关于微生物育种中化学诱变技术的综述

关于微生物育种中化学诱变技术的综述

姓名：周旭班级;11生工1 学号：20110801120 摘要：化学诱变是一种传统而经典的微生物育种技术，不仅在高产工业菌株选育中得到广泛应用，而且近来还用于改造野生菌株代谢功能，以发现新产活性产物。本文简要综述常用化学诱变剂及其作用机制，以及化学诱变技术在微生物育种领域中的新近应用研究进展。

关键词：微生物育种；化学诱变剂；诱变机制；应用

1前言

菌种优劣对于微生物药物的工业化生产具有决定性意义。野生菌株往往因产率低而不能直接用于工业生产，而需要通过菌种改良，选育高产优良菌株。微生物药物的工业化生产对菌株的这种需求带动了各种育种技术的蓬勃发展，而育种技术则通过不断提供优良菌株又促进了微生物药物产业的持续发展。

在育种研究中，近来还发现有些突变株可代谢产生新产物，具有可供作药源新菌株资源的潜在应用前景，使育种技术进一步拓展了新的应用研究发展空间。微生物人工诱变育种技术按诱导突变类型可分为物理诱变、化学诱变和生物诱变三大类［1］。化学诱变是一种传统而经典的微生物育种技术，不仅在高产工业菌株选育中得到广泛应用，而且还用于改造野生菌株的代谢功能，从而发现新产活性产物。在实际应用中，化学诱变既有利用某一种化学诱变剂的单一诱变，也有组合利用化学或其他多种诱变剂的复合诱变，还有化学诱变联合抗生素抗性筛选等。本文简要综述常用化学诱变剂及其作用机制，以及化学诱变技术在微生物育种领域中的新近应用研究进展。

2常用化学诱变剂

2.1碱基类似物作为化学诱变剂的碱基类似物主要有嘧啶类似物和嘌呤类似物两大类。其中，常用嘧啶类似物有5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、6-氮杂尿嘧啶（6-NU）等；嘌呤类似物有2-氨基嘌呤（2-AP）、6-巯基嘌呤（6-MP）、8-氮鸟嘌呤（8-NG）等［2］。

2.2烷化剂

烷化剂类化学诱变剂种类较多，如硫芥（氮芥）类、环氧衍生物类、乙撑亚胺类、硫酸（磺酸）酯类、重氮烷类、亚硝基类等。其中，亚硝基乙基脲、亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸甲酯、甲基磺酸乙酯等较为常用。

2.3移码诱变剂

移码诱变剂系指能够引起DNA分子中组成遗传密码的碱基发生移位复制，致使遗传密码发生相应碱基位移重组的一类化学诱变物质，主要为吖啶类杂环化合物，常用的有吖啶橙和原黄素两种（图1）。

图1吖啶橙和原黄素的结构

2.4其他类诱变剂（或协同诱变剂）

其他类较常用的还有亚硝酸及其盐和部分金属化合物。

3化学诱变剂致基因突变作用机制

3.1替代DNA中的正常碱基

碱基类似物具有与正常碱基相同的分子骨架结构，可替代正常碱基掺入到DNA分子中，通过DNA复制过程造成碱基错配而发生突变，从而影响遗传特性。

3.2化学修饰DNA中碱基从而影响遗传特性

3.2.1烷基化

烷化剂类诱变剂主要通过对DNA分子中碱基的烷基化修饰，破坏正常生物学功能，从而影响遗传特性。这类诱变剂往往具有活泼的烷基化基团，与水反应先形成碳正离子，继而攻击DNA碱基中电荷密度高的亲核部位，导致相应部位的烷基化。烷化剂类一般先攻击鸟嘌呤的N-7位，其次鸟嘌呤的N-3位和腺嘌呤的N-3位［2］。

3.2.2氧化

有些有氧化活性的诱变剂通过对DNA中碱基的氧化损伤发挥致突变作用。譬如，亚硝酸可氧化腺嘌呤，使腺嘌呤经脱氨基氧化后变成次黄嘌呤（图2）。通常在DNA中腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）配对、鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）配对，而次黄嘌呤则在DNA复制中替代G与C配对（图2），并通过以后的复制过程使DNA中原来的AT配对转换成GC配对。

图2腺嘌呤氧化与DNA复制中的碱基配对变化

3.3移码突变的可能机制［4］

移码突变倾向于发生在重复碱基区域（如CCCCC等）。根据相关机制解释模型［4］，在DNA复制过程中局部碱基配对发生在这类重复碱基区域里的复制计数器以外处。重复碱基部位间发生滑移（slippage），将造成留置在双螺旋外未配对而凸起的单个或几个碱基。如果这种突起在DNA复制过程中发生在被复制中的模板链上，凸起部分在复制链中将被删除。相反，如果凸起发生在复制初始链上，将会导致复制链中插入额外碱基。嵌入型移码诱变剂可增强DNA链间滑移的可能性，同时可稳定所形成的凸起。该模型还被扩展至原黄素及其类似物诱导噬菌体T4突变的特例，机理涉及T4拓扑酶Ⅱ的DNA破损活性。虽然这可解释原黄素个别实验中所见到的突变特征，但应当注意并非所有嵌入型突变剂都与拓扑酶Ⅱ相互作用。

3.4金属离子致突变的可能机制

在有关类鼻疽伯克霍尔德菌的铁离子摄取调节基因fur相关研究中，有文献报道通过金属锰诱变成功筛选获得了Mn2+抗性fur基因突变株［5］。他们认为，Mn2+诱变的分子机制并不清楚，但研究结果提示，Mn2+刺激细胞使胞内蓄积过量的铁离子，而当细胞发生fur 基因突变时会失去严密调控fur-依赖性铁摄取系统的能力，导致产生不蓄积毒性水平铁离子的fur基因突变体；还有另一种可能是fur基因对Mn2+致突变作用高度敏感所致。经文献调查和分析研究，我们认为Mn2+有可能作用于fur相关级联基因调控系统的某些环节，不能完全排除通过对fur调控因子的影响导致fur突变的可能性，但尚未见到直接证实Mn2+致突变作用的实验证据。鉴于文献［5］中记载的所有获取Mn2+抗性fur基因突变株的实验均与自发突变抗生素抗性筛选一致，我们更倾向于所获取fur突变株的基因突变有可能是由自发突变所产生的，高浓度二氯化锰只不过是选择性筛选条件，使获得Mn2+抗性的突变株生长而非抗性突变株不能生长。考虑到Mn2+是否具有真的致突变作用尚需实验证实，我们认为文献所称锰诱变实际上称作Mn2+抗性筛选可能更为贴切。

4化学诱变技术在菌株选育中的应用

4.1单一诱变

单一诱变是指在菌株选育中用一种诱变因子致突变的育种实验方法，在化学诱变育种研究中，当仅用一种诱变剂就能达到所需选育目的时，不失为最简便快捷的育种方法。

碱基类似物诱变剂是在1959年佛里兹提出基因突变的碱基置换理论以后发展起来的。近年单用碱基类似物的诱变育种研究并不多见，文献报道多为组合应用其他诱变剂的复合诱变研究。但程世清［3］采用5-BU单一诱变剂，以1株产类胡萝卜素的分支杆菌为原始菌，分别对菌体及其原生质体进行了单一诱变育种研究。鉴于色素产生与所培养生产菌的细胞量正相关，以单位体积液体培养液中固形物的量（简称生物量）为指标，初步测评了原始菌及其突变株的产色素能力，结果表明，无论从菌体还是从原生质体均得到了产色素能力获得提高的突变株，菌体突变株和原生质体突变株的生物量与原始菌株相比分别平均提高了22.5%和16.4%。

自1944年奥尔巴克发现氮芥子气的诱变效应以来，烷化剂类诱变剂越来越广泛应用于微生物育种领域。无论是气态的重氮烷还是液态的硫酸二乙酯或固态的亚硝基胍，都能产生较理想的诱变效果，但近年应用较多的是硫酸二乙酯和亚硝基胍。

基于F.H.C.克里光等1961年提出的移码突变理论，吖啶及其衍生物类凭借对DNA遗传密码的移码功能迅即成为移码诱变剂的研究热点。吖啶及其衍生物类可插入到DNA分子中，通过复制过程导致遗传密码中碱基移位重组，最终改变突变株的遗传特性［4］。顾真荣等［10］利用移码诱变剂吖啶橙，通过诱变枯草芽孢杆菌G3，不仅使突变株培养物的抗真菌活性获得提高，而且还使突变株生物合成伊枯草菌素A的能力得到增强。

亚硝酸（盐）作为一种最早被发现的其他类诱变剂在提高产能以及改善微生物有用性能方面有明显作用。当用亚硝酸单一诱变处理氧化铁硫杆菌时，不但菌株氧化活性提高了41.3%，而且对黄铜矿的浸出率提高了13.3%，还使达到浸出终点时间也同时缩短了5～10d ［11］。在L-组氨酸高产菌株选育研究中，原始菌仅经1轮亚硝酸钠单一诱变，就使突变株的产能比原始菌提高了5.08%［5］。金属化合物本身通常被认为并无明显诱变作用［2］，但在铁离子摄取调节基因fur有关研究中，曾有报道记载，利用二氯化锰，通过锰诱变成功获得了Mn2+抗性fur基因突变株［11］。本文认为该文所称锰诱变实际上称作二氯化锰抗性筛选可能更为贴切。

4.2复合诱变

微生物突变机制复杂，单一诱变往往难以达到预期目的。因此，诱变育种往往采用组合2种或者2种以上化学或其他诱变剂的育种方法，即复合诱变法。这种方法可一定程度上克服诱变的盲目性，提高正向诱变效果，因此越来越趋于被大多育种研究所采纳。

4.2.1碱基类似物组合其他诱变剂

4.2.2烷化剂组合其他诱变剂

其中亚硝基胍组合其他诱变剂的复合诱变研究为常见。

4.2.3移码诱变剂组合物理诱变

4.2.4其他类诱变剂（或协同诱变剂）组合物理诱变

在微生物法重金属废水处理中，选育对重金属具有高度抗性和高效去除作用的优良菌株至关重要。

氯化锂本身并无直接致突变作用［2，7］，但当与其他诱变剂联用时，往往会产生很好的协同诱导突变作用。氯化锂在育种研究中通常多与紫外联用。紫杉醇产生菌NCEU-1［7］源自东北红豆杉的1株内生真菌，是通过紫外、甲基磺酸乙酯、钴60、亚硝基胍等一系列诱变筛选得到的突变衍生株，产能已达314.07μg·L－1。

4.3化学诱变联合抗生素抗性筛选

提高抗生素产生菌对自产抗生素的抗性，是选育抗生素高产菌株的一个重要环节，在人工诱变育种研究中往往结合自产抗生素抗性筛选来实现，如用于上述土曲霉酸高产菌株育种

研究［6］。在紫杉醇产生菌育种研究中，虽然相关机制尚未阐明，但经过紫外-氯化锂复合诱变结合制霉菌素抗性筛选，发现所获突变株的紫杉醇产能与其对制霉菌素的抗性强弱呈正相关［7］。

近来研究表明，微生物对作用于核糖体的抗生素所产生的某些抗性突变会直接影响其次级代谢功能，从而改变产物水平和代谢能力，致使突变株的产能获得大幅提高［6，7］，或者赋予突变株新生次级产物的代谢生产能力［7～9］，相关抗生素抗性筛选技术被广泛应用于微生物菌株选育中［7］。化学诱变结合抗生素抗性筛选，既可用于提高产能，又可用于改造无活性菌株的代谢功能，从而寻找发现新产活性产物。

5 结语

在微生物育种研究领域，随着相关基础学科的研究发展，利用基因工程、代谢工程等现代生物技术，合理改造代谢途径，构建优良菌株的研究受到关注，成为育种领域一个研究热点和微生物药物工业育种发展的一个重要方向。然而，实施生物技术改造，首先，需要对其遗传背景和次级代谢途径非常清楚，但大多育种研究中这些情况并不都很清楚，其次，由于微生物次级代谢调控系统的复杂性，生物工程对某些单一环节的改造往往还会导致细胞整体水平的负反馈调控。因此，目前通过生物技术改造获取的优良菌株用于工业生产的实例还极少，实际应用的绝大多数工业菌株仍然是通过传统育种技术选育得到的。

化学诱变作为一种经典而传统的育种技术，在育种研究领域仍然具有重要作用和地位，不仅在优良高产工业菌株选育中一直得到广泛应用，近年来还在拓展药源微生物菌株资源相关领域展露出新的应用研究发展空间。化学诱变与其他传统诱变育种方法一样，具有盲目性和随机性等不足，但也有无需知晓遗传背景和代谢途径、操作简便、不需要价格昂贵的现代高档仪器设备等显著优势。针对传统诱变的这些不足，只要组合使用相关筛选技术，从而能够实现快速筛选目标菌株，化学诱变技术仍可通过优化诱变筛选实验操作程序，在微生物育种研究中进一步发挥不可替代的重要作用。迄今化学诱变育种研究多采用组合2种或2种以上化学或物理诱变因子的复合诱变方法。在实际实验操作中，有用不同种类的单一诱变剂交替进行2轮或多轮诱变的，也有用2种诱变剂同时作用或依次作用诱变的，还有化学诱变结合抗生素抗性的筛选等多种方式。但为了筛选获取目的菌株，无论何种诱变方式都要配合进行含量测定或相关活性筛选等工作。因此，在化学诱变育种研究中，如何改进或组合使用适合的相关筛选技术，从而实现快速高效获取目的菌株，值得进一步探讨。这在拓展药源微生物新菌株资源相关研究中显得尤为重要，相信在今后研究中会逐步得到解决。

参考文献

［1］贾啸静.微生物药物产生菌诱变育种方法的应用和进展

［J］.河北省科学院学报，2006，23（1）：65－69.

［2］章名春.工业微生物诱变育种［M］.北京：科学出版社，1984.7.

［3］程世清.产色素菌T17-2-39的诱变育种实验［J］.江苏食品与发酵，2000，（2）：9－12.

[4]FergusonLR,DennyWA.Genotoxicityofnon-covalentinterac-tions:DNAintercalators

［J］.MutatRes，2007，623（1/2）：14－23.

［5］LoprasertS，SallabhanR,WhangsukW,etal.Characterization And mutagenes is of furgene from Burkholderiap seudomallei［J］.Gene，2000，254（1/2）：129－137.

［6］OchiK OkamotoS，TozawaY，etal.Ribosome engineering and secondary metaboliteproduction ［J］.AdvApplMicrobiol，2004，56：155－184.

［7］孙玉雯，崔承彬.抗生素抗性筛选在微生物菌株选育中的作用［J］.国际药学研究杂志，2008，35（3）：213－217.

［8］于志彬，崔承彬，朱天骄，等.用核糖体工程技术开拓海洋微生物药用资源的研究［J］.高技术通讯，2005，15（5）：87－90.

［9］于志彬，朱天骄，崔承彬，等.用核糖体工程技术二次开发海洋微生物菌株资源的研究［J］.高技术通讯，2006，16（11）：1190－1194.

［10］顾真荣，陈伟，程洪斌，等.吖啶橙诱变提高枯草芽孢杆菌G3抗真菌活性［J］.植物病理学报，2008，38（2）：185－191.

［11］徐晓军，宫磊，赵丙辰，等.氧化铁硫杆菌的亚硝酸化学诱变及对黄铜矿的生物浸出［J］.有色金属（选矿部分），2004，（6）：20－24.

微生物的诱变育种

微生物的诱变育种 作者：佚名来源：生物秀时间：2008-4-18 实验仪器大全实验试剂大全 一、实验目的和内容 目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。 内容：1．对米曲霉(Aspergills oryzae )出发菌株进行处理，制备孢子悬液。 2．用紫外线进行诱变处理。 3．用平板透明圈法进行两次初筛。 4．用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。 二、实验材料和用具 米曲霉斜面菌种； 豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白； 三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。 三、操作步骤 (一)出发菌株的选择及菌悬液制备 1．出发菌株的选择可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。2. 菌悬液制备取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中，30℃培养3～5d 活化。然后孢子洗至装有1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜)，30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成把子悬液，调其浓度为106～108 个/mL，冷冻保藏备用。 (二)诱变处理 用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。 1．紫外线处理打开紫外灯(30W)预热20min。取5mL 菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5 份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射l min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h 然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。 2．稀释菌悬液按10 倍稀释至10-6，从10-5和10-6中各取出0.lmL 加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3 个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2～3d。 (三)优良菌株的筛选 1. 初筛首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落40～50 个，作为复筛菌株。 2．平板复筛分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心划线至周边分成8 等份，1～7 份中点种初筛菌株，第8 份点种原始菌株，作为对照。培养48h 后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，进大摇瓶复筛阶段。3．摇瓶复筛将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养基中进行培养，其方法是，称取麦秩85g，

诱变育种技术

诱变育种技术 诱变育种是利用物理、化学因子，促使育种的原始材料的遗传性发生变异，从而选出优良品种的一种育种方法。它包括物理的辐射诱变和化学诱变两种。 辐射诱变是指利用γ-射线、X-射线、β-射线、中子、无线电微波、激光、紫外线等物理因子，照射植物的种子、植株和其他器官，使它们的遗传物质发生变化，产生各种各样的变异，通常称为突变，然后选择符合人们需要的植株进行培育，从而获得新品种。化学诱变则是利用一些化学药品，来浸泡和处理植物的种子或其他器官，促使突变的发生，从而选育出新的品种。 诱变育种是相对于利用自然突变选种(穗选、株选)而言的，植物在自然条件下生长发育，由于受到各种自然条件的作用，它们的遗传物质也会发生变异。但由于自然条件下的各种引起变异的因子的强度较缓和，自然突变的频率较低，发生的变异数往往满足不了育种选择的需要，所以现代育种中往往采取较强的诱变强度，让突变的发生数大大增加，从而加快育种进程。 诱变育种的优点在于： 能大幅度提高植物的变异牢，扩大变异范围：自然突变率一般在十万分之几到百万分之几，而诱变处理后的突变频率可高达 1/30左右，比自然突变高1000～10000倍，同时引起的变异类型多、范围广。如印度用γ-射线处理蓖麻，获得了生育期由270天缩短到120天的特大变异株系。

能改良品种的第一性状，而保持其他优良性状不变：对于一个具有多种优良性状而只希望改进某一两个性状的品种，采用诱变育种最为有效，它较之利用杂交育种方法相比，容易收到满意的效果。如通过辐射，把燕麦的抗锈病特性和对叶枯病易感性分离开来，培育出了抗锈病又不易感染叶枯病的新品种。 引起的变异稳定快，育种年限短;诱变处理后的子代分离少、稳定快，一般在第三代就可稳定，而杂交育种的某个性状的稳定往往要在第五到第七代。对于一年只能生长一季的农作物来说，意味着缩短育种时间2～4年。 能改变作物的育性，有利于杂种优势的发挥：在常规的杂交育种中，往往要用较多的时间和人力去除掉母本的雄蕊，避免自交现象的发生。用诱变处理母本的种子，可以选育出雄性不育的植株，形成雄性不育系，供杂交育种时使用。由于杂交后的第一代往往表现出杂种优势，发挥了父、母本的各自的优良品质，用它们的子一代作种子来生产，其产量及其他性状往往很好。所以我国现在大面积推广的杂交水稻、杂交玉米、杂交小麦，都取得了明显的经济效益和社会效益，为解决我国广大农民的温饱问题作出了巨大贡献。 诱变育种的中心是利用各种诱变剂提高作物的突变率。但是诱变剂的剂量是一个首先要注意的问题，并非剂量越大越好，要明白诱变剂的处理是建立在对原有细胞中的遗传物质的损伤基础上来加大突变率的，它们的处理对细胞是有伤害的。选择一定的诱变剂量很重要，诱变育种中有相应的三个名词或俗语，那就是“致死剂量”、

关于微生物育种中化学诱变技术的综述

关于微生物育种中化学诱变技术的综述 姓名：周旭班级;11生工1 学号：20110801120 摘要：化学诱变是一种传统而经典的微生物育种技术，不仅在高产工业菌株选育中得到广泛应用，而且近来还用于改造野生菌株代谢功能，以发现新产活性产物。本文简要综述常用化学诱变剂及其作用机制，以及化学诱变技术在微生物育种领域中的新近应用研究进展。 关键词：微生物育种；化学诱变剂；诱变机制；应用 1前言 菌种优劣对于微生物药物的工业化生产具有决定性意义。野生菌株往往因产率低而不能直接用于工业生产，而需要通过菌种改良，选育高产优良菌株。微生物药物的工业化生产对菌株的这种需求带动了各种育种技术的蓬勃发展，而育种技术则通过不断提供优良菌株又促进了微生物药物产业的持续发展。 在育种研究中，近来还发现有些突变株可代谢产生新产物，具有可供作药源新菌株资源的潜在应用前景，使育种技术进一步拓展了新的应用研究发展空间。微生物人工诱变育种技术按诱导突变类型可分为物理诱变、化学诱变和生物诱变三大类［1］。化学诱变是一种传统而经典的微生物育种技术，不仅在高产工业菌株选育中得到广泛应用，而且还用于改造野生菌株的代谢功能，从而发现新产活性产物。在实际应用中，化学诱变既有利用某一种化学诱变剂的单一诱变，也有组合利用化学或其他多种诱变剂的复合诱变，还有化学诱变联合抗生素抗性筛选等。本文简要综述常用化学诱变剂及其作用机制，以及化学诱变技术在微生物育种领域中的新近应用研究进展。 2常用化学诱变剂 2.1碱基类似物作为化学诱变剂的碱基类似物主要有嘧啶类似物和嘌呤类似物两大类。其中，常用嘧啶类似物有5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、6-氮杂尿嘧啶（6-NU）等；嘌呤类似物有2-氨基嘌呤（2-AP）、6-巯基嘌呤（6-MP）、8-氮鸟嘌呤（8-NG）等［2］。 2.2烷化剂 烷化剂类化学诱变剂种类较多，如硫芥（氮芥）类、环氧衍生物类、乙撑亚胺类、硫酸（磺酸）酯类、重氮烷类、亚硝基类等。其中，亚硝基乙基脲、亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸甲酯、甲基磺酸乙酯等较为常用。 2.3移码诱变剂 移码诱变剂系指能够引起DNA分子中组成遗传密码的碱基发生移位复制，致使遗传密码发生相应碱基位移重组的一类化学诱变物质，主要为吖啶类杂环化合物，常用的有吖啶橙和原黄素两种（图1）。

微生物领域中的物理诱变

南开大学 物理诱变方法及其在微生物诱变育种中的 应用 物理科学学院1110293尚彤彤 2012/12/8 摘要：综述了紫外线、空间诱变、离子注入、激光四种物理诱变方法的原理与应用

物理诱变方法及其在微生物诱变育种中的应用 物理科学学院1110293 尚彤彤 目前，随着人口的增多和资源的匮乏，开发新能源或者提高资源利用率和回收率等成为人们研究的重点。微生物在解决人类的粮食、能源、健康、资源和环境保护等问题中发挥着越来越重要且不可替代的独特作用，也为人类带来了巨大的社会效益和经济效益。但微生物菌种的自然突变率很低，单纯依赖自然突变选育好的菌株远不能满足人们的需求，为了获得高产、低耗、优质的菌种，人们常常通过外界物理、化学、生物因子等因素的改变诱发基因突变。常用的诱变方法包括物理诱变和化学诱变。 传统的物理诱变是利用各种射线（包括紫外线、X射线、γ射线、快中子、微波、超声波、电磁波和宇宙射线等）为诱变源，对生物靶进行诱变。近年来，又兴起一些新型高效的诱变方法，如空间诱变、离子注入诱变、激光诱变等，他们操作简单、安全，而且具有突变谱宽和在一定程度上能克服菌种对传统诱源的抗性饱和等优点。 下面介绍一些物理诱变原理及其应用。 1、紫外线诱变 原理： DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸收能力，最大的吸收峰在260nm。紫外线可使DNA分子形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对，引起突变或死亡。 嘧啶二聚体的形成还会妨碍DNA双链的解开，影响其复制和转录。 应用： 在食品方面，它是最常用的技术，因为它操作简单且效果明显。比如以谷氨酸棒杆菌FC22为出发菌株，经过紫外线诱变（15W紫外灯，照射距离30cm， 时间为20s），定向选育出具有磺胺胍抗性的突变株，其L-色氨酸产量比原菌株 产量提高了110%；对产曲酸的米曲霉菌株、抗噬菌体保加利亚杆菌、浓香型枸 杞久酿造酵母等进行紫外线诱变选育均取得了较理想的成果。同时很多研究者将紫外诱变结合其他诱变方式配合使用，更是产生了突出的效果。比如将紫外线与 硫酸二乙酯结合使进行复合诱变，筛选到了巨大芽孢杆菌突变株8B，其α－淀 粉酶和蛋白酶活性性较出发菌株分别提高96.4%和126.58%，突变株经5次传代后，性能保持稳定。邹建忠交叉采用紫外线照射和光复法对酒精酵母进行诱变， 获得1株耐高温型酒精酵母 UT，在40℃下，其产酒率比出发菌提高了11.1%， 1 且对温度、酸度和盐度变化的耐受力也更好。 环境工程方面，随着工农业的发展，化肥和化工品的大量使用，有机废物的排放量不断增大，难降解的有毒有机物的排放量不断增多，高耐毒性、高降解活性以及特异或光谱降解污染物的特殊细菌用于处理特殊污水，并且起到很好的效果。近年来有一种新的理论认为活性污泥是一个微生物的生态群体，这些微生物存在着紫外线敏感性差异，适当的紫外线辐射会改变活性污泥的微生物组成结构。紫外线增强活性污泥的生化降解能力，实际上是利用紫外线抑制活性污泥中的非目标菌群的生长，消除目标菌群在污水中的营养物质竞争对手，优化目标菌群的生长环境，最终达到所需要的增强效果。 2、空间诱变育种

菌种诱变方法

微生物诱变育种的方法 摘要:介绍了几种常用的物理诱变和化学诱变育种方法的原理、特点以及成功案例等,为微生物诱变育种提供了一个总体的方法框架。 关键词:诱变; 微生物育种 微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切，其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏，甚至影响人们的日常生活质量，所以选育优质、高产的微生物菌株十分重要。微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，人为地使某些代谢产物过量积累，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。作为育种途径之一的诱变育种一直被广泛应用。目前，国内微生物育种界主要采用的仍是常规的物理及化学因子等诱变方法。 1 物理诱变 1.1紫外照射 紫外线照射是常用的物理诱变方法之一，是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰260nm，因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂。紫外辐射的作用已有多种解释，但比较确定的作用是使DNA分子形成嘧啶二聚体[1]。二聚体的形成会阻碍碱基间正常配对，所以可能导致突变甚至死亡[2]。 马晓燕[3]等以紫外诱变原生质选育法筛选发酵乳清高产酒精菌株马克斯克 鲁维酵母菌株ZR-20，比优化前的酒精产率提高10.5%，较出发菌株提高了68%。顾蕾[4]等通过紫外诱变红酵母ns-1原生质体，获得类胡萝卜素产量明显提高的突变株，其生物量、色素产量分别为6.15g/L、6.41mg/L，分别比原始菌株提高了67.6%、54.1%。 紫外照射诱变操作简单，经济实惠，一般实验室条件都可以达到，且出现正突变的几率较高，酵母菌株的诱变大多采用这种方法。 1.2电离辐射 γ-射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一，具有很高的能量，能产生电离作用，可直接或间接地改变DNA结构。其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基，或者脱氧核糖的化学键和糖-磷酸相连接的化学键。其间接效应是能使

诱变育种

诱变育种 第一节诱变育种的概念、意义与特点 诱变育种就是人为地采用物理、化学的因素,诱发有机体产生遗传性的变异,并经过人工选择、鉴定、培育新品种的途径。诱变育种的目标就是改变或增加一个满意品种的某一特性,而在其她方面保持品种不变。如果需要一个适应性好、独特的、非常合意的与受欢迎的品种,这种方法特别吸引人。 诱变育种的特点:1)提高突变率,扩大变异谱;2)适于进行个别性状的改良;3)育种程序简单,年限短;4)变异的方向与性质不定(已有人把人工合成低聚核苷酸片段引入基因组中,以一定方式改变某一基因,进行定向诱变)。 作为一种育种方法,诱发突变技术在培育那些在种内有足够的遗传变异与由显性基因确定其特性的作物,就是可有可无的或无前途的。但就是,显性突变型曾被诱发,特别就是抗病型,部分由于寄生植物的基因与病原体的基因之间的相互作用。在完全不育或无性繁殖的植物中,诱变育种就是品种改良的唯一方法,例如专性无融合生殖植物,它不产生有合子胚的种子。无融合生殖在柑橘类与某些苹果属、树莓属的种中就是普通的。 诱变育种就是常规育种的一个补充或在园艺植物育种某些方面潜在替代者:1)在适应性广泛的种中诱发变异性,假若进一步的杂交提供有限的变异性与改良,而品种已接近选择的极限;2)诱发一个新的特性,如果没有通过杂交能传递的已知基因源,例如抗病性、企望的生长型或自交亲与性;3)在有性繁殖中将会消失的特定突变,通过营养繁殖产生与保存;4)打破与不良的特性或基因多效影响的连锁;5)使现存的嵌合体显露与均质化,并使突变型获得稳定;6)在远缘亲本之间杂交中遏制不亲与性;7)诱发单倍体;8)在无融合生殖植物中产生过渡性有性状态。 成功的诱变育种需要:1)处理可用于筛选的大的植物群体;2)预期的特性突变率高;3)可以用视力诊断或简单测定鉴别突变的有效方法。 第二节诱变因素 在诱发突变中,有两类诱变剂被使用:物理的与化学的。物理的诱变剂有:1)紫外灯发出的紫外线(UV)照射;2)电磁辐射:X射线发生器发出的X射线;从放射性同位素钴60或铯137发出的?射线;3)微粒辐射:从核反应堆发出的热中子或慢中子;从放射性同位素磷32或硫35发出的β粒子(电子)。化学诱变剂主要用于种子繁殖植物。较常用的有:叠氮化物、秋水仙碱、烷化剂、碱基类似物等。 1.物理的诱变因素 物理诱变因素的辐射能对植物诱发化学反应,结果造成DNA结构的变化。这些变化如果在DNA中保持重复,证明就是突变。 1、１紫外线的能量与穿透力低,能成功地用于处理花粉粒。 1、2电磁辐射与中子容易穿透植物组织。 1.3X射线:辐射源就是X光机。X射线又称阴极射线,就是一种电磁辐射,它不带电核,就是一种 中性射线。一大部分的栽培作物用物理诱变剂诱发的突变就是X射线辐射的结果。X射线的反应在有氧时会加强。 1.4?射线:辐射源就是60Co与137Cs及核反应堆。?射线也就是一种不带电荷的中性射线。应用 于植物育种的?射线照射装置有?照射室与?圃场,前者用于急性照射,后者用于慢性照射。1.5中子:辐射源为核反应堆、加速器或中子发生器。根据中子能量大小分为超快中子、快中 子、中能中子、慢中子、热中子。在生物研究中,通常用慢中子或热中子。热中子处理比用X射线照射更少受干扰因素的影响,如氧的浓度或温度。对多数作物来说,包括苹果,中子就是比X或?射线更有效的诱变剂。高密度中子主要造成氧独立的不可挽回的损害,包括染色体畸变。

工业微生物育种

转谷氨酰胺酶生产菌株的诱变选育方案 学生： 摘要：通过诱变育种选育转谷氨酰胺酶工业生产菌株，使目的菌株产酶量高、酶活高、到达最大产酶量的时间短，生长周期、最适产酶温度等条件尽可能地符合工厂要求。 关键字：筛选；工业菌株；诱变育种 前言： 工业微生物育种是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造, 去除不良性质, 增加有益新性状, 以提高产品的产量和质量的一种育种方法。工业微生物的育种技术已从常规的突变和筛选技术发展到基因诱变、基因重组和基因工程等, 育种技术的不断成熟, 大大提高了微生物的育种效果。 微生物发酵要想取得优良成绩, 有赖于优良菌种的利用。从工业发酵的观点来看发酵菌种的优异生产性能等于经选育的、符合经济要求的优良遗传背景加上经人为精心设计的、优化的发酵环境。菌种选育的最终目标, 就是通过人工干预, 使选出的优良菌种在优化环境中尽可能表现出优异性状。菌种分离、筛选、改良是贯彻微生物发酵始终的工作。 一．菌种选育的具体目标 (1) 提高产量。 (2) 提高产物的纯度。减少副产物; 提高有效组分;减少色素等杂质。 (3) 改变菌种性状。改善发酵过程, 包括: 改变和扩大菌种所利用的原料结构; 改善菌种生长速度; 提高斜面孢子化程度; 改善菌丝体形状, 采用菌球菌丝体发酵;少用消泡剂或使菌种耐合成消泡剂; 改善对氧的摄取条件, 降低需氧量及能耗; 耐不良环境: 抗噬菌体的侵染,耐高温、耐酸碱、耐自身所积累的代谢产物; 改善细胞透性, 提高产物的分泌能力等。 (4) 菌种的遗传性状。生产性状稳定。 (5) 改变生物合成途径。以获得新产品。 二．获取优良菌种的有效途径 广义上说, 菌种改良可描述为采用任何科学技术手段( 物理、化学、生物学、工程学方法以及它们的各种组合)处理微生物菌种, 从中分离得到能显示所要求表型的变异菌种。 菌种改良的基本途径: 突变和选择; 基因重组( 遗传重组) 和基因工程( 遗传工程) MTG 生产菌株的诱变育种 诱变的方式包括了各种物理射线、化学诱变剂以及生物方面的噬箘体等等。用得最多的是前两种，也有将几种方式混合使用的。国内的王璋教授还曾借助“神舟”4 号飞船搭载MTG 生产菌种在外太空进行诱变实验，取得不错的效果。

电离辐射和化学诱变剂在诱变育种中的机理解析

电离辐射和化学诱变剂在诱变育种中的机理解析 诱变育种的机理 问题的提出 最近在进行《育种在农业生产中的应用》教学，按照五种育种的难 点来看，我一直认为是单倍体育种，所以平时教学中重点就是解决 单倍体育种的原理、过程和优缺点。通过和学生的面对面交流抽 查，发现学生的掌握情况却是诱变育种最薄弱，这是我没有想到 的。这固然和学生的生活常识有一定的关系，如不知道具体的诱变 剂，最主要的可能是诱变育种的机理不够了解，影响了诱变育种的 理解、 问题：诱变育种的机理是什么？辐射射线或诱变剂如何导致基因突 变？ 01 辐射诱变是利用各类射线如X射线、γ射线、α射线、β射线、中子等照射生物。 自然空间中来源于宇宙空间或地球岩石等的射线剂量极低，对各类生物虽然有一定影响，但影响极少。但若加大剂量或长时间使生物暴露在各

类射线的照射条件下，很容易诱发染色体的断裂和结构变异。各类染色结构变异中易位发生频率最高。 射线有两种类型，一种是波长较短的电磁波射线（X射线γ射线），另一种是高能量基本粒子（如α粒子、β粒子和中子）。X射线、γ射线和中子穿透力强，常用作外照射，α和β射线穿透力弱，如α射线仅能穿透软组织1m m，常用于内照射。 射线的作用分急性和慢性两种，急性是指短时间大剂量的照射；慢性是指低剂量长时间照射，二者均可导致染色体结构改变。一次照射剂量过大容易导致生物死亡。 通过辐射诱变已获得多种染色体结构变异类型，X射线诱发果蝇的染色体结构变异是诱发变异的经经典例证。早在1927年，H.J.M u l l e r报道了在果蝇中用X射线诱发的易位及其他染色体结构变异。 电离辐射的主要机理： 已知构成D N A分子的原子是由数量相等的质子和电子组成的。质子全部在原子核内，其中一半与电子结合成中子，另一半保持独立。而电子除一半与原子核内的质子结合为中子外，另一半分层包围在原子核的外围。因此正常的原子呈中性。 导致D N A分子上的原子（基团）发生电离。高能电磁波或射线粒子直接轰击原子，使其外围电子脱离轨道，原子释放出高能电子成为带正电荷的离子，称为初级电离或原发电离。活跃的高能电子高速运动引起途径的其他原子电离，称为次级电离。电离释放的电子被邻近原子（基团）捕获后形成带负电基因。

工业微生物育种诱变剂

第一章工业微生物育种诱变剂 1物理诱变剂的总类：物理辐射分为电离辐射和非电离辐射。 包括紫外线、X射线、r射线。快中子。微波，超声波、电磁波、激光射线和宇宙线等。（X 射线、r射线属于电离辐射，紫外线属于非电离辐射） 2物理诱变剂对微生物的影响实质：由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程。 3辐射作用的时相阶段： 物理阶段——直接作用DNA或作用于水 物理化学阶段——激发和电离DNA分子或激发电离水分子 化学阶段——产生生物自由基 生物学阶段——分子发生变化，变异或死亡 4细菌中紫外线对DNA的影响：促使G:C A:T的转换； DNA链断裂，单链或双链；嘧啶或嘌呤被氧化脱去氨基；碱基分子结构中碳与碳之间的链断裂形成开环现象；辐射击中单个核苷酸后，使碱基或磷酸酯游离出来；交联作用 5辐射引起的生物学效应的影响因素：微生物的遗传背景；微生物的生理状态；可见光；细胞水分；温度；空气或氧气。 6紫外线的诱变机理及原因？ 机理：(1)DNA与蛋白质交联(2)胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用(3)DNA链断裂，形成嘧啶二聚体 原因：形成嘧啶二聚体 7DNA损伤修复中光修复与暗修复的主要机理？ 光修复：嘧啶二聚体被一种光激活酶结合形成复合物，这种复合物在可见光下由于光激活酶获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。 暗修复：嘧啶二聚体的5’端限制性内切酶和外切酶的作用下，造成单链断裂，接着在外切核酸酶的作用下，切除嘧啶二聚体。然后再DNA聚合酶Ⅰ、Ⅲ的作用下，并以另一条完整的单链做模板合成正确的碱基对序列，最后由连接酶完成双链结构。 8紫外线有效波长（诱变）范围是：200~300nm 9紫外线的剂量以什么计算？绝对剂量：erg/mm2；相对剂量：照射时间、杀菌率表示 10紫外线诱变的步骤方法（以及应用，包括如何计数、致死率的计算） 步骤：（1）出发菌株的选择将细菌斜面培养至对数期，霉菌或放线菌培养至孢子刚成熟（2）前培养培养基中可添加咖啡碱或异烟肼等抗修复物质。将菌体培养至最佳状态（对数期）。 （3）制备菌悬液离心去除培养基，用生理盐水制备菌悬液，要求菌体浓度108，107， 106 mL-1等 （4）紫外线照射紫外灯预热20min；避免光修复。 （5）后培养将照射完毕的菌悬液加入到适合于正突变体增殖的培养基中，在适宜温度下培养1.5-2h。 （6）稀释涂皿后培养结束后，从中取一定量培养物，经不同稀释，涂皿，并且以未经紫外线照射过的菌悬液做对照皿，培养后，挑取菌落，以待筛选。 11化学诱变剂的概念：一类能够对DNA起作用、引起遗传变异的化学物质。 12以5-BU为例，详述碱基类似物的诱变机理：（见书43页） 答：诱变作用是取代核酸分子中碱基的位置，再通过DNA的复制，引起突变，因此，也叫掺入诱变剂。 1）争产掺入错误复制

(整理)工业微生物育种复习资料.

第一章绪论 一、微生物遗传育种 对野生型菌株或低产菌株进行遗传操作和分离筛选，从大量突变体中筛选出性状优良的菌株，并对其发酵条件加以优化，得到适合发酵工业生产的优良菌种（产量、质量、新产物）。 二、微生物遗传育种的具体目标: 1、提高产量生产效率和生产效益总是排在一切商业发酵首位的目标 2、提高产物的纯度，减少副如色素；提高有效产物组分 3、改变菌种形状，改善发酵过程，如改变和扩大菌种的原料结构；改善菌种生长速率；提高斜面孢子化程度；降低需氧量和能耗；耐不良环境；耐目的产物；改变细胞透性，提高产物分泌 4、遗传性状特别是生产性状稳定 5、改变生物合成途径，获得新产物 三、优良发酵菌株应具备哪些特性 1、遗传稳定 2、易于培养：营养谱广、培养条件易达到 3、易于保存（如孢子丰富或产生休眠体） 4、种子生长旺盛 5、发酵周期短，产量高，产物单一 6、产物易于分离纯化 第二章微生物遗传学基础 一、名词解释： 基因：遗传信息的基本单位。一般指位于染色体上编码一个特定功能产物（如蛋白质或RNA分子等）的一段核苷酸序列。 转化：受体细胞直接吸收了来自供外源DNA片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。 转导：外源遗传物质通过噬菌体的携带进入受体细胞，并与受体染色体发生基因重

组 接合：供体菌通过性菌毛传递不同长度的单链DNA给受体菌，在后者细胞中发生交换、整合，从而使后者获得新的遗传性状的现象。 菌种衰退：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。 二、突变型的种类：形态突变型、生化突变型、条件致死突变型、致死突变型、抗性突变型。 三、试质粒的性质及其在基因工程中的应用 性质：自我复制、拷贝数高、不相容性、转移性。 第四章工业微生物诱变育种 一、物理诱变剂基本作用过程 物理过程：能量吸收和传递物理化学作用：分子激发 化学过程：DNA断裂、碱基异构、碱基化学共价交联、碱基脱氨基等 生物学过程：经过DNA修复、复制、细胞分裂、代谢，产生死亡、基因突变、染色体畸变、染色体倍性变化等，使细胞死亡或形成各种突变体 二、紫外线的诱变机制 1、造成NDA断裂、与蛋白质交联、形成胸腺嘧啶二聚体 2、形成胸腺嘧啶二聚体是UV 引起突变的主要原因。形成于单链相邻TT间、或双链间 3、单链上出现TT二聚体，复制可能在此停止，或超越这一点继续复制，使子代DNA形成缺口，碱基错误插入该缺口，造成突变 4、双链间出现TT二聚体造成复制无法进行 三、DNA中TT二聚体的修复方法 1、光复活：90％，可见光，在黑暗下TT与一种光激活酶结合成较稳定的复合物，但在可见光下这种酶吸收光能而解离，二聚体重新分解！！！紫外诱变时照射和分离均应在黑暗或红光下进行 1、切补修复：4种酶参与，识别、内切、外切、延伸、连接。紫外诱变照射后在冰

化学诱变(检测方法HYN)

第七章 本章主要内容 概述 化学毒物致突变的类型 化学诱变作用机制及后果 机体对致突变作用的影响 观察化学物致突变作用的基本方法 第五节观察化学物致突变作用的 基本方法 主要内容 ?观察项目的选择 - 效应终点类型 - 成套的观察项目 ?常用的致突变试验 - 细菌回复突变试验(Ames试验) - 微核试验(MNT) - 染色体畸变分析(CA) - SCE ……. ?致突变试验中的一些问题 - 对照, 体外活化系统, 与致癌的关系, 评价 化学诱变剂的检测 ?遗传毒理学试验的目的：致突变性的鉴定；预测潜在的致癌物以及各种遗传毒物的监测及评价。

?遗传学终点（genetic endpoint) :致突变试验的观察终点(致突 变过程中发生的事件) 观察项目的选择 ?目前实用的genetic endpoint分类方法： ?基因突变 染色体畸变 染色体组畸变 ＤＮＡ原始损伤 诱变试验的选择与配套原则 遗传毒理学评价程序通常为一组包括体内、外遗传毒理学试验。原因有四： ●遗传学终点不一样，没有一个试验可以涵盖所有的遗传学 终点。 ●靶细胞：靶细胞有的是体细胞，或生殖细胞，或两者兼而 有之，故在成套观察项目中既要用体细胞检测又要用生殖细胞。 3、直接致突变作用与间接致突变作用 ?间接致突变作用需要在体内代谢活化后、才具有致突变作用。 ?体内试验具有完整的活化系统，而体外试验则通过加人模拟代谢系统，如S9来弥补缺乏活化系统的不足。 4. 化学毒物的致突变性强弱不一 ?有的化学物在某一检测系统中是强致突变物，而在另一系统中可能是弱的致突变物。 ?弱致突变物在某些系统中比较容易漏检，即出现假阴性。

工业微生物育种

工业微生物育种简介 刘春波-12生工2-20120802224 摘要：本文综述了工业微生物遗传育种的历史地位，介绍了遗传育种的方法和机理，并对其前景进行了展望。微生物遗传育种，所谓微生物遗传育种，即菌种改良，是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造，去除不良性质，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量的一种育种方法[1]，使我们获得所需要的高产、优质和低耗的菌种，其目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。 关键词：工业微生物；遗传育种；方法；机理 工业微生物菌株选育在工业发酵中占有重要地位。用于工业生产的微生物菌种，最好具有以下特征：1.在遗传上必须是稳定的。2.易于产生许多营养细胞、孢子或其它繁殖体3.必须是纯种，不应带有其它杂菌及噬菌体。4.种子的生长必须旺盛、迅速。5.产生所需要的产物时间短。6.比较容易分离纯化。7.有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。8.能保持较长的良好经济能力。9.菌株对诱变处理较敏感，从而提高产量潜力高[2]。 1 历史地位 菌种选育技术的广泛应用为我们提供了各种类型的突变菌株，使得在食品工业、医药、农业、环境保护、化工能源、矿产开发等领域产生众多新的产品，促使传统产业的技术改造和新型产业的产生，同时使诸如抗生素、有机酸、维生素、色素、生物碱、激素以及其它生物活性物质等产品的产量成倍甚至成千万倍地增长，并且产品的质量也不断的提高。与此同时链霉素、土霉素、金霉素和氯霉素等抗生素也大规模的生产起来；在代谢控制育种的推动下使得产氨基酸、核苷酸、有机酸等次生代谢产物的高产菌株大批投入生产；由基因工程构建的工程菌株使得微生物次生代谢产物生产能力迅速提高，而且生产出微生物本生不能生产的外源蛋白质，如胰岛素、生长激素、单克隆抗体和细胞因子等等。由此可见工业微生物遗传育种技术是工业发酵工程的核心技术，在其作用下人们获得了许多的高产优质菌株，为生产实践发展起了强大的推动作用。 2 机理及方法 2.1 自然选育 就是不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。这类突变没有人工参与并非是没有原因的，一般认为自然突变有两种原因引起，即多因素低剂量效应和互变异构效应。所谓多因素低剂量效应，是指在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等作用引起的突变。互变异构效应是指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配[3]。自然突变可能会产生两种截然不同的结果，一种是菌种退化而导致目标产量或质量下降；另一种是对生产有益的突变。为了保证生产水平的稳定和提高，应经常地进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，选出优良的菌种。

微生物诱变育种研究进展

微生物诱变育种研究进展 摘要：本文综述了国内外微生物诱变育种领域的研究新进展，对生物学效应及诱变微生物的机理进行了总结。从物理诱变、化学诱变及复合诱变三个方面介绍了诱变效应、作用机制及在实践中的应用，并对微生物诱变育种的研究进展进行了概述。 关键词：微生物；诱变育种；机制；研究进展 常规的诱变育种方法主要为物理诱变育种和化学诱变育种。微生物的诱变育种，是以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异菌体中筛选出产量高、性状优良的突变株，并且找出发挥这个突变株最佳培养基和培养条件，使其在最适的环境条件下合成有效产物。以人工诱发突变为基础的微生物诱变育种，具有速度快、收效大和方法简单等优点，是菌种选育的1个重要途径，在发酵工业菌种选育上具有卓越的成就，迄今为止国内外发酵工业中所使用的生产菌种绝大部分是人工诱变选育出来的。诱变筛选方法相对简便，是菌种选育的基本、常规和经典方法。特别是对遗传背景不很清楚的对象，诱变育种更是必不可少。近年来，随着新诱变因子的不断发现和筛选体系的进一步完善，微生物诱变育种有了长足的发展。 1 微生物诱变育种的作用 从自然界分离的野生菌种，不论是在产量上还是在质量上，均难适合工业化生产的要求。理想的工业化菌种必须具备遗传性状稳定、纯净无污染、能产生许多繁殖单位、生长迅速、能于短时间内生产所要的产物、可以长期保存、能经诱变产生变异和遗传、生产能力具有再现性、具有高产量和高收率等特性。微生物发酵工业中，诱变育种主要有以下作用: 提高有效产物的产量；改善菌种特性，提高产品质量；简化工艺条件；开发新品种，产生新物质；用于研究推测产物的生物合成途径；与其他育种方法相结合[1]。 2诱变育种的过程 诱变育种包括三个重要环节：突变的诱发、突变株的筛选突变基因的表达。 2.1突变的诱发 突变的诱发受到菌种的遗传特性、诱变剂、菌种的生理状态以及诱变处理时环境条件的影响。出发菌株就是用来进行诱变试验的菌株。出发菌株的选择是诱变育种工作成败的关键。功的经验。诱变作用不但决定于诱变剂，还与出发菌株的遗传背景有关。菌种的生理状态、被处理菌株诱变前的预培养和诱变后的培养条件以及诱变处理时的外界条件等都会影响诱变效果。

工业微生物化学诱变育种研究及应用进展

[收稿日期]2008-05-18 　[作者简介]欧平(1970-),男,广西贺州学院讲师,微生物专业在读硕士。主要研究方向:微生物学。 工业微生物化学诱变育种研究及应用进展 欧　平 (贺州学院,广西　贺州　542800) [摘　要]文章着重介绍了当代化学诱变技术、发生突变的机理和诱变效率,概述了化学诱变的原理及 其在工业微生物育种上的应用进展,选择性地介绍了几种公认有效的突变剂的作用机理。 [关键词]微生物;化学诱变;诱变剂 [中图分类号]Q933　[文献标识码]A [文章编号]1673-8861(2008)03-0139-06 变异是生物进化的基础推动力(Stebbins 1950),也是保证物种多样性的前提,是其他任何方式不能代替的重要演变方式。人为地利用这种方式,用尽可能小地影响基础生命代谢的方式最大限度地追求对物种变异的加速,正是诱导变异的研究目的。诱变育种是人为地利用诱变因素诱发生物遗传变异,在较短时间内获得有利用价值的突变体,根据育种目标要求,选育成新品种直接生产利用,或育成新种质作亲本在育种上利用的育种途径。诱变育种对于品种的改良有着很大的贡献,而在生物的生理机制研究中,诱变技术也功不可没,许多代谢途径的发现都是建立在若干突变体的基础上的。随着分子水平的深入研究,与诱变相关的基因um u D 、C 和di n B 的克隆,以及其他突变机理的进一步明晰,诱变育种的工作变得更为有序和可操纵。 1927年,Muller 发现X 射线能诱发果蝇基因突 变,从此开创了诱变育种技术的先河。诱变育种技术发展至今形成了3种技术:辐射诱变、定点诱变和化学诱变。世界化学诱变育种研究工作始于20世纪50年代,我国近几十年来这方面的研究工作也有了较大进展。20世纪70年代以来,诱变因素从早期的单一诱变剂发展到多种化学诱变剂和生理活性物质,诱变方法从单一处理发展到复合处理,同时,诱变育种与组织培养等密切结合,大大提高了诱变育种的实际意义。 从自然环境中分离,经过简单筛选而获得的的产酶菌株虽然具备了一定的产酶能力,但是要达到某种特定代谢产物的大量积累,实现高产、优质和低 耗的高效转化,则需要对菌株进行改良,解除或突破微生物的代谢调控[1]。微生物育种手段主要有:诱变育种、杂交育种和基因工程育种。虽然现代的基因操作技术对菌株改造更为精准,但实际工业化生产上所使用的产酶菌株,仍然是多采用一些传统诱变技术。诱变育种就是利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群,在大大提高其突变频率的基础上,采用适当的筛选方法获得所需要的突变菌株,以供科学实验和生产实践使用[2]。由于化学诱变育种技术还具有易操作、剂量易控制、对基因组损伤小、突变率高等特点,因而近年来成为运用最为广泛的诱变技术。经过近一个世纪的不断发展和完善,化学诱变育种技术已成为目前工业微生物育种中最为常用、最有效的技术之一。 1.化学诱变的主要原理 化学诱变是通过采用一些分子结构不太稳定的化学诱变剂进行的,它通过化学试剂造成生物的损伤和错误修复,产生突变体。这些突变以点突变为主,并且因试剂不同具有某些相对高频而且较为稳定的突变谱。单一碱基对改变而形成的点突变是化学诱变的主要形式。 化学诱变剂主要指某些烷化剂、碱基类似物、抗 生素等化学药物,常见的有甲基磺酸乙酯(EMS )、硫酸二乙酯(DES )、叠氮化钠(SA )和乙烯亚胺(EI )等,这些化合物通过与核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反应来诱发突变,并对某特定的基因或核酸有选择性作用[3]。 其中烷化剂因可与核酸的碱基等直接发生化学

工业微生物育种全解

1.工业微生物育种在发酵工业中的作用如何？其目的是什么？ 工业微生物育种建立在： （1）遗传和变异（微生物遗传学）的基础之上； （2）物理和化学诱变剂的发现和应用； （3）工业自动化（自动仪表装置和微机）。 工业微生物育种在发酵工业中占有重要地位，是决定该发酵产品能否具有工业化价值及发酵过程成败与否的关键。 2.工业微生物发展经历了哪几个阶段？ 1)自然选育阶段 2)人工诱变选育阶段 3)杂交育种阶段 4)代谢控制育种阶段 5)基因工程育种阶段 3.工业微生物育种的核心指标有哪些？ 1)在遗传上必须是稳定的。稳定性。 2)易于产生许多营养细胞、孢子或其它繁殖体。 3)必须是纯种，不应带有其他杂菌及噬菌体。 4)种子的生长必须旺盛、迅速。 5)产生所需要的产物时间短。转化率。 6)比较容易分离提纯。 7)有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。 8)能保持较长的良好经济性能。产率。

9)菌株对诱变剂处理较敏感，从而可能选育出高产菌株。 10）在规定的时间内，菌株必须产生预期数量的目的产物，并保持相对地稳定。 4.革兰氏阳性和阴性菌的细胞壁结构有何差异？它们对溶菌酶和青霉素的敏感有何不同？ 5.缺壁细菌有哪些类型和异同？制备缺壁细菌主要有哪些途径？原生质体：G+菌经溶菌酶或青霉素处理； 球状体：G-菌，残留部分细胞壁。 是研究遗传规律和进行原生质体育种的良好实验材料。 L型细菌：自发突变形成细胞壁缺陷菌株； 6.原生质体制备时，为什么不同微生物要选择不同的酶？举例说明。 酶在原生质体制备中主要用来酶解细胞壁的，不同的微生物其细胞壁成分及含量可能不同，所以要用不同的酶。 酵母菌的细胞壁主要成分有葡聚糖、甘露聚糖蛋白质、几丁质。霉菌的细胞壁：主要成分是纤维素、几丁质、葡聚糖等。

人工化学诱变技术

化学诱变技术是指利用一些化学物质提高生物的自然突变率，这些化学物质就叫做“化学诱变剂”。其特点有：可操作性强，简单易行；特异性较强，能诱变定位到DNA上的某些碱基；后代较易稳定遗传，一般到F3代就可稳定；应用于遗传标记，是细胞融合技术的基础。诱变剂主要包括5类，他们的特点、机理和应用如下： 1、烷化剂：能使一些碱基烷基化，比如使鸟苷酸甲基化，影响mRNA的转录，从而使蛋白质的表达紊乱，使得蛋白质重组，而改变了性状。临床上应用此类物质作为抗癌药物，具有强烈杀伤癌细胞的作用，所以在应用在于植物上时，也要注意他的强烈杀伤性。 主要有：甲基磺酸乙酯（EMS），是最常用的诱变剂，我们曾用作真菌的遗传标记，诱变率很高。常用浓度0.05-0.5mol/L，作用时间5-60min。该物质具有强烈致癌性和挥发性，可用5%硫代硫酸钠作为终止剂和解毒剂。SIGMA公司价格：80元/25ml。 硫酸二乙酯（DMS），也很常用，但由于毒性太强，目前很少使用，作用机理和使用方法和EMS基本相同。属于剧毒品，受公安局管治。 乙烯亚胺，生产的较少，很难买到。只要用于大量诱变育种用，使用浓度：%，高度致癌性！使用时需要使用缓冲液配置。 盐酸氮芥，用于抗癌药物，可以从药店买到，但有些地方必须有主任医师的处方。 一般是针剂，稍加稀释即可使用，作用时间5-10min，可用甘氨酸作为终止剂和解毒剂。 环磷酰胺、亚硝基胍等物质也可作为诱变剂使用，但较少使用。 2、碱基类似物：分子结构类似碱基，导致DNA复制时产生错配，mRNA转录紊乱，功能蛋白重组，表型改变。该类物质毒性相对较小，但负诱变率很高，往往不易得到好的突变体。主要有：6-溴尿嘧啶、6-BudR、马来酰肼、2-氨基嘌呤等，同样属于抗癌药物，可到药店买到，稍加稀释即可使用。 3、嵌入剂：是分子生物学比较常用的一类，诱导率较高。原理是这类分子的大小正好可以嵌入碱基分子中，导致错配。最常用的：溴化乙锭（EB），高致癌性！价格较贵，但诱变率很高，是实验室常用试剂，可以到生化实际商店买到，1500元/100mg. 4、无机化合物：比较容易得到，效果一般，危险性较小。常用：氯化锂，白色粉状，使用时配成0.1-0.5%的溶液，作用30min-2d。可到化工商店买到：120元/500克。 亚硝酸：没有现成商品，由于该物质易分解，所以现配现用。常用亚硝酸钠和盐酸制取，将亚硝酸钠配成0.01-0.1mol/L的浓度，使用时加入等浓度等体积的盐酸即可。 过氧化氢：又名双氧水，效果不好，所以很少用到。 5 其他：盐酸羟胺，一种还原剂，作用于C上，是G-C变为A-T。也较常用，可以买到。使用浓度：0.1-0.5%，作用60min-2h。较便宜。 生物碱类：如长春碱、秋水仙碱、喜树碱等。 以上的诱变剂同时又是致癌物！使用时必须小心。通常用来浸种，最好的方法是将诱变剂加到组织培养的培养基中，诱变率最高。我们曾经搞过相关的突变检测、抗除草剂和抗药试验，我们认为最好的诱变程度是半数致死，另外的一半则有可能出现好的变异。所以调整诱变浓度、诱变时间至关重要。 搞诱变必须遵循生物安全性的公约，在没有全面考察诱变产物的遗传性、安全性之前，不得将诱变物外流，以免导致危险后果！

2微生物的诱变育种

微生物的诱变育种 一、教学目标及基本要求： 1. 理解诱变剂对微生物的杀菌和诱变双重生物学效应； 2. 学习紫外线诱变的方法和测定诱变剂最适剂量的方法。 二、实验原理 紫外线的生物学效应主要是它能引起DNA结构的变化而造成的。 紫外线具有杀菌和诱变双重生物学效应，随着紫外线照射时间的增加，杀菌率和突变率随之提高。但当照射时间延长到某一程度时，继续延长照射时间，其杀菌率虽然增加，突变率却下降。 紫外线的强度单位(剂量)为尔格/mm2，由于测定困难，在实际诱变育种中，常用紫外线照射时间或细胞的死亡率表示相对剂量，其中以细胞死亡率表示具有实际意义。 本实验以枯草芽孢杆菌为出发菌株，以营养缺陷的突变作为诱变效应的指标，测定紫外线诱变剂的最适剂量。以照射时间为横坐标，以细胞存活率或死亡率和突变率为纵坐标作图，突变率最高值相对应的照射时间即为最适剂量。 三、实验材料 1. 菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 2. 培养基肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1），细菌基本培养基（附录Ⅱ-1.9） 3. 其它生理盐水，诱变箱，磁力搅拌器，涂布棒，离心管，离心机，培养皿等。 四、方法与步骤 1. 菌体的培养取斜面菌种1环，接种于盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养(120r/min)16~18h。取1ml培养液转接于另一只盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养(120r/min)6~8h。 2. 细胞悬浮液的制备取10ml培养液，3500/min离心10min，收集菌体，沉淀用10ml 生理盐水洗涤离心2次，之后将菌体充分悬浮于12ml生理盐水中。 3. 活菌计数法测定细胞悬浮液的浓度取1ml细胞悬浮液，逐步稀释为10-1、10-2、10-3……。取最后3个稀释度的菌液各1ml，置于无菌空平皿中，然后倾注15ml融化并冷却至45~50℃的肉汤固体培养基，轻轻充分混匀，凝固后于37℃倒置培养1~2天，计数每皿的菌落数（每个稀释度作三个平行）。按下式计算每毫升细胞悬浮液菌体的浓度（N0）。 菌体浓度(个/ml) = 菌落数(按杂菌总数计数原则)×稀释倍数 4. 诱变处理 (1) 取10ml菌液于φ90mm的培养皿中（带有磁棒），将皿放置于诱变箱内的磁力搅拌器上。 (2) 开启紫外灯，预热20min，开启磁力搅拌器，打开皿盖，分别照射15、30、45、60、75、90s。 (3) 取不同时间诱变处理的菌液1ml，以肉汤固体培养基平板，按照上述菌落计数的方法进行适当稀释后，采用肉汤固体培养基倾注法测定处理液中存活的细胞浓度（每个照射剂量做三个稀释度，每一稀释度平行做三个平皿）。将结果填入表1。 表1 紫外线对枯草芽孢杆菌存活率的影响