结果，感染细胞内RF DNA 的数目和子代正链DNA 的产生速率都能保持适度。
成熟噬菌体颗粒由11 个病毒蛋白中的5 个组成，至少4 个其他蛋白（如基因Ⅰ、Ⅳ和Ⅺ蛋白，以及宿主的硫氧还蛋白（thioredoxin）对噬菌体颗粒的组装和分泌是必须的。
图4-10 M13噬菌体在感染细胞中的复制
M13没有包装限制：
图4-11 M13噬菌体的包装
3. M13载体的构建
单链DNA 的酶切和连接是比较困难的，因此M13 噬菌体在用作载体时是利用其双链RF DNA。RF DNA 很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。
（1）载体的插入位点
在M13 噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源DNA（基因Ⅱ/Ⅳ和基因Ⅷ/Ⅲ之间）。基因Ⅱ和基因Ⅳ之间的508bp 间隔区是主要的外源片段插入位点。在基因Ⅷ和基因Ⅲ之间的小间隔区也可用来插入外源片段，但是在操作过程中，需要获得感染细胞的菌落进行影印筛选，比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦。基因Ⅹ也可用来克隆外源片段。
（2）M13 噬菌体载体组成
现在所使用的M13 噬菌体载体是Messing 及其同事建立的mp 系列载体，以基因Ⅱ和基因
Ⅳ之间的区域作为外源DNA 插入区。
mp 载体系列都是从同一个重组M13 噬菌体（M13mpl）改造而来的。在M13mpl 载体中，间隔区内的HaeⅢ位点插入了一小段大肠杆菌DNA ，引入α 互补筛选。
（3）M13载体系列
①M13载体系列的命名：M13mpn，n代表系列数字。
②对M13mp1的改进：加上常用的酶切位点。如B. Gronenborn和J. Messing1978年把LacZ’
5’端的第13个核苷酸G突变成A，产生了一个EcoR I切点，构建成M13mp2。
③对M13mp2的进一步改进产生了M13mp系列载体。在M13mp2的LacZ’的5‘端加上一段人工合成的多克隆位点（MCS）。如M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19分别对应于pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。
（4）M13mpl8 和M13mpl9
M13mpl8 和M13mpl9 这两个载体含有13 个不同的酶切位点，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的DNA 片段。M13mpl8 和M13mpl9 DNA 的全序列已经测定完成，这两种载体只是在lacZ
区内不对称的多克隆区的方向上有所不同。
当RF DNA 被两种不同的限制酶切割以后，M13mpl8 和M13mpl9 轻易不能重新环化。仅当连接混合液中含有带匹配末端的外源双链DNA片段时，方可闭合成环。这一片段在M13mpl8 和M13mpl9 中将以两个互为相反的方向插入。这样一来，在M13mpl8 的正链中含有外源DNA 双链的其中一条链，而在M13mpl9 正链中则含有外源DNA 的另一条链，即M13mpl8 重组体的子代噬菌体内含有外源DNA 的一条链，M13mpl9 重组体的子代噬菌体内则含有它的互补链。故用M13mpl8 和M13mpl9 作为一对载体，就可能用一个引物（通用引物），从所插入DNA 片段的任一端开始，测定互为相反的两条链的DNA 序列，并可制备只与外源DNA 的任意一条链互补的DNA 探针。
4. M13系列载体的优点
（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段。
（2）Xgal显色反应，可供直接选择。
（3）无包装限制，克隆能力大。
（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链（子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA）。
5. M13载体的缺点
①插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降。
②实际克隆能力小于1500bp（虽无包装限制，并非无限包装）。
图4-12 M13mp18/19
6．M13 噬菌体载体的宿主菌
由于M13 噬菌体通过F 质粒编码的性纤毛进入宿主细胞内，故只能用雄性细菌来增殖病毒。Messing 及其同事已经构建了许多携带F' 质粒并便于M13 载体进行基因操作的多种大肠杆菌菌株，其
中最重要的遗传标志有：
（1）lacZ D Ml5 lacZ 基因缺失突变体。
（2）D（lac-proAB）lac 基因缺失突变体。
（3）lacI q lacI 基因的突变体。
（4）proAB 细菌染色体上脯氨酸生物合成酶类的编码区域。
（5）traD36 抑制F' 因子接合转移的突变。
（6）hsdR l7 与hsdR 4 对大肠杆菌K 株Ⅰ类限制- 修饰系统失去限制活性但仍保留修饰
功能的突变体。
（7）recA1大肠杆菌重组酶基因。
（8）supE 琥珀抑制基因。
在M13 噬菌体载体中进行克隆时常用的宿主菌株如下。
JM101 supE D （lac-proAB）[F'traD 36 proAB + lac I q lacZ D M15]
JM105 JM101/ hsdR 4
JM107 JM101/ hsdR 17
JM109 JM101/ hsdR 17 recA1
TG1 JM101/ hsd D5（不修饰不限制）
XL1-Blue supE lac- hsdR 17 recA1 [F' proAB + lac I q lacZ D M15]Tn 10 （Tet r）
四、噬菌粒载体（phagemid vectors）
噬菌粒（phagemid）实际上是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有ColE1 复制起点及抗生素抗性选择标记的质粒，以及丝状体噬菌体的间隔区。此间隔区含噬菌体DNA 合成的起始与终止及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用序列。含噬菌粒的细菌被噬菌体感染后，基因Ⅱ蛋白可作用于噬菌粒的间隔区，启动滚环复制产生ssDNA 并进行
包装。
克隆于这些载体内的外源DNA 区段可以象质粒一样用常规方法进行增殖。而带有这种质粒的细菌被M13（或f1）丝状噬菌体感染后，在病毒的基因Ⅱ蛋白影响下，质粒的复制方式发生改变。基因Ⅱ产物与质粒所携带的基因间隔区相互作用，启动滚环复制，产生质粒DNA 一条链的拷贝，最终包装在
子代噬菌体颗粒中。
常用的如pUC118/pUC119。由带有M13复制起点的M13的基因间隔区（IG）和pUC18/pUC19质粒载体的质粒复制起点、Ampr、lacZ’、MCS等构成。pUC118 和pUC119 是功能比较完善的噬菌粒载体，对外源DNA 片段的大小不那么敏感，并且保留了pUC 质粒在克隆操作方面的优点。在pUC18/19 中增加了带有M13 噬菌体DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列（IG），当含这些质粒的细胞被适当的M13 丝状噬菌体感染时，可合成质粒DNA 的其中一条链，并包装在子代
噬菌体颗粒中。通过纯化噬菌体颗粒，可制备单链DNA ，用于DNA 序列测定、定点诱变或制备探针。pUC118/pUC119有两种不同的复制模式：1）双链质粒复制模式，受pUC本身的复制起点（来源于ColE1）的控制。2）单链滚环噬菌体复制模式，来源于M13的复制起点被辅助噬菌体的基因II产物控制。
噬菌粒具有以下特征：①双链DNA 既稳定，又高产，具有常规质粒的特征；②免却了将外源DNA 片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一既繁琐又费时的步骤；③由于载体足够小，故可得到长达10kb 的外源DNA 区段的单链；④两种复制形式：既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。
因此，既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。
噬菌粒的主要优点在于它可以产生大段外源DNA 的适量单链拷贝，又不必担心发生缺失突变，而这些外源DNA 区段常常由于太大而不能克隆于常规M13 载体。但许多噬菌粒都有一个主要缺点，即辅助噬菌体感染后，有时候单链DNA 的产量较低且重复性较差。
图4-13 Puc118/119
五、M13KO7 辅助噬菌体
M13KO7 辅助噬菌体是M13 的衍生株，大小为8.7kb。M13KO7 噬菌体带有来自p15A 质粒的复制起点，因此可以象质粒一样复制，且可以与带ColE1 的质粒共存于同一个宿主菌中。还带有一个来自转座子Tn903 的卡那霉素抗性基因（kan r），用作选择标记。基因Ⅱ带有一个G 至T 的突变（第6125 核苷酸），导致基因Ⅱ蛋白第40 位氨基酸由甲硫氨酸变为异亮氨酸。
当M13KO7 感染带有噬菌粒的大肠杆菌后，如E.coli（pUC118），进入宿主细胞内的单链DNA ，在宿主胞内酶的作用下转变为双链形式，后者可在质粒p15A 的复制起点控制下进行复制。由于细胞内M13K07 双链DNA 的积累并不需要病毒基因产物，细胞内的噬菌粒几乎没有机会干扰所进入的
M13K07 病毒基因组的早期复制。
M13KO7 基因组双链DNA 可表达产生子代单链DNA 所必需的所有蛋白。但M13K07 中突变的基因Ⅱ产物与自身携带的噬菌体复制起点的作用尚不如它与克隆于噬菌粒pUCll8 和pUCll9 中的病毒复制起点的作用有效，这就使噬菌粒正链DNA 能够优先合成，以确保在细胞所产生的病毒颗粒中来自
噬菌粒的单链DNA 能够占据优势。
六、PCR产物克隆载体---T 载体
1．pCR系列载体
是Invitrogen公司开发的线性噬菌粒载体。由pUC的质粒部分、fi噬菌体ori、Kanr和Ampr抗性构成。突出特点是MCS的中部已经切开，各有一个3’端突出的T。因PCR产物往往在3’端突出一个A，所
以能与这个载体直接连接。
图4-14 pCR2.1的MCS
2．Promega 公司的T载体系列
如pGEM-T vector
图4-15 pCR1
图4-16 pTarget vector，G418抗性。可在真核生物表达。
M13、f1和fd，是一类丝状大肠杆菌噬菌体，它们都含有长度为6.4kb、彼此具有很高同源性的单链环状DNA分子。这些丝状噬菌体表现出一系列其它载体所不具备的优越性：
第一，单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形DNA为中间媒介的。这种复制形式的DNA（replication form DNA，简称RFDNA）,可以如同质粒DNA一样，在体外进行纯化和操作。
第二，不论是RF DNA还是ssDNA，它们都能够转染感受态的大肠杆菌寄主细胞，并依据所采用的实验方法而定，或产生出噬菌斑，或形成浸染的菌落。
第三，单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA多寡制约的。因此对它们来说，并不存在包装限制的问题。
第四，应用这类单链DNA噬菌体，可以容易地测定出外源DNA片段的插入取向。
第五，可产生大量纯化的含外源DNA片段插入的单链DNA分子。这种重组体单链DNA分子可按双脱氧链终止法作核苷酸序列测定，也可用于制备具放射性同位素标记的DNA探针，还可进行寡核苷酸定点突变。
下面以M13噬菌体为例子加以说明。
一．M13噬菌体的生物学特性
M13噬菌体颗粒的外形呈丝状，在颗粒中包装的仅是（十）链的DNA，有时亦称为感染性的单链（图5-11）。
M13噬菌体首先吸附在F性须上，其吸附的位点看来是在性须的末端（图
5-12）。噬菌体的基因组从性须末端进入到细胞的内部，进入细胞内部的M13（＋）链DNA，便起到一种模板的作用，合成出互补的（一）链 DNA。由此形成的双链形式的M13DNA，称为复制型 DNA。它按θ形式进行几轮复制之后，基因Ⅱ的产物便在RFDNA的正链待定位点上作切割反应，形成一个缺口。这样，M13基因组的扩增活动便正式开始启动。其基本特点是利用大肠杆菌的DNA聚合酶I，以环形的MI3（一）DNA为模板合成 M13（＋）DNA。当DNA复制叉沿着模板DNA
分子转移到复制终点时，在基因Ⅱ编码产物的作用下，新合成的（十）DNA便会被切除下去，并进一步环化形成单位长度的 M13基因组DNA（图5-13）。二．M13克隆体系
（1）β-半乳糖苷酶显色反应原理
M13克隆体系，包括M13噬菌体本身和寄主菌株两个组成部分，只有将两者结合在一起时，才能形成有功能的β-半乳糖苷酶，而且这种酶的活性还可以用Xgal显色反应法测定出来。
所谓顺反子内互补作用，是指编码同样的多肽链序列但又各具有一个突变的两个基因，联合产生出一种有功能活性的蛋白质多肽的生化过程。
顺反子互补作用偶然也能够以多肽片段的形式出现。M13克隆体系就是一个典型的例子。lac缺失突变lacZ（△M15），简称M15基因（不要同M13噬菌体混淆），合成的是一种缺失了11～41氨基酸的缺陷性的β-半乳糖苷酶（又称M15多肽）。这段缺失虽然不是位于酶分子的活性部位，但却使它失去了四聚化作用的功能。在体外加入野生型的β-半乳糖苷酶的溪化氰片段（cyanogen bromide fragment）（2～92氨基酸），就可以使多肽的活性得以恢复，并重新获得形成四聚体的能力。因此，我们说澳化氰片段补偿了lacZ基因的 M15突变。
这种现象叫做α-互补作用（alpha complementation）。
在M13克隆体系中，当M13mPl载体感染了JM101菌株，通过A互补作用，这些细胞便会产生出有活性的β半乳糖苷酶，于是在补加有指示剂Xgal和诱导物IPTG的培养基中，就会出现蓝色的噬菌斑。
（2）M13载体系列的发展
在M13噬菌体基因Ⅱ和IV之间（从第5498个核苷酸起到第6O05个核苷酸止），有一个长度为 507个核苷酸的基因间区段（intergenic region，IG区段）。通过在这个基因间区段内插入外源 DNA片段，对 M13噬菌体进行改建，并因此成功地发展出了M13克隆载体系列。
（3）M13载体系列的优点
M13载体系列特别适用于克隆单链的DNA分子。它具有两个十分有用的优点：第一个优点是，在这类载体的基因组中有一条饰变的β半乳糖苷酶基因片段（Hindll片段）,其中插入了一段具有密集的多克隆位点（polycloning site）的序列（图5-14）；第二个优点是，M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的，可以有效地克隆双链DNA分子中的每一条链。
噬菌体的分类
病原微生物名词解释与解答题 噬菌体的分类:毒性噬菌体温和噬菌体 沙门菌肠热证胃肠炎败血症病 毒复制T：吸附穿入脱壳生物合成装配与释放 乙肝颗粒：大小球形颗粒管型颗粒 梅毒分期硬性下疳全身和皮肤黏膜出现梅毒疹皮肤黏膜溃疡性坏死和内脏器官肉芽肿样变（梅毒骝） 细菌的致病性物质:毒素（外神经毒素细胞毒素肠毒素内） 霍乱弧菌致病因子：霍乱肠毒素鞭毛菌毛及其他毒力因子内毒素 细胞壁保护细菌物质交换决定抗原性与致病性染色性药物敏感性有关 真菌培养基沙保弱(G 蛋白胨） 病毒培养法细胞培养鸡胚接种动物接种 AIDS性接触血源性母婴垂直 IMVIC：I吲哚M甲基红VP C枸橼酸盐 病毒自然条件入侵机体呼吸道消化道皮肤黏膜 病毒抗原变异类型抗原漂移抗原性转变 细菌生繁条件水碳源氮源无机盐生长因子（有些）温度：37℃ pH：7.2～7.6 气体：对O2要求(专性需氧菌、微需氧菌、兼专性厌氧菌）对CO2求： 5~10% CO2 渗透压 革兰染色初染媒染脱色复染将细菌涂片标本固定，初染加结晶紫，约一分钟，水洗。滴加碘液媒染，约一分钟，水洗，形成结晶紫—碘复合物，成深紫色。用95 ％酒精脱色，30 秒钟，用水冲净酒精。用稀释复红复染1 分钟，水洗。镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。 链球菌所致脓疾病：化脓性感染（淋巴管炎淋巴结炎蜂窝组织炎痈等局部皮肤和皮下组织感染）毒素性疾病（猩红热）超敏反应性疾病（风湿病急性肾小球肾炎）
狂犬病：管理传染源（捕杀野犬多犬预防接种对咬过人的猫犬隔离观察7·10发病处死取脑组织检查病毒抗原和內基小体）伤口处理和注射抗体（用3%·5%肥皂水0.1%苯扎溴铵或清水洗再用75%乙醇或碘酒注射高效价抗狂犬病毒血清于伤口周围与底部）预防接种（咬后和接触病毒危险的人及早接种疫苗） 真原核差异：无典型细胞结构核质无核膜核仁仅核糖体DNA RNA 细菌生长曲线分期定义将一定量的细菌接种于合适的培养基和T 过程有规律数目对数纵T横的曲线a迟缓期（最初准备代谢活跃V大储蓄E 中间代谢产物不繁殖1-4h 对数期（最快先短暂的加速期后对数期活细菌快增细菌形态染色性生理活性典型）稳定期（繁殖减慢死活相等活细菌保持稳定典型小改变代谢产物产生）衰退期（更慢死大于活典型大改变生理活动停滞出现衰退形菌体自溶） 内外毒素差异1（来源阳及部分阴分泌于菌体外或菌体自溶阴细胞壁裂解释放）2化学成分（蛋白质脂多糖）3稳定性（不稳定60死160 2-4h死）3抗原性（强产抗毒素经甲醛脱毒成类毒素4毒性作用强选择性毒害较弱引起发热休克DIC） 病毒感染类型隐性感染（无明显症状获得免疫力显性感染感染靶细胞大量增殖造成细胞结构域功能损伤急性感染持续性感染（慢性感染潜伏感染慢病毒感染） 微生物是存在于自然界的一群体形微小、结构简单、肉眼直接看不见，必须借助于光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物 消毒消除和杀灭物体上或环境中的病原微生物及其它有害因子，但不一定能杀死全部非病原微生物的方法 灭菌杀死物体上所有微生物的方法，包括杀死芽胞 无菌操作防治病原微生物进入人体或其他物品上的方法 热原质是细菌合成的一种注入人体或动物体内能引起发热反应的物质，产生它的dad是阴，其细胞壁的脂多糖是热原质 正常菌群正常下人动物体表及呼吸道消化道泌尿生殖道德微生物种类数量稳定与机体平衡 致病菌少数正常菌在条件下致病 病原菌：少数微生物引起人动植物具有致病性
噬菌体简介
噬菌体 一、生物学特性 噬菌体（Phage）属于非细胞型微生物，是侵染细菌、放线菌等细胞型微生物的病毒。它们个体微小，通常仅能在电子显微镜下观察到；结构简单，多数噬菌体仅由蛋白质和核酸两种成分组成，蛋白质构成的衣壳包裹着核酸。在自然界单独存在的噬菌体不表现出生命规象，但具有潜在的生命力。噬菌体从吸附至宿主细胞上的一瞬间，就开始了自己的生命过程。根据噬菌体与宿主的关系，可将其分为烈性噬菌体与温和噬菌体。烈性噬菌体通过吸附、侵人、生物合成、装配与释放等步骤使宿主细胞裂解死亡；而温和噬菌体侵染宿主后，则将其核酸整合在宿主基因组上，并以原噬菌体状态存在，宿主则转为溶原性菌株；但有时也有机率较少的温和噬菌体与烈性噬菌体一样，引起宿主细胞的裂解死亡。温和噬菌体对溶原状态和裂解途径的选择，取决于感染细胞内的一些宿主基因产物和噬菌体基因产物活性之间的平衡。[1] 噬菌体广泛分布于自然界是与其宿主的广泛分布分不开的。迄今为止，几乎没有一群细菌尚未发现其相应的噬菌体，只有那些我们了解的还很肽浅的细菌才尚未见其相应噬菌体的报导。[2] 根据大小、形态结构特征，可以把噬菌体分为3种类型，一是蝌蚪状不可收缩尾的噬菌体，其头部为二十面体，直径约110 -120nm，尾部长220-230 nm,尾宽13-15 nm,无尾鞘、基板、尾丁、尾兹等结构。二是蝌蚪状可收缩尾的噬菌体，其头部为三十面体，约70nm x 110 nm，尾部长约120 -130 nm,尾宽约18-22nm，有尾鞘、基板、尾丁、尾兹等结构，该噬菌体似有包膜。三是短尾噬菌体，其头部为二十面体，大小为20 nm，尾部长约2-3 nm。 [3]
噬菌体制剂的研究现状及发展前景
噬菌体制剂的研究现状及发展前景 作者：赵庆友，朱瑞良* （山东农业大学动物科技学院山东泰安 271018） 来源：中国兽药杂志2010-7期 南宁兽药科技网（南网）https://www.wendangku.net/doc/f116765550.html,上传2010-9-1 摘要：噬菌体制剂是利用噬菌体溶解细胞的特性而用于治疗动物的病原菌的临床感染。早 在20世纪初，噬菌体治疗就取得了积极的治疗效果。目前传统抗生素治疗动物细菌感染时 易产生耐药性，而噬菌体制剂则表现出许多突出的优越性。本文从噬菌体的生物学特性，噬 菌体制剂的作用机制，以及噬菌体制剂的发展状况和应用前景等方面进行了论述。 关键词：噬菌体；制剂；应用；现状；前景。 Recent Advances And Prospects In Bacteriophage Therapy ZHAO Qing-you, ZHU Rui-liang* (College of Animal Science & Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Tai’an, 271018) Abstract: Phage therapy is to treat bacterial clinical infections of animals with bacteriolysis. In the 1920’s, Phage therapy had had efficiency in clinical treatment. Many creatural experiments and clinical treatments indicate that phage therapy is a potential alternative method for treatment and prevention of bacteria disease. This method comes along, quite opportunely to counter the resistance problem of the antibiotics. From the biological characteristics,the therapy mechanism,the development status and the application prospects, the systemic discussion of bacteriophage in this review. Key words: Bacteriophage ; biological agents; application; current situation; prospects 英国细菌学家和内科医生Frederick Twort 和法裔加拿大细菌学家Flix D’Herelle 分别在1915年和1917年独立发现了噬菌体，不久之后就用来治疗感染性疾病。d`Herelle 最早从来自痢疾的临床样本研究中观察到噬菌体滴度的增加正好伴随着病人的康复过程。他 将噬菌体称为“外源性免疫因子”[1]。1934年美国科学家报道了利用噬菌体疗法治疗肠球菌 感染的成功率可达80%【2】。但随着抗生素的成功推广应用，二次世界大战之后美国和西欧的 大多数国家都终止了噬菌体制剂的研制。近年来细菌耐药性问题不断突现，用抗生素治疗细 菌感染面临巨大的挑战，一些科学家和临床工作者开始重视噬菌体制剂的研制。 1 噬菌体的生物学特征 噬菌体(Bacteriophage, phage)是以细菌为宿主的一类病毒，所以又称为细菌病毒，它
2020年病毒的分类与命名.pdf
病毒的命名过去不够统一，有些病毒是以宿主、病理特点、致病症状、病毒颗粒形态进行命名，有些病毒是以地名和人名进行命名，还有些病毒是以字母和数字命名。病毒的分类系统也不一致，动物病毒分类等级设立科、属、种；而植物病毒分为组、亚组、种。为了力求分类和命名的统一，1992年Martelli首先提出了植物病毒的科、属、种分类原则，1993年8月在英国格拉斯哥召开的第9届国际病毒大会上，国际病毒分类委员会(ICTV)采纳了这一分类原则，并且新设立了一些植物病毒的科、属［1］，1995年在ICTV 所公布的病毒分类和命名第六次报告中，植物病毒分类已不再采用组、亚组，而统一使用科、属、种分类系统［2］。病毒的分类系统也开始逐渐向更高级的分类等级发展，1991年ICTV在病毒分类和命名第五次报告中首次公布了比科更为高级的分类等级，单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales)［3］，最近ICTV 又先后增设了套病毒目(Nidovirales)［4］和有尾噬菌体目(Caudovirales)［5］。除此以外，1996年8月ICTV在第10届国际病毒大会上还对原有的病毒分类和命名规则作了进一步的修订，提出了38条新的病毒命名规则［6］。最近据Mayo等报道，ICTV又批准了43条新的病毒分类和命名规则，同时对病毒目、科、属和种名的书写也作了专门的规范［7］。 1 病毒命名规则 1.1 病毒种的定义和命名病毒“种”是指构成一个复制谱系(replicating lineage)、占据一个特定小生境(ecological niche)、具有多个分类特征的病毒。这就是说病毒种的分类和命名不是单纯由某一个分类特征、而是由多原则分类特征决定的，包括病毒的基因组组成，病毒颗粒形态结构、生理生化特性和血清学性质等；而病毒种的一个复制谱系则强调了病毒种的系统进化特性，即现今所有的病毒种可能起源于共同的病毒祖先；病毒种所占有的小生境是指某种病毒的特定生物学特性、地理分布、宿主范围、媒介的嗜亲性、致病机理等［8］。 病毒种的命名由几个有实际意义的词组成，但不是单独以宿主名加“virus”构成，当ICTV下属委员会不能肯定一个新的病毒种的分类地位时，新的病毒种可以作为暂定种列在适宜的属和科中；在不考虑病毒属和科的情况下，病毒种名与病毒株一起，均应有明确的含义；如果数字和字母已经用于某一特定病毒种的命名，其数字、字母或其组合可作为病毒种的形容词，现在已知的细菌病毒种名就是由数字和字母组成的，这些细菌病毒通常没有太大的表型上的差异，而且感染相同或相似的宿主；植物病毒种的命名，一般是由宿主名加症状名和“virus”构成。 1.2 病毒属的命名病毒属是一群具有某些共同特征的种。其属名的词尾为“virus”，但在设立一个新的病毒属时必需有一个同时被承认的代表种(type species)。 1.3 病毒科的命名病毒科是一群具有某些共同特征的属。科名的词尾为“viridae”，“科”下面可以设立或不设立亚科。亚科名的词尾为“virinae”。
噬菌体展示总结技术
噬菌体展示总结技术 各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢篇一：噬菌体展示技术 噬菌体展示技术 关键词：噬菌体展示组装融合蛋白2008-07-21 00:00 来源：互联网点击次数：3662 噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。到目前为止，人们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。本文主要概述了噬菌体展示技术的基本原理、噬菌体展示系统研究以及技术特点等，并跟踪了目前该领域的最新研究进展和发展前景。 关键词：噬菌体展示；组装；融和
蛋白 1985年，Smith G P[1]第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了噬菌体展示技术。该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。 另外，这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。近年来，随着噬菌体展示技术的日益完善，该技术在众多基础和应用研究领域产生的影响已日渐明显。 一、噬菌体展示技术的原理 噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳
蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。思想汇报专题被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集 [2]。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。 二、噬菌体展示系统 单链丝状噬菌体展示系统 （1）PⅢ展示系统。 丝状噬菌体是单链DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。每个病毒颗粒都有3个～5个拷贝
乳杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析
乳杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析乳杆菌作为公认的安全级微生物,具有促消化、抗菌、增强免疫力等多种益生功能,广泛应用于食品工业、医药工程和畜牧业,其中植物乳杆菌、干酪乳杆菌和戊糖乳杆菌较为常用。在发酵工程中,噬菌体的污染可造成不可忽视的后果,严重影响产品品质,甚至导致发酵失败。 本研究通过噬菌体富集法从酸菜中分离出两株烈性乳杆菌噬菌体,分别命名为LpeD和Lpa804,并对这两株噬菌体进行了生物学特性的鉴定。通过电镜观察,噬菌体LpeD和Lpa804均具有典型的二十面体头部和非收缩性尾部,均属于尾噬菌体目、长尾噬菌体科。 根据宿主范围测定结果,噬菌体Lpa804可感染植物乳杆菌(L.plantarum PA106和L.plantarum SC),而噬菌体LpeD可感染戊糖乳杆菌(L.pentosus KLDS1.0413)和植物乳杆菌(L.plantarumKLDSl.0344)。一步生长曲线的测定结果显示,噬菌体LpeD的潜伏期为15min,裂解期为90min,裂解量为194PFU/cell;噬菌体Lpa804的潜伏期为30min,裂解期为105 min,裂解量为221 PFU/cell。 理化因素对噬菌体的影响结果表明,噬菌体LpeD和Lpa804均对热敏感,LpeD 在56℃作用2 min全部失活,Lpa804在63℃作用2 min全部失活。噬菌体LpeD 和Lpa804在pH 4-12的环境中较为稳定,显示了较强的酸碱耐受性。 紫外线照射并不能使噬菌体LpeD和Lpa804完全灭活,二者在紫外线照射20 min后均仍有部分噬菌体颗粒存活。噬菌体LpeD和Lpa804对乙醇和异丙醇较敏感,35%乙醇作用10 min可使LpeD全部失活,25%乙醇作用10 min可使Lpa804 全部失活。 35%异丙醇作用10 min可使LpeD全部失活,25%异丙醇作用10 min可使
噬菌体抗体淘筛方法
这两个文库来自于单个人的V H和Vκ的基本结构，具有和那些已知结构的抗原结合位点的侧链多样性，并且在成熟的体系中中具有很高的多样性。由这个框架来编码的标准结构是目前人抗体技术体系中最普通的。在能够形成抗原结合表面的前提下重链的CDR3设计的尽可能短。这两个文库都可以在未知筛选的克隆的序列的情况下进行筛选和免疫亲和力成熟。这两个文库是噬菌粒/单链片段可变区格式的，并且都经过与蛋白A和蛋白L的结合筛选，所以未筛选的克隆的大多数都是具有功能的。 TomlinsonI构建在plT2载体（(HIS myc 标签），多样化的侧链主要是来自于原始体系中多样性的位点（一共18个残基，H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 and L96）此文库经过筛选后与体细胞突变的多样性的共同作用使其成熟。 我们保证上述信息在没有另外通知之前是严格可信的。 使用此文库之前请认真阅读以下材料 确认收到以上材料 2. 确认收到的文库未溶解，且使用之前-70摄氏度保存。 3. 参照方案G制备KM13 4. 在使用文库前清仔细阅读这个方案：在含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的TYE平板上将对 照划线培养，置于培养箱37℃过夜培养，挑单菌落置于摇床，接种在5ml含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的2倍TY培养基内，37℃过夜培养。分别制备阳性和阴性的噬菌体对照（第一天到第十天过夜用500微升）。用阳性对照和阴性对照产生的噬菌体按照1：100的比例混合，进行一轮的筛选，用100 μg/ml的遍在蛋白在PBS中包被。通过单克隆噬菌体ELISA检验遍在蛋白的富集程度（经过第一轮筛选后应该超过50%） 5. 尽可能的用专用的移液管和一次性的手套，由于噬菌体会非特异的吸附到其他的塑料上，建议使用 聚丙烯管。 6. 为提高感染效率，大肠杆菌应该在37℃培养至对数生长期（600nm的OD值应该在0.4） (1)、从一个小型的培养板上转移一个细菌克隆至5ml的2倍TY培养基（不加抗生素和葡萄糖），37℃ 震荡过夜培养 (2)、次日稀释100倍至新鲜的2倍TY培养基内，震荡培养至培养至对数生长期600nm的OD值应该在 0.4。（1.5-2小时） 7. 所有的离心，除了在微型离心机中操作的之外，都是在4℃下进行。 8.两个文库最好是同时使用，以保证筛选得到最多的抗原结合克隆。 In advance 准备好用到的仪器和试剂（详见方案后注解），确保有足够的用于细菌增殖的培养基（大的生物分析的培养皿在使用前进行灭菌和干燥处理） 在实验之前仔细阅读这个方案，以便安排你的时间同时进行操作 Steps Procedure Day 1 (5 hrs) A1-A6 Grow libraries I and J and make phage B1-B3 Make secondary stock of libraries 第一天A1-A6 增殖文库I和J，并且制备噬菌体 B1和B3 制作文库的第二原种 Day 2 (6 hrs) A7-A12 Grow libraries I and J and make phage (cont.)
第四章 噬菌体
一、选择题 A 型题 1. C 2.B 3.C 4.D 5.A 6.B 7.C 8.D X 型题 1.ABCD 2.BCE 3.ABCDE 二、填空题 1.DNA 基因 2.毒性温和 3.复制吸附穿入生物合成成熟与释放 三、名词解释 1.噬菌体是一类侵袭细菌、真菌或其他微生物的病毒。根据噬菌体侵入细胞后，是否增值并裂解细菌，可分为毒性噬菌体和温和噬菌体。 2.毒性噬菌体是能在敏感菌中增值并能使之裂解的噬菌体。 3.温和噬菌体是指感染细菌后可将其基因组与宿主菌染色体整合，不增值产生子代噬菌体，但随细菌DNA的复制而复制，也不裂解细菌。 4.前噬菌体是指整合在细菌染色体上的噬菌体基因组。 5.溶源性细菌是带有前噬菌体的细菌。 四、问答题 1. 噬菌体是一类侵袭细菌、真菌、放线菌、支原体、螺旋体等微生物的病毒，属于肺细胞型微生物。具有以下这些主要的生物学特性。 （1）体积微小，可以通过细菌滤器;结构简单，没有完整的细胞结构，仅由核酸（DNA或RNA)和蛋白质组成。 （2）是一种专性活细胞内寄生的微生物。 （3）以复制方式进行增值。 （4）有严格的宿主特异性，只寄居在易感宿主菌体内。 2. 根据与宿主菌的相互关系，可将噬菌体分成两种类型：毒性噬菌体和温和噬菌体。前者能在宿主菌细胞内复制增值，产生许多子代噬菌体，并最终裂解细菌；后者感染宿主菌后，将其基因组整合于宿主菌中，随细菌基因组的复制而复制，并随细菌的分裂将噬菌体基因传给子代细菌，在细菌体内不产生子代噬菌体，不引起宿主菌的裂解。整合在细菌基因组中的噬菌体成为前噬菌体。带有前噬菌体的细菌成为溶源性细菌。
毒性噬菌体的细菌作用具有高度的的特性，即一种噬菌体只能裂解一种和它相应的菌，故可用于未知细菌的鉴定于分型，这对流行病学的调查、追查传染源等具有重要的意义。 某些前噬菌体可导致溶源性细菌的基因型和性状发生改变，这称为溶源性转换。许多细菌毒素产生、抗原结构和血清型别都与溶源性转换有关。此外，温和噬菌体还是遗传物质转运的工具。 第4章噬菌体
人源性天然噬菌体展示库的构建
人源性天然噬菌体展示文库的构建及鉴定 年四季黄黎王栩邬于川袁青(四川省泸州医学院基础医学院,泸州646000) 中国图书分类号R392. 11 文献标识码A 文章编号1000 484X( 2010) 06 0544 04 [摘要] 目的:构建人源性天然噬菌体展示文库并对文库进行鉴定。方法: 从未经主动免疫健康志愿者的外周血淋巴 细胞中提取总RNA, 反转录合成cDNA, 用直接PCR 及半巢式PCR 扩增人抗体重链( VH)及轻链( V 和V ) 可变区基因。采用改 进的重叠延伸PCR 法将VH 基因和VL( V 和V) 基因连接成人单链抗体( scFv) 基因, 并将scFv 文库基因克隆到噬菌体载体 pCANTAB5E中, 电转化E . coli TG1, 构建单链抗体文库。结果: 采用直接PCR 和半巢式PCR 扩增得到42 条VH 基因片段, 16 条V 基因片段, 18条V基因片段。混合的VH 和VL 等摩尔比连接后, 产生的单链抗体文库基因大小为750 bp 左右; 转化后构 建了文库容量为1. 35 108 的单链抗体文库。BstN !酶切分析文库中的单链抗体基因结果显示,酶切得到的scFv 指纹图谱均 不相同。结论:构建的抗体文库多样性好, 可用于多种人源性单链抗体的筛选。 [关键词] 单链抗体;噬菌体抗体文库; 重叠延伸PCR Construction and identification of nonimmunized human phage display library NIAN Si Ji , HU ANG Li , WANG Xu , WU Y uChuan, YU AN Qing. School o f BasicMedical Sciences, Luzhou Medical Col lege, Luzhou 646000, China [Abstract] Objective:To develop non immunized human phage display library.Methods:The total RNA of lymphocyte cells from pe ripheral blood of healthy voluntee was isolated and cDNA was synthesized, and the genes of heavy variable chain ( VH) and light variable chain ( V and V ) were amplified by direct PCR and half nested PCR. By overlapping extension PCR, the genes of VH and VL( V and V) were linked. The linked genes of single chain Fv fragment ( scFv) were ligated with the vector pCANTAB 5E and then cloned into TG1 for the scFv library construction. Results:By direct PCR and half nested PCR, 42 VH fragments, 16 V and 18 Vfragmen ts were obtained. The size of linked scFv library genes was 750 bp and the volume of constructed scFv library was 1. 35 10 8 . The results of BstN ! analysis of scFv genes from the phage library showed that fingerprint map of the selected scFvs was different. Conclusion:The developed phage library is diversity and can be used for selecting humanized scFv. [Key words] Sin gle chain Fv fragment; Phage antibod y library; Overlapping extension PCR 目前单克隆抗体( mAb) 作为治疗性抗体发展 迅速,主要用于免疫治疗肿瘤、免疫性疾病、器官移 植、感染性疾病及心血管疾病等。但单克隆抗体的 临床应用仍然受到一定的限制, 主要障碍是诱导产 生的人抗鼠抗体( HAHA) 反应、肿瘤渗入量低及半
第八讲 单链噬菌体载体及噬菌粒载体
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体 吴乃虎 中国科学院遗传与发育生物学研究所
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体 一、单链噬菌体的一般生物学 1．单链噬菌体的优越性 2．M13噬菌体的生物学特性 二、M13克隆体系 1．M13克隆体系 2．M13克隆体系 -半乳糖苷酶的显色反应原理 3．M13载体系列的发展 4．M13载体系列的优点 三、噬菌体展示载体 1．噬菌体展示载体的构建原理 2．噬菌体展示载体 3．噬菌体表面展示文库 4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例 四、噬菌粒载体
1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒 3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体
第八讲单链噬菌体载体 一、单链噬菌体一般生物学 大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。 1．单链DNA phage的优越性 A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。 B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。 C．不受包装的限制。因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。 D．可容易地测出外源DNA的插入取向。 E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)： *1用作双脱氧链终止法进行DNA测序
*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针 *3利用寡核苷酸进行定点突变 2．M13 phage的生物学特性 A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如： ①基因组组织形式相同； ②病毒颗粒大小、形状相近； ③DNA同源性高达98%以上。 B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。 C．复制型双链DNA(RF DNA=Replication Form DNA) 感染过程：当感染的M13 phage颗粒穿过性须时，其外层主要 衣壳蛋白质脱落，M13 DNA及附着其上的Gene Ⅲ 蛋白进E.coli细胞内， ↓ 感染性单链DNA(正链DNA)在细菌胞内酶的作用 下转变为双链DNA，称复制型DNA。通过 结构进 行几轮复制。
第4章 噬菌体(习题)
第4章噬菌体 一、选择题 A型题 1．用来测量噬菌体大小的单位是: A.cm B.mm C.μm D. dm E. nm 2．下列微生物中，不受噬菌体侵袭的是: A．真菌B．细菌C．支原体D．立克次体E．螺旋体 3．关于噬菌体的叙述，下列哪项是正确的? A．可用细菌滤器除去B．对理化因素的抵抗力比一般细菌弱 C．具有严格的宿主特异性D．含DNA和RNA E．能在无生命的人工培养基上生长 4. 噬菌体的本质是： A.细菌 B.病毒 C.支原体 D.衣原体 E.立克次体 5. 能与宿主菌染色体整合的噬菌体基因组称: A. 前噬菌体 B.溶原性噬菌体 C.温和噬菌体 D.毒性噬菌体 E.以上都不是 6. 既有溶原期又有裂解期的噬菌体是: A.毒性噬菌体 B. 温和噬菌体 C. 前噬菌体 D. β噬菌体 E. λ噬菌体 7.噬菌体感染的特异性取决于: A. 其核酸组成与宿主菌是否相符B．噬菌体的形态 C．噬菌体蛋白与宿主菌表面受体分子结构的互补性D．细菌的种类E．噬菌体的核酸类型 8．毒性噬菌体感染细菌后导致细菌: A．快速繁殖B．停止繁殖C．基因突变D．裂解E．产生毒素 X型题 1．噬菌体的特点是: A.非细胞型微生物 B.严格活细胞内寄生 C.以细菌、真菌、螺旋体及放线菌等为宿主
D.可通过滤菌器 E.对人致病 2．下列细菌中，产生毒素与噬菌体有关的是: A．大肠杆菌B．白喉棒状杆菌C．金黄色葡萄球菌 D．破伤风梭菌E．肉毒梭菌 3．噬菌体的应用包括: A．分子生物学研究的重要工具B．细菌的鉴定和分型 C．检测标本中的未知细菌D．用于治疗某些局部感染性疾病 E．用于追踪传染源 二、填空题 1．噬菌体可以作为的载体，把某些带到宿主细胞中与DNA整合，引起后者发生变异。 2．根据噬菌体侵人菌细胞后，是否增殖并裂解细菌，可以分为噬菌体和噬菌体。 3．毒性噬菌体以方式进行增殖，增殖过程包括、、和4个阶段。 三、名词解释 1．噬菌体（bacteriophage，phage) 2．毒性噬菌体(virulent phage) 3．温和噬菌体(temperate phage) 4．前噬菌体(prophage) 5．溶原性细菌(lysogenic bacterium) 四、问答题 1.简述噬菌体的主要生物学特性。 2.噬菌体与宿主菌的相互关系怎样?各有何医学意义?
噬菌体治疗细菌性疾病的研究进展
《专业外语》课程论文
噬菌体治疗细菌性疾病的研究进展 摘要噬菌体在被发现之初已经被尝试用于治疗细菌性疾病，后来由于抗生素的出现使之渐渐淡化出人们的眼球，但是对于现今很多细菌都对抗生素有很强的耐药性甚至出现了具有多重耐药性的超级细菌，使得重新重视起噬菌体治疗细菌性疾病的作用。本文主要综述了噬菌体对于治疗细菌性疾病的早期研究和最新进展。 关键词噬菌体裂解酶细菌性疾病 细菌性感染是感染性疾病中比较常见的类型，如果缺乏及时有效的治疗，严重的话可以导致很高死亡率[1]。例如每年由弯曲杆菌、沙门氏菌、O157大肠杆菌和单核细胞增多利斯特菌引起的食源性疾病就给人类带来巨大的经济损失和生命威胁。 在19世纪初Herelle发现噬菌体（bacteriophage，phage）[2,3]后，人们就曾经尝试采用噬菌体治疗细菌感染。但自抗生素的出现后人们就渐渐的淡化噬菌体的研究而大量的进行有关抗生素的研究，进而大量使用抗生素作为治疗细菌感染的有效途径，在前期抗生素的确有非常好的治疗效果，然而随着抗生素使用的泛滥，细菌的耐药性问题日益加剧，新抗生素研发的速度远远低于耐药菌产生的速度。由于新型抗生素的发现越来越困难，噬菌体治疗重新得到人们的重视，并且取得了一些不错的研究成果。 1 噬菌体及裂解酶的概况 噬菌体( Bacteriophage，简称phage)又叫细菌病毒，是一种可以侵入细菌细胞内，通过酶的用破坏细胞壁，使细菌裂解从而将其杀灭的病毒。噬菌体分为烈性噬菌体和温和性噬菌体，前者可在敏感宿主菌内增殖并使之裂解，亦称为毒性噬菌体（virulent phage）。 噬菌体裂解酶( Lysin或Endolysin)是双链DNA噬菌体所特有的、在病毒复制晚期合成的一类胞壁质水解酶。多数噬菌体具有编码3种细胞壁水解酶的基因，分别为裂解酶、酰胺酶和内肽酶，其中酰胺酶是国内外研究比较多的一种裂解酶。裂解酶的高亲和性与种属特异性的细胞壁糖基有关，而后者常常是细菌存活的必要成分。因此，细菌很难产生对裂解酶的抗性。 2 噬菌体的研究历史回顾 人们曾尝试用噬菌体治疗痢疾、手术伤口的皮肤感染,采用口服、局部外用、滴眼耳鼻等多种给药途径，治疗效果较好[4]。Bruynoghe和Maisin于1921年率先用噬菌体制剂治疗皮肤葡萄球菌感染[5]。1934年美国科学家就报道了噬菌体疗法抗肠球菌感染的成功率可达80%。近期各国研究者进行的动物试验及临床应用结果表明, 噬菌体治疗的效果是值得肯定的并且其效果受使用剂量和用药时间的限制较小。Smith等[6]用噬菌体治疗感染了大肠埃希氏菌的小鼠模型,结果发现给予1次后，小鼠体内的大肠埃希氏菌数量即下降，小鼠全部存活下来。在随后的研究，Smith发现利用专一性噬菌体可治疗由大肠埃希氏菌引起的猪、牛和羊的腹泻，所有经噬菌体治疗的动物都存活下来。所以噬菌体不失为一种安全性和治疗性都较好的药物。2002年, Bisw as采用耐万古霉素的肠道球菌对老鼠进行感染, 45m in后腹腔内注射一定剂量的噬菌体。保护力达到100%。即使在老鼠处于濒死状态的时候才注射噬菌体, 其保护力仍有50%。而没有进行噬菌体治疗的老鼠48h后几乎全部死亡。Bull等[7] 也证明, 即使是在小鼠感染后8h才使用噬菌体对其治疗仍不影响治愈率, 但使用抗生素治疗的小鼠成活率却大大降低。同时，大量的人体试验也证明了噬菌体治疗的安全性。2005年，
M13 kO7 Help phage
辅助噬菌体株的制备 M13K07辅助噬菌体由M13衍生而来，gII上带有Met40IIe突变，并在M13复制起始点处插入有P15A复制起始点和来自Tn903的卡那霉素抗性基因Kana R。M13K07能在噬菌粒DNA缺失时复制，当野生型M13或f1复制起点存在时，单链噬菌体被优先包装并分泌到培养基中，从而容易获得用于诱发突变或测序的单链噬菌粒DNA。 保存条件 1X PBS和50%甘油。-20°C保存。 辅助噬菌体株的制备 准备： 1. 需要3 ml新鲜辅助噬菌体株（109 pfu/ml）来完成噬菌体展示文库的筛选实验。 2. 从辅助噬菌体工作储备板上用黄色灭菌枪头挑一个单个分散的含辅助噬菌体噬菌斑的琼脂块，接种到3～4 ml处于对数期的TG1培养物中，37℃摇床培养2 h。转接到250 ml 2×YT培养基液体培养基(1L摇瓶)中，继续培养1h，然后加入50 mg/ml卡那霉素水溶液，至终浓度50～70 ug/ml，继续培养8～16 h或过夜。注：时间少于1个月的新鲜噬菌斑才可以保证实验结果。 3. 将过夜的250 mL细菌培养物，3300X g离心30 min。 4. 用PEG沉淀噬菌体颗粒：加入1/5体积(100ml)的20 % PEG / 2.5 M NaCl，充分混匀，冰浴30～60 min。 5. (Optional)10800 X g离心10min，弃上清，沉淀重新悬浮于30 mL水和6 mL PEG / NaCl 中，冰浴30～60 min。 6. 10800 X g离心10min，弃上清，沉淀重新悬浮于10 mL LB中，11600 X g离心10min，去除沉淀。 7. 将上清转入一新标记好的管子，0.45um膜过滤除菌。存于4度（最长1年）。 8. 测定M13KO7辅助噬菌体株的滴度。注：含单链质粒DNA的颗粒滴度通常每ml细菌培养物大于5X1010pfu。在M13KO7扩增的过程中，对丢失p15A和Tn903转座子的噬菌体基因组有选择作用。因此不要连续传代噬菌体。用直接从单个噬菌斑来源的M13KO7株来进行后续的超感染实验。
肠出血性大肠埃希菌O157噬菌体的生物学特性
［文章编号］ １６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０１－００７９－ ０５［收稿日期］ ２０１１－０７－ １３［基金项目］ 吉林省计划经济委员会科研基金资助课题（２００９ ６３３）［作者简介］ 刘 悦（１９７８－）女，吉林省四平市人，在读医学硕士，主要从事噬菌体的生物学研究。［通信作者］ 孙延波（Ｔｅｌ：０４３１－８５６１９５７４，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｎｙｂ＠ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７噬菌体的生物学特性 刘 悦１，李菁华１，史红艳１，温剑平２，孙延波１ （１．吉林大学白求恩医学院病原生物学系，吉林长春１３００２１； ２．吉林大学白求恩医学院分子生物学系，吉林长春１３００２１ ）［摘 要］ 目的：分离并鉴定肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７噬菌体，对其生物学特性进行研究，为开发抗肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７的生物制剂提供实验依据。方法：以肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７为宿主菌，采用噬斑法从环境污水中分离出针对肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７的噬菌体。噬菌体经超滤浓缩后，电镜观察其大小和形态；将宿主菌和噬菌体以不同的比例混合，测定噬菌体的最佳感染复数并观察其一步生长曲线；利用ＳＤＳ－Ｐ ＡＧＥ分析噬菌体的结构蛋白和非结构蛋白；提取噬菌体基因组，进行酶切电泳分析。结果：电镜显示噬菌体的头部呈球形、直径４０ｎｍ，噬菌体的尾部长约８０ｎｍ。噬菌体的最佳感染复数为１０－２，即当宿主菌和噬菌体之间的比例为 １∶１００时裂解效率最高。一步生长曲线示噬菌体在裂解宿主菌时，潜伏期约为１０ｍｉｎ，爆发期约为３０ｍｉｎ ，裂解量为１３０。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳呈现１３种蛋白，相对分子质量为１６ ０００～２２ ０００。琼脂糖凝胶电泳显示噬菌体基因组大小约２３ ０００ｂｐ 。结论：成功分离并鉴定一株针对肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７的噬菌体，是一种裂解性强、特异性高的毒性噬菌体，肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７噬菌体属于有尾病毒目，管尾噬菌体科。 ［关键词］ 肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７；噬菌体；最佳感染复数 ［中图分类号］ Ｒ３４２ ［ 文献标志码］ ＡＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇ ｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒａｗ ｓｅｗａｇ ｅＬＩＵ Ｙｕｅ１，ＬＩ Ｊｉｎｇ－ｈｕａ１，ＳＨＩ Ｈｏｎｇ－ｙａｎ１，ＷＥＮ Ｊｉａｎ－ｐｉｎｇ２，Ｓ ＵＮ Ｙａｎ－ｂｏ１（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｍａｎ Ｂｅｔｈｕｎｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００２１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｍａｎ Ｂｅｔｈｕｎｅ Ｃｏｌｌｅｇ ｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇ ｃｈｕｎ １３００２１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊ ｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７ｐｈａｇｅｓ ｆｒｏｍ ｒａｗ ｓｅｗａｇｅ ａｎｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｇｅｎｔａｇａｉｎｓｔ ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒａｗ ｓｅｗａｇ ｅ ａｎｄ ｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐｌａｑｕｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｕｓｉｎｇ ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７ａｓ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｓ．Ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｇｅｓ ｗｉｔｈｕｌｔｒａｆｉｔｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｈａｇｅｓ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｐｈａｇｅｓ ｗｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｂｙ ｍｅａｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｐｈａｇｅｓ ｍｉｘｔｕｒｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｏｒｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｐｈａｇｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅｓ ｏｆ ｐｈａｇｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐ ｅｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｐｈａｇｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ａ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｆｏｒｍ，４０ｎｍ ｉｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ ａｎｄ ｔｈｅｓｅ ｐｈａｇ ｅｓ ｈａｄ ａ ｔａｉｌ，ａｂｏｕｔ８０ｎｍ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ．Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｇｅｓ ｗａｓ １０－２，ｔｈａｔ ｗａｓ，ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｈｏｓｔ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｏｐｈａｇｅｓ ｂｅｉｎｇ １∶１００，ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｐｈａｇｅｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｗａｓ １０ｍｉｎ，ｔｈｅ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｗａｓ ３０ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｙｓｉｓ ａｍｏｕｎｔ ｗａｓ １３０．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎａｌｙ ｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ １３ｋｉｎｄｓ ｏｆ９ ７第３８卷 第１期 ２０１２年１月吉 林 大 学 学 报 （医 学 版）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．１ Ｊａｎ．２０１２