部分省市猪群猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定

动物医学进展,2003,24(3D:67-72

Progress in Veterinary Medicine

部分省市猪群猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定

李海燕1,2,于康震1,3,辛晓光1,李雁冰1,蔡雪辉2,杨焕良1,毕英佐4,王自振5

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,黑龙江哈尔滨150001;2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150001;3.农业部畜牧兽医总局,北京100026;

4.华南农业大学动物科学学院,广东广州510642;

5.河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002D

中图分类号:S852.659.5;S858.28文献标识码:A文章编号:1007-5038(2003D03-0067-06

摘要:对黑龙江~吉林~辽宁~安徽~山东~内

蒙~河南~河北~江苏~安徽~浙江~湖北~福建~广

东~海南~上海等省~市猪群进行了猪流感的血

清学和病原学调查研究O从1306份猪鼻棉拭子

样品和死亡猪肺~气管样品中分离到39株H3N2亚型猪流感病毒,12株H1亚型猪流感病毒及其它亚型猪流感病毒,病毒粒子在透射电

镜下呈现典型的正粘病毒特征,有囊膜和纤突,

多为椭圆形~圆形~或杆形,直径约80~120nm O

对1997-2001年3895份猪血清的血清学调查

结果表明,近年中国多个地区猪群存在抗SWTN77(H1D~SWCO77(H3D~DKAT69(H1D~ TKUK63(H3D流感病毒抗体;1998年来自河北的猪血清中抗SWTN77阳性率高达33.3%; 1999年来自内蒙的猪血清中抗TKUK63和SWCO77阳性率分别为13.3%和26.7%;2000 -2001年调查的所有省市的猪群中均存在抗SWCO77抗体,阳性率从3.2%~100%O说明近年我国猪群中H3亚型猪流感的污染相当普遍O 关键词:猪流感;猪流感病毒;血清学调查;分离鉴定

猪流感病毒(SIV D属正粘病毒科成员,可单独引起

猪流感(SI D O SI是一种以突发~咳嗽~呼吸困难~衰竭~

迅速康复或死亡为特征的急性~高度接触性传染病,猪

不分年龄~性别和品种均能感染,发病率高,是规模化养

猪场普遍存在且难以根除的群发性疾病之一O其突出的

流行特点是常以亚临床形式存在并常激发其它呼吸道细菌和呼吸道病毒的继发或混合感染,使疫情变复杂,死亡率增高O

SI的发生和流行已有近百年的历史,欧~美~亚~非~澳洲等世界各地均有该病的发生和报道O在猪群中广泛流行的主要有古典猪H1N1~类禽H1N1和类人H3N2亚型毒株,古典型H1N1SIV以地方流行性存在于欧美大陆,并于20世纪70年代先后传到了我国台湾~香港~大陆和日本,在亚洲广泛流行O1979年,禽源H1N1SIV在欧洲猪群中广为传播,之后逐渐蔓延到亚洲,我国也未能幸免O H3N2亚型SI是继1968年香港流感流行之后,1969年在台湾首次报道,1970年在香收稿日期:2002-10-21

基金项目:兽医生物技术国家重点实验室开放课题基金资助项目(200204D

作者简介:李海燕(1968-D,女,广西柳江人,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所博士,副研究员,主要从事兽医传染病的诊断~防制及分子流行病学研究工作O 港的猪群中也分到了H3N2SIV O大量的血清学调查结果表明,1968年香港流感H3N2毒株及其变异株迅速传到了欧~美的猪群中,并在世界范围包括我国在内的猪群中存在了数年之久O倪汉忠等(2000D的调查显示,广东省猪群较普遍受H3型流感病毒感染,抗体阳性率高达53.7%,H1型抗体阳性率为30.9%O李海燕等(1999D从东北猪群中分离到多株H3N2SIV[1-2]O 近年来,我国禽流感疫情变得复杂而严峻,不容忽视,哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心已从国内分离到多株覆盖了H1~H3~H5~H9和H14不同亚型的AIV;世纪之交,我国大陆~香港几乎同时从人群中分到了H9N2亚型病毒,近期,香港从猪群中首次分离到一种非H1或H3亚型的H9N2AIV,而且,香港卫生署发现本地首宗人感染猪源H3N2流感病毒病例O鉴于猪在禽-猪-人传播链中的中间宿主和多重宿主作用,我国猪群中SI的存在情况及潜在的公共卫生意义如何,已成为世界同行关注的焦点,而我国目前对SI的研究远不能满足我国规模化养猪对猪疫病防制的需要O因此,为了解近年SI在我国的存在和流行情况,从根本上阐明SI的流行规律,我们在我国大范围内开展了SI的血清学调查和SIV的收集~分离~鉴定和统一命名工作,以期为SI的诊断~防制及其分子流行病学等研究奠定物质基础O

1材料

1.1病原分离培养病料

鼻棉拭子或病死猪的肺~气管样品共1306份,分别采自黑龙江~吉林~辽宁~安徽~山东~河南~江苏~浙江~福建~广东~深圳等省~市出现呼吸道症状的猪群或病死猪,置4C或-20C保存备用O

1.2标准阳性血清和抗原

禽源流感病毒H1~H2~H3~H5和H9标准阳性抗原和血清~猪源H1和H3亚型流感病毒抗原~琼脂扩散(AGP D阳性血清及抗原均由哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心制备并提供;鸡新城疫(ND D标准阳性血清由哈尔滨兽医研究所成果推广部提供O

1.3被检猪血清

为1998至2002年分别收集或采集自中国不同省市和地区猪血清,共3895份O其中,黑龙江省6个地区,共518份;辽宁省35份;山东省26份;安徽省27份;江苏省38份;浙江省49份;上海市8份;天津市11份;河南省191份;河北省33份;湖北省47份;海南省14份;广东省227份;深圳市33份;福建省112份;内蒙69份O 1.4SPF鸡胚和试验动物

SPF鸡胚和SPF鸡均由哈尔滨兽医研究所实验动

物中心SPF种禽饲养室提供,豚鼠200~300g~昆明系小白鼠12~16g均购自并饲养于哈尔滨兽医研究所实验动物中心小动物饲养室,试验猪6只80日龄购自哈尔滨市香坊哈白原种猪场临床健康AGP和I试验检测均为抗流感病毒抗体阴性饲养于哈尔滨兽医研究所实验动物中心小动物饲养室,

1.5红细胞

豚鼠红细胞由哈尔滨兽医研究所实验动物中心小动物饲养室提供所用豚鼠临床表现健康,

1.6主要仪器

BECKMAN台式冷冻高速离心机JEM-1200EX 型透射电镜均由哈尔滨兽医研究所提供,

2方法

2.1病毒的分离及增殖

将采集的样品按文献 1 方法处理后以羊膜腔和尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚(0.2mL/胚)置35孵化4d分别收集24~96h内死亡和存活鸡胚羊水和尿囊液并进行无菌检查测定其对7mL/L豚鼠红细胞的凝集活性并观察鸡胚病变情况,有血凝活性者作进一步鉴定;无血凝活性者将其尿囊液~羊水及其肺悬液混合物盲传2代仍无血凝活性者弃去,

2.2病毒的血清学鉴定

2.2.17mL/L豚鼠红细胞悬液的制备按文献 2 方法进行,

2.2.2血清中非特异性抑制因子的去除按文献 2 方法进行,

2.2.3红细胞凝集(A)试验按常规微量法 3 进行,以出现完全凝集的病毒最大稀释度为该样品的一个血凝(A)单位即A价,

2.2.4红细胞凝集抑制(I)试验按常规微量法 3 进行,先用ND标准阳性血清分别与A阳性的鸡胚尿囊液和羊水进行I试验ND阴性的样品再与流感病毒1~2~3~5~9标准阳性血清进行I试验,以能完全抑制7mL/L豚鼠红细胞的凝集的血清最高稀释倍数为其I价,I价小于或等于2log2(或40)判定I试验阴性;I价大于或等于3log2(即80倍稀释)为阳性,

2.2.5AGP试验将A阳性的鸡胚尿囊液或羊水适当浓缩后用2.5mL/L甲醛置4冰箱灭活过夜冻融数次即为SIV分离物AGP抗原AGP试验按常规方法 4 进行,

2.2.6神经氨酸酶抑制(NI)试验ND I试验阴性的样品与流感病毒N1~N2标准阳性血清进行NI试验其操作程序与判定标准均按文献方法 4 进行,呈现粉红色为神经氨酸酶活性浅黄色或无色为神经氨酸酶抑制活性,

2.3SIV的形态学鉴定

将待检病毒尿囊液或羊水以1000g离心15min 上清以40000g离心30min沉淀用100:L生理盐水悬浮以20mL/L(2%)磷钨酸(PTA)负染电镜观察并照相,

2.4SIV的命名

根据1980年世界卫生组织公布的流感病毒通用命名系统进行命名SIV分离株名称中包括型别(A~B~ C)/宿主来源/分离地点/毒株序号/分离年代(血凝素及神经氨酸酶抗原亚型)几项内容,

2.5SI的血清学检测

所用抗原为禽源副粘病毒~禽源DKAT63 (1N1)~TKUK68(3N2)及猪源SWTN77(1N1)~ SWCO77(3N2)流感病毒,所有被检血清样品均按文献 2 方法处理以除去非特异性抑制因子按文献 3 方法进行I试验记录其I价,

3结果

3.1流行病学调查结果

我们对所采病料或所收集到的SIV初步分离物及血清学调查的原发病猪场进行SI的流行病学调查结果如下,

3.1.1猪群历史或发病情况调查从黑龙江省分离的SIV主要来自哈尔滨地区~大庆地区和佳木斯地区病毒分离阳性猪场大多为规模化养猪场也有极少数来自村屯的庭院个体养殖户,夏末到深秋季节从采集的样品中病毒分离阳性率最高只有

4.9%;从深秋到整个冬季采样的每个猪场和屠宰场几乎都可分离到病毒猪群都有不同程度的呼吸道症状病毒分离阳性率最高可达

18.9%死亡率较低或不出现死亡偶尔可见怀孕母猪流产~产弱仔或死胎,未发现SI的地方性大暴发和流行, 2001年3月浙北地区仔猪产区尚仪~嘉兴等个别乡镇养猪场仔猪出现了一种以呼吸道症状和高热为特征的猪呼吸道传染病6月份蔓延至周边城区7月份疫情扩大有3个县大片流行并逐步向浙南扩散个体农户~集约化猪场均出现传播快发病率高死亡主要出现在窝内仔猪~架子猪哺乳仔猪死亡率在80.9%~ 100%养猪密度越高的地区病情越严重,

嘉善县某猪场主要以水路与外界相连完成饲料~生猪~畜产品等与外界的运输,2001年6月持续高温后突降暴雨6月底洪水漫进第1栋猪舍南侧并由南向北蔓延,6月27日洪水过后产后母猪一夜之间全部表现高热平均41最高达42.9架子猪发病率几乎达100%但未出现死亡;7月19日第2批母猪发病其中20头反复发病内二元和外二元母猪都有发病;7月28日第3批母猪发病8月10日1头大约克母猪死亡2头长白猪死亡;之后仔猪开始发病但未出现死亡,母猪出现流产~早产或产木乃伊胎1头死亡乳猪死亡率高,死亡猪临床出现高热~食欲下降~精神不振~不愿走动~皮肤潮红~先流清鼻水后流脓性鼻液;剖检可见全身淋巴结出血~水肿有些呈大理石样;心脏柔软~心壁变薄~心肌迟缓~出血严重心包纤维素性渗出物包裹胸腔严重纤维素性渗出;肺萎缩~呈深褐色肺间质变宽~并呈大理石或肉样变,抗生素早期用药症状缓解食欲增加;发病高峰时抗生素诊断性治疗效果不明显改善饲养条件半个月后自行康复愈后良好,此次疫情8月份已波及到10多个县9月份仍为流行高峰此后流行趋缓~发病减少10月份仅有部分县发生,此次发病传播迅速~发病面广病情复杂调查发现部分猪场同时存在SI~PRRS及猪伪狂犬病(PPV)的混合感染其血清抗禽源1N1~3N2和抗猪源

86动物医学进展2003年第24卷第3期(总第125期)

H1N1~H3N2流感病毒抗体阳性率分别为1.8%(4/ 225)~10.7%(24/225)和5.3%(12/225)~86.2%(194/ 225)[2];PRRS和PPV的血清抗体阳性率分别为69.72%(76/109)和2.78%(2/72)[5]病原检测结果表明PRRS~SI~猪瘟病毒及细菌的检出率分别为100% (7/7)~28.6%(6/21)~10.52%(2/19)~61.54%(8/ 13)[5]从不同地区部分高热症病死猪体中检测到的细菌主要有链球菌~大肠杆菌~沙门氏杆菌~巴氏杆菌等有部分检出弓形体

河南省自2001年6月份自南向北(先驻马店后许昌)自东向西(先商丘后开封)在大范围猪群中(包括母猪~小猪~断奶猪~育肥猪)流行一种发病率高~死亡率低~病程长~药物治疗效果差的疫病其主要特征为,各年龄猪均发病均出现呼吸道症状高热食欲减少或废绝粪便时干时稀妊娠母猪流产~早产或产弱仔~死胎~木乃伊胎仔猪皮肤发红断奶猪耳尖~肚脐紫红少数猪场的育肥猪经短时间(约10)发烧后不治自愈剖检全身淋巴结肿大~多汁;肝肿大质脆呈紫红色有的出现白色坏死灶肺脏心叶~尖叶肝变~肺尖叶性肺炎肾~膀胱散在出血点大肠充血~出血通过流行病学调查~对近100头病猪剖检观察及实验室诊断结果表明猪群中同时存在SI~PRRS~猪附红细胞体~猪链球菌等病的感染大多病例呈混合感染其血清抗体阳性率分别为

100%(18/18)~56.9%(73/129)~36.1%(83/230)~ 75.6%(197/261)对疑似SI病猪采气管~肺~肺区淋巴结组织后剪碎~研磨加双抗作用后按1=100倍稀释接9~10日龄鸡胚在3代内可分离出SIV

2001年6月中旬江苏省淮安市~扬州市等地出现了SI疫情高峰期波及59个乡镇到8月上旬疫情基本得到控制发病猪只由22.47万头下降到2.06万头下降了90.8%;发病率由50%下降到20%

2001年7月安徽省天长市猪群发生以高热和呼吸道炎症为主的传染病传播迅速来势凶猛没有明显的发病日龄~性别~品种差异经调查发现肥猪~母猪最早发病然后种公猪~架子猪~仔猪~乳猪先后感染发病发病率高达100%死亡率各地不一致一般不超过5% ~10%但乳猪死亡率较高可达50%左右7月1日天长市高庙乡某村村民所养的猪最先发病到7月27日全市36个乡镇中有27个乡镇都有该病流行至8月中旬几乎波及全市所有乡镇的猪场患猪高热稽留对症治疗后体温即短时间下降如不继续用药体温又回升到40C以上其临床表现为发病突然全群几乎同时发病一个自然村庄在1~2内猪都会感染发病发病初期吃食减少或废绝流清水鼻涕后则流浓稠鼻涕眼分泌物增多眼结膜潮红精神萎顿粪便干硬呈栗状小便量少呈黄色呼吸急促~气喘~腹式呼吸呈犬坐姿势常伴有阵发性咳嗽~打喷嚏脊背强直四肢僵硬站立不稳强行驱赶则后肢拖地前进全身皮肤潮红高热稽留40.0~41.6C如不坚持对症用药则会发生抽筋~尖叫~昏厥等神经症状衰竭而死怀孕母猪引起流产~早产~死胎且地方母猪比二元母猪为多哺乳仔猪发生黄~白痢部分粪便带血脱水严重死亡率较高肺有大面积出血点或块状出血性融合肺间质变宽肺气肿有的出现散在的肉样变病程长的猪肺实变呈紫红色如鲜牛肉状;鼻~气管~支气管大面积充血且有粘液呈浓痰状;心壁变薄心肌内膜出血;胃积食肠道空虚气肿;颌下~肩纵隔及肠系膜淋巴结出血~肿大

3.1.2猪场管理~环境及防疫措施的调查我们在对SI进行血清学和病原学调查的同时对猪场环境及综合管理情况进行了调查可以看到80年代以来菜篮子工程的实施促进了中国集约化畜牧生产的发展家家养猪~户户养鸡的中国传统养殖模式已逐渐被区域化~规模化的养殖模式所代替但集约化~工厂化养猪由于其规模大~饲养密度高~应激因素多很容易引起群发性疾病的流行许多规模化猪场都集中在城郊布局密集靠近居民点~工厂~交通干线对猪场的防疫极为不利;同时有些猪场盲目引进国外生产工艺和技术甚至包括畜舍和饲养设备但不引进舍内环境调控和粪污处理设备导致大跨度~高密度饲养的畜舍内环境恶化粪污既不能进行处理又无利用去向任意堆弃排放的现象普遍存在粪便污水严重污染环境致使许多老病久防不止病情反复新的疫病又不断出现和蔓延严重威胁养猪业的健康稳定发展及畜产品的安全

某些省市的部分小猪场~专业户没有坚持自繁自养经常从疫源地引入病猪加之蚊~蝇传播打针时消毒不严造成针头扩散发病后没有及时采取隔离和消毒措施病猪任意买卖造成疫病迅速扩大蔓延

3.2SIV的分离及鉴定

3.2.1SIV的分离及初步鉴定将无菌检验合格的猪鼻棉拭子和病料接种鸡胚后绝大部分鸡胚在24~96 h都不致死鸡胚对照鸡胚也全部健活1306份鼻拭子和病料中有81份样品的鸡胚液对豚鼠红细胞有血凝活性可经鸡胚传代;第4代病毒液HA价达到1256~1 =2048 其中67份具有血凝活性的样品与抗NDV阳性血清的HI试验为阴性鸡胚液具有血凝活性的鸡胚表现为不同程度的全身泛在性出血变化极少数能致死鸡胚死亡鸡胚出血现象严重以头部及肢端出血尤甚将其制成AGP抗原与AGP标准阳性血清反应48h 内出现清晰白色沉淀线并与阳性对照孔之间的沉淀线末端相连接初步鉴定这67份样品分离物为SIV

3.2.2SIV的亚型鉴定及命名将上述初步鉴定为SIV分离阳性的鸡胚液用HI及NI试验进行亚型鉴定结果表明上述不能被NDV标准阳性血清抑制的67份样品分离物的红细胞凝集作用均不同程度被SIV 标准阳性血清所抑制39株为H3N2亚型SIV12株为H1亚型SIV还有其它亚型的SIV其血凝抑制价在1, 160~1,512之间根据流感病毒通用命名法则进行命名将部分SIV分离株的名称及来源列于表1

3.2.3SIV的形态学鉴定取新收获的鸡胚液经离心沉淀和磷钨酸负染后在电镜下可见到球形~椭圆形及杆形的病毒粒子直径平均为100nm囊膜和核有时因病毒粒子的破损而形态不规则如呈长丝状等

3.3SI的血清学调查结果

所有现地血清均经胰酶-加热-高碘酸盐方法处理分别用禽源H1N1~H3N2和猪源H1N1和H3N2作为诊断抗原进行微量HI试验结果见表2

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李海燕等,部分省市猪群猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定

表1中国不同地区部分SIV分离株的来源及命名

Table1Referring of SIV Isolates in Different Regions in China

毒株标准命名(SIV isolates in China)毒株缩写名称(Abbreviated name)地区(Areas) A/SWine/Heilongjiang/8/2000(H3N2)SWHLJ8 00或SWHLJ8东北

A/SWine/Heilongjiang/11/2000(H3N2)SWHLJ11 00或SWHLJ11东北

A/SWine/Heilongjiang/35/2000(H3N2)SWHLJ35 00或SWHLJ35东北

A/SWine/Heilongjiang/74/2000(H3N2)SWHLJ74 00或SWHLJ74东北

A/SWine/Heilongjiang/81/2000(H3N2)SWHLJ81 00或SWHLJ81东北

A/SWine/Heilongjiang/124/2000(H3N2)SWHLJ124 01或SWHLJ124东北

A/SWine/Heilongjiang/432/2001(H3N2)SWHLJ432 01或SWHLJ432东北

A/SWine/Heilongjiang/481/2001(H3N2)SWHLJ481 01或SWHLJ481东北

A/SWine/Heilongjiang/515/2001(H3N2)SWHLJ515 01或SWHLJ515东北

A/SWine/Neimeng/526/2001(H3N2)SWNM526 01或SWNM526东北

A/SWine/Neimeng/547/2001(H3N2)SWNM547 01或SWNMJ547东北

A/SWine/Guangdong/579/2001(H3N2)SWGD579 01或SWGD579华南

A/SWine/Jiangsu/661/2001(H3N2)SWJS661 01或SWGD579华东

A/SWine/Fujian/668/2001(H3N2)SWFJ668 01或SWFJ668华东

A/SWine/Fujian/670/2001(H3N2)SWFJ670 01或SWFJ670华东

A/SWine/Fujian/674/2001(H3N2)SWFJ674 01或SWFJ674华东

A/SWine/Fujian/676/2001(H3N2)SWFJ676 01或SWFJ676华东

A/SWine/Anhui/691/2001(H3N2)SWAH691 01或SWAH691华中

A/SWine/Zhejian/694/2001(H3N2)SWZHJ694 01或SWZHJ694华东

A/SWine/Zhejian/697/2001(H3N2)SWZHJ697 01或SWZHJ697华东

A/SWine/Henan/702/2001(H3N2)SWHN702 01或SWHN702华北

A/SWine/Henan/703/2001(H3N2)SWHN703 01或SWHN703华北

A/SWine/Guangdong/704/2001(H3N2)SWGD704 01或SWGD704华南

A/SWine/Guangdong/706/2001(H3N2)SWGD706 01或SWGD706华南

A/SWine/Guangdong/708/2001(H3N2)SWGD708 01或SWGD708华南

A/SWine/Guangdong/709/2001(H3N2)SWGD709 01或SWGD709华南

A/SWine/Shandong/719/2001(H3N2)SWSHD719 01或SWSHD709华北

A/SWine/Shandong/721/2001(H3N2)SWSHD721 01或SWSHD709华北

A/SWine/Shandong/722/2001(H3N2)SWSHD722 01或SWSHD722华北

A/SWine/Heilongjiang/378/2001(H1N2)SWHLJ378 01或SWHLJ378东北

A/SWine/Heilongjiang/395/2001(H1N1)SWHLJ395 01或SWHLJ395东北

A/SWine/Guangdong/568/2001(H1N2)SWGD568 01或SWGD568华南

A/SWine/Guangdong/591/2001(H1N1)SWGD568 01或SWGD568华南

A/SWine/Shenzhen/639/2001(H1N2)SWSHZH639 01或SWSHZH639华南

A/SWine/Guangdong/710/2001(H1N1)SWGD710 01或SWGD710华南

A/SWine/Guangdong/711/2001(H1N1)SWGD711 01或SWGD711华南

A/SWine/Guangdong/713/2001(H1N2)SWGD713 01或SWGD713华南

A/SWine/Guangdong/714/2001(H1N1)SWGD714 01或SWGD714华南

A/SWine/Guangdong/716/2001(H1N1)SWGD716 01或SWGD716华南

A/SWine/Fujian/679/2001(H1N1)SWFJ679 01或SWFJ679华东

A/SWine/Fujian/685/2001(H1N1)SWFJ685 01或SWFJ685华东

A/SWine/Fujian/686/2001(H1N2)SWFJ686 01或SWFJ686华东

A/SWine/Henan/700/2001(H1N1)SWHN700 01或SWHN700华北

A/SWine/Heilongjiang/62/2001(H?N2)SWHLJ62 01或SWHLJ62东北

A/SWine/Heilongjiang/454/2001(H?N2)SWHLJ454 01或SWHLJ454东北

A/SWine/Guangdong/705/2001(H?N2)SWGD705 01或SWGD705华南

A/SWine/Guangdong/712/2001(H?N2)SWGD712 01或SWGD712华南

A/SWine/Zhejiang/698/2001(H?N2)SWZHJ698 01或SWZHJ698华南

A/SWine/Neimeng/551/2001(H?N2)SWNM551 01或SWNM551华北

3讨论

301SI的危害及流行病学意义

中国是世界上最大的养猪国家9近年中国养猪业已由过去传统的家庭式饲养逐步向规模化方向发展9但由于其饲养规模大\饲养密度高\应激因素多9极易引起SI等群发性疾病的反复流行9已严重威胁中国养猪业的持续稳定发展及畜产品的安全SI是主要的免疫抑制病9其兽医传染病学意义显而易见9但其公共卫生意义更令人关注SIV感染火鸡并引起火鸡流感的暴发已屡见报道9而1976年1月发生了第1例人感染猪源流感病毒的事件后至少有12人因感染猪源流感病毒而死亡因此9了解SI在中国的流行情况及开展SIV流行病

07动物医学进展2003年第24卷第3期(总第125期)

学的研究不仅可促进中国畜牧业的健康稳定发展对预测新的人流感病毒株也起到重要作用其公共卫生意义还体现在人体器官移植的研究中作为人体器官移植供体的猪必须排除SI的感染O

表21997-2001中国不同地区SI的血清学调查

Table2Serological Surveillance of SI in Different RegionS in China from1997to2001

时间(年)time地点血清(份)DKAT69(H1)SWTN77(H1)TKUK63(H3)SWCO77(H3)PMV-I 1997黑龙江10025560 1998黑龙江210009.50 1998河南19100000 1998河北24 4.233.30 4.20 1998湖北47000 4.30 1999黑龙江2500000 1999内蒙150013.326.70 1999河北9000044.4 2000黑龙江2190 1.410.5 3.20 2000辽宁35 2.9 2.911.4160 2000海南1400028.60 2000福建69 4.3 2.911.615.90 2000广东45 2.2 2.211.113.30 2001黑龙江1530 3.0 5.2 3.7 5.2 2001福建4317.426.1031.90 2001上海8002412.50 2001内蒙540 3.70 5.60 2001安徽27 3.77.419.625.90 2001浙江225 1.8 5.310.786.20 2001江苏5000400 2001山东1915.821.10 5.30 2001河南1800 5.510011.1 2001广东1720.5 2.340.552.60 2001深圳3312.115.247.356.40注:血清学调查所显示抗体数据为阳性率O

3.2中国大范围内SI的血清学和流行病学调查

调查中发现目前在中国的猪群都未注射SI疫苗因此猪群中抗流感病毒抗体可以客观地反应猪群受

SI污染的情况O从调查结果看1997年调查的黑龙江省100份猪血清中同时存在抗禽源H1N1~H3N2及抗猪源H1N1~H3N2流感病毒抗体是否存在抗人流感病毒抗体我们没有进行检测O魏启珍等调查发现1981年到1984年黑龙江省松花江~绥化及嫩江地区8月龄 18月龄猪血清中同时存在抗人H1N1和抗人H3N2抗体其抗H1N1和抗H3N2抗体阳性率都在逐年递增并和人群中流感的流行情况呈平行关系说明这几年猪群中感染过H1N1和H3N2人流感病毒而且SI与人流感的流行密切相关O由此看来自20世纪80年代以来黑龙江省的猪群中已同时受到SIV和人流感病毒的感染O从近年的调查情况看猪群也受到AIV的感染说明猪的种间屏障较低不仅对SIV有易感性而且可被AIV和人流感病毒感染O

我们对保存的1998年4个省份的猪血清进行检测发现河北省的24份猪血清中同时存在抗禽源和猪源流感病毒抗体抗体阳性率分别为4.2%33.3% 4.2%;黑龙江和湖北的猪群中只存在抗猪源H3N2流感病毒抗体阳性率分别为9.5%和4.3%从河南省191份猪血清中未检测到抗流感病毒抗体其原因可能有两方面一是猪群确实未受到SI的污染另一原因可能由于血清在保存的过程中抗体滴度已降到检测不到的水平;1999年来自黑龙江和河北的猪血清中均未检测到抗流感病毒抗体内蒙猪血清中同时存在抗禽源和猪源H3N2流感病毒抗体阳性率分别为13.3%和26.7%O

2000-2001年猪群中H3N2SI的污染面更广~污染率更高2000年调查的5个省份和2001年调查的11个省市猪群中均能检测到抗SWCO77(H3N2)毒株的抗体广东~深圳~浙江~河南猪血清中抗体阳性率分别为52.6%~56.4%~86.2%和100%O说明在此期间H3N2亚型SI在我国东北~华北~华中~华东~华南的猪群中普遍存在结合流行病学调查的结果看某些省市猪群已呈现地方性流行并常常与PRRSV~PPV~猪链球菌~猪巴氏杆菌~猪弓形体等其它病原体混合感染使疫情复杂化母猪流产率~产弱仔率及患猪死亡率增高O 值得注意的是广东~深圳~安徽~浙江等省市的猪群中同时存在抗猪源H1N1~H3N2和禽源H1N1~H3N2流感病毒的抗体而且猪群中抗AIV抗体的阳性率和中国近几年禽流感的发生和发展呈平行上升的关系说明在这些地区AIV已跨越了猪-禽的种间屏障在猪群中存在并传播开O可以看出我国猪群中的流感疫情相当复杂特别是在华南和华中沿海地区地处全球候鸟迁徙路线同时该地区水网密布四季放养或混养着鸭~鹅等水禽这一特殊的生态环境加上我国独特的~地理~气候条件和人们的生活习惯使得候鸟~水禽~猪~人频繁接触并交叉循环感染自然成为流感病毒天然的种毒库O流感专家认为在病毒来源和分子流行病学研究上中国是全球流感研究的重点区域是世界新流感亚型出现和流感暴发的疫源地[6-7]O因此H9N2及H1~H3等亚型毒株在中国猪群中存在的情况及潜在的公共卫生意义如何已成为世界同行关注的焦点O基于猪和SIV 在禽流感和人流感流行的中间宿主和混合器作用中国SI的流行动态以及猪群中的SI对中国禽流感和人流感的发生和流行有何意义和作用一直是我们关注和

17

李海燕等:部分省市猪群猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定

研究的重点G

3.3中国不同地区SI病原学的调查研究

2OOO-2OO1年间本研究从我国东北~华北~华中~华东及华南等不同地区的猪群中采集了13OO多份猪病料及鼻拭子经病毒增殖~传代~血清学鉴定及病原形态学鉴定表明从中分离到多株SIV其中39株为H3N2亚型12株为H1亚型此外还有其它亚型的SIV G本研究中一个非常有意义的发现是在分离得到的SIV中有一部分SIV分离株可被禽源H2亚型(A/Duck/Ger-many/1215/73)或人源H2亚型(A/Singapore/1/57和A/Japan/3O5/57)的标准阳性血清抑制血凝抑制价为1:8O~1:128O 这些分离株与H3亚型因子血清也有一定的交互抑制作用从猪群中分离到H2亚型流感病毒至今还未见报道1982-1983年范中华等对中国成都地区6O7份猪血清的调查结果发现猪血清中抗H2N2人流感病毒抗体阳性率达78.3%说明除H3型外H2型流感在成都猪群中也广为流行;我国猪群中确实存在H2亚型SIV?众所周知H2N2亚型流感病毒曾引起1957年的亚洲流感造成约28O万人死亡G我国特殊的生态环境有利于流感病毒的生息~变异猪又是流感病毒基因重组的活载体那么在我国猪群中存在H2亚型流感病毒也不足为奇但却足以使世人关注1对此我们已进行了分子水平的鉴定和进一步的研究G

4小结

本研究首次对中国SI疫情进行了大范围的血清学和病原学研究证实了中国东北~华北~华中~华东~华南~西南地区部分猪群中存在由H1~H3和其它亚型SIV引起的SI G明确了近年中国不同地区猪群中的SI 以H3N2亚型为主H1亚型SI已出现在中国的黑龙江~福建~浙江~广东等地区部分猪群G首次从黑龙江~安徽~山东~河南~江苏~浙江~福建等省猪群中分离到H3N2~H1N1及其它亚型SIV;从我国东北~华南~华东~华中~华北地区部分猪群中共分离到39株H3N2亚型~12株H1亚型及多株其它亚型SIV G黑龙江~安徽~浙江~福建~广东~深圳猪群中同时存在抗SWTN77 (H1)~SWCO77(H3)~DKAT69(H1)~TKUK63(H3)流感病毒的抗体G大量的研究结果表明猪的种间屏障较低具有最大限度被人流感病毒和禽流感病毒感染的能力在人和动物流感病原学和流行病学中具有举足轻重的地位G因此对SI的监测和研究已成为禽流感和人类流感预警预报系统的重要组成部分G

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L I Hai-yan1 2Y U Kang-zhen1 3X IN X iao-guang1 2

L I Y an-bing1 2Y ANG Huan-liang1 2BI Y ing-zuo4WANG Z i-zhen5

(1.Anzma fnf uenza Resealch Centel Halbzn Vetelznal y Resealch fnstztute of CAAS Halbzn Hez ongjzang15OOO1 Chzna;

2.Natzona Key labolatol y of Vetelznal y Bzotechno ogy Halbzn Vetelznal y Resealch fnstztute of CAAS Halbzn Hez ongjzang15OOO1 Chzna;

3.Genela Buleau of Anzma Husbancl y anc Vetelznal y Mznzstl y of Aglzcu tule Bezjzng1OOO26 Chzna;

4.Depaltment of Anzma Sczence South Chzna Aglzcu tula UnzUelszty Guangzhou Guangcong51O642 Chzna;

5.Co ege of Anzma husbancl y anc Vetelznal y Henan Aglzcu tula UnzUelszty Zhengzhou Henan45OOO2 Chzna)

Ab stract:To gain insight into the molecular epidemiology genetic evolution of S W ine Influenza virus(SIV)and spread of SI in China serological and etiological studies of SI W ere carried out in16provinces and cities includ-ing Heilong j iang Jilin L iaoning Shandong Inner Mongolia Jiangsu Anhui Henan Hebei Z he j iang Fu-j iang Hainan Hubei Guangdong and Shanghai.Serological testing W as performed on3895pig serum sam-ples.One thousand and si x viral samples W ere isolated from nasal tract lungs and trachea of virus infected dead pigs.These virus isolates W ere propagated in chicken embryos.The positive cultures W ere further e x am-ined by serological morphological and biological methods.From13O6viral samples collected from nasal tract lungs and trachea of virus infected dead pigs39strains of H3N2 12strains of H1and other subtypes of SIV W ere isolated.The virions e x hibited characteristic features of Orthomy x oviridae e x hibiting various shapes of spherical oval elliptic and elongated forms W ith diameters in the range of8O-12O nm.The H3N2SIV subtype W ere isolated for the first time from Heilong j iang Shandong Jiangsu Anhui Henan Z he j iang and Fu j ian Provinces.Results of serological surveillance from1997to2OO1indicated co-occurrence of anti-SWTN77(H1) SWCO77(H3)DKAT69(H1)TKUK63(H3)SIV antibodies.In Hebei Province33.33%of serum samples W ere positive for SWTN77in1998.In Inner Mongolia13.3%and26.7%of serum samples W ere positive for TKUK63and SWCO77respectively in1999.All the pig herds in2OOO-2OO1surveillance W ere positive for SWCO77antibody and the positive rates W ere56.4%52.6%86.2%and1OO%in Shenzhen SE Z Guang-dong Z he j iang and Henan Provinces respectively.

K e y words:S W ine influenza;s W ine influenza virus;serological studies;isolation and identification 27动物医学进展2OO3年第24卷第3期(总第125期)

部分省市猪群猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定

作者：李海燕， 于康震， 辛晓光， 李雁冰， 蔡雪辉， 杨焕良， 毕英佐， 王自振

作者单位：李海燕(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001)， 于康震

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,黑龙江,哈尔滨,150001;农业部畜牧兽

医总局,北京,100026)， 辛晓光,李雁冰,杨焕良(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物流感

研究中心,黑龙江,哈尔滨,150001)， 蔡雪辉(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技

术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001)， 毕英佐(华南农业大学动物科学学院,广东,广

州,510642)， 王自振(河南农业大学牧医工程学院,河南,郑州,450002)

刊名：

动物医学进展

英文刊名：PROGRESS IN VETERINARY MEDICINE

年，卷(期)：2003,24(3)

被引用次数：64次

参考文献(7条)

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59.黄良宗.顾万军.王淑敏.冼琼珍H3亚型猪流感病毒分离与鉴定[期刊论文]-动物医学进展 2006(6)

60.猪流感分子流行病学及免疫预防研究进展[期刊论文]-动物医学进展 2005(10)

61.陈君彦.李海燕.申之义.陈化兰.于康震.毕英佐H1N1亚型猪流感病毒中国分离株血凝素基因分子演化的研究[期刊论文]-中国预防兽医学报 2005(1)

62.赵朴.李海燕.杨焕良.陈化兰.于康震.卢中华猪流感病毒A/Swine/Inner Mongolia/547/01分离株神经氨酸酶基因的克隆及真核表达[期刊论文]-中国预防兽医学报 2005(1)

63.胡永浩.姚学萍.李海燕.赵有淑.杨焕良.陈化兰H1N1猪流感广东株血凝素基因的克隆与序列分析[期刊论文]-畜牧兽医学报 2005(2)

64.李海燕.于康震.杨焕良.辛晓光.陈君彦.赵朴.毕英佐.陈化兰中国猪源HSN1和H9N2亚型流感病毒的分离鉴定[期刊论文]-中国预防兽医学报 2004(1)

65.黄良宗.马春全.王淑敏.顾万军广东部分地区H1和H3亚型猪流感抗体监测和病毒分离[期刊论文]-畜牧与兽医2011(2)

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犬流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析

犬流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析 摘要：使用Vero细胞接种临床症状疑似感染犬流感病毒（CIV）的犬肺组织，盲传3代，观察其病变情况，收集72 h培养液进行PCR鉴定、血凝特性及形态学观察，同时进行序列测定和分析，并制作系统进化树。结果表明，从犬肺中成功分离出一株犬流感病毒，该病毒能够凝聚豚鼠、猪、鸡抗凝血，电镜观察病毒呈圆形、长丝状等形态多样、大小不等的颗粒状;序列分析表明，与人源、犬源等10株有代表性的流感病毒基因同源性极高，只有少数地方發生了特异变异。这些数据的分析对于犬流感的防控有一定的参考价值。 关键词：犬流感病毒;分离鉴定;基因序列 中图分类号：S858.292 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2019）08-0009-02 犬流感是由犬流感病毒（CIV）引起的犬的一种接触性传染病，该病的主要临床症状表现为发热、流涕和咳嗽。CIV是犬传染性呼吸系统疾病的主要病原之一，其容易引起犬的支气管炎和支气管肺炎，损害呼吸道上皮细胞，给其他病原体的感染创造了条件。该病对于世界各国养犬业的发展也产生了一定的影响。 CIV在分类上属于副黏病毒科副黏病毒亚科如布拉病毒属。其与同属的猴病毒V型、人SV5分离株及人流感病毒等抗原性密切相关。当前，市场上虽然有相关疫苗，但是该病的发生率依然很高，之所以出现这种现象可能与该病毒的不断变异存在一定的关系。基于该原因，分离当前的流行变异株、了解序列变异情况对于该病的预防、诊断及治疗意义重大。本试验对一例疑似犬流感病例的肺组织中分离出的病毒进行了鉴定，并尝试对该病毒中的部分基因序列进行了分析，探讨了其出现遗传变异的情况。现将其报道如下。 1 材料与方法

病毒的分离鉴定

病毒的分离鉴定 Prepared on 22 November 2020

病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体内分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50mlPBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g4℃离心30min。 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。

b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用 4小时。 c)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病 毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2病毒的分离培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 鸡胚接种 a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质 量上的一致。 b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适 温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况 （二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 ②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管， 鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d)接种：

怎样治疗猪流行性感冒

怎样治疗猪流行性感冒（猪流感） 猪流行性感冒（猪流感）是由流感病毒引起猪的一种急性、高度接触引起的呼吸道传染病，如果与猪副、嗜血杆菌或巴氏杆菌混合感染科使病情加重。流感病毒可以再猪和人之间相互传播，猪型流感在历史上曾多次引起人类流感的爆发。 【流行特点】猪流感病毒常能分离到的病毒亚型HINI亚型H3N2亚型，这两种猪源病毒亚型均可感染人，属于A型流感病毒。各种品种、年龄、性别的猪对流感病毒都有易感性，其发病特征为发病急、传播快、发病率高、死亡率低。流行具有明显的季节性，一般多发生于气候易变的秋末、早春和寒冷的冬季，炎热的夏天很少发生，呈地方性流行。通过病猪、带毒猪的呼吸道分泌物传播给易感猪群或人。 【临床症状】本病潜伏期短，为几小时至几天，发病突然，往往在第一头病猪出现后的24小时内，同一猪场的中大部分猪已被感染。病初病猪体温升高，精神极度萎靡，食欲减退或废绝。呼吸急促，咳嗽，打喷嚏，鼻腔流出浆液性或浓性鼻液。眼结膜潮红、流眼泪，卧底不起，难以移动，驱赶时病猪变现疼痛。病程5-7天，惹无并发症3-4天可自行康复。妊娠猪后期可能流产，但极少发生死亡，个别转为慢性的出现持续性咳嗽、消化不良、消瘦，惹并发肺炎则引起死亡。 【病理变化】病猪呼吸道病变最为明显的，鼻、咽、喉、气管、支气管粘膜充血，表面有大量泡沫样黏液，有时混有血丝，胸腔，心包蓄积大量混有纤维素的黏液，肺脏可见气肿，有时水肿和苍白色，界限分明，胃粘膜尤其是胃大弯部充血，脾脏轻度肿大。 【类别鉴定】①与猪霉形体肺炎的鉴别两者均表现体温升高、气喘、咳嗽、流鼻涕等症状。不同点是：猪霉形体肺炎的症状为反复干咳、气喘，一般不打喷嚏，不出现疼痛，病程缓慢且比较长，剖检肺部可见特征性的融合性支气管炎肺炎，尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘呈现“肉样”或“虾肉样”实变。 ②与猪肺炎的鉴别两者均表现为体温升高，呼吸急促、咳嗽、鼻涕流黏液。不同点是：猪肺疫发病急，病猪咽喉部肿胀，呼吸困难、流延，呈犬坐姿势。剖检皮下有大量胶冻样淡黄色或灰青色纤维素浆液，肺部可见纤维素性炎症，切面呈大理石样外观，有时胸膜与肺脏粘连。 ③与猪大叶性肺炎的鉴别两者均表现体温升高、腹式呼吸、流鼻液等症状。不同点是：猪大叶性肺炎无传染性，病猪流铁锈色或红色鼻液，剖检肺部呈现暗红色或紫红色。 【诊断】根据流行特点、临床症状和病理变化综合分析后，可作出判断，进一步明确需要靠实验室检查。实验室检查后常采用病猪细支气管炎渗出物或仔猪咽喉部黏液，进行病毒分离或血清学检查 【预防措施】目前国内尚无猪流行性疫苗生产和应用。如果发病猪群在一个季节内没有重复流行的话，说明康复猪获得的一定的免疫力。 加强饲养管理，消除发病原因，特别是在阴雨潮湿、气候多变时。应保持圈舍清洁卫生。通风干燥。温暖安静，注意消毒，勤换垫料，给足清洁用水，尽量减少或消除与发病有关的各种应急因素。 【治疗方法】目前尚无特效疗法，发病时可采取对症治疗，如果在饮水中加入止咳化痰剂、清热解毒药或使用抗菌药物，以减轻症状，对控制并发症和继发感染有一定的效果。 信息来源：https://www.wendangku.net/doc/2612564043.html,/

病毒的分离与鉴定

病毒的分离与鉴定 （一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离… （一）病毒的分离 病毒分离的一般程序是： 检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状 鸡胚→病变或死亡 细胞培养→细胞病变 →鉴定病毒种型(血清学方法) 无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。 原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。 二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细

2011—2013年辽阳市流感病毒实验室检测结果分析

2011—2013年辽阳市流感病毒实验室检测结果分析 发表时间：2014-04-09T14:43:02.983Z 来源：《中外健康文摘》2013年第39期供稿作者：刘婧媛 [导读] 2011-2013年两年间辽阳市均有流感病毒流行,通过实验室检测得知两年的流行病毒毒株型别不同,证实了流感病毒抗原性变异的特性。 刘婧媛 (辽阳市疾病预防控制中心质量管理科辽宁辽阳 111000） 【摘要】流行性感冒病毒是引起急性呼吸道感染的重要病原，传播迅速,常会引起暴发，甚至造成世界大流行。上世纪流感病毒就引起四次世界大流行，造成相当严重的损失[1]。目的为了探究流感病毒流行和变异规律，了解其根据流感病毒核蛋白（NP），M1蛋白抗原性和基因特性的不同分为甲（A）乙（B）丙（C）三型[2],病毒具有抗原性变异的特性,提供控制流行的科学依据,对 2011—2013年度辽阳市流行性感冒的病原学监测结果进行分析。方法采集流感样病例的咽拭子标本,采用real time-PCR进行核酸检测，分别用人红细胞、狗肾细胞(MDCK)进行病毒分离,采用血凝抑制方法(HAI)进行流感病毒型别鉴定。结果 2011年4月~2012年3月共检测辽阳市流感哨点医院咽拭子标本388份,核酸检测PCR阳性13例，分离到流感病毒10株,阳性分离率为2.58%,经分型鉴定A型H3N2亚型2株(20%),B型Victoria5株(50%),B型Yamagata3株(30%),A型H1N1亚型、新H1N1未检出；2012年4月~2013年3月共检测辽阳市流感哨点医院咽拭子标本593份,核酸检测PCR 阳性40例，分离到流感病毒30株,阳性分离率为5.06%,经分型鉴定A型H1N1亚型2株(6.67%)，A型H3N2亚型,15株(50%),新H1N112株(40%)，B型Yamagata,1株(3.33%)，B型Victoria未检出。结论:2011~2012年度流感流行季节中辽阳市有流感流行,流行的优势毒株为B型,同时有A型H3N2亚型毒株的存在；2012~2013年度流感流行季节中辽阳市有流感流行,流行的优势毒株为A型H3N2亚型和新H1N1,同时有A型H1N1亚型、B型Yamagata毒株的存在。 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）39-0179-02 1.材料和方法 1.1标本 2011年4月1日-2012年3月31日采集的辽阳市中心医院咽拭标本388份；2012年4月1日-2013年3月31日采集的辽阳市中心医院咽拭标本593份。 1.2流感病毒核酸 real time-PCR 1.2.1采用Quant One step RT-PCR kit RNA 提取试剂盒提取流感病毒样本核酸。 1.2.2QIAGEN real time (荧光定量PCR法)检测试剂盒扩增病毒核酸，反应体系见表1 组分体积（μl） 2×QuantiText Probe RT-PCR Master Mix12.5× 上游引物（40μM）0.5× 下游引物（40μM）0.5× Probe （10μM）0.5× QuantiText RT Mix0.25× Rneasy Free Water UP to 25 病毒核酸RNA 5.0× 1.2.3将上述加好的反应体系的反应管放于PCR仪进行反应，反应程序如下：见表2 步骤反应温度(℃)时间(min)是否采集荧光循环数 逆转录酶605否1 5030否1 预扩增9515否1 950.25否45 扩增及荧光收集550.5否45 720.5是45 725否1 1.2.4结果判定及标准 对照：阴性对照无CT值或CT值为零，阳性对照CT值＜30。 样品：CT值≤35报告为阳性。 样品：37≤CT值≤40为灰区，需重新采样检测。 样品：无CT值或CT值为零报告为阴性。 1.3流感病毒分离 上述PCR结果为阳性的样本接种培养好的MDCK细胞生长液，观察细胞病变情况。 1.3.1将已长成单成的MDCK细胞生长液，用DPBS液洗两遍。 1.3.2每瓶接种标本0.5ml，每个标本接种1瓶，轻摇，使标本完全覆盖细胞，置35℃吸附2小时。 1.3.3倒掉感染液，用DPBS液洗两遍，每瓶加入含2μg/ml胰酶的病毒维持液10ml，35℃培养。 1.3.4次日起每天观察有无细胞病变（CPE）并记录，如病变明显细胞脱落可收获并做血凝，如未有病变，继续观察7日收获做血凝。 1.4血凝实验

犬细小病毒的分离与鉴定

犬细小病毒的分离与鉴定 摘要：采用细胞培养法对疑似犬细小病毒的粪便和内脏进行了分离和鉴定，并对分离到的病毒进行生物学特性鉴定和动物回归试验。结果共分离到3株CPV，分离株在猫肾细胞F81产生明显细胞病变，血凝效价达1∶27～1∶210，细胞病变能被犬细小病毒阳性血清所抑制，接种幼犬后，分离株3可以引起试验犬发病死亡。 关键词：犬细小病毒；分离；鉴定 犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）属于细小病毒科细小病毒属，为单股、负义、线形无囊膜的DNA病毒[1]。CPV可引起犬的出血性肠胃炎和心肌炎，并使白细胞大量减少，在幼犬中的发病率和死亡率都很高[2]。CPV对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力，在4～10 ℃存活6个月，37 ℃存活2周，56 ℃存活24 h，80 ℃存活15 min，在粪便中可存活数月至数年[3]；该病毒对乙醚，氯仿和醇类有抵抗力[4]。CPV一年四季均可发病，以冬、春多发[5]，饲养管理条件骤变、长途运输、寒冷、拥挤均可促使该病发生[6]。病犬是主要传染源，其呕吐物、唾液、粪便中均有大量病毒[7]。根据临床症状和血清学反应，可做出准确诊断[8-13]。本研究通过对山东毒株分离，并对其部分生物学特性进行研究，为该病的防治和后续研究提供一定的理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂DMEM培养基为Gibco产品；小牛血清、谷氨酸胺、双抗、胰蛋白酶等购自大连宝生物TaKaRa有限公司；其他化学试剂均为分析纯试剂。 1.1.2 病料病料为2009～2011年聊城大学兽医院收集或其他养犬场送检的可疑CPV病料，包括20份粪便样品和10份脏器。 1.1.3 试验动物和细胞8只40～50日龄的山东细犬幼犬（抗CPV HI抗体效价小于1∶4），健康状况良好；猫肾传代细胞系（F81）和犬肾传代细胞系（MDCK）等由聊城大学农学院实验室保存。 1.2 方法 1.2.1 试剂的配制 1）1%猪红细胞悬液的制备。用20 mL注射器内吸入阿氏液3～5 mL，于健康猪前腔静脉采血10～15 mL，立即混匀，4 ℃保存备用。使用时用PBS洗涤保存的猪红细胞，1 000 r/min离心5 min，洗涤3次，取红细胞泥1 mL加稀释液100 mL，再加入小牛血清白蛋白0.1 g，即为1%猪红细胞悬液。 2）HA抗原配制。用移液器向V型血凝板每孔加稀释液25 μL，然后吸取25 μL经福尔马林灭活的CPV细胞培养物，在血凝板上倍比稀释，最后1孔不稀释，作为阴性对照；接着每孔加稀释液25 μL和1%猪红细胞悬液50 μL，于振荡器上振荡1 min混匀，于4 ℃冰箱静置1～2 h，待红细胞完全沉淀后判定。判定的方法是以50%红细胞凝集为终点，在对照孔红细胞完全不凝集，呈圆形小点

流感病毒的实验室检测方法及进展

·１９０·星堕墅墅盘查！！！！生篁！！鲞釜ｉ塑！里！』曼！！丛！！至！坠：！！塑！！！！：！！：堕！：！ 流感病毒的实验室检测方法及进展 李月越陈杭薇李兵 【摘要】流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其在人群中蔓延快，且具有高发病率及致死率的特点。流感的诊断不仅要根据临床症状和体征，其确诊还有赖于实验室检查。流感病毒的检测技术大致分为４个方面，即病毒分离培养、血清学诊断、现代免疫学诊断及分子生物学诊断。现分别从以上几个方面对流感病毒实验室检测方法及进展进行综述。 【关键词】流感病毒；检测方法 Ｌａｂ帅ｔｏｒｉａｌｍｅｔｈｏｄｓ狮ｄｐ哪哪艄０ｆｄ咖ｔｉＩｌｇｉＩＩｆｌｕ眦ａｖｉｎ麟Ｕｙ访ｙ獬，ＣＨＥＮ协咒ｇ－讹ｉ，ＵＢｉ恕ｇ．＆加仃批，ｚｆｏ，尺Ｐｓ加ｍ￡ｏ删Ｍ毒ｄ觑九８，＆巧ｉ挖ｇＣＤｍ凇挖ｄ＆咒８ｍ￡Ｈｏｓｐｉ￡ｎＺｏ，ＰＬＡ，＆巧锄ｇ１００７００，吼ｉ御 （乃ｒｒ已ｓ户Ｄ行矗ｉ７２９口“腩ｏｒ：（ＨＥ小，Ｈ口ｎｇ一议，Ｐｉ 【ＡｂｓｔＩ’ａｃｔ】Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｃａｕｓｅａｎａｃｕｔｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅｔｈａｔｓｐｒｅａｄｓｅｐｉｄｅｍｉｃａｌｌｙｉｎｔｈｅｈｕｍａｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｏｆＩｎｆｌｕｅｎｚａｉｓｈｉｇｈｍｏｒｂｉｄｉｔｙａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙ．ＤｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｄｅｐｅｎｄｓｏｎｎｏｔｏｎｌｙｃｌｉｎｉｃｉａｌｓｙｍｐｔｏｍｓａｎｄｓｉｎｇｓｂｕｔａｌｓｏｌａｂｏｒａｔｏｒｉａＩｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓ．Ｖｉｒａｌｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｉｍｍｕｍｏｌｏ—ｇｉｃａｌａｓｓａｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏＩｏｇｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓａｒｅｆｏｕｒｍｅｔｈｏｄｓｔｈａｔｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｅｄｆｏｒｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉａｌｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓｏｆｄｅｔｅｃｔｉｎｇｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓａｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｔｈｅｆ０１ｌｏｗｉｎｇｔｅｘｔ． 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ 流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的急 性呼吸道传染病，传染性强，蔓延快，其抗原易变异， 对人群尤其是儿童、老年人及机体免疫力低下的人 群有较高的发病率及致死率，危害很大。流感病毒 分为甲、乙、丙三型，其中变异大的、危害重的主要是 甲型和乙型流感病毒，尤以甲型为主，常可引起较大 范围的流行［１］。 流感的诊断不仅要根据临床症状和体征，还需 要实验室检测来证实。病毒诊断技术大致分为４个 方面，即病毒分离、血清学诊断、现代免疫学诊断及 分子生物学诊断瞳］。现分别进行介绍。 ｌ病毒分离培养 病毒分离培养是诊断流感最可靠的方法之一。 因流感病毒能够在鸡胚中良好生长，所以早期多用 鸡胚分离流感病毒，一般用９日龄至１１日龄的鸡胚 通过羊膜腔或尿囊腔接种分离病毒，接种后２４～９６ｈ 收集鸡胚尿囊液，２４ｈ内死亡的鸡胚弃掉，用鸡的 红细胞检测尿囊液或细胞培养液的血凝活性来证实 病毒的增殖和存在，如初次分离不到病毒，可盲传２ 代再进行检测；但近年来，随着分子生物学技术的发 展，发现通过鸡胚所分离到的流感病毒，其抗原性与 原始标本有所不同，而通过马一达犬１肾细胞（ＭＤＣＫ） 作者单位；１００７００北京军区总院呼吸内科 通讯作者：陈杭薇．综述． 分离病毒的抗原性与原始标本相似，另外由于 ＭＤｃＫ细胞对“ｏ”相毒株的敏感性比鸡胚高很多， 故ＭＤＣＫ细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一 种宿主系统，现亦得到较为广泛的应用；ＭＤＣＫ分 离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此 病毒分离现同时采用鸡胚及ＭＤＣＫ细胞两套系 统口］。但无论是以上哪种方法对标本中病毒采集、 运输及保存条件要求均较高，病毒样品如能在４８ｈ 分离，可在４℃保存，如果样品要存放较长时间必须 低温冻存（一７０℃）；且要求标本中的病毒含量高， 必须达到鸡胚或ＭＤＣＫ培养法所需要的病毒含量， 分离培养较为复杂、耗时且不稳定，也不能在普通实 验室进行，要确诊需要较长时间，故对流感早期诊断 及临床指导意义不大。 Ｓｈｉｈ等Ｈ３将一种新的实验室培养技术——离 心培养技术（ｓｈｅｌｌｖｉａｌｃｕｌｔｕｒｅ，ＳＶＣ）应用于流感病 毒的培养，其与传统培养方法没有本质的区别，不同 点为在标本接种后进行长时间的低速离心，使标本 中含病毒的颗粒在外力作用下被压挤吸附于培养细 胞，从而大大缩短了培养时间并提高了敏感性。在 国内倪安平等口］亦采用ＳＶＣ技术快速诊断流感病 毒，结果显示该技术能在２４ｈ内获得流感病毒培养 结果，可以快速确诊流感患者。 郭元吉等［６３建立了一种流感快速诊断方法，具 体为：采集标本经成片ＭＤＣＫ细胞扩增，使细胞表万方数据

病毒的分离鉴定

病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 1.1.1标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g 4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g 4℃离心30min。 1.1.2 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。 b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用4 小时。

c) 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、 痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2 病毒的分离培养 病毒是严格的细胞寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 1.2.1 鸡胚接种 a) 鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以的受精卵以保证规格质量上 的一致 。 b) 孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱进行,气室向上，孵育的最适温度 为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c) 检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二 天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d) 接种：

猪流感常见问题解答(2021)

Safety issues are often overlooked and replaced by fluke, so you need to learn safety knowledge frequently to remind yourself of safety. （安全管理） 单位：___________________ 姓名：___________________ 日期：___________________ 猪流感常见问题解答(2021)

猪流感常见问题解答(2021)导语：不安全事件带来的危害，人人都懂，但在日常生活或者工作中却往往被忽视，被麻痹，侥幸心理代替，往往要等到确实发生了事故，造成了损失，才会回过头来警醒，所以需要经常学习安全知识来提醒自己注意安全。 猪流感是一种具有高度传染性的猪的急性呼吸道疾病，由几种猪A 型流感病毒其中的一种引起。发病率高死亡率低（1%-4%）。病毒在猪群中通过气溶胶、直接和间接接触传播，无症状携带病毒的猪也可传播。在温带地区，猪间疫情全年均可发生，但秋冬季节发病较多。许多国家常规给猪群接种疫苗来预防猪流感。 猪流感病毒最常见的是H1N1亚型，但是也存在其他的亚型（如 H1N2，H3N1，H3N2）。像感染猪流感病毒一样，猪也能感染禽流感病毒和人类季节性流感病毒。最初曾认为，H3N2猪流感病毒是由人传向猪的。有时，猪能同时感染一种以上的病毒类型，使得这些病毒的基因可以发生重组或重配。这能导致一个流感病毒包含许多来源的基因，称为重组病毒。一般来说，猪流感病毒存在种属特异性、只感染猪，但有时确实能跨越种群屏障引起人类发病。 对人类健康有何影响？ 散在的人感染猪流感病毒病例和暴发都曾偶见报道。一般来说，

病毒分离鉴定技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种繁殖障碍与呼吸困难的传染病。其特征为发病母猪厌食、发热，怀孕后期发生流产、死胎和木乃伊胎，幼龄仔猪发生呼吸道症状[1]。1987年在美国中西部首先发现该病，并分离到病毒，其后在北美、欧洲、亚洲等国家流行。目前该病已在全球范围内传播、蔓延。我国郭宝清等[4]于1996年首次从暴发流产的胎儿中分离到PRRSV。国内诸多血清学检测结果表明，该病在我国许多地方已有流行[5]。河南某猪场"猪场发生临床症状疑似PRRS的传染病，用间接ELISA法检测，呈PRRS 抗体阳性。从病猪肺、淋巴结病料中分离到1株疑似PRRSV，并对其进行了一系列的鉴定。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1病料采自河南某猪场疑似PRRS发病仔猪肺脏及淋巴结。 1.1.2细胞及血清细胞系Marc­145、Vero、PK­15均购自中国兽药监察所；阳性血清购自中国兽药监察所；阴性血清采自无PRRS病史猪场的新生仔猪血清，经中和试验证明为阴性。 1.1.3主要试剂及试剂盒RNasin、dNTP、反转录 Buffer、M­MLV、rTaq酶均购自宝生物(大连)工程有限公司；琼脂糖为 Sigma公司产品；其他常规试剂均为分析纯；UNIQ­10柱式Trizol 总RNA抽提纯化试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.1.4RT­PCR引物设计根据GenBank公布的PRRSV美洲株ORF5核苷酸序列，参照文献[6]自行设计并由宝生物(大连)工程有限公司合成下述一对引物，引物扩增片段长度为720bp；上游引物P1 5′­CTG GAG CCG TGC TAT CAT­3′；下游引物P2 5′­TCC ATT TCA TGA CAC CTG­3′。 1.2方法 1.2.1细胞培养生长液为含100 mL/L新生牛血清(NCS)的RPMI­l640培养液；维持液为含20 mL/L NCS的RPMI­l640培养液。Marc­145、Vero和PK­15细胞均在体积分数为5%的CO2培养箱中于37 ℃培养至单层后传代培养。 1.2.2病料的处理无菌采集发病仔猪的淋巴结、肺脏、脾脏等组织并剪碎，用Hanks液研磨并制成5倍～10倍的乳悬液，反复冻融3次后，经5 000 r/min离心30 min，上清悬液用0.22μm微孔滤膜过滤后，－20 ℃保存备用。 1.2.3病毒的分离将上述处理的病料悬液1 mL分别接种于长成单层的 Marc­145细胞、Vero细胞和PK­15细胞，37 ℃吸附1 h，补加维持液至8 mL，继续培养3 d～5 d，反复冻融3次，收获培养上清液，同时设参考毒株、正常细胞作为对照。出现典型PRRSV细胞病变时按上述方法继续传代，供进一步检测备用，连传5代未出现CPE者判为阴性。

预防猪流感的方法

预防猪流感的方法 猪流感是前段时间大家谈之色变的传染病，如果您家有了宝宝，就更需要注意了。最新研究显示，儿童更易感染猪流感病毒。宝宝该如何有效的预防猪流感呢?什么是猪流感?猪流感是一种由A 型猪流感病毒引起的猪呼吸系统疾病，该病毒可在猪群中造成流 感暴发。通常情况下人类是很少感染猪流感病毒的。但近年也发 现一些人类感染猪流感的病例，患者大多为与病猪有过直接接触 的人，如饲养者等。目前已证实有猪流感病毒在人际间传染的病例，其传染途径通常是通过感染者咳嗽和打喷嚏等。此次疫情特点：感染者大多为年轻人，这需要引起特别关注。宝宝如何预防 猪流感?第一. 预防猪流感尽量少与病源或病源相关的事物接触这 段时间父母最好不要让宝宝到人过多或宠物过多的地方玩，尽量 避免宝宝与实物发生接触。尽量不要身体接触，包括握手、亲吻、共餐等。这样可以起到预防猪流感病源接触的作用。 第二. 预防猪流感平时宝宝应该多注意的几点保持充足睡眠、让 宝宝多锻炼、多洗手、注意室内保持通风，培养宝宝良好的个人 卫生习惯。第三. 预防猪流感宝宝这段时间特别有注意的几点强 烈要求宝宝避免接触流感症状(发热，咳嗽，流涕等)或肺炎等呼 吸道病人;注意宝宝个人卫生，要经常使用消毒液和清水洗手，尤 其在咳嗽或打喷嚏后; 避免接触生猪或前往有猪的场所;避免前往 人群拥挤场所;咳嗽或打喷嚏时用纸巾遮住口鼻，然后将纸巾丢进 垃圾桶。如果确实有需要带宝宝出入这些场所，最好给宝宝带上 口罩之类的预防猪流感工具。

猪流感是前段时间大家谈之色变的传染病，如果您家有了宝宝，就更需要注意了。最新研究显示，儿童更易感染猪流感病毒。宝宝该如何有效的预防猪流感呢? 什么是猪流感? 猪流感是一种由A型猪流感病毒引起的猪呼吸系统疾病，该 病毒可在猪群中造成流感暴发。 通常情况下人类是很少感染猪流感病毒的。但近年也发现一 些人类感染猪流感的病例，患者大多为与病猪有过直接接触的人，如饲养者等。 目前已证实有猪流感病毒在人际间传染的病例，其传染途径 通常是通过感染者咳嗽和打喷嚏等。 此次疫情特点：感染者大多为年轻人，这需要引起特别关注。 宝宝如何预防猪流感? 第一. 预防猪流感尽量少与病源或病源相关的事物接触 这段时间父母最好不要让宝宝到人过多或宠物过多的地方玩，尽量避免宝宝与实物发生接触。尽量不要身体接触，包括握手、 亲吻、共餐等。这样可以起到预防猪流感病源接触的作用。 第二. 预防猪流感平时宝宝应该多注意的几点 保持充足睡眠、让宝宝多锻炼、多洗手、注意室内保持通风，培养宝宝良好的个人卫生习惯。 第三. 预防猪流感宝宝这段时间特别有注意的几点 强烈要求宝宝避免接触流感症状(发热，咳嗽，流涕等)或肺 炎等呼吸道病人;注意宝宝个人卫生，要经常使用消毒液和清水洗

标准操作规程(SOP)——流感病毒的鸡胚分离方法

一、目的 流感病毒的鸡胚分离方法是流感病毒分离方法之一，常用于流感病毒的分离、培养。本SOP 是为确保鸡胚分离流感病毒的操作准确、规范和可靠而制定。 二、范围 适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行流感病毒的鸡胚分离。 三、程序 （一）生物安全要求 H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的鸡胚分离实验室生物安全级别：BSL-3。实验操作人员需进行BSL-3防护，具体详见“生物安全个人防护SOP ”。H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的鸡胚接种和病毒培养液的收获操作必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。 其余流感病毒的鸡胚分离实验室生物安全级别：BSL-2。实验操作人员需进行BSL-2防护，具体详见“生物安全个人防护SOP ”。其余流感病毒的鸡胚接种和病毒培养液的收获操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。 （二）材料 1．9～11日龄SPF 鸡胚 2．照卵灯 3．70%～75％酒精 4．一次性注射器 5．鸡蛋开孔器 6．蜡或医用胶布 7．液体石蜡 8．15mL 无菌离心管、试管架 标准操作规程（SOP ）——分离方法

9．10mL无菌移液管 10．无菌镊子。 （三）实验步骤 1．验卵 （1）用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎的位置。 （2）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全或表面有好多渗水孔，应弃掉。 （3）如何判断鸡胚状态 1）血管：活胚血管清晰，死胚模糊，成淤血带或淤血块 2）胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动。 3）绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限。 2．鸡胚接种 （1）将鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每个鸡胚，通常每个样本接种3个鸡胚。 （2）用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10×6mm裂口。 （3）用注射器吸200μL处理过的临床标本，装上16号针头。 （4）从裂口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层（脏层）铺开，此时在照卵灯下即可清楚的看到鸡胚胎的位 置。将注射针头刺入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进 入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射100μL临床标 本。将针头退出至1/2寸，将另外100 μL临床标本注入鸡胚尿囊腔。 （5）用同一注射器将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚。 （6）用注射器反复吸取2‰次氯酸钠消毒液2~3次后，将针头放于毁形器中销毁，注射器针筒弃于锐器桶中。 （7）用蜡或者消毒过的医用胶布封口。 （8）35℃或37℃温箱（哺乳动物流感病毒35℃培养）培养鸡胚2～3天。 鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24h内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去。

流感病毒分离培养SOP

作业指导书第 1 页共 5 页第1版第1次修订 起草人：王军鹏审核人： 标题：流感病毒分离培养和鉴定标准操作规程批准人：批准日期：2013年12月18日实施日期：2013年12月18日 1. 范围 适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。 2. MDCK细胞培养程序 2.1 生物安全要求 MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。 2.2 材料 2.2.1 生长成片的MDCK细胞 2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶 2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺） 2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000μg/mL硫酸链霉素），分装后保存于 -20℃ 2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液 2.2.6 胎牛血清 2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃ 2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V 2.2.9 1mL、10mL无菌移液管 2.2.10 70％～75％的酒精 注意事项：经常检查试剂使用的有效期。 2.3 实验步骤 这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。 2.3.1 D-MEM培养液的准备 500mL D-MEM液中加入： a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100μg/mL链霉素）。 b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。 c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。 2.3.2 细胞生长液的准备 胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。 2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。 2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。 2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。 2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL

流感病毒采集规范

附件5：流感监测实验技术操作规范 一、流感监测临床标本的采集、运送、处理及流感病毒株的运输 （一）、流感临床标本的采集 病毒分离成功与否很大程度上取决于临床标本的质量，及其保存运输等环节。多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物及尸检组织。标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存。 采样液常用的采样液有以下五种： 普通肉汤、pH 7.4～ 7.6的Hank's、Eagle's、水解乳蛋白液或不加抗菌素的生理盐水（漱喉液）。 为防止采样液生长细菌和真菌，在采样液中需加入抗菌素，加入庆大霉素，其终浓度为 0.1mg/ml,和抗真菌药物，其终浓度为2mg/ml。加入抗菌素以后重新调节pH值为 7.4，配制好以后，分装每个采样管4ml,-20℃冻存。采样方法有以下几种： 1)鼻拭子： 将带有聚丙烯纤维头的拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以另一拭子拭另侧鼻孔。将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。 2)咽拭子： 用带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。注： 亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。

3)鼻咽抽取物： 用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。 先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。 收集抽取的粘液，并用采样液5ml涮洗收集器3次。4)漱口液： 用10ml生理盐水漱喉。漱时让患者头部微后仰，发“噢”声，让生理盐水在咽部转动。然后，用平皿或烧杯收集洗液 5)鼻洗液： 患者取坐姿，头微后仰，用移液管将5ml生理盐水注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。然后让患者低头使生理盐水流出，用平皿或烧杯收集洗液。重复此过程洗两侧鼻孔。 （二）、临床标本运送 新鲜的临床采集标本应在4℃条件下24小时内运送至全国流感监测网络实验室。未能24小时内送至实验室的，应置-70℃或以下保存。标本送至实验室后，病毒分离标本应尽快进行接种分离，24小时内能进行接种的可置于4℃保存，如未能接种应置-70℃或以下保存。 冻存的临床采集标本应在冻存的条件下，低温送至实验室。冻存的标本送到实验室后，24小时内能进行病毒分离的，可以放置4℃保存。如未能分离的标本应置-70℃或以下保存。 临床标本采集管建议使用带螺口的塑料管。 （三）、临床标本处理 临床采集标本送至实验室后，须经处理后再进行病毒的分离接种。含聚丙烯纤维的拭子的采集标本，先将含聚丙烯纤维的拭子在管壁反复挤压后取出。鼻腔或咽部洗液的标本，充分振荡标本管，将粘液打碎。置4℃待其自然沉淀5～10分钟，取上清5ml。上清液可直接接种或低温保存。 鼻咽漱液或抽取液：

甲型H1N1流感疫情(猪流感)

甲型H1N1流感疫情(猪流感） 4月份由墨西哥发端的甲型H1N1流感疫情，目前已蔓延至36国，其中17国/地区已有确诊病例。世卫组织29日将流感大流行警告级别提高到5级，这意味着人与人之间传染在同一地区蔓延到至少两国，强烈显示即将发生大流行。 1.什么是猪流感？ 猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV），是猪群中一种可引起地方性流行性感冒的正黏液病毒（Orthomyxoviruses）。目前在实验室里所分离出来的病毒，多被辨识为C型流感病毒，或者是A型流感病毒的亚种之一。电子显微镜下的A型流感病毒猪流感有很多个不同的品种，计有：H1N1、H1N2、H3N1、H3N2和H2N3亚型的甲型流感病毒都能导致猪流感的感染。 现在在墨西哥爆发的猪流感是由A型流感病毒引起的猪呼吸道传染病，初步研究检测出这种病毒是Ａ型流感病毒，携带有Ｈ1Ｎ1亚型猪流感病毒毒株，包含有禽流感、猪流感和人流感三种流感病毒的脱氧核糖核酸基因片断，同时拥有亚洲猪流感和非洲猪流感病毒特征。 路透社援引美国科学家的研究成果报道，称这种新型流感病毒为猪流感，是因为科学家曾在患者体内检测出Ｈ1Ｎ1亚型猪流感病毒毒株，但这种新型流感病毒具有病毒杂交特性。 世界卫生组织称，这次引发猪流感的病毒是禽流感和人类流感经过“洗牌效应”产生的新病毒。不同的病毒相遇后交换基因，变异为新型的混种病毒，因此人类对其缺乏免疫力。这将使得此次猪流感疫情的波及范围和后续影响难以估测。但该病毒的攻击性，人体免疫力的个体差异和人类从对抗各种流行性感冒中所获取的综合抵抗力都是决定这次疫情状况的决定性因素。 根据美国的纪录，人类感染H1N1猪流感病毒疫情曾在1976年和1988年出现，造成两人死亡。 2.猪流感会有什么症状？ 流感病毒的跨物种性也会使人类感染猪流感病毒，其症状与普通流行性感冒类似，但严重程度却有天壤之别。一般为突然发烧到38度以上，咳嗽，头痛，关节疼痛，鼻塞，全身乏力以及没有胃口。一些感染了病毒的人还会出现流鼻涕，咽喉痛，恶心、呕吐以及腹泻等症状。在以前发现的一些病例中，猪流感还能使人感染肺炎，呼吸出现衰竭，以及健康状况慢性恶化。而也有些患者无任何不适，有些则足以致死。香港大学微生物学系袁国勇教授指出，猪流感主要对抵抗力弱的人威胁较大。所以，只要保持身体健康，坚持体育锻炼，民众不需要过于担心。

病毒的分离与测定

第二十九讲病毒的分离与测定 教学目的：掌握病毒效价的测定方法 教学重点：噬斑法、终点法 教学难点：病毒的分离与鉴定 课时分布：1学时 教学过程： 一、病毒的分离与纯化 1、病毒的分离 病毒的分离是将疑有病毒的样品经处理后，接种于敏感的宿主，经培育后，通过检查其特异性病理表现或其它方法以肯定病毒的存在。 （1）标本的采集与处理标本应含有足够量的活病毒；加入抗菌素除细菌；研磨或超声波处理破碎细胞，让病毒充分释放出来；标本处理后立即接种，否则冷冻保藏。 （2）标本接种与感染表现接种实验宿主（动植物、细菌）、鸡胚或细胞（要求：操作简单、易于培养、产生的感染结果易判定）。噬菌体以噬菌斑为标记；动物病毒产生致细胞病变效应；植物病毒致敏感质感植物出现坏死斑或枯斑。 2、病毒纯化 通过分离得到的是病毒感染的宿主机体、组织或破细胞后的抽提物，或感染的宿主的体液、血液和分泌物，或培养液，须将杂质成分除去。 （1）病毒纯化的标准：纯化的病毒制备物应保持其感染性；纯化的病毒毒粒应具有均一性。 （2）病毒纯化的方法毒粒的主要成分是蛋白质，故可利用蛋白质提纯方法纯化；毒粒具一定的大小、形状和密度，可离心提取。 二、病毒的测定 在谷氨酸、抗菌素、酶制剂等生产中，经常出现不正常的发酵现象。发酵缓慢、发酵液含菌数下降、菌体畸形、耗糖缓慢或停止，镜检时发现有云雾状碎片，严重时以致倒罐。

1、病毒的物理颗粒计数 （1）电镜下直接计数 （2）血细胞凝集试验许多有包膜的动物病毒能在一定条件下凝集一定种类的脊椎动物红血球，凝集量与病毒浓度成正比。 此外，可根据病毒的抗原性质，与抗体发生特异性结合，利用分光光度计对病毒进行定量。但灵敏度较低，多在特殊情况下使用。总之，该方法测得的是有活力与无活力病毒数量的总和。 2、病毒的感染性测定 测定的是因感染所引起宿主或细胞发生某一特异性病理反应的病毒数量。 病毒感染单位：能引起宿主或宿主细胞一定特异性反应的病毒最小剂量。 病毒效价：指单位体积病毒悬液的感染单位数目。 （1）噬菌斑的测定 噬菌斑：噬菌体感染敏感细胞后，通过复制使宿主细胞裂解，释放大量噬菌体，扩散到周围的细胞中，继续侵染，从而在有噬菌体的地方形成一个透亮无菌近似圆形的空斑。它是phage存在的一种指示性指标。 在液体培养基中培养物变清。一个phage产生一个噬菌斑，故可根据在固培上形成的噬菌斑数测得phage的效价。通常是将噬菌体悬液分别与高浓度的敏感细菌以及半固体琼脂均匀混合后涂布在较高浓度的营养琼脂上，培养后计算噬菌斑数便可算出噬菌体效价。 ①双层平板法 底层培养基10ml 上层培养基4ml、凝固 指示菌0.2 ml、检样0.1 ml →32℃16-24h 测定前，事先配制含2%和1%的琼脂底层培养基和上层培养基，将铺成平板，用无菌吸管吸取一定量的指示菌和被测样品与上层培养基混合，冷到45℃迅速倒在底层平板上铺平，凝固后恒温培养16—20小时，如有phage存在，则在双层琼