FasL 在睾丸细胞的定位
2008年4月第18卷 第4期
中国比较医学杂志
CHINESE JOURNA L OF COMPARATIVE ME DICINE April ,2008
V ol.18 N o.4
综述与专论
[作者简介]余秀琴(1979-),女,硕士研究生,研究方向:细胞工程,E 2mail :yuxq05@s https://www.wendangku.net/doc/f217747400.html, 。[通讯作者]朱宝长,教授,E 2mail :baochangzhu @https://www.wendangku.net/doc/f217747400.html, 。
Fas L 在睾丸细胞的定位
余秀琴,张衍泉,朱宝长
(首都师范大学生命科学学院,北京 100037)
【摘要】 Fas L ΠFas 系统介导的胞外信号凋亡途径是哺乳动物睾丸生殖细胞凋亡的一条主要途径,然而,关于
Fas L 在睾丸细胞中的定位却存在争议。本文对近年来国内外关于Fas L 在睾丸中的细胞定位研究进行了综述,为阐
明Fas L ΠFas 系统介导生殖细胞凋亡的机制提供资料,对深入理解睾丸中Sertoli 细胞和生殖细胞间的调控关系及临床实践具有一定的指导作用。
【关键词】 细胞定位;生殖细胞
【中图分类号】R329128 【文献标识码】A 【文章编号】167127856(2008)0420073205
Localization of F asL in the Testicular Cells
Y U X iu 2qin ,ZH ANG Y an 2quan ,ZH U Bao 2chang
(C ollege of Life Sciences ,Capital N ormal University ,Beijing 100037,China )
【Abstract 】 The Fas ΠFas L 2mediated pathway is well recognized in germ cell apoptosis in the mammalian testis.H owever the
cellular location of Fas L in testicular cells remains ambiguous.The present paper briefly reviews the recent researches concerned with cellular location of Fas L in the testis.H opefully ,it could provide useful in formation for further investigation in clarifying the mechanism of the Fas ΠFas L 2mediated germ cell apoptosis during spermatogenesis and in its clinical practice.
【K ey w ords 】 Cellular localization ,Fas L ;Apoptosis ;G erm cell
在哺乳动物睾丸中,精原干细胞不断地增殖与分化,成就了精子生成的庞大群体,然而,其增殖数
量和质量都要受到多方面的“检验”和限制(包括Sertoli 细胞),多余或未通过“检验”的生殖细胞需要
被清除,该清除过程主要是通过自发性细胞凋亡来维持的。Fas L 为Fas 的天然配体,是一种诱导细胞凋亡的Ⅱ型跨膜蛋白,能特异性地与靶细胞膜上的Fas 结合诱导细胞凋亡。这种Fas L ΠFas 系统介导的
细胞凋亡途径是哺乳动物睾丸生殖细胞凋亡的一条主要途径
[1-4]
,Fas L 能特异性地与生殖细胞膜上的
Fas 结合诱导其凋亡。长期以来,虽然人们对于睾
丸中Fas L ΠFas 凋亡途径研究非常活跃,但对于Fas L 在睾丸曲细精管中的细胞定位却观点不一。研究
Fas L 在睾丸中的细胞定位,不仅有助于澄清细胞凋
亡过程中的信号传递途经,深入了解睾丸Sertoli 细胞和生殖细胞相互作用、睾丸内精子发生以及免疫豁免微环境的形成,还将有助于了解睾丸疾病的发病机制,从而为男性疾病的临床诊断及治疗开创新的途径。
1 F asL 与细胞凋亡111 F asL 概述
Fas L 基因定位于人的1号染色体长臂2区3带(1q23),总长约810kb ,cDNA 全长1909bp ,开放性
阅读密码框长846bp ,含4个外显子和3个内含子。
Fas L (C D95L ,APO 21L ,C D178)蛋白是一类含有280
个氨基酸(～40kDa)的Ⅱ型跨膜蛋白,属于肿瘤坏死因子(T NF)超家族表面分子[5]。这个超家族也包括T NFα的死亡受体、与诱导凋亡相关的T NFα配体(TRAI LΠAPO22L)以及T NF凋亡诱导物(T WE AKΠAPO23L)。人的Fas L氨基酸序列与小鼠、大鼠的同源性分别为7619%和7518%。Fas L蛋白的胞内段(位于N端,含80个氨基酸)有一脯氨酸丰富区,参与将Fas L分送至溶酶体;还有一酪蛋白激酶I (CKI)基序(2SS ASS2),其在Fas L信号通路中的作用尚不清楚。Fas L蛋白的胞外段(位于C端,含179个氨基酸)有一寡聚化结构域,参与其自装配,与T NF家族的其他成员具有高度同源性,受体结合位点、金属蛋白酶裂解位点也位于Fas L的胞外段。生物体内主要有两种类型的Fas L蛋白分子[6]:膜结合型Fas L(mFas L)与可溶型Fas L(sFas L)。mFas L通常以单体形式存在;sFas L是由锌离子依赖的金属蛋白酶(M MP)作用于mFas L的近胞外区,经蛋白水解切割而形成的,一般是以二聚体的形式存在。有研究表明[7]:用M MP抑制剂抑制Fas L的裂解,可显著增强Fas L介导的凋亡进而提出sFas L可拮抗mFas L 的作用。因此,Fas L的两种不同形式调节着Fas LΠFas系统介导的细胞凋亡。
112 F asL介导细胞凋亡的途径
细胞凋亡(apoptosis)在某种意义上又称为程序性细胞死亡,是指细胞在一定的生理和病理条件下,遵循自身的程序,自己结束其生命的一种主动过程。细胞凋亡途径有胞外和胞内两条信号途径[8]。胞内凋亡途径也称为“线粒体途径”[8],此类信号包括辐射、损伤、某些药物如氧化砷等,这些信号往往通过各种机制引发线粒体功能结构的变化,导致线粒体通透性转换孔打开,细胞色素c释放,最终致使细胞凋亡。由于篇幅所限,与Fas L信号无关的胞内途径将不在本文探讨。胞外凋亡途径是由Fas LΠFas 系统介导的,Fas L也称为“死亡信号”,故胞外凋亡途径又称为“死亡信号”途径。Fas LΠFas系统介导的胞外凋亡途径,它们在caspase8活化时又开始分道扬镳[9-10]。细胞死亡抗凋亡蛋白如Bcl22、Bcl2x L不能防止“I型细胞”路径细胞遭受死亡受体诱导的细胞死亡。Bcl22、Bcl2x
L能明显抑制Fas LΠFas介导的“Ⅱ型细胞”途径的细胞凋亡[9],且发现在Bid缺失或BaxΠBak缺失的小鼠中,Fas LΠFas系统介导的“Ⅱ型细胞”途径细胞凋亡被抑制[11-12]。
113 F asL介导细胞凋亡的作用
Fas L介导的凋亡通路在生物体内发挥了重要作用:通过与细胞膜上的Fas受体相结合,参与激活诱导性细胞死亡[13];在免疫系统中,介导CT L和NK 细胞对靶细胞的细胞毒作用[14-15];维持生物体内脑、眼、睾丸等免疫豁免的微环境,保障其内部细胞的正常生长发育[6];通过诱导浸润的淋巴细胞凋亡,参与肿瘤的形成及发展[16]等。
2 F asL在睾丸细胞中的表达
Fas L的天然受体Fas,是一种跨膜受体蛋白,在体内多种组织细胞广泛表达,尤其在免疫细胞表面。已有研究证实[17],Fas还在很多组织中表达,如肝脏、肾脏、肠道、卵巢、阴道、睾丸等。不同于Fas蛋白,Fas L在组织中的表达有明显的特异性。早期研究发现Fas L表达在T淋巴细胞和NK细胞中,后来研究表明[17],Fas L不仅在免疫细胞中表达,并且还在免疫豁免的微环境如眼、脑、胎盘以及睾丸中表达丰富。
Sertoli细胞(支持细胞)和生精细胞是哺乳动物睾丸曲细精管内两种主要的细胞,两者的关系非常密切。Sertoli细胞是曲细精管中的体细胞[18],位于曲细精管基底膜,被认为是生精细胞的支架,为生精细胞提供必需的营养物质。同时Sertoli细胞之间的紧密连接构成血2睾屏障,为精子的生成提供免疫豁免的微环境[19]。生殖细胞是曲细精管中的性细胞,通过传递一些信号分子,反作用于Sertoli细胞,从而调节自身的增殖、分化与凋亡[7]。Fas LΠFas系统介导的胞外凋亡途径是生殖细胞凋亡的一条普遍途径,膜上表达有Fas受体的生殖细胞通过相邻的Sertoli细胞或通过自身细胞表达的Fas L来介导其凋亡。近年来,国内外学者对睾丸细胞中的Fas L定位开展了一些研究工作,并获得许多有意义的定位信息。
211 正常生理条件下,F asL在睾丸细胞中的表达雄性睾丸在正常生理条件下会出现大量的生殖细胞凋亡,青春期后精子发生时尤为显著。对大鼠等啮齿目动物的研究表明,生精过程中实际产生的精子数量比理论预测的减少了25%～75%[20]。表明在此过程中确有相当数量的细胞发生了凋亡,而Fas L在此凋亡过程中起着非常重要的作用,下面综述了人们在研究过程中关于Fas L的表达情况。21111 Fas L定位于Sertoli细胞:首先是Bellgrau (1995)等[21]提出Fas L定位于Sertoli细胞。他们发现用正常成年小鼠睾丸(表达有Fas L活性)作供体
进行肾囊膜异体移植,供体睾丸在受体小鼠体内能够存活,而用gld成年小鼠睾丸(Fas L基因突变致使Fas L蛋白失活)作供体进行相应地移植,则不能在受体小鼠存活,表明由于睾丸细胞表达的Fas L(在移植部位通过诱导宿主炎症细胞的凋亡)为睾丸提供了免疫豁免的微环境,进一步从睾丸中分离出Sertoli细胞,用RT2PCR分析证实该动物睾丸中Fas L 表达来自于Sertoli细胞。French(1996)等[22]用RNase保护测定法得到成年小鼠睾丸中高表达Fas L mRNA,免疫荧光进一步探测到Fas L定位于Sertoli 细胞。Lee(1997)等[1]选取28日龄大鼠(处于青春期),进行免疫组织化学观察Fas LΠFas蛋白的定位,发现Fas L特异性地表达于曲细精管基底部的Sertoli 细胞,Fas仅表达于生殖细胞,主要是精母细胞。Xu (1999)等[23]用原位杂交技术检测出,在啮齿类成年动物的睾丸中,Fas表达于生殖细胞,而Fas L表达于Sertoli细胞。随后,人们普遍认为Fas L定位于Sertoli 细胞,而Fas定位于生殖细胞[24-26],在Fas LΠFas系统介导的生殖细胞凋亡中,由Sertoli细胞分泌的Fas L,通过与膜上表达有Fas的生殖细胞相结合,以旁分泌形式介导生殖细胞凋亡。
对于Fas L的定位研究,人们多集中在小鼠或大鼠等实验动物,在人体上的研究较少。Francavilla 等[27]用原位RT2PCR技术检测到成年人睾丸细胞中,Fas L mRNA也在Sertoli细胞上有表达。在临床医学上,有人把Sertoli细胞与供体组织一起移植到受体组织中,可以延长供体组织在受体体内的存活时间,认为是Sertoli细胞上表达的Fas L为所在组织提供免疫豁免的微环境所致[28-29]。
21112 Fas L定位于生殖细胞:D’Alessio(2001)等[30]最先明确提出Fas L定位于生殖细胞。他们将各类型生殖细胞分离纯化后分别检测mRNA则发现Fas L主要表达在圆形精子细胞中,少量表达在粗线期精母细胞中。使用原位杂交方法对成年大鼠睾丸mRNA进行探测,结果表明Fas L主要定位于减数分裂后的生殖细胞,尤其是长形精子细胞中,与前述实验基本一致。并进一步用流式细胞仪检测Fas L蛋白在各类型生殖细胞的表达,其结果也与上述研究相吻合,即Fas L表达于减数分裂后的单倍体精细胞中。Shaha等[31]也观察到生精周期第V期的曲细精管中Fas L蛋白定位于长形精子细胞,随后又做了体外实验[32],分离纯化的各类型生殖细胞中,流式细胞仪检测到Fas L表达于二倍体和单倍体细胞。Celik2Ozenci等[33]也观测到正常成年大鼠生殖细胞凋亡后Fas L定位于精子细胞。这些结果表明,Fas L 定位于生殖细胞,通过自分泌介导生殖细胞的凋亡,即生殖细胞自身分泌Fas L蛋白与其膜上的Fas蛋白相互结合,诱导其自身的凋亡过程。
K ajihara等[34]用免疫组化检测到Fas L在正常成年小鼠的Sertoli细胞和生殖细胞中都表达。这一结果则表明Fas L有可能来自Sertoli细胞和生殖细胞,它可以分别通过旁分泌和自分泌的形式与生殖细胞膜上的Fas受体结合,从而诱导生殖细胞的凋亡。212 病理生理条件下,F asL在睾丸细胞中的表达雄性睾丸在不适宜的环境(病理状态)下,也会导致大量的生殖细胞凋亡。已有研究表明[35-38],各种睾丸损伤如药物处理、激素影响、辐射处理以及缺血后灌注等导致的生殖细胞凋亡多数与Fas LΠFas 系统有关。依据刺激物作用不同的靶目标(Sertoli 细胞或生殖细胞),研究者报道了Fas L在睾丸细胞中的不同表达。
21211 损伤Sertoli细胞,Fas L在睾丸细胞中的表达:Lee等[2]用特异性损伤Sertoli细胞的药物MEHP (邻苯二甲基酯酸)或2,52H D(2,52己二酮)处理成年大鼠睾丸组织,发现精子发生不能正常进行,生殖细胞凋亡增加。进一步检测到Fas L mRNA表达上调,免疫组化显示Sertoli细胞上的Fas L蛋白也显著上调。后来,Y ao等[39]印证了Lee等人的实验,用实时定量PCR技术检测到成年大鼠ASC217D细胞系(Sertoli细胞系)在MEHP作用下其细胞中Fas L mRNA表达显著上调。Ozawa等[40]曾用CdCl2(能够打开Sertoli细胞之间紧密连接,破坏血睾屏障)注射成年大鼠睾丸组织,发现Fas L在生殖细胞和Sertoli细胞中都表达,且表达上调。W oolveridge 等[35]用E DS(二甲基磺酸乙烷,特异性损伤Leydig 细胞,间接影响Sertoli细胞)处理成年大鼠,通过免疫组化方法分析,检测出Fas L在Sertoli细胞中表达,同时也在初线期精母细胞和圆形精子细胞中表达。
21212 损伤生殖细胞,Fas L在睾丸细胞中的表达: D’Alessio等[30]用辐射和隐睾这两种经典去除生殖细胞(主要是去除分化的生殖细胞,其中辐射影响的是仔鼠精子发生延缓)损伤模型作用于大鼠,发现正常胎鼠产下的仔鼠出生后30d(青春期)有Fas L mRNA的表达,而辐射处理胎鼠,其产下的仔鼠直到出生后63d(生精过程恢复)才有Fas L mRNA的表
达;隐睾处理也发现Fas L mRNA在正常成年大鼠睾丸中有表达,而在隐睾后的睾丸中不表达。这一现象表明Fas L mRNA表达于生殖细胞。随后,该实验小组又发表了一篇精子活力障碍病人精液Fas L方面的报道[32],通过流式细胞仪检测到Fas L表达于成熟精子,进而印证上述现象。Shaha等[31]用雌激素类似物22DES(二乙基乙烯雌酚,生精细胞受体类似物)处理成年Wistar大鼠,免疫染色结果显示出,在DES处理早期(1d后),Fas L表达于生殖细胞的分泌泡中。随着作用时间的延续,Fas L在其中的表达上调,到第7天,生精上皮周期Ⅴ2Ⅶ期的长形精子细胞的细胞质中高表达Fas L,精母细胞和圆形精子细胞中也有较少表达。该实验小组随后又做了体外实验[32],在17β2雌二醇诱导的生殖细胞凋亡中,通过流式细胞仪检测出表达Fas L的二倍体和单倍体细胞数目显著升高。K ajihara等[34]用LPS(脂多糖)注射成年小鼠体内,导致睾丸生精紊乱,生殖细胞凋亡。免疫组化检测到Fas L在Sertoli细胞和生殖细胞中都有表达。O’Neill等[42]也观察到,输精管结扎术(5年以上)后的病人组(精子活力障碍)与对照组相比,生殖细胞和Sertoli细胞均表达Fas L,且表达上调。
3 小结与研究展望
综上所述,从发育时段上看:Fas L在Sertoli细胞表达的研究都是针对从青春期到性成熟阶段的成年动物进行的[1,21-27],而在胚胎到青春期前所进行的研究未观察到Fas L在Sertoli细胞的表达[30];Fas L在生殖细胞的表达主要在减数分裂后的单倍体细胞中,尤其是成熟精子细胞[30-33]。从生活状态上看:正常生理状态下,Fas L在睾丸Sertoli细胞的表达[21-27]报道较多,而在生殖细胞的表达主要鉴于体外实验[30-33];病理状态下,一些研究者检测到Fas L 在睾丸Sertoli细胞、生殖细胞均有表达[35,40,42],也有一些研究者检测到仅受损靶细胞表达Fas L[2,30,31]。另外,不同检测技术所观察到的Fas L定位信息不同[1,30],即使是同一技术也会因为操作过程差异而导致检测结果的差异[23,30]。由此我们不难看出, Fas L作为诱导生殖细胞的“死亡信号”,在睾丸细胞中的定位相当复杂,Fas L在睾丸细胞的定位问题并不是某一个研究组的实验就能解决的。Fas L在睾丸生殖细胞、Sertoli细胞均有表达,但不同的时段、不同状态下的细胞Fas L表达的时空程序是有差异的。
在哺乳动物睾丸中,生殖细胞数量之所以相对恒定,主要是通过Fas LΠFas系统介导的生殖细胞凋亡来维持的。明确Fas L在睾丸的细胞定位将有利于人们从旁或自分泌角度研究生殖细胞凋亡的调控机制,深入了解睾丸微环境与生殖细胞间的关系,进而为解决男性生殖疾病以及探寻避孕的新策略和方法提供思路。
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〔修回日期〕2007212220
AMPK信号通路负向调节热应激诱导仔猪睾丸支持细胞乳酸分泌
目录 目录 中文摘要............................................................................................................................ I ABSTRCT....................................................................................................................... III 第一章文献综述. (1) 1.睾丸支持细胞概述 (1) 1.1支持细胞的结构和功能 (1) 1.2支持细胞的能量代谢 (1) 1.3支持细胞乳酸的分泌 (2) 2.热应激的研究进展 (4) 2.1热应激概述 (4) 2.2热应激对机体代谢的影响 (5) 2.3热应激对公猪繁殖性能的影响 (7) 3.AMPK的研究概况 (8) 3.1 AMPK的结构 (9) 3.2 AMPK的活性 (10) 3.3 AMPK与代谢调节 (11) 3.4 AMPK与热应激 (13) 4.结束语 (13) 第二章引言 (15) 第三章试验材料与方法 (17) 1.试验材料 (17) 1.1试验材料 (17) 1.2主要试剂 (17) 1.3试剂配置 (18) 1.4主要试验仪器 (20) 2.试验方法 (21) 2.1睾丸支持细胞分离培养 (21) 2.2支持细胞的纯度鉴定 (22) 2.3热应激处理 (23) 2.4 AMPK过表达载体的构建 (23) 2.5细胞转染 (26) 2.6蛋白免疫印迹 (26) 2.7 乳酸含量测定 (28) i
小鼠睾丸支持细胞分离培养
小鼠睾丸支持细胞分离培养 一、材料和器械： 1、材料：小白鼠（18~ 20 日龄）1只 2、配液： PBS 1L，高压灭菌 细胞洗液：DMEM+双抗 消化液：0 25% ( 质量分数) 胰蛋白酶，0 1%( 质量分数) 胶原酶 细胞培养液：DMEM+10%FBS+双抗 3、器械： 镊子、手术剪、手术刀各3-4把，高压灭菌 500mL烧杯2个，高压灭菌 25 mL离心管、5 mL离心管各20个，高压灭菌 酒精棉一瓶 细胞培养皿若干 冰块若干 二、操作步骤： 1、处死小鼠颈椎脱臼法处死； 2、消毒置于含75% ( 体积分数) 乙醇平皿中浸泡2 min, 然后置于超净台上； 3、取睾丸用中剪剪开下腹部皮肤, 眼科剪从下腹部附睾部剪断精索, 取出双侧睾丸, 放入含预冷细胞洗液的培养皿中； 4、取实质修剪睾丸附带的精索。剥除睾丸被膜, 将睾丸实质剪成约1 mm 1 mm 1 mm 碎块, 静置3~ 4 min； 5、消化转入25mL 离心管中。吸出上层细胞洗液, 每只睾丸加入1 5mL 37 预温的0 25% ( 质量分数) 胰蛋白酶，37 高速振荡消化15~ 20min, 直到残存的间质消化成粘液状, 可见成片断的曲细精管； 6、终止消化加入入少许血清终止消化,； 7、离心1000 r/ min离心5 min, 倾去上层胰酶。加入DMEM/ F12 培养基重悬, 1000r/min 离心5min。倾去上层培养液； 8、再消化每只睾丸加入1 mL 37 预温的0 1%( 质量分数) 胶原酶, 37 低速
缓慢振荡消化20~ 25min； 9、铜网过滤取滤液800 r/ min 离心5min, 2 次去除胶原酶, 用培养液洗涤； 10、接种往离心管加入细胞培养液5ml左右，吹打均匀，接种到两个30细胞培养皿中，补加培养液到培养皿1/3~1/2,培养皿标记显微观察后放入36CO2培养箱培养。 三、换液纯化，计数结果鉴定
小鼠睾丸支持细胞体外培养特性
生物工程学报Chin J Biotech2009, May 25; 25(5): 745-753 https://www.wendangku.net/doc/f217747400.html, Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@https://www.wendangku.net/doc/f217747400.html,? 2009 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved 小鼠睾丸支持细胞体外培养特性 师冰洋1, 张淑香1, 郭美锦1, 王永红1, 张嗣良1, 史小林2 1 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室, 上海 200237 2 首都医科大学生殖医学中心, 北京 100069 摘要:支持细胞是睾丸的重要组成部分, 其主要功能是为生精细胞提供适宜的生长环境。从幼鼠睾丸中分离得到支持 细胞, 并通过苏木精-伊红和Fas-L免疫组化染色对分离得到的细胞进行了鉴定。通过对原代小鼠睾丸支持细胞的贴壁、 生长和培养液中葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸等营养底物及其副产物乳酸、铵根离子等的代谢以及培养液渗透压和pH的 研究, 发现支持细胞的贴壁时间主要集中在接种后2~4 h; 当培养液中氨根离子浓度高于 2.3 mmol/L, 渗透压高于 326 mosm/kg, pH≤6.8时支持细胞生长进入衰亡期; 在氨基酸代谢方面, 发现培养过程中丙氨酸和谷氨酸浓度迅速增加, 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸浓度略有降低, 丝氨酸、精氨酸和甘氨酸浓度基本保持不变。因此培养液中铵根离子浓度的 过量积累、渗透压和pH的异常和贴壁面积不足是限制支持细胞静态生长的主要因素。研究结果为支持细胞大规模培养 及工艺优化奠定了基础。 关键词:支持细胞, 分离与鉴定, 体外培养, 代谢特性 Metabolic characterization of rat sertoli cell in vitro culture Bingyang Shi1, Shuxiang Zhang1, Meijin Guo1, Yonghong Wang1, Siliang Zhang1, and Xiaolin Shi2 1 State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China 2 Reproductive Medical Center of Capital Medical University, Beijing 100069, China Abstract: Sertoli cell (SC) is intrinsic to the testis and provides an appropriate growth environment for the germ cells. It was separated from rat’s testis and identified by hematoxylin and eosin staining(HE) and immunocytochemical reaction, then cultivated in vitro. Culture conditions such as pH, osmotic pressure and metabolic parameters that include consumption rates of glucose, glutamine, amino acids and formation rates of lactic acid, ammonium ion were investigated. It was showed that adhesion process of SCs was accomplished within 2?4 hours after inoculation. It was also observed that the SCs entered into the decline phase when the concentration of ammonium ion and lactic acid were above 2.3 mmol/L and 14 mmol/L, respectively, which caused osmotic pressure above 326 mosm/kg and pH below 6.8 in the medium. As the changes of amino acids during culture were concerned, Glu and Ala accumulated rapidly, while Val, Leu, Ile reduced slightly and at the same time Ser, Arg, and Gly were stable. The restrict factors for SCs grown in static culture might be high osmotic pressure and low pH, which were generated when glutamine and glucose were metabolized into lactic acid. The findings could be fundamental in the process optimization of large scale Sertoli cells in vitro culture. Received:December 9, 2008; Accepted:February 19, 2009 Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA02Z216), Shanghai Biotechnology Industrialized Platform (No. 07DZ22914), National Special Fund for State Key Laboratory of Bioreactor Engineering (No. 2060204). Corresponding author: Shuxiang Zhang. E-mail: zhangsx1976@https://www.wendangku.net/doc/f217747400.html, Meijing Guo. E-mail: guo_mj@https://www.wendangku.net/doc/f217747400.html, 国家高技术研究发展计划(863计划)(No. 2007AA02Z216), 上海市生物技术产业化平台(No. 07DZ22914), 国家重点实验室专项经费 (No. 2060204)资助。
组织学解剖--睾丸
组织学解剖--睾丸 睾丸(一) 一般结构 1. 被膜浆膜（睾丸鞘膜脏层）：由间皮及少量结缔组织组成白膜（tunica albuginea）：位于浆膜深层，由致密结缔组织组成睾丸纵隔（mediastinum testis）：白膜在睾丸后缘增厚形成睾丸纵隔，纵隔结缔组织呈放射状深入睾丸实质形成许多睾丸小隔 2. 实质由睾丸小隔分隔睾丸实质成250多个锥体形睾丸小叶。每个睾丸小叶含1）1～4条弯曲的小管——生精小管生精小管在近睾丸纵隔处变为短而直的直精小管 直精小管在睾丸纵隔内相互吻合形成睾丸网 即生精小管→直精小管→睾丸网2）生精小管间的结缔组织为睾丸间质,内含睾丸间质细胞 (二) 生精小管(seminiferous tubule) 是睾丸产生精子的场所它为极度弯曲的上皮性管道成人的生精小管：长30～70cm 管径150～250um，中央为管腔 管壁厚60～80um 1.结构生精上皮基膜1）生精上皮（spermatogenic epithelium）组成：两种细胞支持细胞：支持细胞作单层排列生精细胞（spermatogenic cell）生精细
胞镶嵌在支持细胞侧面及腔面 由上皮基部到腔面作多层（5～8层）排列2）基膜较厚外周覆以胶原纤维和一些梭形的具有收缩功能的类肌细胞(myoid cell)肌样细胞收缩有助于精子排出 2.生精细胞与精子的发生生精细胞精原细胞 初级精母细胞 次级精母细胞 精子细胞 精子青春期前，生精小管管腔很小或缺如，管壁中只有支持细胞和精原细胞青春期开始，在垂体促性腺激素的作用下，生精细胞不断增殖分化形成精子，生精小管壁内可见不同发育阶段的生精细胞。 1）精原细胞（spermatogonium）位置紧贴生精上皮基膜细胞形态圆形或椭圆形，直径约12um细胞结构细胞质内除核糖体外，细胞器不发达。是各级生精细胞中最幼稚的细胞细胞分类精原细胞分A、B两型A型精原细胞是生精细胞中的干细胞，经过不断地分裂增殖，一部分A型精原细胞继续作为干细胞，另一部分分化为B型精原细胞B型精原细胞经过数次分裂后，分化为初级精母细胞
睾丸性索间质肿瘤
由正常发育和演化的间质细胞成分构成的睾丸肿瘤。2004年世界卫生组织WHO《泌尿系统及男性生殖器官肿瘤病理学和遗传学》中将其分为间质细胞瘤和恶性间质细胞瘤。睾丸问质细胞瘤罕见，间质细胞瘤占睾丸肿瘤的1%～3%，是最常见的性索/间质肿瘤。儿童睾丸间质细胞瘤为良性，约有10%成人的睾丸间质细胞瘤为恶性，可能发生腹膜后淋巴结转移或远处脏器转移。恶性睾丸间质细胞瘤肿瘤体积常大于5cm，核分裂象增多，有坏死或血管浸润。1895年由Sacchi 首先报道。该病可发生于任何年龄段，其中，约有20%发生于儿童，约80%发生于成人。 目录 1病因 2临床表现 3检查 4治疗 1病因 病因不清。可能与先天性睾丸发育不全、隐睾有关。 2临床表现 儿童睾丸间质肿瘤高发年龄为3岁～9岁，成人睾丸间质肿瘤高发年龄为21岁～59岁。5%～10%的患者有隐睾史。常为单侧，3%为双侧。成人患者最常见的临床表现是无痛性睾丸增大或肿物，30%的患者有乳房增大，男性乳房增大的表现往往较睾丸肿物更早，平均比睾丸间质细胞瘤的诊断早3年。儿童患者常见症状为无痛性睾丸肿大，假性性早熟，如出现喉结、声音低沉、阴毛增生，阴茎增粗、时常勃起。 3检查 超声检查是临床上辅助诊断睾丸病变的首选方法。B超对于判断睾丸肿瘤的性质、大小、部位、肿瘤所占睾丸组织的比例甚至选择治疗方式等具有重要的临床价值。睾丸内可见单发，均呈类圆形，界清，体积小，实性低回声/中等回声/
高回声，与正常睾丸组织有明显的边界，形态不规则，内部回声均匀。丰富的动、静脉血流信号。 成人睾丸间质细胞瘤患者的血清和尿中的雌激素常常升高。儿童睾丸间质细胞瘤患者的血清睾酮升高，部分患儿的尿17-酮升高。间质细胞瘤患者的血清甲胎蛋白（AFP）和人绒毛膜促性腺激素（β-hCG）多在正常范围。 4治疗 外科手术切除是惟一有效的治疗方法，对儿童睾丸畸胎瘤患者术中冰冻病理检查结果排除恶性肿瘤者，可以考虑行保留睾丸手术。根治性睾丸切除术能够治愈大多数患者，对于病理怀疑恶性的病例，可以考虑腹膜后淋巴结清扫术。远处转移的患者对放疗或化疗不敏感。
睾丸细胞的生物学特征及研究进展
睾丸细胞的生物学特征及研究进展 周文钧 摘要：睾丸形态与功能的维持主要依靠生精细胞、支持细胞、管周肌样细胞、间质细胞发挥作用。生精细胞、支持细胞功能的正常是精子发生的基础，管周肌样细胞的收缩促使精子排出至睾丸网，间质细胞是睾酮的主要来源。目前，睾丸细胞研究主要集中在细胞体外培养、细胞基因组学、细胞应用三大领域。本次研究将分别探讨生精细胞、支持细胞、管周肌样细胞、间质细胞的的生物学特征及其研究进展。 关键词：生精细胞；支持细胞；管周肌样细胞；间质细胞；生物学；应用 睾丸由生精小管和间质构成，1～4条生精小管（seminiferous tubule）高度盘曲于睾丸小叶中。管壁上皮为特殊的生精上皮，是精子发生的场所，主要由支持细胞（Sertoli cell）、生精细胞（spermatogenic cell）组成。小管上皮基膜外有胶原纤维和管周肌样细胞（peritubularmyoid，PTM）。睾丸间质是含有大量的血管及淋巴管的疏松结缔组织，其中含有大量的间质细胞（Leydig cell），其主要功能为合成和分泌雄激素。本次研究将分别探讨生精细胞、支持细胞、管周肌样细胞、间质细胞的的生物学特征及其研究进展。 1 睾丸细胞生物学特点 1.1生精细胞精子发生既是一个复杂的生物形态与遗传变化过程，又是一个复杂、特异的细胞分化过程，是生命周期循环的重要环节之一，其中生精细胞生物学变化起到关键作用。人的精子发生需要（64±4.5）d，需要经过精原细胞增殖分化、精母细胞减速分裂、形成精子三个阶段。 精原细胞位于生精小管基底室，基膜与之相接触。其分化起始于胚胎时期的原始生殖细胞，分化形成生殖母细胞并逐渐迁移至生精上皮基膜，经过细胞分裂分化成为以精原干细胞（SSCs）为主的精原细胞，SSCs可自我更新，又能定向分化成精母细胞。大鼠的精原细胞可分为A型、中间型、B型精原细胞，Huckins提出将大鼠的精原细胞分为三部分，即贮备型精原干细胞（As），更新或增值型精原细胞（Apr-Aal）和分化型精原细胞（A1～A4-In-B）[1]，前两者也可以称之为未分化型精原细胞。As一般情况下处于休止状态，只有在其他类型的精原细胞耗尽的情况下才会进行分裂。单个的精原细胞As分裂形成成对Apr精原细胞，Apr精原细胞再分裂分化成4、8、16个链状精原细胞（Aal），Aal再分裂形成分化型A型精原细胞（A1～A4）四个亚型及中间型（In）、B型精原细胞。初级精母细胞内细胞器增多，有发达的高尔基复合体，在组织切片中可观察到大量处于各阶段的初级精母细胞，分裂完成后次级精母细胞便很快开始第二次减数分裂，因次级精母细胞存在时间短，故在组织切片中不易看到，此时次级精母细胞不进行染色体复制，形成单倍体圆形精子细胞，最终形态改变形成精子。 1.2支持细胞支持细胞（Sertoli cell）是维持生殖上皮稳定性与维持睾丸功能的关键细胞，是一种滋养型细胞，位于基部紧贴基膜，顶部伸向腔面，侧面和管腔面有很多不规则的凹陷，其内镶嵌着各级生精细胞。支持细胞之间的连接复合体将生精上皮分为了基底室和近腔室，基底室有精原细胞和细线前期精母细胞，近腔室有精母细胞、精子细胞和精子[1]，为精子发生内环境的稳定提供了保障，支持细胞和精子细胞之间存在缝隙连接，此连接就像锚一样在精子细胞镶嵌在支持细胞上发挥作用[2]。 支持细胞可分泌生长因子（如TGFα、TGFβ、IGF-1、IL-1）、转运蛋白（如雄激素结合蛋白、转铁蛋白、铜蓝蛋白）、类固醇等物质，为精子细胞提供营养物质，同时还起到包裹生殖细胞质突起和释放管腔作用。支持细胞分泌的生长因子可支持精原细胞的增殖分化[3]。支持细胞具有免疫豁免作用[1]，还可以通过自分泌与旁分泌作用调节睾丸间质细胞的功能。
小鼠睾丸细胞染色体标本的制备及观察
姓名系年级组别同组者 科目细胞生物学实验题目小鼠睾丸细胞染色体标本的制备及观察学号 小鼠睾丸细胞染色体标本的制备及观察 一．实验目的 1．了解快速制备动物染色体标本的方法，掌握小鼠睾丸细胞染色体标本的制备方法。 2．观察小鼠睾丸染色体的数目及其形态特征。 3．掌握小鼠睾丸染色体标本制备基本过程，了解操作步骤的原理。 二．实验原理 （一）染色体 染色体是基因的载体。真核细胞染色体的数目和结构是重要的遗传指标之一。制备染色体标本无疑是细胞学最基本的技术之一，优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。 染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。本实验采用的方法是从小鼠的睾丸细胞中获取。 染色体的形态结构在细胞增殖周期中是不断地运动变化的，一般在有丝分裂中期，染色体的形态最典型、最易辨认和区分。因此，制备染色体标本获取的是中期细胞。 染色体特征： 1.数目（2n=？） 2.长度（绝对长度、相对长度） 3.着丝粒位置（M/SM/ST/T） 4.随体与次溢痕的数目、大小和位置 5.带型分析 （二）操作方法 小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织（由于分裂活动旺盛，睾丸也可以）。利用睾丸细胞的制片技术虽然需要离心以及细致的操作，但其基本程序是简便的。在小鼠睾丸中，细胞有丝分裂和减数分裂比较旺盛，因此不需要体外培养就可以直接得到分裂中期细胞。通过小鼠睾丸得到染色体比较简便，一般不需要无菌操作。用秋水仙素作为有丝分裂的抑制剂。 由于小鼠睾丸细胞分裂活动旺盛，具有高度的分裂能力，本实验采用这一材料，通过前处理、低渗、固定、制片、染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。 减数分裂是细胞分裂染色体数目减半时发生在性细胞的形成过程中。哺乳动物在性成熟以后，精巢内的性细胞总是在分批分期不断的成熟，因此，对哺乳动物的精巢进行一定的技术处理，随时都可以获得减数分裂过程中各个时期染色体的标本。 用适量的秋水仙素溶液注入动物腹腔内，可以阻止分裂细胞纺锤丝的形成，
睾丸肿瘤诊疗指南
睾丸肿瘤诊疗指南目录 1.背景 1.1.方法 1.2.出版史 1.3.热点问题的潜在争议 2.病理学分类 3.诊断 3.1 临床体检 3.2 睾丸影像学检查 3.3 血清肿瘤诊断标记物 3.4 腹股沟探查和睾丸切除 3.5 保留脏器手术 3.6 睾丸病理检查 3.7 睾丸上皮瘤的诊断与治疗 3.8 肿瘤筛查 4．肿瘤分期 4.1 诊断工具 4.2 血清肿瘤标记物：睾丸切除术后半衰期动力学4.3 腹膜后、纵膈及锁骨上淋巴结和内脏 4.4 分期和预后分类 4.5 预后危险因素 4.6 对生育能力及生育相关问题的影响 5. 睾丸肿瘤诊断和分期指南 6. 治疗：原发生殖细胞肿瘤 6.1 原发精原细胞瘤 6.1.1 监控 6.1.2 辅助化疗 6.1.3 辅助放疗 6.1.4 腹膜后淋巴清扫（RPLND）
6.1.5 治疗相关风险 6.2 原发性精原细胞瘤治疗原则 6.3 原发性非精原细胞瘤的生殖细胞肿瘤（NSGCT） 6.3.1 监控 6.3.2 基本化疗 6.3.3 治疗相关风险 6.3.4 腹膜后淋巴清扫（RPLND） 6.4 持续增高的血清肿瘤标记物 6.5 原发性非精原细胞瘤的生殖细胞肿瘤治疗原则 7 治疗：转移性生殖细胞肿瘤 7.1 低危的转移性疾病（IIA/B期） 7.1.1 IIA/B期精原细胞瘤 7.1.2 IIA/B期非精原细胞瘤 7.2 晚期转移疾病 7.2.1 主要化疗 7.3 二次分期和治疗 7.3.1 二次分期 7.3.2 残留肿瘤切除 7.3.3. 手术质量 7.3.4 二次手术后辅助化疗 7.4 复发性或难治疗疾病的系统性补救治疗 7.4.1 迟发型复发(一线之后2年以上) 7.5 补救手术 7.6 脑转移的治疗 7.7 转移性生殖细胞肿瘤治疗原则 8 . 根治性治疗后肿瘤随访 8.1一般原则 8.2随访：I期非精原细胞瘤 8.2.1随访期间监测 8.2.2 保留神经的RPLND术后随访
小鼠睾丸支持细胞使用说明
小鼠睾丸支持细胞 小鼠睾丸支持细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠睾丸支持细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠睾丸支持细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠睾丸支持细胞产品简介： 产品名称：小鼠睾丸支持细胞 组织来源：小鼠睾丸 产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠睾丸支持细胞细胞简介： 睾丸支持细胞又称sertoli细胞。它是生精细胞的支架,为其提供必需的营养物质,能合成与分泌雄激素结合蛋白,为其提供高浓度的雄激素环境等,还具有构成血-睾屏障,形成睾丸内微环境,调节精子发生等功能。制备高活率的sertoli 不仅对sertoli的基础研究有重要价值,而且在精子发生等领域有重要意义。本研究旨在建立小鼠sertoli的快速高效分离方法,并根据其分泌FasL的特性,采用细胞免疫化学方法对分离的小鼠sertoli进行鉴定,以期为进一步研究和应用sertoli奠定基础。
小鼠睾丸细胞染色体的制备与观察
姓名 ### 班级 生命基地班 学号 201000140### 同组者：##### 科目 细胞生物学实验 题目 小鼠睾丸细胞染色体的制备与观察 组别 ### 小鼠睾丸细胞染色体的制备与观察 【实验目的】 1. 掌握染色体的制备方法； 2. 观察小鼠睾丸染色体的数目及其形态特征； 【实验原理】 A. 染色体 染色体是基因的载体。真核细 胞染色体的数目和结构是重要的 遗传指标之一。制备染色体标本无 疑是细胞学最基本的技术之一，优 良的染色体制片是进行染色体显 带、组型分析、原位杂交等的先决 条件。 染色体的制备在原则上可以 从所有发生有丝分裂的组织和细 胞悬浮液中得到。最常用的途径是 从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培 养的细胞中制备染色体。本实验采 用的方法是从小鼠的睾丸细胞中 获取。 染色体的形态结构在细胞增 殖周期中是不断地运动变化的，一般在有丝分裂中期，染色体的形态 最典型、最易辨认和区分。因此，制备染色体标本获取的是中期细胞。 染色体特征： 1. 数目（2n=？） 2. 长度（绝对长度、相对长度） 3. 着丝粒位置（M\SM\ST\T ） 4. 随体与次溢痕的数目、大小和位置 5. 带型分析 B. 操作方法 小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织（由于分裂活动旺盛，睾丸也可以）。利用睾丸细胞的制片技术虽然需要离心以及细致的操作，但其基本程序是简便的。在小鼠睾丸中，细胞有丝分裂 图1染色体形态类型
姓名 ### 班级生命基地班学号 201000140### 同组者：##### 科目细胞生物学实验题目小鼠睾丸细胞染色体的制备与观察组别 ### 和减数分裂比较旺盛，因此不需要体外培养就可以直接得到分裂中期细胞。通过小鼠睾丸得到染色体比较简便，一般不需要无菌操作。用秋水仙素作为有丝分裂的抑制剂。 由于小鼠睾丸细胞分裂活动旺盛，具有高度的分裂能力，本实验采用这一材料，通过前处理，低渗，固定，制片，染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。 减数分裂是细胞分裂染色体数目减半时发生在性细胞的形成过程中。哺乳动物在性成熟以后，精巢内的性细胞总是在分批分期不断的成熟，因此，对哺乳动物的精巢进行一定的技术处理，随时都可以获得减数分裂过程中各个时期染色体的标本。 用适量的秋水仙素溶液注入动物腹腔内，可以阻止分裂细胞纺锤丝的形成，从而积累大量处于分裂中期的细胞。利用上述原理，通过常规的制片方法，观察小鼠睾丸细胞的染色体。 C.Giemsa染色法 MGG由May-Grunwald染料和Giemsa染料组成。前者化学名为曙红亚甲基蓝Ⅱ，对胞质着色较好；后者对胞核着色较好。因此MGG染色，可兼两者的优点，常用于细胞涂片染色。 染色结果：染色将细胞核染成紫红色，细胞质和核仁染成蓝紫色。 其优点：染色方法简单，且兼有瑞氏、姬氏两种染色的优点，并且涂片可保存十多年而不退色。MGG 染色对胞质胞核染色效果均较好，结构清晰，所染细胞亦比HE染色的细胞大；同时对细菌、霉菌及胆固醇结晶的显示也很清楚。因此适用于淋巴造血系统的细胞标本、胸腹水、穿刺标本等。尤其对鉴别恶性淋巴瘤的类型，MGG染色更有帮助。 【实验用品】 1.材料：小白鼠。 2.试剂：秋水仙素、0.3%KCl溶液、甲醇、冰醋酸、吉姆萨原液。 3.器械：手术刀、手术剪、镊子、试管架、解剖盘、注射器、针头、吸管、离心管、离心机、玻片(冰片)、 天平、试镜纸、吸水纸、、烧杯、水浴锅。 【操作步骤】 预处理→取睾丸→剪碎→离心→低渗→离心→固定→离心→固定→滴片→染色→观察 1．预处理：取雄性小鼠按每克体重注射4ug，给小白鼠注射秋水仙素（抑制纺锤丝的形成，使染色体排列在赤道板上，便于观察，而不至于纺锤丝的牵引下移动向细胞两极），经14-16h后，断头法杀死小鼠，去除睾丸用生理盐水（0.9%的NaCl）洗去血污； 2．放入装有1ml 0.3%KCl液的小烧杯中剪碎（呈乳白色）； 3．用铜网过滤到刻度离心管中，再加0.3%KCl液至4ml； 4．37℃静置30min，进行低渗处理（不能使细胞因吸水而涨破）； 5．离心：800-1000r/min 离心8min（务必要控制在800-1000r/min，过大会使细胞涨破，导致实验失败，时间也要控制，过长也会影响观察）,弃上清液； 6．加入2ml甲醇冰醋酸固定液（3:1），并用吸管吹气，轻轻打散细胞，固定8min；