细胞生长调控 标书

项目名称：细胞生长调控的重要蛋白质群的功能与

作用机制

首席科学家：李林中国科学院上海生命科学研究院起止年限：2010年1月-2014年8月

依托部门：中国科学院上海市科委

一、研究内容

本项目将围绕细胞生长调控的重要蛋白质群开展系统研究，从几条重要的信号转导通路、细胞骨架可塑性、细胞有丝分裂染色体运动、以及细胞周期重要调控的蛋白质修饰等方面着手，阐明细胞生长调控的物质基础，并揭示功能蛋白质群可塑性调控的新机制与新规律。主要研究内容包括以下几个方面：

（1）系统地分析和研究细胞生长调控的信号转导机理。针对Wnt、Hh、Hpo等成形素和生长因子诱导的信号转导通路，结合哺乳动物细胞、果蝇、斑马鱼、小鼠疾病模型等研究系统，寻找和揭示参与相关信号转导通路的新分子与新机制、以及参与其它信号通路的新功能，并开展信号通路间的交互作用研究，揭示新分子与新机制同细胞生长增殖等重要生命活动的内在关系，关注信号转导与调控过程的动态性，从而丰富对相关信号转导网络的认识。

（2）深入探讨细胞生长过程细胞骨架可塑性与细胞有丝分裂染色体运动调控的分子机制。围绕细胞增殖的接触抑制，研究细胞内微管骨架的修饰与重构在其中的作用；以纤毛的结构与功能为模式体系研究微管骨架的修饰与重构在细胞增殖中的作用机制；利用三维培养系统研究在细胞增殖过程中细胞骨架重排的分子机制，特别是细胞外基质的变化对细胞骨架重排的调控机制。利用化学生物学及生物光子学技术, 评估有丝分裂重要马达驱动蛋白的单分子行为, 描绘参与细胞有丝分裂染色体运动信号转导的蛋白质群交互作用机制及时空动力学特征，阐明上述信号通路对动点（kinetochore）组装可塑性及动力学特征调控的分子机制。（3）系统阐明细胞生长调控的关键蛋白质修饰的分子作用机理。围绕成形素和生长因子诱导的信号转导通路与细胞有丝分裂和细胞周期调控，通过建立与发展高水平研究蛋白质修饰的蛋白质组学技术平台，深入发掘相关的重要蛋白质修饰的调控机理。特别是系统地鉴定参与细胞周期调控的泛素化和类泛素化修饰靶蛋白及其调控机理，建立其靶蛋白谱和信号调控网络，旨在更加深入认识调控细胞生长的重要蛋白质群的可塑性。

（4）解析细胞生长调控的重要蛋白质群可塑性和动力学特征变异在重大疾病发生与发展中的作用。重点研究成形素与生长因子诱导的信号通路失调、动点组装可塑性及动力学特征改变、细胞周期调控的蛋白质修饰改变在肿瘤等重大疾病发

生与发展过程中的作用机理；发掘调控相关信号通路、蛋白质修饰酶活性的小分子化合物，结合各种细胞、动物模型的进一步验证，旨在确认新的药物作用的靶标和新发现的小分子的成药性。

二、预期目标

1、项目总体目标

本项目瞄准细胞生长调控的重要蛋白质群的功能调控机制这一国际研究前沿，整合在细胞增殖调控研究领域已做出优秀成绩的研究单位和科学家，系统地研究蛋白质复合物或蛋白质群的组成、修饰、组装、动态变化和效应机制，剖析细胞生长增殖相关信号转导通路及其重要蛋白质作用网络的时空动力学特征，发现其新机制和新规律以及在生命活动中的重要作用，揭示蛋白质群动力学特征变化异常在重大疾病发生发展中的病理学意义。以上研究成果必将丰富蛋白质科学与细胞生物学的内涵，为人类健康做出重要贡献。本项目的实施将获得一系列具有国际领先和拥有自主知识产权的研究成果，打造一支达到国际先进水平的蛋白质及细胞动力学研究队伍，跻身于国际细胞动力学研究的领先行列。

2、五年预期目标

在基础理论研究方面：揭示若干成形素信号转导通路重要蛋白质群交互作用机制和时空特征及其动力学特征改变在肿瘤发生与发展过程中的作用机制；阐明纤毛的功能调控重要蛋白质群的本质及其可塑性改变在疾病发生与发展过程中的作用机制；阐明细胞有丝分裂重要马达蛋白时空定位动力学的物质基础及其单分子行为特征、细胞有丝分裂重要蛋白质群在染色体运动调控中的交互机制及时空特征；阐明细胞周期中泛素和类泛素修饰靶蛋白的分子作用机理及所涉及蛋白质群的调控分子机制，并解析上述信号失调、修饰变异等在肿瘤的形成和发展过程中的分子病理学机制。

在应用基础研究方面：筛选并鉴定出若干种可供相关疾病诊治与新药开发等研究的重要潜在靶标，开发相应小分子化合物，促进有自主知识产权创新药物的开发。

在人才培养方面：培养博士研究生40~50名，博士后10~20名，国家杰出青年等高级人才3~5名。

成果考核指标：在国际一流杂志（IF >10）发表论文15~20篇，在有影响力的杂志（IF >5）上发表论文40~50篇。申请10项以上发明专利。

三、研究方案

1、学术思路

蛋白质是生命活动的主要执行者。认识蛋白质分子的生化特性及其相互作用的规律是人类知识积累的重要方面。蛋白质通常以群体作用形式参与细胞生命活动的各个环节。蛋白质在不同的时空环境中行使不同的生物学功能，为此，蛋白质群的动态行为决定了细胞表型。蛋白质群行为变异会导致许多疾病的发生与发展。本项目主要从蛋白质群网络结构及其调控模式出发，应用细胞生物学、化学生物学及生物光子学等多学科新技术，研究重要功能蛋白质群的分子动力学行为及其参与生命活动的特征和规律，揭示蛋白质群动力学变化与细胞生长增殖和重大疾病发生发展的内在关系。

2、技术途径

本项目研究细胞生长增殖调控的相关信号转导通路中新分子、新机制、新功能以及不同信号通路间的交互作用。通过研究信号通路和信号转导分子的功能机制以及它们调控的细胞生理活动，阐述与之相关的细胞活动异常或调控异常的分子机理。围绕项目研究内容和目的，本课题将在分子、细胞和整体动物模型上开展研究。在研究手段上将突出系统性、动态性和发展并使用新方法。在分子水平的研究中，除了常规的研究方法外，将开展多标记、定量和实时的方法对蛋白质表达、蛋白质修饰以及蛋白质相互作用进行动态研究，如蛋白质组学的定量动态实时监测技术。在细胞水平的研究中，将突出活细胞研究技术，如活细胞标记观察、活细胞内标记蛋白质的动态立体观察等。通过结合常规的固定细胞研究技术和活细胞研究的方法，更好地认识细胞内信号转导分子和通路在调控细胞活动中的作用。例如：对细胞活动调控状态相关的瞬时蛋白质修饰的研究，就可以通过结合蛋白质实时监测和活细胞研究获得新的结果。分子和细胞水平的机制性研究，是为了更好地认识它们在动物整体上的功能。课题的研究还将利用果蝇、斑马鱼，肿瘤细胞和疾病系统等模型对信号转导分子及其它重要蛋白质的功能开展体内生理条件下的研究。

本项目针对细胞生长调控的几个关键要点和过程设臵了相应的四个研究课题，包括：（1）成形素诱导的信号转导通路的调控机制；（2）细胞生长过程细胞骨架可塑性的调控机制；（3）细胞有丝分裂染色体运动的调控机制；（4）细胞周期中蛋白质修饰的作用与调控机制。总体技术途径如下图：

总体技术途径示意图

3、创新点与特色

从科学问题来看，本项目以重要蛋白质分子动力学行为为焦点，以蛋白质复合物动态变化的重要调控性为切入点，关注蛋白质在微尺度的作用规律，既深入研究蛋白质复合物相互作用的动态机理，又联系它们在细胞运动过程中的功能与意义。研究和揭示蛋白质功能分子在实时细胞生命活动中的动力学行为及调控规律是本项目的关键创新点。

从研究内容上看，本项目抓住了细胞生长调控研究的几个关键要点，从细胞骨架调控、有丝分裂染色体运动调控、细胞周期蛋白质修饰调控以及几条成形素诱导的信号转导通路的蛋白质网络调控等研究着手，形成了一个由表及里、相互关联的研究体系。本项目强调细胞功能（生长）的可塑性（调控性）和动态性研究具有鲜明的前沿性。

从研究系统上看，本课题针对细胞生长调控的关键节点，从分子、细胞和整

体动物多个层次，应用哺乳动物细胞、果蝇、斑马鱼、疾病小鼠等模型，有利于更好地揭示相应关键蛋白质（群）的生物学功能及其作用机制。

从研究方法来看，本项目应用和发展生物光子学及纳米生物学研究手段，综合运用生物化学、分子生物学、细胞学、化学生物学、蛋白质组学、生物信息学和生物光子学等方面的研究思想和技术方法，系统地研究细胞活动过程中蛋白质相互作用可塑性与动力学调节机制。不仅从细胞器的视角，而且从纳米尺度的动态变化来揭示蛋白质动力学调节的新规律。因此，动态性、全息性和微观性是本项目研究方法的主要特色。

4、可行性分析

在学术思路上，本项目拟从重要功能蛋白质复合物动态时空效应着手，应用现代生物学技术，研究重要调控蛋白质复合物分子动力学特征及其参与的生命过程的一般规律，揭示细胞动力学特征变化与重大疾病发生发展的关系，创建我国分子与细胞动力学研究的基础理论和技术体系。由于蛋白质是一切生命活动的执行者，蛋白质分子动力学行为变化异常是重大疾病发生的重要原因，因此以细胞动力学特征及调控规律研究作为切入点，研究蛋白质分子动力学变化及其和生命过程和疾病的关系切实可行。

本研究团队已经承担多项本研究项目相关的前期项目，其中包括国家“十五”科技攻关计划课题，科技部“973”项目、“863”项目，国家自然科学基金重点项目、国家杰出青年基金、国家自然科学基金创新团队和国际合作项目。特别是具有相关“973”项目顺利实施的丰富经验。

承担和参加本项目的研究单位都属于国内一流的科研院校，有很强的综合科研实力。并且，大部分科研骨干都依托于国家级和省部级重点实验室，为本课题的开展提供了良好的工作环境和条件。

本课题依托、承担和参加研究单位装备了开展分子生物学、细胞生物学、免疫学、电生理、形态学和行为学方面研究的仪器设备，建立了成熟的实验方法，包括免疫电镜技术、活细胞成像技术、原子力显微镜术、光镊术、单分子生物光子学术、以及蛋白质肽谱分析、转基因动物制备和基因敲除技术等。这些条件都确保了本项目在仪器设备和技术方法的常规需求。

四、年度计划

2010年度：为项目开始的第一年。项目主要由各课题组按课题的年度计划进行。并适时开展课题间的交流。项目第一年的主要目标是每个课题围绕研究主题全面开展探索性研究。

2011年度：以课题研究计划为主，加强项目内各课题间的交流。年底开展项目中期交流活动，全面了解各个课题的研究状况。根据课题的研究进展与发现，进一步凝练研究内容。

2012年度：按课题研究计划进行，同时，根据前两年的研究进展与取得的研究成果，注重课题间的相互联系与交流，逐步形成项目重点研究内容与方向。

2013年度：加强课题间的联合研究工作，在课题研究的基础上，注重重点研究内容和方向。

2014年度：课题间研究内容的进一步联系，在课题研究组的基础上形成项目研究的课题交叉团队与梯队。整合课题的研究目标与项目的研究目标。

激素对细胞伸长生长的调控综述

激素对细胞伸长生长的调控综述 摘要植物的细胞伸长生长受多种内外因素的调节和控制，其中内源激素对植物的调控起重要作用，如生长素（IAA）、赤霉素（GA）、油菜素内酯（BR）和乙烯（ETH）等均可调控细胞的伸长生长，且内源激素间的相互作用也直接或间接地调控着细胞的伸长生长。介绍了几种内源激素对细胞伸长生长的调控以及激素间的互作对细胞伸长生长的调控。 关键词内源激素；细胞；伸长生长；调控 植物激素有五大类，分别是生长素类、赤霉素类、细胞分裂素类、乙烯和脱落酸。此外，油菜素甾体类、茉莉酸类、水杨酸和多胺类等对植物的生长发育有多方面的调节作用。已知植物细胞伸长生长受多种内源激素的调控，如生长素吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、赤霉素（gibberellin，GA）、油菜素内酯（brassinosteroid，BR）和乙烯（ethylene，ETH）等，且激素间相互作用调控细胞伸长生长的研究一直受到广泛的关注。现主要介绍各种植物激素（GA、IAA、BR）及其之间的相互作用（如IAA与GA、BR与IAA、GA和乙烯与IAA、GA、脱落酸等）调控植物细胞伸长生长的研究进展。 1 激素对细胞伸长的调控 植物激素可以调控细胞的伸长生长，如生长素和赤霉素（GA）参与了细胞的纵向伸长[1]，研究表明，油菜素内酯也参与了细胞纵向的极性伸长[2-3]。相反，细胞分裂素、脱落酸和乙烯沿横向诱导细胞伸长[4-5]。 1.1 GA对细胞伸长的影响 近年来在各种植物中已有很多关于GA与节间伸长的研究报道[6-8]，许多植物的节间伸长受GA控制。植物茎伸长的主要原因是细胞长度的增加，也有细胞数目的增加。GA最明显的作用就是促进茎伸长。有研究发现，用GA3处理玉米的叶片后，伸长区的长度增加，其原因是由于GA3处理后，细胞数目和细胞长度增加，从而最终使玉米茎秆长度增加[9]。 1.2 生长素对细胞伸长的影响 无论是双子叶植物还是单子叶植物，生长素是茎秆伸长所必需的物质[10]。生长素影响细胞伸长是通过调节细胞壁的延伸度，但生长速率也受其他因素如细胞渗透势的影响。生长素调节细胞生长与细胞壁特异葡聚糖代谢有关[11]。 1.3 乙烯对细胞伸长的影响 乙烯抑制植物茎的纵向生长却促进茎的横向生长。乙烯影响植物茎细胞内微管的排列状态，即乙烯减少了微管的横向排列，增加了微管的纵向排列，微管纵

细胞培养技术在医药研究中的应用

细胞培养技术在医药研究中的应用 摘要：近年来，动物细胞培养技术在生物制药领域成为最受关注的热点之一，动物细胞培养技术广泛应用于动物细胞高密度培养，推动了现代生物医药 产业的发展。动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外模拟体内的: 生理环境 , 在无菌、适宜的培养条件下生长、繁殖的过程。利用人工培养的动物细胞可以进行科学研究和生物制药, 动物细胞的大规模的培养技术是生物制药中非 常重要的环节。在动物细胞培养过程中, 最重要的是使细胞的培养条件达到最 优化程度, 尽可能消除或减轻环境对细胞的影响, 因此动物细胞培养环境的控 制是细胞培养的关健技术。 关键词：动物细胞培养技术，生物制药，培养条件,人工培养。 自1885 年，Roux 从鸡胚中分离细胞首次建立体外细胞培养; Dulbecco于1943 年创建单层细胞培养已有半个多世纪。因其具有的培养简单、操作方便、消耗少、大量运用等优点，被广泛运用于生命科学的各个领域[1]。全球生物制药技术和市场的迅速发展为动物细胞培养基市场提供了快速成长的发展环境， 并使之保持强劲的发展势头。 1 细胞培养的环境及条件 1.1 无污染的环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件[3]。 1.2 适宜的温度 维持培养细胞旺盛生长, 必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同[3]。 1.3 气体环境和氢离子浓度 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一, 所需气体主要有氧气和二氧化碳[3]。 1.4 适宜的p H 值 每种细胞都有其最适p H 值。p H 值随培养的细胞种类不同而不同, 大多数细胞的适宜pH 为7.2至7.4, 偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响[3]。 1.5 培养基 培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质, 而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境[3]。 1.6 细胞培养外部环境 细胞培养是一种无菌操作技术, 对实验室、常用设施及设备、培养器皿等都有严格的要求[3]。 2 细胞培养无菌操作基本技术无菌操作技术分为: 工作环境及表面、细胞培养所用器皿、培养液与培养细胞的处理。 2.1 工作环境的处理 使用层流超净工作台是最经济有效的手段[3]。 2.2 细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒 消毒方法分为物理灭菌法( 紫外线、湿热、干烤、过滤等), 化学灭菌法( 各种化学消毒剂) 和抗生素三类。[3] 细胞培养基的质量标准及产品质量控制参考国内外细胞培养基产品企业标 准的现状，着重考虑了生物制药用户对产品质量的要求以及《中华人民共和国

影响细胞生长分化的因素

影响细胞分化的因素 1、胞外信号分子 ①近端组织的相互作用： 又叫做胚胎诱导，指细胞分泌信号分子旁泌素，影响周围细胞想一定方向分化。如：眼的发生。已知正常情况下，视泡诱导与其接触的外胚层发育为晶状体，实验证明，把视泡移植到其他部位后也能够诱导与之接触的外胚层发育为晶状体。 ②远距离细胞的相互作用 通过激素进行调节，如：蝌蚪变态过程中，会分泌大量甲状腺素和三碘甲状腺原氨酸。 2、细胞记忆与决定 胞外信号分子作用时间短，单细胞可以储存这些记忆，使细胞向特定方向分化。果蝇的成虫盘移植实验便是一个很好地列子。 细胞记忆使得细胞在其形态、结构和功能等分化特征尚未表现出来就已经确定了细胞的分化命运，这就是细胞决定。 3、受精卵细胞质的不均一性 母体效应：卵母细胞中贮存的mRNA和蛋白质的分布是不均匀的，各种mRNA 在细胞中都定位分布，在细胞分裂时mRNA不均一的分配到子细胞中，从而决定细胞分化的命运。 4、细胞间的相互作用与位置效应 实验证明，改变细胞所处的位置可导致细胞分化方向的改变。此即位置效应 5、环境对性别的决定 很多爬行动物通过与环境的作用决定其性别。 6、染色质变化与基因重排对细胞分化的影响 染色质变化主要包括：基因丢失，基因扩增，基因重排，DNA甲基化 基因丢失：细胞发育过程中出现染色体数量减少或者某一部分丢失的现象。如蛔虫发育过程 基因扩增：细胞内特定基因拷贝数在某一时期大量增加的现象。如卵母细胞rDNA 扩增以及双翅目昆虫体细胞内的多线染色体。 基因重排：基因与基因间的位置或顺序发生重新排列组合。如B淋巴细胞分化为浆细胞的过程中，它的DNA经过断裂重排的变化，这有利于其利用有限的免疫球蛋白基因表达大量的抗体。 DNA甲基化：DNA上某些序列处的胞嘧啶被甲基化而引起基因失活。 总之伴随染色质变化，细胞分化也出现变化。 7、（补充）数量效应：细胞数量对诱导组织形成是必要的 如小鼠胚胎胰腺原基在体外进行组织培养时，可发育成具有功能的胰腺组织，但如果把胰原基切成8小块分别培养，则都不能形成胰腺组织，如果再把分开的小

05-细胞分裂和分化

05-细胞分裂和分化

05 细胞的分裂和分化 一、单项选择题： 1．细胞周期的正确顺序是： A．G l—S—G2—M B．G1—G2—M—S C．G1—M—G2—S D．G1—M—S—G2 2．连续进行有丝分裂的细胞，其间期的特点是：A．细胞没有变化B．核膜解体，核仁逐渐消失 C．染色质隐约可见D．细胞内进行着DNA复制和组蛋白的合成 3．各对染色单体上的着丝粒彼此分开，染色单体分别移向细胞两级，是_______的特点。 A．前期B．中期C．后期D．末期 4．染色体端粒的作用是： A．防止DNA从端粒处降解B．降解DNA复制后余留的RNA引物 C．防止DNA因为复制过程而变短D．合成RNA引物 5．当细胞开始分裂时，它有N个染色体和Q个DNA。经过有丝分裂后，每一子细胞中的DNA量和染色体数目应为多少？ A．N和Q B．N/2和Q/2 C．N

A 线粒体 B 叶绿体 C 高尔基体 D 液泡 12．在有丝分裂的一个细胞周期中，出现染色单体的时期是 A．间期和分裂前期B．间期和分裂中期C．间期和分裂前期及中期D．分裂前期和分裂中期 13．在细胞分裂中，既有同源染色体，又有姐妹染色单体的时期是： A．有丝分裂前期B．减数第一次分裂末期C．有丝分裂后期D．减数第二次分裂中期 14．细胞分裂时，DNA复制发生在______期。A．G1B．G2C．S D．M 15．皮肤癌一般发生于哪一层皮肤细胞的哪一时期？ A．表皮细胞有丝分裂期B．生发层细胞有丝分裂S期 C．真皮细胞有丝分裂G1期D．生发层细胞有丝分裂G2期 16．在有丝分裂过程中，染色体、染色单体、DNA分子三者的数量比是1︰2︰2时，该细胞所处的时期是：A．前期和中期B．末期和前期C．中期和后期D．后期和末期 17．下列四组人体细胞中，能够通过细胞分裂使组织得以

软骨细胞培养及其调控(一)

软骨细胞培养及其调控(一) 关键词：软骨细胞 自从1965年chestman和Smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来〔1〕，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨〔2〕。虽然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所表现出的生物学特性也有差别。软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。软骨细胞的生长密度对其生长也至关重要。在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分裂经过和形态功能完全不同。组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌或旁分泌信号的方式而存活。 1细胞因子对体外培养软骨细胞的影响 软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培养研究又提出了一个新方向。近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化等的影响研究也较多。也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。目前认为促进软骨细胞增殖和基质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，对软骨细胞有抑制作用的有IL-1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下： 1.1转化生长因子beta(TGF-β) TGF-β最初是由Robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。TGF-β可以诱导间充质细胞转化为软骨细胞。现已实验证明TGF-βs具有促进软骨细胞增殖、调节其分化和胞外基质合成的能力〔3〕。F.Redni等实验证明培养兔关节软骨细胞表达了不同的TGFβ受体且与软骨细胞生长周期功能有关，软骨细胞在S期表现了低亲和力受体表型(kd=appiox1100pm)然而GO/G期的软骨细胞表现了高亲和力受体。因此，TGF-β对软骨细胞的作用有多种受体参与。同时也有实验证明TGF-β更多的结合在GO/G1期比S期的同步化软骨细胞，从而说明TGF-βs对软骨细胞的作用是通过不同的途径〔4〕。也有学者证明TGF-βs 在不同的条件下对成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重作用，1-10ng/ml浓度的TGF-β可诱导大鼠胚胎肌细胞分化成软骨细胞，合成特异性的Ⅱ型胶原和蛋白多糖，而在0.4mol/L 浓度下，TGF-β可诱导大鼠颅骨成骨细胞的碱性磷酸酶活性，减少软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖的合成〔5〕。同时也有实验证明TGF-β可抑制培养兔关节软骨细胞的终末分化及钙化。TGF-β可能与多种因素如胞外基质和其它分化调控生长因子参与对细胞的调节作用〔6〕。TGF-β在细胞对其它各种分化信号的应答过程中同样也有调节作用。Wen-NingQi等实验证明Ⅱ型胶原能特异的调节TGF-β刺激软骨细胞合成Ⅱ型前胶原DNA和蛋白多糖，同时说明Ⅱ

细胞生长状况有关指标的检测方法

细胞生长状况有关指标的检测方法 一、细胞计数 这是细胞培养中常用的基本技术之一。所用材料为细胞计数板。巴氏吸管和显微镜。步骤如下。 l 取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻擦干。 l 取细胞悬液0.3ml，加入0.9结晶紫染液，混匀后滴半滴于细胞计数板内，以充满不外溢为宜。也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡。 l 在显微镜下用10X物镜观察计数四角大方格中的细胞数。代入下式得出细胞密度。 细胞数（ml）=（4大格细胞数之和/4）×104×稀释倍数 台盼蓝染色法可计算出活细胞和死细胞数以测定细胞存活百分率。一般0.5%-1.0%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。此外还可用0.02%的藻红b染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑丝。 细胞存活率=[4大格活细胞数/（4大格活细胞数+4大格死细胞数）]×100% 在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/100mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。 二、细胞生长曲线和生长倍数 细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增值数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种等量的同一代细胞，经培养后每隔24h取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横坐标，不同时刻的细胞数的对数为纵坐标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反映出细胞生长的动态。 测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养1周（7天），期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。 也可采用MTT法来进行生长曲线测定。 标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，经过一段时间的潜伏期，再进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后衰老。

细胞生物学研究技术答案

第四章细胞生物学研究技术 一、填空 C-四-1.一般观察培养的活细胞用相差显微镜，各种细胞工程中显微操作时用激光扫描共焦显微镜、分辨干涉差显微镜，用荧光染料对细胞结构标记后观察用荧光显微镜。 C-四-2.由起始实验材料所进行的细胞培养叫原代培养，对已有细胞进行的继续培养叫传代培养。 C-四-3.由单一类型的细胞所组成的细胞系称为细胞株。 C-四-4.处于对数生长期的细胞群体，当它的细胞数量增加一倍所需要的时间称为群体倍增时间。 C-四-5.两个或两个以上细胞相互接触并合并而形成一个细胞的现象称为细胞融合。 D-四-1.激光扫描共聚焦显微镜的主要用途有：①荧光检测；②细胞结构的三维重现；③显微操作。 D-四-2.细胞器和大分子的离心分离方法常用有：①差速离心；②密度梯度离心。 D-四-3.常用的离心分离方法包括：①差速离心；②密度梯度离心。 D-四-4.双向电泳的操作可以分成两部分，第一步是等电聚焦，第二步是SDS-PAGE 。 二、单项选择 A-四-1.下列显微镜中，可以对活细胞进行观察的是（ C ）。 A 普通光学显微镜 B 荧光显微镜 C 相差显微镜 D 电子显微镜 A-四-2.下列显微镜中，可以用于细胞工程中显微操作的是（ C ）。 A 普通光学显微镜 B 荧光显微镜

C 微分干涉显微镜 D 电子显微镜 A-四-3.下列显微镜中，用于荧光染料标记细胞结构后观察的是（ A ）。 A 荧光显微镜 B 普通光学显微镜 C 相差显微镜 D 电子显微镜 A-四-4.冷冻蚀刻技术是（ B ）样品制备的一种方法。 A 普通光镜 B 透射电镜 C 暗视野显微镜 D 相差显微镜 A-四-5.群体倍增时间越短，表明细胞的增殖速度（ A ）。 A 越快 B 越慢 C 维持不变 D 无关 A-四-6.如果一种细胞在体外不能传代，或者只能传少数几代，就可以将其称为（ A ）。 A 有限性细胞系 B 永生性细胞系 C 转化性细胞系 D 细胞株 A-四-7.如果一种细胞在体外能无限的传代，永远的活下去，就可以将其称为（ B ）。 A 有限性细胞系 B 永生性细胞系 C 转化性细胞系 D 细胞株 B-四-1.有关体外培养细胞，下列说法不正确的是（ D ）。 A 可根据需要人为地建立培养条件，来观察和研究细胞生命活动的规律 B 通过传代培养可获得研究所需要的细胞量 C 可摆脱活体组织的复杂背景 D 可获得与其在活体组织中完全相同的实验结果 B-四-2.在制备单克隆抗体的过程中，使得与骨髓瘤细胞发生融合的细胞是（ A ）。 A B淋巴细胞 B T淋巴细胞 C 巨噬细胞 D 粒细胞 B-四-3.要探知细胞内某一蛋白质的表达水平，可以通过（ C ）技术实现。 A Southern blot B Northern blot C Western blot D 原位分子杂交 DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印

Wntβ-catenin 途径是调控细胞生长增殖的关键途径

糖尿病患者的皮肤感染可见有疖、痈、蜂窝织炎、糖尿病性大疱病、毛囊 导致Wnt 信号通路的重要变化。Wnt 信号途径未激活时，β-catenin 与GSK3，Axin， 大肠腺瘤样息肉基因(APC)组成复合物，GSK3β可以将β-catenin 磷酸化，磷酸化的β -catenin 通过β-TRCP 连接泛素，进而由蛋白酶降解，维持胞内β-catenin 的稳定。此时 核内的LEF/TCF，与Groucho 和CtBP 抑制蛋白结合，抑制基因转录。当经典的Wnt 信号途径被激活后，分泌到胞外的Wnt 与跨膜受体Lrp5/Lrp6 以及Fzd 结合形成复合物，然后Lrp5/Lrp6 的胞内段被某个蛋白激酶(目前尚不清楚)磷酸化，Dishevelled 被磷酸化 而激活，进而抑制GSK3β活性，多蛋白复合体随之解离，未被降解的β-catenin 在胞 质内大量聚集，当胞内β-catenin 达到一定的水平时，形成的游离的β-catenin 进入胞核内，取代抑制蛋白与转录因子LEF1/TCF 结合，调控下游基因的转录 [11-12] 。 Wnt/β-catenin 途径是调控细胞生长增殖的关键途径，在胚胎发育中起着重要作用 [13] 。新近的研究表明，Wnt/β-catenin 信号可通过激活下游靶基因(如cyclinD1 和c-myc) 促进多种类型干细胞及前体细胞自我更新的能力，包括胚胎干细胞 [14] 、肠干细胞 [15] 、 表皮干细胞 [16] 、造血干细胞 [17] 等。在CNS 发育过程中，Wnt/β-catenin 通路同样具有 重要作用。Wnt1 的缺失引发中脑、小脑及脊髓的严重缺陷 [18-20] ，Wnt3a 的缺失则引起 海马的整体丧失 [21] 。上述现象可归结为Wnt 的缺失扰乱了脑室区干细胞或前体细胞的 增殖。脑室区的神经上皮前体细胞持续表达稳态的β-catenin 使前体细胞储蓄量增加， 从而扩大了大脑皮质区。J. Viti 等将逆转录病毒携带的Wnt7a 转染小鼠前脑后，促进 神经前体细胞增殖 [22] 。N. Israsena 等从小鼠皮质分离NSCs，使之过表达β-catenin， 在bFGF 存在下，继发神经球的形成显著增加。由此进一步提示Wnts 促进NSCs 增殖 的功能 [23] 。 纵上所述，Wnt/β-catenin 在神经发育过程中神经干细胞增殖分化过程发挥了重要 的作用。众所周知，在胚胎发育过程中，由于完整脉管系统尚未形成，无法提供血供， 因此神经系统的发育是处于低氧(1~5％O 2

2.2 培养细胞的生长与增殖过程

细胞工程培养细胞的生长与增殖过程

1.单个细胞的生长过程 细胞周期是指一个母细 胞分裂结束后形成的细胞至 下一次再分裂结束形成两个 期 子细胞的时间，可分为G 1 、S期、G 期和M期。培养 2 细胞单个细胞的生长过程与 体内细胞单个细胞的生长过 程相似。

2.细胞系的生长过程 原代细胞经培养传代或再培养后，便成为细胞系。体外培养细胞的生命是有限的，传代培养的细胞最多只能传代30～50代，相当于150～300个细胞周期；国际上用于实验研究的细胞大多在10代以内冻存，这样细胞特性基本保持不变。

细胞系的生长过程原代培养期 传代期 衰退期 为新鲜组织自体内取出并在体外 培养生长至第一次传代的时期。 原代培养的细胞生长一定时间之 后，如贴附型细胞即融合成片而逐 渐铺满底物的表面，此时应将原代 细胞分开接种至2个或更多的新的 培养器皿中，即传代，此即成细胞 系。 一般有限细胞系在此期的细胞开 始时虽仍然存活，但增殖已很缓慢 并逐渐完全停止，进而细胞发生衰 退死亡。

3.每代细胞的生长过程 细胞培养过程中一代 指的是从细胞接种到分 离再培养的一段时间。 与细胞世代或倍增不同 ，在细胞一代中细胞倍 增3～6次。每代细胞生长曲线

每代细胞生长过程滞留期 指数生 长期 停止期 细胞接种后，先进入生长缓慢的滞 留阶段，包括悬浮期(游离期)和潜伏 期。细胞贴壁后，逐渐伸展，恢复细 胞原有形态，经过一个潜伏期，才进 入生长和增殖期。 又称对数期。此期为细胞增殖最 旺盛的阶段，细胞分裂相增多，成 倍增长，活力最佳。 又称平台期，此时细胞数量饱和， 细胞不再增殖，但仍有代谢活动。

人体各大器官细胞的更新周期

人体各大器官细胞的更新周期 肝细胞的寿命只有5个月 由于血液供应充足，肝脏自我恢复和再生的能力惊人。这意味着它把毒素排出体外的重要工作可以继续下去。如果你奇怪为什么就连酒鬼的肝功能有时候也会提高，这是因为肝细胞只有150天左右的寿命。英国莱斯特皇家医院的肝脏外科医生大卫·劳埃德解释说：“我可以在一次手术中切除患者肝脏的70%，只要两个月的时间，大约90%的肝就会长出来。” 但是，酗酒者的软组织细胞（肝脏的主要细胞）可能会逐渐受损，形成疤痕组织，也叫硬化。因此，虽然健康的肝可以不断自我更新，而硬化损伤是永恒的，有时甚至是致命的。 味蕾的寿命仅仅10天 英国牙医协会的科学顾问达明·维穆斯莱教授解释说，舌头上有大约9000个味蕾，帮助我们感受甜、咸、苦或者酸味。味蕾本身是舌头表面细胞的集合，每个味蕾有大约50个味觉细胞。味蕾一般只需要10天到2周便会自我更新一次。但是，任何引起发炎的因素如感染或者吸烟都会损害味蕾，影响它们的更新，减弱它们的敏感性。 大脑的寿命和你自己的寿命相同 英国巴特与伦敦医院的神经外科专家约翰·瓦德莱指出，能持续终身的大多数细胞是在大脑中发现的。瓦德莱说：“我们的脑细胞约有1000亿个，出生时数量已固定，我们大脑的大部分不会随老化而自我更新。” 事实上，我们的确会损失细胞，这就是患上痴呆症的根本原因以及头

部受伤破坏性很大的原因。瓦德莱说：“但是，大脑有两个部位的细胞会自我更新，支配我们嗅觉的嗅球和用于学习的海马状突起。” 脑细胞处在一种连续不断地死亡且永不复生增殖的过程，死一个就少一个，直至消亡殆尽。这是一种程序性死亡，也叫凋亡。人到20岁之后,脑细胞就开始以每天10万个速度递减，减少的都是那些闲置的，呀不经常通电的，也就是不用的，爱因斯坦的大脑利用为11%，平常人一般3--6%吧 心脏干细胞的寿命是20年 之前人们一直以为心脏不能自我更新。但是，纽约医学院的一项研究发现，心脏上布满不断自我更新的干细胞，它们一生中至少更新2到3次。 肺表面细胞的寿命大约是2到3周 国肺脏基金会副主席基思·普罗斯解释说，肺细胞不断自我更新。但是，肺有不同的细胞，它们的更新速度不同。位于肺部深处的用来交换氧气和气体的气泡或者气囊细胞更新过程稳定，需要约1年的时间。与此同时，肺部表面的细胞必须每隔2到3周进行自我更新。普洛斯博士说：“它们是肺的第一道防线，因此必须快速更新。”肺气肿会阻止这种更新，因为这种病源自气泡的破坏，肺壁上形成了永久性的“洞”。 眼睛的寿命也和你的寿命相同 眼睛是身体中为数较少的在你的生命期间不会改变的身体部分之一。眼部唯一不断更新的部位是角膜。英国视光师学院的院长罗伯·霍根表示，如果角膜受损，它能在24小时内复原。霍根说：“角膜必须有一个平滑的

细胞培养全过程

我是细胞培养的新手，在开始养细胞前看到篇文章（老师给的）很实用，希望对大家有帮助。细胞培养室实验操作规范 一、细胞培养室的环境 1. 细胞生长要求严格的无毒无污染环境，因此必须注意培养室的清洁卫生，保持操作空间的无菌条件： 1) 培养室应为独立、封闭的空间。培养室及缓冲间都应保持整洁，不要随意出入； 2) 保持超净工作台的无菌环境，每次使用前打开紫外灯照射消毒15—30分钟；每次使用后将废弃物清理干净，各用具规放整齐，用70%酒精擦净台面，再打开紫外灯照射30分钟以上； 3) 定期擦洗桌面、地板、清洁培养室，并用0.1%的新洁尔灭溶液消毒；定期打开培养室的大紫外灯，将整个房间进行照射消毒； 4) 每次打开培养箱前，或手伸入超净工作台进行操作之前，均应用70%酒精擦手。 5) 定期清理冰箱。将药品试剂分类摆放，过期的试剂应及时清除； 6) 培养箱要定期清洁。隔板及内壁等用0.1%的新洁尔灭溶液清洗，再用70%酒精擦净；并要注意底层水箱的水位，及时补充水份； 7) 注意监测CO2的气压，及时补充。 8) 注意监测液氮罐中液氮的挥发情况，及时补充，液面不能低于最高一层细胞冻存盒的位置。 2. 实验器具的清洗、消毒灭菌： 1) 反复使用的器皿应严格清洗干净，其清洗程序为：清水浸泡——去污剂刷洗

——清水冲洗——超声波洗涤——洗液浸泡（过夜）——充分冲洗（务必冲洗干净，不能残留洗液）——蒸馏水漂洗——烘干；若为新的玻璃器皿，要在刷洗后用5%的稀盐酸浸泡过夜。 *洗液：浓硫酸+重铬酸钾 2) 胶塞的清洗：清水浸泡——2%NaOH煮沸10—20分钟——冲洗——1%稀盐酸浸泡30分钟——充分冲洗——蒸馏水漂洗——烘干 3) 玻璃器皿，如玻璃吸管、离心管、玻璃培养瓶、套管等等以及胶塞，清洗后均可用高压蒸气灭菌，15磅灭菌30分钟。 4) 不能高压灭菌而又需反复使用的器具，如加样枪、多道枪的加样槽、塑料吸头等，应事先用70%的酒精擦洗，置于超净工作台中用紫外线照射2小时以上。 二、细胞培养用水、用液： 1. 胞培养必须使用玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水，二次蒸馏水或外购的金属蒸馏器制备的蒸馏水只能用来清洗器皿； 2. 平衡盐溶液（BSS）严格按照配方配制，含Ca++、Mg++离子的要避免其沉淀。可过滤灭菌或高压灭菌。采用高压灭菌时如含有葡萄糖等成份，应避免高压过度，一般8磅10分钟及即可。灭菌后的BSS于4℃冰箱中保存，如出现浑浊或沉淀时，应废弃，重新配制。 3. 培养液的配制，以配制1000ml RPMI1640为例： 1) 将RPMI1640干粉倒入约800ml三蒸水中，搅拌使其溶解； 2) 加入5.94g HEPES，在磁力搅拌器上搅拌约半小时； 3) 加入2g NaHCO3，继续搅拌约2小时； 4) 定容至1000ml；必要时用1N NaOH凋至PH7.0 5) 过滤除菌。滤纸由上到下为：普通定性滤纸、0.4μm滤膜、0.22μm滤膜；

金纳米粒子能调控细胞的分化生长

金纳米粒子能调控细胞的分化生长 2016-05-12 12:44来源：内江洛伯尔材料科技有限公司作者：研发部 金纳米粒子修饰培养基表面示意图 细胞的生长需要营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。液体培养基用于大规模的工业生产以及生理代谢等基本理论的研究工作。液体培养基中加入一定的凝固剂（如琼脂）或固体培养物（如麸皮、大米等）便成为固体培养基。固体培养基为细胞的生长提供了一个营养及通气的表面，在这样一个营养表面上生产的细胞可形成单个菌落。因此，固体培养基在细胞的分离、鉴定、计数等方面起着相当重要的作用。 通过精确地控制培养基表面的成分与结构，细胞的生长、分化可以受到控制。虽然这种表面处理技术已被应用于细胞体外培养、组织再生、器官再造等生物医学领域，但是由于细胞会与维持其生长的微环境发生反应，所以在现阶段开发出一种精确处理表面以优化生物相容性的通用方法几乎是不可行的。目前广泛采用的处理工艺往往是复杂的涂层工艺，例如层层沉积与纳米图案成形，这些工艺耗时、耗力，不利于大规模生产的实施。那么如何探寻一种简单、快速的表面处理方法呢？近些年来飞速发展的纳米科学为人们解决这一难题提供了新的途径。 金纳米粒子以其优异的生物适应性成为人们研究的热点，加上其表面很容易修饰一些基团进行功能化，所以是用于医学领域最有希望的候选者。 近日，美国马萨诸塞大学Rotello团队在表面处理方面取得了重大突破，相关研究发表在最近的AdvancedMaterials上。该团队在等离子处理过的商业聚苯乙烯细胞培养基上喷涂具有各种功能化表面配位体的金纳米颗粒，通过对颗粒表面配位体末端基团的调节，准确控制颗粒及其表面性质。纳米金表面的配位体能够阻止蛋白质污染，最大化地发挥颗粒调节细胞间相互作用的能力。颗粒间的静电排斥作用使颗粒不会过多地在表面沉积，确保了涂层的单层稳定。

仙人掌对体外培养成纤维细胞生长增殖的影响(精)

仙人掌对体外培养成纤维细胞生长增殖的影响 作者：金照，金可可，陈雷，刘长宝 【摘要】目的：观察仙人掌对体外培养成纤维细胞增殖的影响及其量-效关系。方法：以小鼠成纤维细胞株(NIH3T3)为研究对象，采用四氮唑盐(MTT) 比色法测定仙人掌对成纤维细胞增生的影响(以OD值反映细胞活性)，采用免疫细胞化学染色法检测成纤维细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果：在一定浓度范围内(0.0625～0.5 mg/mL)，仙人掌能明显促进体外培养的成纤维细胞生长增殖，同时促进PCNA蛋白的表达，并随着仙人掌浓度的增加，成纤维细胞数量和PCNA蛋白的表达均不断增加，在0.5 mg/mL浓度时达到高峰，呈现明显的剂量-效应关系(r分别为0.761，0.783;P均<0.01)。结论：在一定浓度范围内，仙人掌具有促进体外培养成纤维细胞增殖的作用，并表现为明显的量-效关系。 【关键词】仙人掌;成纤维细胞;增殖 Abstract: Objective: To explore the effects of Opuntia on fibroblast proliferation in vitro and its concentration-effect relationship. Methods: The effects of Opuntia on proliferation of fibroblast were measured with MTT colorimetric assay，and PCNA productions were examined with immunocytechemistry. Results: Opuntia could provoke fibroblast proliferation and increase PCNA protein expression in concentration range 0.0625～0.5 mg/mL. Furthermore，the effects exhibited a significant concentration-dependent relationship (r =0.761，0.783 respectively，P <0.01). Conclusion: Opuntia can provoke fibroblast proliferation within a certain concentration range， which exhibits a significant concentration-effect relationship. Key words: Opuntia;fibroblast;proliferation 仙人掌(Opuntia)，又名神仙掌、老鸦舌、观音掌等，已经被用来治疗糖尿病、溃疡等症[1-2]。仙人掌治疗胃溃疡的机制可能与成纤维细胞的增殖有关[3]。近几年来，虽然仙人掌的药理作用已成为医学热门研究方向，但有关仙人掌对体外培养的成纤维细胞增殖的影响未见报道。本研究以体外培养成纤维细胞为实验对象，观察仙人掌对成纤维细胞生长增殖的影响及其量-效关系。 1 材料和方法 1.1 材料小鼠成纤维细胞株(NIH3T3)购自上海肯强仪器有限公司，鼠抗人PCNA单克隆抗体及其他试剂均购自武汉博士德生物有限公司。仙人掌干粉为鲜茎片80 ℃烘干制成，由福州日冕科技开发有限公司生产提供。

软骨细胞培养及其调控

关键词：软骨细胞自从1965年chestman和Smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来［1］，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨［2］。虽然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所表现出的生物学特性也有差别。软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。软骨细胞的生长密度对其生长也至关重要。在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分裂经过和形态功能完全不同。组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌或旁分泌信号的方式而存活。1 细胞因子对体外培养软骨细胞的影响软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培养研究又提出了一个新方向。近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化等的影响研究也较多。也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。目前认为促进软骨细胞增殖和基质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，对软骨细胞有抑制作用的有IL- 1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下：1.1 转化生长因子beta(TGF-β) TGF-β最初是由Robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。T GF-β可以诱导间充质细胞转化为软骨细胞。现已实验证明TGF-βs具有促进软骨细胞增殖、调节其分化和胞外基质合成的能力［3］。F.Redni等实验证明培养兔关节软骨细胞表达了不同的TGFβ受体且与软骨细胞生长周期功能有关，软骨细胞在S期表现了低亲和力受体表型(kd=appiox 1100pm)然而GO/G期的软骨细胞表现了高亲和力受体。因此， TGF-β对软骨细胞的作用有多种受体参与。同时也有实验证明TGF-β更多的结合在GO/G1 期比S期的同步化软骨细胞，从而说明TGF-βs对软骨细胞的作用是通过不同的途径［ 4］。也有学者证明TGF-βs在不同的条件下对成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重作用，1-10ng/ml浓度的TGF-β可诱导大鼠胚胎肌细胞分化成软骨细胞，合成特异性的Ⅱ型胶原和蛋白多糖，而在0.4mol/L浓度下，TGF-β可诱导大鼠颅骨成骨细胞的碱性磷酸酶活性，减少软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖的合成［5］。同时也有实验证明TGF-β可抑制培养兔关节软骨细胞的终末分化及钙化。TGF-β可能与多种因素如胞外基质和其它分化调控生? ?］。TGF-β在细胞对其它各种分化信号的应答过程中同样也有调节作用。Wen-Ning Qi等实验证明Ⅱ型胶原能特异的调节TGF- β刺激软骨细胞合成Ⅱ型前胶原DNA和蛋白多糖，同时说明Ⅱ型胶原在TGF-β存在的条件下调节软骨细胞特异性基因表达具有剂量依赖性(量效关系)。因此Ⅱ型胶原基因表达的变化在 TGF存在条件下受Ⅱ型胶原的调控［7，8］。[!--empirenews.page--] 体外实验证明，许多细胞因子对软骨细胞有协同或拮抗作用如TGF-βs、IGFs、FGF、BMP、 IL-1等，兔关节软骨细胞体外培养时，TGF-β对IGF的分泌作用有三种，(1)减少41KD的IG FBP；(2)增加IGF受体的结合位点； (3)下调了诱导型IGF-1受体的自身磷酸化［9］，从而促进软骨细胞的增殖和特异性基质的合成。也有学者认为TGF-β和IGF可以使反分化的软骨细胞再分化诱导和持久表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖［10］。软骨细胞在传代培养中表型的变化可能与软骨细胞自分泌IL-1有关，而TGFβ可作为一种IL-1的拮抗剂，减少了IL-1对胞外基质的分解代谢同时也下调了IL-1受体及其金属蛋白酶的表达［1 1］。TGFβ可能通过以下两种途径拮抗IL-1的作用，(1)刺激成软骨细胞中蛋白糖抑制剂的产生。(2)抑制软骨细胞蛋白酶的产生，因而对细胞外基质的

细胞增殖实验word版

细胞增殖检测方法 细胞增殖检测通常是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化。目前细胞增殖检测主要分为五类：DNA合成检测、代谢活性检测、细胞数量检测、细胞增殖相关抗原检测和ATP 浓度检测。在这些方法中作何选择，主要取决于所研究的细胞类型和研究方案。 1.DNA合成检测 这是目前实验室中检测细胞增殖最准确可靠的方式。该法是将放射性标记的3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育，这样新增殖细胞的DNA中就会掺入放射性标记，经洗脱后可用闪烁计数器检测。该方法耗时长，而且有个明显的弊端就，即使用和处理放射性物质既麻烦又不安全。不过，可以使用5-溴-2-脱氧尿苷BrdU来进行类似实验，因为BrdU也同样可以掺入到新合成的DNA中。但这样就需要进行额外的实验步骤，先孵育特异性BrdU单抗和带标记的二抗，然后再进行比色法、化学发光检测或荧光信号检测等步骤。该方法的优点就是不再需要放射性物质。BrdU标记很适合免疫组化IHC、免疫细胞化学IC、细胞内ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。 2.代谢活性检测 检测细胞群体的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。在细胞增殖过程中脱氢酶的活性会增加，因此其底物四唑盐或Alamar Blue在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。可以通过低配置或高配置的分光光度计和酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。 四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS和WST1。MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶体需要溶解在DMSO或者异丙醇中。因此，MTT 主要作为终点检测方法。其他三种盐与Alamar Blue一样，都是可溶且无毒。它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。其中XTT的效率较低，需要添加额外的因子；WST1更灵敏有效，与其他盐相比能够更快显色；Alamar Blue 的灵敏度也很高，只要微孔板的孔中有100个细胞就能够检测到。四唑盐和Alamar Blue氧化还原染料能够用于多种仪器和高通量研究，非常方便。它们适用的检测仪器包括：标准分光光度计、

2010CB912100-细胞生长调控的重要蛋白质群的功能与作用机制

项目名称：细胞生长调控的重要蛋白质群的功能与 作用机制 首席科学家：李林中国科学院上海生命科学研究院起止年限：2010年1月-2014年8月 依托部门：中国科学院上海市科委

一、研究内容 本项目将围绕细胞生长调控的重要蛋白质群开展系统研究，从几条重要的信号转导通路、细胞骨架可塑性、细胞有丝分裂染色体运动、以及细胞周期重要调控的蛋白质修饰等方面着手，阐明细胞生长调控的物质基础，并揭示功能蛋白质群可塑性调控的新机制与新规律。主要研究内容包括以下几个方面： （1）系统地分析和研究细胞生长调控的信号转导机理。针对Wnt、Hh、Hpo等成形素和生长因子诱导的信号转导通路，结合哺乳动物细胞、果蝇、斑马鱼、小鼠疾病模型等研究系统，寻找和揭示参与相关信号转导通路的新分子与新机制、以及参与其它信号通路的新功能，并开展信号通路间的交互作用研究，揭示新分子与新机制同细胞生长增殖等重要生命活动的内在关系，关注信号转导与调控过程的动态性，从而丰富对相关信号转导网络的认识。 （2）深入探讨细胞生长过程细胞骨架可塑性与细胞有丝分裂染色体运动调控的分子机制。围绕细胞增殖的接触抑制，研究细胞内微管骨架的修饰与重构在其中的作用；以纤毛的结构与功能为模式体系研究微管骨架的修饰与重构在细胞增殖中的作用机制；利用三维培养系统研究在细胞增殖过程中细胞骨架重排的分子机制，特别是细胞外基质的变化对细胞骨架重排的调控机制。利用化学生物学及生物光子学技术, 评估有丝分裂重要马达驱动蛋白的单分子行为, 描绘参与细胞有丝分裂染色体运动信号转导的蛋白质群交互作用机制及时空动力学特征，阐明上述信号通路对动点（kinetochore）组装可塑性及动力学特征调控的分子机制。（3）系统阐明细胞生长调控的关键蛋白质修饰的分子作用机理。围绕成形素和生长因子诱导的信号转导通路与细胞有丝分裂和细胞周期调控，通过建立与发展高水平研究蛋白质修饰的蛋白质组学技术平台，深入发掘相关的重要蛋白质修饰的调控机理。特别是系统地鉴定参与细胞周期调控的泛素化和类泛素化修饰靶蛋白及其调控机理，建立其靶蛋白谱和信号调控网络，旨在更加深入认识调控细胞生长的重要蛋白质群的可塑性。 （4）解析细胞生长调控的重要蛋白质群可塑性和动力学特征变异在重大疾病发生与发展中的作用。重点研究成形素与生长因子诱导的信号通路失调、动点组装可塑性及动力学特征改变、细胞周期调控的蛋白质修饰改变在肿瘤等重大疾病发

《细胞周期》——细胞生物学知识点总结

《细胞周期》 ★细胞的最终命运： 细胞分裂及生长（相关物质准备）→细胞增殖（受到严密的调控机制所监控）→细胞死亡 ★标准的细胞周期： （从G1期开始，历经S、G2，到M期结束） 一．细胞周期的基本概念： 1.细胞周期：细胞周期是细胞增殖周期的简称，指细胞从分裂结束后开始生长，到再次分裂终了所经历的全过程。 2.细胞周期时间(Tc)：细胞周期时间因细胞类型、状态和环境而异，变异范围大，从0h~数年都可能。 3.细胞的增殖特性（机体细胞的状态）： 1）增殖细胞（周期性细胞）：能够增殖，不断进入 周期完成分裂。 2）暂不增殖细胞（休眠细胞，G0细胞）：长期停 留在G1晚期（G0期）而不越过限制点，未丧失 分裂能力，在适当条件下可恢复到增殖状态。 3）永不增殖细胞（终末分化细胞）：始终停留在 G1期，失去增殖能力直到衰老死亡。 二．细胞周期的研究方法： ★细胞周期模型 细胞周期研究中经常使用一些典型的物种和细胞系统，最常用的模型包括酵母、爪蟾胚胎细胞和哺乳动物体外培养细胞。 ★细胞周期同步化 ——由于实验常常需要设法获得时相均一的细胞群，使样品中的细胞都处于大致相同的细胞周期阶段，所以常需要使细胞周期同步化。 同步化的策略：①诱导同步化；②选择同步化 同步化常用方法：①细胞分裂收获法②代谢抑制法（加入过量胸苷后清洗）③低温培养法 ★3H-TdR（氚标记胸苷）有丝分裂标记法（测定细胞周期的时间） ——应用3H-TdR短期饲养细胞，数分钟至半小时后，将3H-TdR洗脱，置换新鲜培养液并继续培养。随后，每隔半小时或1小时定期取样，作放射自显影观察分析，从而确定细胞周期各个时相的长短。