核酸分子杂交及PCR技术
核酸的分子杂交技术
一、核酸分子杂交
用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。
待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。
二、核酸分子杂交的分类
液相杂交核算分子杂交
印记杂交
固相杂交
原位杂交
1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。
2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。
常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭
缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。
三、核酸分子杂交的基本原理
1、变性：
在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。
﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。
﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。
﹡变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。
增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。
DNA热变性现象
双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规则线团。同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。由于二级结构的丧失，也失去了部分或全部生物活性。
增色效应和减色效应
当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应。
A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。Tm与核酸的G、C含量有关。
Tm=（G+C）%×0.41+69.3
Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低。
2、复性
在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新结合，形成双链的过程称为复性。
在热变性后，当温度缓慢冷却至比Tm值低20-30℃时，变性的单链DNA即可恢复双链螺旋结构，这样的复性又称为退火。
﹡复性过程：
第一步是两条单链随机碰撞形成局部双链，这种局部的双链是暂时的，若周围的碱基不能配对就会重新解离，一旦找到正确的互补区，则其局部双链形成核（成核反应），然后核两侧的序列迅速配对，形成完整的双链分子。
﹡影响复性的因素
①单链核酸的起始浓度：反应开始时的总浓度可直接影响单链分子碰撞的几率，浓度
越高，复性越快。
②核酸链长度（分子量）：分子越长，扩散越慢，形成配对的难度也大，复性也慢。
③核酸分子的复杂性：复杂性即核酸分子中不同序列的总长度，复杂性越高，形成正
确配对的难度也越大，复性越慢。
④温度：温度过高有利于变性；过低则分子运动减慢，少数碱基形成的局部双链也不
易解离。适宜的复性温度是比Tm低25℃。
⑤离子强度（盐浓度）：适当的离子强度可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电，减
少双链间的静电斥力，有利于复性。离子强度过高则不利于复性。
3、杂交
﹡来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂交。﹡杂交可分成：DNA与DNA、RNA与RNA、DNA与RNA之间的杂交。
﹡核酸分子杂交技术：使已知序列的DNA或RNA片段上带上可检测的标记，可用来检测样品中未知的核酸序列。
﹡影响核酸分子杂交的因素：
- 探针浓度、长度、复杂性：探针浓度越高，复性速度越快。但双链探针浓度过高会增加自我复性而影响杂交；浓度过高也会增加非特异结合，使杂交背景增强。探针越长扩散速度越慢；复杂性越高，配对难度也增大。
- 离子强度：高离子强度溶液中，正离子可中和DNA链磷酸基团的负电荷，削除相互间的静电斥力，有利于杂交分子形成。
- 温度：通常在低于Tm 20-25℃的温度下进行杂交。
- 添加剂：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸等，因其表面可吸附DNA探针，使DNA 接触面增大，而加速杂交反应。
- 杂交条件的严谨性：指杂交反应体系中，避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度。它主要与杂交反应的温度、离子强度和洗膜的温度有关。实际操作时，一般采用较低严谨性杂交以提高反应速率，以较高严谨性洗膜以尽量洗去非特异性结合和配对较差的探针，以提高特异性。
4、预杂交
为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非特异位点封闭。在杂前的这些处理过程称为预杂交。
﹡常用于预杂交的封闭物：
﹡变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在杂交反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。﹡高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用Denhard`t 溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。
四、核酸探针
1、定义：一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。
﹡分子杂交技术的应用
利用核酸探针，可以：
?通过同源性比较,研究不同物种或个体DNA之间的亲缘关系；
?通过杂交的严紧性,发现基因的缺失或突变；
?通过标记信号的强度,测定某种遗传信息量的多少；
?证明某种疾病(如肿瘤)是否与某种基因(如病毒基因)有关。
2、探针的制备方法
探针长度一般以50-300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
2）PCR扩增
3）化学合成
3、探针的分类：
据制备方法及核酸性质不同，可分为：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、寡核苷酸探针
（1）寡核苷酸探针：
由实验者设计、经核苷酸合成仪合成。目前的合成仪均可合成70-100bp长的寡核苷酸，但一般常用的寡核苷酸针长18-30bp。
优点：
①制备方便，实验者可根据需要自行设计，避免了天然核酸探针存在的高度重复序列。
②由于大多数寡核苷酸探针长度只有15-30bp，其中即使有一个碱基不配对也会显著影响
其熔解温度。因此它特别适用于基因点突变分析。
③比活度高，适用于大多数杂交，如DNA序列测定、Sounthern、Northern原位杂交等。
缺点：探针短，与靶序列形成的杂交体稳定性差，对杂交及漂洗的温度、盐浓度等条件要求高，操作难度大；探针特异性差，背景噪音也大。
（2）基因组DNA探针：
利用机械剪切或限制性内切酶消化基因组DNA制备成一定大小的DNA片段，再将这些片段插入到适当的载体中，转化宿主细胞，构建成基因组DNA文库，进而进入文库中筛选出含有目的基因的阳性克隆，经扩增、提取DNA、酶切及电泳分离，即可得到足够量的基因片段，经适当的标记后，即可作为探针使用。PCR方法也可制备DNA探针。在选择此类探针时要特别注意真核基因组中存在的高度重复序列。要尽可能使用基因的编码序列（外显子）作为探针，而避免使用内含子及其它非编码顺序，否则探针中可能因高度重复序列存在引起非特异性杂交而出现假阳性。
基因组DNA探针从基因组DNA文库中选取某一基因片段
↓
与载体连接（质粒、噬菌体）
↓
克隆(PCR扩增)
↓
酶切
优点：①无性繁殖、制备方法简单；②不易降解（与RNA比较）；③标记方法成熟。（3）cDNA探针：
由mRNA转录而来，在逆转录酶的作用下，以mRNA 为模板，合成cDNA第一链，进而合成第二链。将合成的cDNA插入到适当的载体中，构建cDNA文库，然后筛选适当的阳性克隆，再进一步扩增、酶切及纯化该cDNA片段即可。
优点：双链探针，长度较长，可与靶序列形成的杂交体稳定性、特异性比寡核苷酸探针高，杂交信号强。
缺点：由于是双链，必须先变性再杂交，在杂交过程中还存在自我复性现象。
cDNA探针（complementary DNA）
通过逆转录
↓
双链cDNA
↓S1核酸酶切平两端
加接头
↓限制酶
粘性末端
↓
载体连接
↓
克隆
（4）RNA探针：
以双链DNA为模板，利用噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶于体外转录而成。
优点：①RNA/RNA比RNA/DNA杂交体系稳定性高。
②单链，不存在变性和自我复性。
③RNA中不存在高度重复序列，非特异性杂交少。
④杂交后可用RNase将未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低。
缺点：RNA容易降解。
4、探针所携带的标记物应具备的条件：
﹡标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，绝不影响其碱基配对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。
﹡标记探针的检测方法简便、省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高。
﹡稳定性好、环境污染少、价廉。
5、常用的探针标记物：
﹡放射性同位素：3H、32P、35S、125I等。
﹡非放射性同位素：地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。
6、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
（4）生物素光照标记法
﹡缺口平移法的原理
- 将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的5`→3`的聚合酶活性和5` →3`的外切酶活性相结合。
- 首先用DNAase I 在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于E.coli的DNA pol I的5`→3`外切酶活性，切去带有5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。
- 这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。
切口移位（平移）法
﹡随机引物标记法原理
用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`- OH 端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。
﹡末端标记法原理
（1）一种是在5`末端加成标记法：
先用碱性磷酸酶（AP ）去掉dsDNA 5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP 转移加到DNA 片段5`-OH 上。
（2）在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个单标记的ddUTP 。
﹡生物素光照标记法
光敏生物素在紫外线照射下与DNA 或RNA 的碱基发生化学加成反应，获得生物素标记的DNA 探针。
7、探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA 片段，可去除dNTP 和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA 和小分子dNTP 、磷酸根离
子及寡核苷酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化
探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针
习题1 DNA 分子受热变性时，其特征是( )
Ａ．碱基间的二酯键断裂
Ｂ．形成超螺旋
Ｃ．熔点温度随G —C 碱基对的含量增加而升高
Ｄ．在２６０ｎｍ处的光吸收降低
习题2 (2002年全国生物学联赛试题) 热变性的DNA 分子，在适当条件下可以复性，条件之一是( )
Ａ．浓缩 Ｂ．加入无机盐
Ｃ．骤然冷却 Ｄ．缓慢冷却
习题3 下列关于核酸的描述，不正确的是（ ）
Ａ．核酸既有酸性基因又有碱性基因，所以是两性电解质，因磷酸的酸性强，通常表现为酸性
Ｂ．核酸变性后会发生减色效应，而复性时会发生增色效应
Ｃ．核酸的最高紫外吸收峰值接近260ｎｍ
Ｄ．G —C 对的含量愈高，介质的离子强度越高，核酸的Ｔｍ值就越高
习题4 (2002年全国生物学联赛试题) 在有核酸的两个制剂D 和E 中，D 的Ａ２６０／Ａ２８０＝２．０；Ｅ的Ａ２６０／Ａ２８０＝１．０。因此判断制剂D 比制剂E 要纯（ ）
四、核酸分子杂交技术
Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、组织原位杂交等。（一）Southern 印迹杂交
此技术由Southern 1975年首先设计。被检测对象为DNA。
纯化的待测DNA样品
↓限制性内切酶酶切后（EDTA，65℃灭活限制酶）
琼脂糖凝胶电泳分离酶切DNA片段
↓变性液（碱变性）
凝胶上DNA变性
↓Tris缓冲液
中和
↓高盐下
DNA转印至NC膜
↓烘干、固定
预杂交
↓
杂交
↓
放射自显影
↓
结果分析
Southern杂交
1．预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点。预杂交液为不含DNA探针的杂交液
2．杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交。双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交
3．洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA
杂交结果检测
1．放射自显影：适用于放射性核素标记的探针
2．比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针
Southern杂交在医学中的应用
1．酶切图谱分析
2．特定基因定性和定量
3．基因突变分析
4．限制性片段长度多态性的分析
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测目的RNA的存在与否及含量。
Northern印迹杂交
1．基本原理和基本过程与Southern blot基本相同
2．鉴别RNA
3．探针可用DNA或RNA片段
4．待测样品为总RNA或mRNA
Northern印迹与Southern 印迹的不同点
1．变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性；
2．转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理；
3．靶核酸为RNA；
用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。
(三）原位杂交in situ hybridization
又分为菌落杂交或噬菌斑、以及真核细胞原位杂交。
直接用探针与细胞或组织切片中的核酸杂交。
应用：1）观察基因在组织中的表达
2）确定基因在染色体中的定位
对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。
需要目的基因的探针。
五、蛋白杂交
（一）蛋白质的免疫印迹（western)
场所：硝酸纤维素膜
待检分子：蛋白
探针：抗体
杂交的方式：经电泳分离不同的蛋白，转印到硝酸纤维素膜上，用特定的抗体与蛋白杂交，检测特定的蛋白。
（二）所用抗体
1．一抗：针对待测分子的抗体
2．二抗：针对一抗的抗体，标记有放射性同位素或生物素
（三）操作过程
蛋白的制备-----→ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同的蛋白质
杂交（一抗与特定蛋白结合）
↓
漂洗去除多余的一抗
↓
二抗与一抗结合
↓
漂洗去多余的二抗
↓
结果检测
六、生物芯片
生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速与大信息量的检测。
Biochips
DNA Chips Protein Chips Lab Chips
﹡DNA芯片技术的基本原理
DNA芯片技术的基本原理是分子识别，与Southern杂交和Northern杂交同出一理，即DNA的碱基互补配对和序列互补原理。
第四节基因扩增技术——PCR
一、基因扩增（gene amplification)
指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。有下列五种方式：
环境诱发扩增
基因的程序性扩增
基因组进化扩增
基因工程扩增
PCR扩增
1. 环境诱发扩增
在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。
2. 基因的程序性扩增
在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基因的扩增。
3. 基因组进化扩增
生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。
4. 基因工程扩增
载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。
5. PCR扩增
应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。
二、PCR技术Polymerase Chain Reaction
1. PCR的发明
（1）1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。
当时由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。
（2）1985年Cetus公司的科学家K.B. Mullis发明了PCR，使这一设想变成现实。
Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。
（3）Taq DNA 聚合酶
1986年H.A. Erilish从嗜热水生菌分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 oC )，PCR技术才进入实用阶段。
1988年R.K. Saiki 把Taq DNA聚合酶用到PCR反应中。使PCR自动循环仪成为可能。
（4）PCR 仪
1988年Cetus公司发明自动热循环仪。
三、PCR的原理
PCR基本原理
在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。
变性(denaturation)：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA 退火(annealing)：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。
延伸(extension)：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）及Mg2+存在条件下，5?→3?的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。
（1）DNA模板变性95℃
双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。
（2）DNA模板与引物复性40-65℃
引物（primer）：人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA 双链的5‘端相同。
（3）DNA链的延伸72℃
DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。
PCR的过程
（1）第一步：变性（denature）
94-95 oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。
（2）第二步：复性（anneal）
50-60 oC下1分钟，引物优先与模板复性。
①引物的浓度高，
②引物的链短。
（3）第三步：延伸（extend）
72 oC下1-2分钟，Taq DNA聚合酶在引物的3…端上加上核苷酸。
（4）第四步：变性（denature）
94 oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。
（5）第五步：重复（repeat）
二、常规PCR操作
﹡试剂：
引物：根椐待扩增的DNA片段，设计其特异的上、下游引物。
耐热DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶。
10×PCR缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-HCl(pH 8.4，20℃)，150mmol/L MgCl2 ，1mg/ml明胶。
2mmol/L dNTP贮备液：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP 4种脱氧核苷酸。
﹡操作程序
PCR反应体系：
10×PCR buffer 10μl
dNTP mix 各200μmol/L
引物1 1μmol/L
引物2 1μmol/L
DNA模板50ng-1 μg
Taq 酶2U
加双蒸水至总体积为100μl
PCR扩增条件：94℃, 300S
↓
94℃, 60S
55℃, 60S 30 cycle
72℃, 60S
↓
72℃, 10 min
PCR扩增AIV M基因片断
5’-
301gttctacact ctgatcacag cgttttt gat cggcgtacag gcagaac cgt acacagagat
361caatgtccca gagggagact ctgtccctga agaccactgg actaaacttc agcattccct
421ctgacacagcc ctacgcagag cccgcagtgc ccctgctgaa ccaatagctg cccgtgtgac
481agggacgacc cgcaacatca ctgtggaccc caaactgttt aagaaacg ga gactccgttc
541accccgcg tg ctgtttagca cccagcctcc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc
-3’Perim 1: (5?) gat cgg cgt aca ggc aga ac (3?) 328-347
Perim 2: (3?) cgc ggg gtg aac gga gtc tc (5?) 529-548
预期扩增长度：220bp
﹡PCR的特点
（1）特异性强
① PCR使用专门合成的DNA引物。
②延伸过程是在高温下进行。
这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。（2）敏感性高
需要的模板量极低。
理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！
（3）快速
整个PCR过程约4小时即可完成。
（4）简便
对模板的纯度要求低。
不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。（5）可以扩增mRNA
RT-PCR：先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。
﹡影响PCR的因素
（1）Taq DNA聚合酶
自从H.A. Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow 片断（37 oC )，PCR技术才进入实用阶段。
①热稳定性
Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。
②最适温度高
最适温度：75-80 oC
延伸速度：约35-150nt/s.酶分子
最长延伸长度：6.7kb
③ Taq酶的功能缺点：具有5?→3?聚合酶活性和5?→3?外切酶活性，但没有3…→5?外切酶活性。因此不能修复错误的碱基配对！
合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。
④ Taq DNA聚合酶的激活剂
金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。
当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。50mmol/L KCl也能激活Taq DNA聚合酶的活性。
（2）其它耐热的DNA聚合酶
①Tth DNA聚合酶
无3? →5?DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA。
②VENT DNA聚合酶
有3…→5?外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受100oC高温。
③ Pfu DNA Polymerase
有3 ?-5?的外切酶活性，5?-3?外切酶活性。是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率最低的。但PCR产物为平端！
④Taq Plus DNA Polymerase
是Taq和Pfu DNA聚合酶的混合物。
Taq的PCR产物3?端往往带有一个A。
（3）引物（primer) 设计
①序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。
②引物长度以15-40 bp为宜。
③碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。
④引物内部避免形成二级结构。
⑤两引物间避免有互补序列。
⑥引物3?端为关键碱基；5?端无严格限制。
3?5?
5? ----------→
限制性内切酶的识别序列
启动子序列
定点突变
探针标记
避免连续相同碱基排列或内部回文序列。
5?GGCAG T CTGCC AGTCTAC3?发卡结构
避免形成引物二聚体（dimer）
两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。
primer1
5? G G T C T G C C A G T C T A C3?-----------------→
←---------------------3 ?C A G G A C T T A G T C A C T 5?
primer2
Sense primer vs Antisense primer
Upstream primer vs Downstream primer
Forward primer vs Reverse primer
Primer1 vs Primer2
（4）模板（template)
①纯度：PCR对模板DNA的纯度要求不高。但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯
合剂等影响DNA聚合酶的活性。
②模板的量：不能太多，100 l反应体系中100ng足够。
（5）dNTPs
dNTPs 是dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。
一般反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmol/L。
浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率。
（6）Mg 2+ 的浓度
Taq DNA聚合酶要求有游离的Mg2+ 。
所以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。
一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2终浓度。
﹡PCR技术的扩展
1.定量PCR
半定量PCR
荧光定量PCR
半定量PCR（相对定量）
参照DNA 4-1 4-2 4-3 4-4 4-5 4-6
待检靶基因：相同
引物相同
靶基因相同
模板量不同
荧光定量PCR
Real—time PCR（或TaqMan PCR ）
借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。
Ct值：样品到达域值水平所经历的循环数。
非特异性荧光标记：
1、SYBR Green
2、EB
特异性荧光标记：
3、TaqMan
4、TaqMan-MGB
5、Molecular Beacon
6、Amplisensor
实时荧光定量PCR 方法1 ——SYBR Green 法
工作机理：
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
变性时，DNA双链分开，无荧光
复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。实时荧光定量PCR 方法2 ——TaqMan法
TaqMan---水解型杂交探针
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)
探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R 与Q分开，发荧光
Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
3.巢式PCR
采用两对引物进行PCR，其中第二对引物位于第一对引物内
用途：验证第一次PCR产物的特异性
进行特殊PCR，如合成探针模板
4.反向PCR
扩增两个引物外侧的未知序列（传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）
技术关键：把线性DNA模板转变成环形分子。
使引物的外侧序列“转变” 成内侧序列。
5.不对称PCR
用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。
技术关键：两个引物的浓度相差100倍。
低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。
最后产物中99%是单链DNA。
6.反转录PCR（RT-PCR)
扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。
技术关键：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。
Temin,H.发现反转录酶，1975诺贝尔奖
7. PCR技术的应用
（1）扩增某一段DNA
从基因组中扩增；
从载体上扩增；
组织样本原位扩增；
微量残留DNA扩增；
分析模板序列；
（2）基因的体外诱变
在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。
技术关键：利用引物的5…端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。（3）基因组的比较研究
比较不同物种之间的基因组特征和相似性。
RAPD (Random amplified polymorphism DNA)
利用6bp长度的随机序列引物扩增细胞中的总DNA，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。
类似于限制性内切酶片断长度多态性（RFLP）分析，因而也称为随机扩增多态性DNA （RAPD）分析。
8. PCR技术在医学中应用
（1）.获得目的基因
（2）PCR在病原体基因检测的应用
PCR技术可用于诊断禽流感、口蹄疫、爱滋病、肝炎病毒、结核杆菌等
（3）PCR技术在法医学上的应用：
法医学上检测DNA的目的有两个，即个人识别与亲子鉴定。由于PCR技术可以在数小时内将目的DNA成千上万倍的扩增，使得犯罪现场留下的极少量的证据，如一滴血、一根毛发、少量精液、口腔上皮细胞以及骨块等都可进行DNA分析。从理论上讲，即使样品DNA已经降解，但只要有一条DNA链包含了欲扩增的靶序列，便可进行PCR反应。
①HLA-DQα分型的应用
HLA-DQα：人类白细胞抗原-DQα
从功能和结构上可将HLA蛋白分为两类：I类和II类。HLA II类蛋白的基因位于第6号染色体上，并由三个家族组成：HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR。每个家族的表型蛋白又由二个亚单位构成：α和β。已经发现，HLA-DQα有8种等位基因，其中有6种最为常见。人们设计了一套能确定这6种常见等位基因特异的寡核苷酸探针（ASO），通过PCR技术，扩增这6种等位基因，然后采用斑点杂交，进行分析。DQα位点的6个等位基因有21种基因型，鉴别能力可达93%。
②在性别鉴定中的应用
决定人类性别的基因位于Y染色体短臂1A1上，人们将其命名为SRY基因。在染色体上只要缺失SRY，个体就发育成女性。用针对SRY基因和X、Y同源序列的两对引物进行PCR扩增，只有男性会出现299bp的扩增片段。用这种方法可鉴别胎儿、运动员、犯罪人员等的性别，准确率极高。
（4）遗传相关基因的检测
①苯丙酮尿症（PKU）
PKU是一种常染色体隐性遗传病，患者由于苯丙氨酸羟化酶（PAH）缺乏或不足，造成苯丙氨酸及其代谢产物不能按正常代谢途径转变为酪氨酸，使得苯丙氨酸及其代谢产物在体内大量蓄积。未经治疗的患者出现脑组织损伤和不可逆的智力发育障碍。
人类PAH基因全长约90kb，包括13个外显子。引物设计在每个外显子及其两侧部分内含子序列。在PUK突变基因中，有几个突变基因的序列改变引起限制性内切酶识别位点的改变。常用的诊断方法是对相应的外显子进行扩增，PCR产物提纯后，应用这些限制性内切酶酶切，通过电泳分离酶切片段，判断个体是否有该种突变。
②杜氏营养不良症：
是一种男性常见的致死性X性连锁隐性遗传病，此种病也是由于基因缺陷所致。人们设计多对引物，用于扩增6个易缺失区。经一次PCR同时扩增，然后电泳观察，当其它片段扩增成功，而某个片段无扩增时，说明这段外显子缺失。在家系中相关的可疑女性妊娠时，可有针对性地对男性胎儿进行DNA检测，达到产前诊断的目的。
第五节DNA序列分析
一、双脱氧链终止法
Sanger等1977年发明。Frederick Sanger, 1980年Nobel Prize化学奖
原理：
（1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对的原则进行的。
（2）脱氧核糖的连接是以3? 5?磷酸二脂键。
（3）复制反应可以在体外进行。
（4）2?和3?双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。
二、Maxam-Gilbert化学修饰法
1977年，哈佛大学的A.M. Maxam和W. Gilbert发明。Walter Gilbert, 1980年Nobel Prize 化学奖。
原理：化学试剂处理
末端放射性标记的DNA片单链———————→特定的碱基中引入化学基团
↓
长度只差一个核苷酸的DNA链混合物←——————DNA在被修饰的核苷酸位置断裂↓
凝胶电泳————→放射性自显影————→阅读碱基顺序
三、DNA杂交测序
90年代初期由英国、前南斯拉夫和俄罗斯的4个科学家小组同时提出来的。
原理：
（1）只有完全互补的DNA序列才能杂交形成完全的双链分子。杂交效率最高。
（2）有个别不互补碱基时，杂交效率下降。
（3）非互补碱基越多，杂交效率越差。
四、DNA自动化测序
1981年第一台商业化生产的DNA自动测序仪诞生。
技术要点：
（1）非放射性标记
荧光物质标记。用激光能激发出不同颜色的荧光。
（2）不同的标记对象
既可标记引物，也可标记ddNTP。
（2）反应的自动化
Sanger脱氧终止法。
（3）读片的自动化
激光探头直接读胶，实时阅读。
（4）分析自动化
电脑自动把荧光信号转化成对应的碱基，并打印出DNA序列。
（5）反应可在一个试管中进行
标记ddNTP时。
核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization） Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。 Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定基中特定mRNA分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法，可推臬出癌基因的表达程度。 差异杂交（differential hybridization） 是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同cDNA探针（如：转移性和非转移性癌组织的mRNA逆转录后的cDNA）分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物（如人），则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅5％左右），价值不大。 cDNA微点隈杂交（cDNA microarray hybridization） 是指将cDNA克隆或cDNA的PCR产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上（如：尼龙膜或
pcr技术原理简介
PCR技术的基本原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多 数情况下，平台期的到来是不可避免的。 PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引
第八章核酸分子杂交技术习题
第八章核酸分子杂交技术 习题 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
第八章核酸分子杂交技术 一．选择题 【A型题】 1.DNA链的Tm值取决于核酸分子的 A.G-C含量 B.A-T含量 C.A-G含量 D.A-C含量 E.T-G含量 2.研究得最早的核酸分子杂交种类是 A.菌落杂交 B. Southern杂交 C. Northern杂交 D.液相杂交 E.原位杂交 3.Southern杂交通常是指 A．DNA和RNA杂交 B．DNA和DNA杂交C．RNA和RNA杂交 D．蛋白质和蛋白质杂交 E．DNA和蛋白质杂交 4.基因芯片技术的本质是 A.核酸分子杂交技术 B.蛋白质分子杂交技术 C.聚合酶链反应技术 D.基因重组技术 E.酶切技术 5.寡糖苷酸探针的最大的优势是 A.杂化分子稳定 B.可以区分仅仅一碱基辑差别的靶序列 C. 易标记 D.易合成 E.易分解 6.血友病是一种 A.染色体病 B.X链锁遗传病 C.先天性代谢缺陷病 D.先天 畸形 E.常染色体隐性遗传病
7.检测的靶序列是RNA的技术是 A. Southern杂交 B. Western杂交 C. Northern杂交 D. Eastern杂交 E.杂交淋巴瘤 8. 检测的靶序列是DNA的技术是 A. Southern杂交 B. Western杂交 C. Northern杂交 D. Eastern杂交 E.杂交淋巴瘤 9.DNA双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，DNA分子成为单链，这一过程称 A.变性 B.复性 C.复杂性 D.杂交 E.探针 10.具有碱基互补区域的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称 A.变性 B.复性 C.复杂性 D.杂交 E.探针 11.一种标记核酸与另一种核酸单链进行配对形成异源核酸分子的双链，这一过程称 A.变性 B.复性 C.复杂性 D.杂交 E.探针 12.标记的参与杂交反应的核酸分子，称 A.变性 B.复性 C.复杂性 D.杂交 E.探针 13.点/缝杂交可以用于 A.快速确定是否存在目的基因 B.不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息 C.用于基因定位分析
PCR原理及过程
PCR技术原理、实验步骤和应用 来源：易生物实验浏览次数：3623 网友评论0 条 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。 关键词：PCR技术PCR聚合酶链反应 一、实验目的 1.掌握聚合酶链式反应的原理。 2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。 二、实验原理 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus 公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。 PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 三、实验试剂与器材 模板DNA、L dNTP Taq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物 O 10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH 2 PCR仪、移液枪、PCR板 四、实验步骤 1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液： 模板DNA 2μL 引物1 1μL 引物2 1μL dNTP μL
核酸分子杂交技术与应用综述样本
核酸分子杂交技术与应用综述 摘要核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种崭新的分子生物学技术。它是基于DNA分子碱基互补配对原理, 用特异性的核酸探针与待测样品的DNA/RNA形成杂交分子的过程。分子杂交实验依据其形式的不同能够分为液相杂交、固相杂交、原位杂交, 而固相杂交又能够分为菌落杂交、点/狭缝杂交、 Southern印迹杂交和Northern印迹杂交。各类型杂交稻基本原理和步骤是基本相同的, 只是选用的杂交原材料、点样方法有所不同。 关键字核酸分子杂交液相杂交固相杂交原位杂交应用 本文是对分子杂交技术的原理和类型分类及其应用的一篇综述。旨在了解各种杂交类型的应用方向, 即在生物、医学上的应用。 一、核酸分子杂交原理 DNA分子是由两条单链形成的双股螺旋结构, 维系这一结构的力是两条单链碱基氢键和同一单链上相邻碱基间的范德华力。在一定条件下, 双螺旋之间氢键断裂, 双螺旋解开, 形成无规则线团, DNA分子成为单链, 这一过程称作变性或融解。加热、改变DNA融解的pH 值, 或有机溶剂等理化因素, 均可使DNA变性。变性的DNA粘度下降, 沉降速度增加, 浮力上升, 紫外光吸收增加。在温度升高引起的DNA变性过程中, DNA的变性会在一个很狭窄的 温度范围内发生, 这一温度范围的重点被称作融解温度T m 。T m 值得大小取决于核酸分子的G-C 含量, 核酸分子的G-C含量越高, 其T m 值越高。因为G-C碱基之间有三个氢键, 而A-T碱基之间只有两个氢键。变性DNA只要消除变性条件, 具有碱基互补的单链又能够重新结合形成双链, 这一过程称作复性。根据这一原理, 将一种核酸单链标记成为探针, 再与另一种核酸单链进行碱基互补配对, 能够形成异源核酸分子的双链结构, 这一过程称作杂交( hybridization) 。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补, 因此不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补序列就能够形成杂交体。 二、核酸分子杂交类型 ( 一) 固相杂交
核酸的分子杂交技术及其应用
核酸的分子杂交技术及其应用 1概述 核酸的分子杂交(molecular hybridization)技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。这时加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性)，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。 在进行分子杂交技术时，要用一种预先分离纯化的已知RNA或DNA序列片段去检测未知的核酸样品。作为检测工具用的已知RNA或DNA序列片段称为杂交探针(probe)。它常常用放射性同位素来标记。 虽然核酸分子杂交技术的应用仅有二十多年的历史，但它在核酸的结构和功能的研究中作出了重要贡献，在基因的表达调控和物种的亲缘关系研究中也发挥重要作用。而且，随着核酸探针制备及标记技术的丰富和完善以及以不同材料为支持物的固相杂交技术的发展，使核酸分子杂交技术在分子生物学领域中的应用更加广泛。这里我们将就分子杂交技术的几个主要过程及其应用进行介绍。 2核酸探针的制备 核酸分子杂交的灵敏性主要依赖杂交探针的放射性比活度。比活度高就可提高反应的灵敏性，减少待测样品的用量。目前一般所用的是体外标记，这里介绍几种最常用的方法： 2.1DNA的切口平移 双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ可把核苷酸残基加到切口处的3’端，同时由于此酶具有5’→3’外切核酸酶活性，它还可从5’端除去核苷酸。这样5’端核苷酸的去除与3’端核苷酸的加入同时进行，导致切口沿着DNA链移动，称切口平移(nicktranslation)。常用于在双链DNA 上打开切口的酶为胰DNA酶Ⅰ。由于高放射性比活度的核苷酸置换了原有核苷酸，就有可能制备比活度大于108计数/(分.μg)的32P标记的DNA探针。 2.2单链DNA探针的制备 与传统的双链探针相比，单链探针由于不存在互补链，因此可以消除由探针的两条链重退火形成无效杂交体的可能。最常用的是以M13噬菌体载体合成单链DNA探针的方法。其主要原理是用人工合成的寡核苷酸引物(其序列与载体上固定区段的序列相互补。可从生物试剂公司直接购买)与来自重组M13噬菌体的单链DNA退火，然后以此寡核苷酸作为引物在大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow大片段催化下合成互补的放射性标记DNA。 2.3单链RNA探针的制备 首先将感兴趣的DNA序列到带有SP6噬菌体或T7及T3噬菌体的启动子的重组载体质粒中。由于这些重组质粒带有的强启动子能被噬菌体的依赖DNA的RNA聚合酶所识别。因此，当把线状质粒与适当的依赖DNA的RNA聚合酶及4种rNTP(核糖核苷三磷酸)在体外混合并温育时，就可在噬菌体启动子处开始合成RNA。 单链RNA探针除具有单链DNA探针的优点之外，还具有：①合成效果高(模板可反复被转录)；②
第八章 核酸分子杂交技术习题
第八章核酸分子杂交技术 一．选择题 【A型题】 1.DNA链的Tm值取决于核酸分子的 A.G-C含量 B.A-T含量 C.A-G含量 D.A-C含量 E.T-G含量 2.研究得最早的核酸分子杂交种类是 A.菌落杂交 B. Southern杂交 C. Northern杂交 D.液相杂交 E.原位杂交 3.Southern杂交通常是指 A．DNA和RNA杂交B．DNA和DNA杂交C．RNA和RNA杂交D．蛋白质和蛋白质杂交E．DNA和蛋白质杂交 4.基因芯片技术的本质是 A.核酸分子杂交技术 B.蛋白质分子杂交技术 C.聚合酶链反应技术 D.基因重组技术 E.酶切技术 5.寡糖苷酸探针的最大的优势是 A.杂化分子稳定 B.可以区分仅仅一碱基辑差别的靶序列 C.易标记 D.易合成 E.易分解 6.血友病是一种 A.染色体病 B.X链锁遗传病 C.先天性代谢缺陷病 D.先天畸形 E.常染色体隐性遗传病
7.检测的靶序列是RNA的技术是 A. Southern杂交 B. Western杂交 C. Northern杂交 D. Eastern杂交 E.杂交淋巴瘤 8. 检测的靶序列是DNA的技术是 A. Southern杂交 B. Western杂交 C. Northern杂交 D. Eastern杂交 E.杂交淋巴瘤 9.DNA双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，DNA分子成为单链，这一过程称 A.变性 B.复性 C.复杂性 D.杂交 E.探针 10.具有碱基互补区域的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称 A.变性 B.复性 C.复杂性 D.杂交 E.探针 11.一种标记核酸与另一种核酸单链进行配对形成异源核酸分子的双链，这一过程称 A.变性 B.复性 C.复杂性 D.杂交 E.探针 12.标记的参与杂交反应的核酸分子，称 A.变性 B.复性 C.复杂性 D.杂交 E.探针 13.点/缝杂交可以用于 A.快速确定是否存在目的基因 B.不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息 C.用于基因定位分析
PCR技术及原理
PCR定义：PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 PCR技术的基本原理 一、PCR反应成分： 1、模板DNA； 2、引物； 3、四种脱氧核糖核苷酸； 4、DNA聚合酶； 5、反应缓冲液、Mg2+等。 二、PCR反应基本步骤： 1、变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程，高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。 2、退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子，低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。 3、延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA 链互补的DNA子链，中温延伸，DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。 PCR扩增的基本方法 PCR反应的成分和作用
总体积：一般为25μl～100μl 一、无Mg2+buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50?mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。二、Mg2+:终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP 为200?μmol/L，注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1?mmol/L时会抑制Taq酶的活性。?Mg2+能影响反应的特异性和产率。、 三、BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。 四、底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。 五、Taq酶：能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA 单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2+浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.5～5个单位/100μl。 六、模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。 七、引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。 引物G+C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。 PCR反应条件的选择（影响因素） 温度参数： 1、变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）变性3～10min，接着94℃变性30～60s。 2、退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。引物长度在15～25bp可通过公Tm=(G+C)×4℃+(A+T)×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。如果(G+C)低于50%，退火温度应低于55℃。较高的退火温度可提高反应的特异性。 3、延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在70～75℃。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min是够用的。 循环数： PCR的循环数主要由模板DNA的量决定，一般20～30次循环数较合适，过多的循环数会增加非特异扩增产物，具体要多少循环数可通过预试验确定。 PCR产物积累规律： 反应初期产物以2n呈指数形式增加，至一定的循环数后，引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡，产物进入一个缓慢增长时期（“停滞效应”），即“平台期”。到达平台期所需PCR循环数与模板量、PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关。
核酸分子杂交的种类及应用
核酸分子杂交 摘要:核酸分子杂交技术就是基因工程中重要的研究手段,就是目前生物化学、分子生物学、与细胞生物学研究中应用最广泛的技术之一。也就是现阶段定性、定量与定位检测DNA与RNA序列片段必须掌握的基本技术与方法。本文主要介绍了核酸分子的原理,分类以及它的相关应用。 关键词:核酸分子;分类;应用; 1、核酸杂交技术的原理 核酸分子(DNA、RNA)就是由许多单核苷酸分子通过3,5磷酸二酯键相互连接所形成的生物大分子。DNA分子双链的形成,DNA的复制,以及RNA的转录等都遵循碱基互补配对原则。DNA就是由两条互补配对的单核苷酸链通过氢键连接的双链分子。双链结构的核酸分子在加热、偏碱环境或受尿素、甲酰胺等氢键解离剂的作用,则形成单链分子,称为核酸“变性”。两条单链核甘酸若有同源顺序,则在一定条件下,她们的碱基互补配对,从而形成双链分子,称为核酸“复性”或核酸“杂交”[1]。核酸分子杂交就是用核酸分子的变性,复性等理化性质而设计的一种常用技术。通常利用一种顺序已知,并被放射性同位素标记的核酸片段瞧作为探针,与未知样品的核酸进行分子杂交,如果样品中的核酸与探针有碱基互补顺序就能形成杂交分子。此时标有同位素或生物素的探针则固定在标本上,用放射性自显影法或免疫组化法可显示出探针[2]。 核酸分子杂交可分为液相杂交、固相杂交与原位杂交[3]。 2、固相分子杂交: 将待测的靶核甘酸链预先固定在固体支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,而标记的探针则游离在溶液中,进行杂交反应后,使杂交分子留在支持物上,然后再进行检测与计算。 固相分子杂交又可分为:Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、Western印迹杂交、斑点杂交、菌落原位杂交等。 2、1 Southern印迹杂交 1975年建立的一种DNA转移方法。该法利用硝酸纤维素膜(或经特殊处理的滤纸或尼龙膜)具有吸附DNA的功能。首先用酚提法从待检测组织中提取DNA,然后以限制性内切酶消化待测的DNA片段,接着进行琼脂糖凝胶电泳使DNA按分子量大小分离,电泳完毕后,将凝胶放入碱性溶液中使DNA变性,解离为两条单链。再在凝胶上贴上硝酸纤维素膜,使凝胶上的单链DNA区带按原来的位置吸印到膜上。然后直接在膜上进行核酸探针(已被同位素标记)与被测样品之间的杂交,再通过放射自显影对杂交结果进行检测[4]。 2、2 Northern印迹杂交 1976年Alwine建立了该方法。这就是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。其检测过程与Southern转移杂交基本相同,所不同的就是用DNA探针检测经凝胶电泳分开的RNA分子。它主要用于研究基因的转录活性及表达[5]。 2、3 Western印迹杂交 Western印迹就是指将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后转移至到固相载体上,然后用抗体通过免疫学反应检测目的蛋白,分析基因的表达程度。
PCR技术的原理与方法
PCR定义 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 PCR技术的基本原理 一.PCR反应成分： 1.模板DNA； 2.引物； 3.四种脱氧核糖核苷酸； 4.DNA聚合酶； 5.反应缓冲液、Mg2 等。 二.PCR反应基本步骤： 1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。 2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。 3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s） 1.变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。 2.退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。 3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2 存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。 以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的
DNA以2n的形式增加。 ?PCR扩增的基本方法 ?PCR反应的成分和作用 总体积：一般为25μl～100 μl （一）无Mg2 buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。（二）Mg2 :终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200 μmol/L，注意Mg2 与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2 ，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。M
第八章 核酸分子杂交技术
第八章核酸分子杂交技术 主要用途：①核酸定性或定量检测；②基因克隆、突变及其表达研究；③疾病的临床诊断。 第一节核酸杂交概述及基本原理 一、核酸杂交概述 ?1961年Hall等建立核酸杂交技术，探针与靶序列溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体； ?60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素(NC)膜上的DNA序列奠定了基础； ?70年代末期到80年代早期，分子克隆技术的出现，各种质粒和噬菌体DAN载体系统的构建，使特异性DNA探针的来源变得十分丰富； ?80年代中期，PCR技术的发明与核酸分子杂交有机的结合，又使得核酸分子杂交技术的灵敏度大大提高； ?90年代，基因芯片技术的出现使得一次性对大量样品序列进行检测和分析成为可能，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、 检测效率低等不足。 核酸的结构：一级结构：核苷酸的排列循序，稳定键为磷酸二酯键； 二级结构：双螺旋结构，稳定键为氢键、碱基堆积力、疏水键； 高级结构：染色体 二、核酸变性 核酸变性(nucleic acid denaturation)：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构 的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。 ?化学键变化：维持双螺旋稳定的氢键和疏水键发生断裂，断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的。 ?化学结构变化：DNA变性改变了其空间结构，不涉及到其一级结构的改变。 DNA的变性因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件。 如加热；极端的pH；有机试剂(甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等) 变性DNA的性质：变性能导致DNA的一些理化性质及生物学性质发生改变 ①溶液黏度降低---DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以“柔软”无规则单股线性 结构，DNA黏度明显下降。 ②溶液旋光性发生改变---变性后DNA分子的对称性及局部构型改变。 ③紫外吸收增加---DNA变性后，DNA 溶液的紫外吸收增强，双链DNA＜单链DNA＜单核苷酸。变性DNA的增色效应 增色效应(hyperchromic effect)：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。 ?DNA分子在250-280nm 波长具有吸收紫外光的特性，其吸收峰值在260nm。 ?增色效应可以作为DNA变性的指标。 ?不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性，其260nm的吸光度值可增加40%以上，其它不同来源的DNA溶液的增值范围大多在20-30%之间。 解链曲线：通常利用DNA变性后在波长260nm处吸光度(A260)的增加来监测DNA变性的过程。如果以温度对A260的关系作图，所得的曲线称为解链曲线。典型DNA变性曲线呈S型。
核酸分子杂交试题
核酸分子杂交试题 一. 名词解释: 1. 核酸分子杂交 2. DNA复性 3. Southern杂交 4. Northern杂交 5. 斑点印迹 6. 原位杂交 二. 单项选择题: 1. 在加热或紫外线照射下，可导致两条DNA链中间的氢链断裂，而核酸分子中所有的共价键则不受影响的称为（）。 A. DNA变性 B. DNA复性 C. DNA重组 D. DNA杂交 变性的本质是（）的断裂。 A. 盐键 B. 氢键 C. 离子键 D. 共价键 3. 一般影响核酸变性的温度可选在（）。 A. 60—70℃ B. 70—80℃ C. 80—90℃ D. 90—100℃ 4. 在核酸分子杂交时，一般对应温度作图得到的DNA复性曲线所用的紫外吸收值是（）。 A. A260吸收值 B. A280吸收值 C. A320吸收值 D. A360吸收值 5. 进行核酸分子杂交时，一般适宜的探针浓度是（ B ）。 A. 0.1μg —μg —μg 6.杂交时如果使用单链核酸探针，随着溶液中探针浓度的增加，杂交效率也会增加，所以探针长度控制在（）。 A. 50—300bp B. 20—200bp —400bp —500 7.进行核酸杂交时，一般适宜的复性温度较Tm值低（）。 A.10℃ B.15℃ C.20℃ D.25℃ 8.寡核酸探针杂交反应一般在低于Tm值（）下进行。 A.5℃ B.10℃ C.15℃ D. 25℃ 9. 下列哪种试剂能降低核酸杂交的Tm值（ B ）。 A．尿素 B. 甲酰胺 C.甲醛 D. 乙醇 10. 在凝胶中核酸变性时，为了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须将最长的DNA片段控制在大约（）。 A. 1Kb B. 2 Kb C. 3 Kb D. 4 Kb 11. 将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，称为（）。
简述PCR基本原理
一．简述PCR基本原理？ PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 二．简述荧光定量PCR基本原理？ Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 ?荧光域值（threshold ）：是指PCR 反应的前15 个循环的荧光信号，荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍，即：threshold
?Ct 值与起始模板的关系：研究表明，每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔 1 〕，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct 值（如图 2 所示）。因此，只要获得未知样品的Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 三．简述PFGE优势用途？ 1.对细菌DNA进行酶切后的脉冲场电泳分析，在分子水平揭示细菌的指纹图谱。 2．可对不同年代和不同地区的菌株建立PFGE图谱数据库，对某种病原菌的流行趋势进行分析和预测。 3．不同实验室和国家不同菌毒株的比较分析，通过软件实现数据化和网络连接，用于传染源或污染源的追踪，快速控制疫情。
习题2核酸分子杂交技术
. 第二章核酸杂交技术 （一）名词解释 1．原位杂交 2．核酸分子杂交技术 3．探针 4．反向点杂交 5．缺口平移标记法 6．随机引物标记法 7．末端标记法 8．Southern blot杂交 9．荧光原位杂交 10．菌落杂交 （二）选择题 【A型题】 1．DNA链的Tm值主要取决于核酸分子的（） A G－C含量 B A－T含量 C A－G含量 D A－C含量 E T－G含量 2．液相杂交是下列哪一种（） A Southem印迹杂交 B Northem印迹杂交 C Dot印迹杂交 D Slot印迹杂交 E RPA实验 3．研究得最早的核酸分子杂交种类是（） A 菌落杂交 B Southern杂交 C Northern杂交 D 液相杂交 E 原位杂交 4．Southern杂交通常是指（） A DNA和RNA杂交 B DNA和DNA杂交 C RNA和RNA杂交 D 蛋白质和蛋白质杂交 E DNA和蛋白质杂交 5．最容易降解的核酸探针是( ) A cDNA探针 B dsDNA探针 C ssDNA探针 D gDNA探针 E: RNA 6．探针基因芯片技术的本质就是（） A 核酸分子杂交技术 B 蛋白质分子杂交技术
. C 聚合酶链反应技术 D 基因重组技术 E 酶切技术 7．DNA探针的长度通常为( ) A 1000 ～2000个碱基 B 500 ～1000个碱基 C 400 ～500个碱基 D 100 ～400个碱基 E. <100个碱基 8．寡核苷酸探针的最大的优势是（） A 杂化分子稳定 B 可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列 C 易标记 D 易合成 E 易分解 9．在Southern印迹中常用的核酸变性剂是( ) A 甲醛 B 乙醛 C 氢氧化钠 D 碳酸钠 E 盐酸 10．盐酸硝酸纤维素膜最大的优点是（） A 脆性大 B 本底低 C 共价键结合 D 非共价键结合 E 高结合力 11．最常用的DNA探针标记方法是( ) A 随机引物 B 切口平移 C 3′-末端标记 D 5′-末端标记 E PCR法 12．为了除去探针，重复使用滤膜，以下哪种情况不可以发生（） A 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经干燥过 B 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经湿润过 C 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经温浴过 D 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经漂洗过 E 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经标记过 13．5′一末端的DNA探针标记主要依靠的酶是( ) A T4多聚核苷酸激酶 B 末端转移酶 C AKP
PCR技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)
聚合酶链式反应（P C R）原理 DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性- 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板- 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR技术分类（常用） （1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。 （2）锚定PCR技术(Anchored PCR, APCR)：用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。 （3）不对称PCR技术(asymmetric PCR)：两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导
pcr技术的基本原理
在科学研究中，每一项新技术的创立都会带来一系列新的研究成果问世，从而推动着各学科的发展。纵观形态研究领域，50年代电子显微镜引入形态学观察领域，带来了从细胞水平到亚细胞水平的深入研究；60-70年代，免疫组织化学与免疫细胞化学技术的广泛应用，又将观察的水平由亚细胞结构推向了蛋白质分子水平，使细胞内众多的活性物质得以进行细胞或亚细胞水平的定位，对医学生物学的发展无疑产生了深刻的影响。70年代，分子生物学技术在形态学中的广泛应用，随着原位杂交技术的出现，使组织细胞内特定的DNA或RNA 序列能够被定位，将蛋白质水平又提高到基因水平即核酸分子的观察和定位，从而使人类对许多生命现象在基因水平上的认识得以深化；80年代，分子生物学领域中一项具有强大生命力的技术PCR——多聚酶链反应技术问世了，很快地就被引入形态学观察的领域，使细胞内低拷贝或单拷贝的特定DNA或RNA得以进行定位及观察。这一技术的问世，必将带来更多的研究成果，使形态学的研究又向前迈出一大步。 基本原理 原位PCR技术的基本原理，就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。 PCR技术是在DNA聚合酶的作用下，经过模板的变性、退火和引物延伸三种循环，将引物引导下的特异性靶序列迅速地进行扩增，经过扩增的靶序列（一般能扩增106倍），很容易在凝胶电泳或Southern印记杂交中显示出来，因此，PCR技术具有灵敏度高，特异性强的优势，随着热循环自动化的提高与稳定也使得PCR技术的操作简便易行。但是，PCR技术是在液相中进行的，在扩增前，需将细胞破坏，从中提取核酸作为模板，因此很难将PCR的结果与组织细胞的形态结构联系起来，同时，也很难判断含特异性靶序列的细胞类型。 原位PCR技术成功地将PCR技术和原位杂交技术结合起来，保持了两项技术的优势又弥补了各自的不足。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。 基本类型 根据在扩增反应中所用的三磷酸核苷原料或引物是否标记，原位PCR技术可分为直接法和间接法两大类，此外，还有反转录原位PCR技术等。 直接法原位PCR技术 直接法原位PCR技术是将扩增的产物直接携带标记分子，即使用标记的三磷酸腺苷或引物片断。当标本进行PCR扩增时，标记的分子就掺入到扩增的产物中，显示标记物，就能将特定的DNA或RNA在标本（原位）中显现出来。 常用的标记物有放射性同位素35S，生物素和地高辛，用放射性自显影的方法或用亲和组织化学及免疫组织化学的方法去显示标记物所在位置。 直接法原位PCR技术的优点是操作简便，流程短，省时。缺点是特异性较差，易出现假阳性，扩增效率也较低，特别是在石蜡切片上，上述缺点更为突出。因为在制片过程中，无论是固定，脱水还是包埋，都会导致DNA的损害，而受损的DNA可利用反应体系中的标记三磷酸核苷进行修复，这样标记物就会掺入到DNA的非靶序列中，造成假阳性。若用标记引物的方法进行直接法原位PCR，其扩增的效率比不标记更低。 间接法原位PCR技术 间接法原位PCR技术师现在细胞内进行特定DNA或RNA扩增，再用标记的探针进行原位杂交，明显提高了特异性，是目前应用最为广泛的原位PCR技术。 间接法原位PCR与直接法不同的是，反应体系与常规PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷均不带任何标记物。即实现先扩增的目的，然后用原位杂交技术去检测细胞内已扩增的特定的DNA产物，因此，实际上是将PCR技术和原位杂交技术结合起来的一种新技术，故又称之为PCR原位杂交(PCR in situ hybridization , PISH)。 间接法PCR技术的优点是特异性较高，扩增效率也较高。缺点是操作步骤较直接法繁琐。 原位反转录PCR技术。