乳酸菌鉴定方法在食品工业中的应用及研究进展

ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＦｏｏｄＩｎｄｕｓｔｒｙ

废鞠疑硪竞迸晨

段宇珩。谈重芳，王雁萍，秦广雍，霍裕平

（郑州大学物理工程学院离子束生物工程省重点实验室，河南郑州４５００５２）

摘要：乳酸茵是食品发酵工业中一类重要的茵种，准确快速的乳

酸茵分类鉴定是十分必要的。本文对目前使用的乳酸茵

表型特征鉴定和基因型特征鉴定乳酸茵方法及各种方法

的优缺点进行了综述。

关ｔ词：乳酸茵，食品，鉴定

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ（ＬＡＢ）ｉＳｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔ

ｉｍｐｏｒｔａｎｔｇｒｏｕｐｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｔｏｔｈｅｆｏｏｄ

ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｔｈｅｃｏｒｒｅｃｔｓｐｅｃｉｅｓ

ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＬＡＢｉＳｖｅｒｙｉｍｐｏｒｔａｎｔ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒ

ｐｒｏｖｉｄｅｓａｎｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎｄｇｅｎｏｔｙｐｉｃ

ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｔｈａｔａｒｅｃｕｒｒｅｎｔｌｙｕｓｅｄｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ＯｆＬＡＢ．ａｎｄｔｈｅｍｅｒｉｔａｎｄｓｈｏｒｔｃｏｍｉｎｇｏｆａｌＩｋｉｎｄｓ

ｏｆｍｅｔｈｏｄｓａｒｅｄｅｓｃｒｉｂｅｄ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ（ＬＡＢ）；ｆｏｏｄ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

中图分类号：ＴＳ２５２．１文献标识码：Ａ

文章编号：１００２—０３０６（２００７）０２—０２４２—０３

乳酸菌是一类革兰氏阳性、利用可发酵糖产生

大量乳酸的细菌的通称。乳酸菌是广义范畴的概念，

是非正式、非规范的细菌分类学名称【１】。乳酸菌广泛

地存在于自然界、动植物体、乳制品和发酵食品中，

且大多数为非致病菌，属于有益微生物，是人体正常

菌群。人们在生产和应用中要利用乳酸菌，需要了解

它们的生物学特性，因此对乳酸菌进行快速、可靠的

分类和鉴定在微生物学和食品科学的研究中是必需

的。在乳酸菌分类鉴定方面，如以形态学、生理生化

和化学特征等表型特征为主要指标，则可能由于乳

酸菌形态多样，且易受培养条件的影响，加之生理生

化特征极其相似，很难对乳酸菌相近种属做出正确

鉴定，在相同种属不同菌株的鉴定方面更是非常困

难。随着分子生物学的发展，包括Ｇ＋Ｃｍ０１％测定、

收稿日期：作者简介：

基金项目：２００６一０５—１１

段宇珩（１９８０一），男，博士研究生，主要从事蔬菜和乳制品

中乳酸茵的分类鉴定及应用研究。

国家“十五”科技攻关项目资助课题（２００１ＢＡ３０２Ｂ一０３）。

ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ、ＤＧＧＥ、ＴＧＧＥ、ＤＮＡ—ＤＮＡ杂交、ＤＮＡ—

ＲＮＡ杂交、ｒｅｐ—ＰＣＲ、１６ＳｒＲＮＡ序列测定以及与ＰＣＲ

相结合的核酸探针杂交技术等基因型和系统发育特

征用于乳酸菌的分类鉴定。

１表型特征鉴定

在食品工业和应用研究中，表型性状测定仍然

是乳酸菌鉴定的重要依据，包括形态学和生理学特

征的测定，主要依据细菌的菌落特征、菌体形态、生

理生化特性和代谢产物等。在乳酸菌的工业应用中，

并不需要把所有的乳酸菌都鉴定到种的水平，乳酸

菌的分类要根据实践需要、工作量的大小、时间以及

成本来衡量分类到何种水平。一般情况下，表型鉴定

是一种比较廉价的方法，Ｇｏｎｚａｌｅｚ等【２】利用４４种形

态学和生理学特征对淡水鱼及其生活环境中分离到

的２４９－ｔ朱￥Ｌ酸菌进行鉴定，其中９０％以上的分离株

被鉴定到属的水平。目前已经有一些比较受欢迎的

微生物鉴定体系，如ＡＰＩ、ＢＩＯＬＯＧ和ＡＰｌ５０ＣＨＬ等

应用于微生物的鉴定。Ｃｏｒｓｅｔｔｉ等［３１利用ＡＰｌ５０ＣＨＬ

体系分析了３１７株可能为乳酸菌的菌株，只有３８％

分离株被鉴定到种的水平。Ｗｉｊｔｚｅｓ等【４】利用两种碳源

发酵测试体系也未能将１４种乳酸菌分离株鉴定到

种的水平。这些研究说明由于表型法鉴定重复性较

差和分辨率较低，因而有一定的限制性，一般只能鉴

定到属的水平。

相比而言，利用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析乳酸菌的整个

细胞的蛋白质是一种更加值得信赖的鉴定方法。

Ｌｅｉｓｎｅｒ等嘲利用蛋白质谱成功的将从马来群岛调味

品中分离到的６４株乳酸菌鉴定到种的水平。

Ｔｅｍｍｅｒｍａｎ等同利用该方法将３５５株乳酸菌鉴定到

种的水平。这种方法的分类学可靠性和重复性大大

提高，缺点是工作量很大。出ｃ＃ｌ－，该方法在嗜酸乳杆

菌的一些亚种和植物乳杆菌的一些亚种鉴定时，分

　万方数据

辨能力较蓑。

其他表型分类的方法，包括薄层Ｊ翼析法分析有机酸以及脂肪酸甲酯等，但这些方法成功率比较低。为，碍到较好的乳酸蔺分类绺粜，经常利用多种表型方法共同鉴定，一种鉴定方法的优点可以弥补另外一种鉴定与‘法的缺点。

表型法嚣定之所以到现在仍然受欢迎的原因是羼为操作过程中不需要特殊的仪器，黻及对罄定数据库且．有一定的实用性。值得注意的是，有时候这些数据库精确的分类学背景比较欠缺，或根本就没有。虽然应用表型性状鉴定对…些乳酸菌是菲常有用的，但对某些乳酸菌来说，即使表型性状很相似，也并不意味着基凶型亲源关系很近。徉这种情况下，必蕊利用藻因型特征束进一步箍定。另外，裹型性状攘定的缺点还包括煎复性比较塞叁，经常会由于培养条件的不同而导致某蟪结果难以判断。

２基因型方法

在过去的二卜多年中，应用于细菌分类学的一系列基于ＤＮＡ的鉴定方法发展十分迅速。基因型方法大多依赖于ＰＣＲ求选择性的扩增特殊目的ＤＮＡ

片段，扶衙得到所需要纳信息，不同的赫困型方ｉ砉展示不同的分类水平。而日．这娄方法最大的优点是不依赖培葬条件，不会冈为培养条件的变化而产生不同翡结果。

２．１ＲＡＰＤ

随机扩增多态性ＤＮＡ技术（ＲａｎｄｏｍＡｍｐｌｉｆｔｅｄ

ＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，ＲＡＰＤ）甓以ＰＣＲ扩增为基稿的分子技术。它以基因组ＤＮＡ为模板，采用随机引物

进行ＰＣＲ扩增，获得多态性的ＤＮＡ片段，经凝胶电泳分据蒜，进行术知毽株的分娄和鉴定。剥崩ＲＡＰＤ方法鉴定黼种时，分辨率高，并且不必知道基因组ＤＮＡ的任何序列信息。ＲＡＰＤ图谱作为一种分子标记，具有种属、甚至种阉特异性。缺点尾霞复件很差，反，泣条件稍有变化就会政变电泳图谱的多态性，而且ＲＡＰＤ技术很难将乳酸菌熊定到种的水平，似可以和其他技术共同耀于乳酸蔺的鉴定。如Ａｎｔｏｎｓｓｏｎ等晴先将分离自奶酪的３３株乳酸菌分为１０个ＲＡＰＤ型（ＲＡＰＤｔｙｐｅｓ），再用温度梯度凝胶电泳（ＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＧｒａｄｉｅｎｔＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）技术将这謦细菌撩定到种的承平。Ｃｕｓｉｃｋ等懵’剥娜改进ＲＡＰＤ技术，将有些乳酸菌黪定到种和菌株的水平。

２１２变性梯度凝胶电泳ＰＧＲ／ＤＧＧＥ和温度梯度凝胶电泳ＰＣＲ库ＧＧＥ

ＤＧＧＥ，Ｉ．ＧＣＥ是适合于研究复杂环境群体微生物的方法，可以针对优势或重要种属研究复杂微生物群落结构及徽生物多样性。该方法是可以选择性地针对微生物群落中的某一娄细菌进行特异件ＰＣＲ

／１０１．２８Ｊｍ．０２，２００７

扩增，再将扩增产物在ＴＧＧＥ／ＤＧＧＥ胶上分离并辫析该类群?ｆ＿】的细菌组成，能够提供有关群体变化和差异的信息。１）ＧＧＥ／ＴＧＧＥ带谱中每条带可熊代表一个不同的微生物物种，电泳带谱巾条带的数寨反映环境微生物茁落中优势娄群的数量嘲。为了得到更详细的信息，往往采用种或粪群专一性探针与得到的条带进行杂交或建立细菌１６ＳｒＤＮＡ文库或将条带切割下来篮新扩增君进行测序，驮瞬避行系缝发生发育分析。ＤＧＧＥ／３１ＧＧＥ在检测和鉴定人类胃肠道内分支杆蘸屑和乳酸杆菌属等菌群时是一种非常有效的技术，并可孺以蓝测患者在应用抗串索后胃肠遵藩群灼改变。Ｆａｖｉｅｒ等㈣庸用ＤＧＧＥ技术通过观察两例新生婴儿ｌＯ个多月粪样菌群的动态变化来＿『解婴幼儿胃肠荫群的情况。

在食品发酵过程中，许多微生物很难培养，而且徽堆物种类变化很大。通过ＰＣＲ—ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ技术能够获得关二｛ｊｆ：发酵过程的实时信息，冉助予我们在必要时做出调整，有勘于发现微生物医系中早已存在的微牛物种类，特别是有害微生物。这对于食龃发酵生产、食品质量、食品爱令具有重太的意义。

２，３１６ＳｒＤＮＡ和１６ＳｒＲＮＡ

当未知的细菌需要鉴定时，１６ＳｒＤＮＡ和１６ＳｒＲＮＡ序列的测定赵一种比较好的方法。该方法是对乳酸萤抟１６ＳｒＲＮＡ／ｒＤＮＡ遂行特异扩增盖，再对棱苷酸序列进行测定，并与已知菌种的１６ＳｒＤＮＡ序列进行比较，以此进行乳酸蔺攘定和系统学研究，是强翦比较准礁的方法之一。该方法缺点是比较耗时，测序费用较高。因此许多研究采用测１６ＳｒＤＮＡ部分序列的方法进行乳酸菌的多样性分析。将测出的序捌与ＥＭＢＬ或Ｇｅｎｂａｎｋ的数搬毙对，之后剥用ＤＮＡＤＩＳＴ软件程序计算相似性，并按Ｊｕｋｅｓ－－Ｃａｎｔｏｒ系数转换为矩阵。然后通过软件计算产生系统发育树。Ｋａｕｆｍｍｍ等Ⅲ！设计了扩增双歧枵茁（ｈｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）ｉ６ｓｒＤＮＡ片段的特殊引物，能检测食品中分离到的双歧杆菌属一种的水平。在属的水平上，利用扩增１６ｓｒＲＮＡ的方法将分离自乳酪的５４３株乳酸菌鉴另４到种的水平。１６ｓｒＤＮＡ序列分析在乳酸茁的分类和鉴定中应用得较多，Ｃｈｏｉ等［１２］利用１６ＳｒＤＮＡ测序和ＤＮＡ杂交技术研究了泡菜巾乳酸菌的菌群变化，在泡菜５ｄ的发酵过程中潍执分离Ｙ１２０株乳酸藏，结果发现在发酵的前中期，柠檬明串球菌（Ｌ．ｃｉｔｒｅｕｍ）是优势种，然而在后期主要为清酒乳杆菌（Ｌｓａｋｅ）或弯曲乳杆茧以及短乳耔蔫。

２。４１６Ｓ一２３８ｒＲＮＡ问区

核糖体ＩＴＳ（ＩｎｔｅｒｎａｌＴｒａｎｓｃｒｉｂｅｄＳｐａｃｅｒ）区的序列测定也同样被用于细薷鉴定。棱糖体基因序列的测定是一种非常有效的鉴定手段，根据１６ＳｒＲＮＡ和２３ＳｍＮＡ＿两侧高度保守的区域进行设计引物对１６Ｓ一

　万方数据

ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＦｏｏｄＩｎｄｕｓｔｒｙ

２３ＳｒＲＮＡＩＳＲ进行扩增测序，这种方法需要有已知的基因库数据为基础。此外菌株的内操纵子序列在一定程度上有一定的变化，从而产生难以判断的结果。Ｗａｈｅｒ等【１司依据１６Ｓ一２３ＳｒＲＮＡ的ＩＳＲ设计的引物鉴定干酪乳杆菌，可以区分干酪乳杆菌或类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌以及玉米乳杆菌。Ｓｃａｒｐｅｌｌｉｎｉ等㈣对Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属的现有种的１６Ｓ一２３ＳｒＤＮＡ间区分析，能够进行该属菌种的鉴定。

２．５ＦｔｓＺ

ＦｔｓＺ是一种广泛存在于细菌和古菌中的结构保守的蛋白质，在细胞分裂的过程中起关键的作用，是真核生物中微管蛋白的类似物。研究表明，ＦｔｓＺ具有ＧＴＰａｓｅ的活性，其Ｎ端的一段３００多个氨基酸残基的肽段是ＧＴＰ的结合位点和水解位点，且氨基酸序列比较保守，适用于细菌系统学研究。张斌等ｎ５１通过ＰＣＲ扩增ＦｔｓＺ基因的一段８００ｂｐ的核苷酸，构建了干酪乳杆菌一片球菌及相关乳酸菌的ＦｔｓＺ蛋白系统发育树。将此系统树和１６ＳｒＤＮＡ系统树比较发现二者的拓扑结构非常相似。在两个基因系统树中，片球菌与乳杆菌的种均显示了较近的亲缘关系，而与其＂Ｅ球ｂｔ的乳酸菌，如链球菌和肠球菌的亲缘关系较远。研究还表明ＦｔｓＺ蛋白序列的分辨率高于１６ＳｒＤＮＡ，更适用于乳酸菌种间的系统分类研究。

３结束语

传统的表型、生物化学方法鉴定微生物耗时耗力，而且培养条件的改变可能会引起结果发生变化，导致鉴定结果很不稳定，因此人们希望能找到一种快速、稳定、灵敏的方法用于微生物的分类研究。目前，一系列分子生物学方法有效的用于食品工业和食品发酵进程中乳酸菌的鉴定。我们必须认识到任何技术都不可能达到鉴定所有乳酸菌的目的。食品工业中，有时需要快速、廉价和鉴别程度较低的传统表型特征鉴定，而有时则需要鉴定程度高的分子生物学方法。鉴定时要考虑多种因素，从而选择合适的鉴定方法和决定鉴定到何种水平。

参考文献：

［１］凌代文，东秀珠．乳酸茵的分类鉴定及实验基础［Ｍ］．北京：中国轻工业出版社，１９９９．１—５．

【２】ＧｏｎｚｌｅｚＣＪ，ＥｎｃｉｎａｓＪＰ，Ｇａｒｃｉａ—ＬｏｐｅｚＭＬ，ｅｔａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉ６ｃａｔｉｏｎｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｆｒｏｍｆｒｅｓｈｗａｔｅｒｆｉｓｈｅｓ［Ｊ］．ＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖ０１１７：３８３－３９１．

［３］ＣｏｒｓｅｔｔｉＡ，ＬａｖｅｒｍｉｃｏｃｃａＰ，ＭｏｒｅａＭ，ｅｔａ１．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｙｅａｓｔｓｆｒｏｍｗｈｅａｔ（ｓｐｅｃｉｅｓＴｒｉｔｉｃｕｍｄｕｒｕｍａｎｄＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）

鲩遮

ｓｏｕｒｄｏｕｇｈｓｏｆ

ＳｏｕｔｌｌｅｒｕＩｔａｌｙ［Ｊ】．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，６４：９５－１０４

［４］ＷｉｊｔｚｅｓＴ，ＢｒｕｇｇｅｍａｎＭＲ，ＮｏｕｔＭＪＲ，ｅｔａ１．Ａｃｏｍｐｕｔｅｒｉｓｅｄｓｙｓｔｅｍｆｏｒｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｌａｃｔｉｃ

ａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ【Ｊ】．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖ０１３８：６５－７０．［５］ＬｅｉｓｎｅｒＪＪ，ＶａｎｃａｎｎｅｙｔＭ，ＲｕｓｕｌＧ，ｅｔａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｎｇｔｈｅｐｒｅｄｏｍｉｎａｔｉｎｇｍｉｃｒｏｆｌｏｒａｉｎａｎａｃｉｄ－ｆｅｒｍｅｎｔｅｄｃｏｎｄｉｍｅｎｔ（ｔｅｍｐｏｙａｋ）ｐｏｐｕｌａｒｉｎＭａｌａｙｓｉａ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖ０１６３：１４９－１５７．

［６】ＴｅｍｍｅｒｍａｎＲ，ＭａｓｃｏＬ，ＴＶａｎｈｏｕｔｔｅ，ｅｔａ１．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆａｎｅｓｔｅｄＰＣＲ－ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔａｘｏｎｏｍｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ【Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖ０１６９：６３８０－６３８５．

［７】ＡｎｔｏｎｓｓｏｎＭ，ＭｏｌｉｎＧ，ＡｒｄｏＹ．ＬａｅｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＤａｎｂｏｃｈｅｅｓｅａｓａｄｊｕｎｃｔｃｕｌｔｕｒｅｓｉｎａｃｈｅｅｓｅｍｏｄｅｌｓｙｓｔｅｍ［Ｊ】．ＩｎｔＪＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００３，８５（１－２）：１５９－１６９．

［８】ＣｕｓｉｃｋＳＭ，ＳｕｌｌｉｖａｎＤＪ．Ｕｓｅｏｆａｓｉｎｇｌｅ，ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙｐｒｉｍｅｄ－ＰＣＲｐｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ【Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，６６（５）：２２２７－２２３１．

［９】庞小燕，张宝让，魏桂芳，等．应用ＴＧＧＥ技术分析人肠道中双歧杆菌的组成［Ｊ］．微生物学报，２００５，４５（５）：７３８～７４４．

【１０】ＦａｖｉｅｒＣＦ，ＶａｕｇｈａｎＥＥ，ＤｅＶｏｓＷＭ，ｅｔａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｏｆｓｕｃｃｅｓｓｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎｈｕｍａｎｎｅｏｎａｔｅｓ【Ｊ】．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００２，６８（１）：２２１９～２２６１．

【１１］ＫａｕｆｍａｎｎＰ，ＰｆｅｆｆｅｒｋｏｒｎＡ，ＴｅｕｂｅｒＭ，ｅｔａ１．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｅｃｉｅｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｆｏｏｄｗｉｔＩｌｇｅｎｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ１６ＳｒＲＮＡ—ｔａｒｇｅｔｅｄｐｒｏｂｅｓｂｙｃｏｌｏｎｙｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄＰＣＲ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９７，６３（４）：１２６８—１２７３．

［１２］ＣｈｏｉＩＫ，ＪｕｎｇＳＨ，ＫｉｍＢＪ，ｅｔａ１．Ｎｏｖｅｌｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｃｉｔｒｅｕｍｓｔａｒｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔｅｍｆｏｒｔｈｅ

ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｋｉｍｃｈｉ，ａｆｅｒｍｅｎｔｅｄｃａｂｂａｇｅｐｒｏｄｕｃｔ［Ｊ１．ＡｎｔｏｎｉｅＶａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，２００３，８４（４）：２４７—２５３．

【１３】ＷａｔｅｒＪ，ＴａｎｎｏｃｋＧＷ，Ｔｉｌｓａｌａ—ＴｉｍｉｓｊａｒｖｉＡ，ｅｔａ１．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｏｆｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｅｃｉｅｓｂｙｕｓｉｎｇｄｅｎａｔｕｒｅｇａｒｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ

ａｎｄｓｐｅｃｉｅｓ—ｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，６６（１）：２９７－３０３．

［１４】ＳｅａｒｐｅｌｌｉｎｉＭ，ＭｏｒａＤ，ＣｏｌｏｍｂｏＳ，ｅｔａ１．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＧｅｎｕｓ／Ｓｐｅｃｉｅｓ－ＳｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲＡｎａｌｙｓｉｓｆｏｒＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣａｒｎｏｂ∞ｔｅｎｕｍＳｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，４５：２４～２９．［１５］张斌，东秀珠．ＦｔｓＺ蛋白同源性分析在乳酸茵系统学研究中的应用［Ｊ】．微生物学报，４５（５）：６６１—６６４．

　万方数据

腐乳中乳酸菌的分离与鉴定_王夫杰

腐乳中乳酸菌的分离与鉴定 王夫杰1,鲁绯1*,渠岩2,张建1,黄持都1 (1.北京市食品酿造研究所,北京 100050;2.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083) 摘要:文章主要对青方、白方和红方腐乳中的乳酸菌进行了分离鉴定。从青方和白方腐乳中分别分离到乳酸菌7株和5株,红方中没有分离到乳酸菌。鉴定结果表明,白方中4株为鼠李糖乳杆菌,1株清酒乳杆菌;青方中有1株为植物乳杆菌,1株干酪乳杆菌,3株鼠李糖乳杆菌,2株清酒乳杆菌。最后,对不同菌株的耐盐性和耐酒精性进行了测试。 关键词:腐乳;乳酸菌;分离;鉴定 中图分类号:T S264.25 文献标识码:B 文章编号:1000-9973(2010)07-0098-04 Separation an d identification of lactic acid bacteria isolated from Su fu WANG Fu jie1,LU Fei1*,QU Yan2,ZH ANG Jian1,H UANG Chi du1 (1.Beijing Foo d Brew ing Institute,Beijing100050,China; 2.Fo od Science and Nutr itional Engineering Co lleg e of China A gricultural U niv ersity,Beijing100083,China) Abstract:The lactic acid bacteria in gr ey Sufu、w hite Sufu and red Sufu w er e separated and identify. Seven str ains w ere isolated from gr ey Sufu,five strains w ere iso lated fr om w hite Sufu,no o ne w as i solated fr om red Sufu.The identification show ed that four str ains w ere Lactobacillus rhamnose and one w as Lactobacillus sake in white Sufu.In grey Sufu,three str ains w ere Lacto bacillus rham nose, tw o strains were Lactobacillus sake,the tw o other w ere Lactobacillus plantar um and Lactobacillus ca sei respectiv ely.At last,the salt and alco ho l tolerance of different strains w er e tested. Key words:Sufu;lactic acid bacteria;separ ation;identificatio n 乳酸菌的应用历史非常悠久,4000年前古人已有酸奶饮用的历史。随着现代微生物学的发展,食品级乳酸菌的优良特性已引起食品微生物界的关注,乳酸菌已广泛应用于乳制品、肉制品、果蔬制品、软饮料等食品。乳酸菌在酿造工业中的应用受到越来越多的关注。 腐乳是中国独创的调味品,在世界发酵食品中独树一帜,它既可单独食用,也可用来烹调风味独特的菜肴,被称为 中国奶酪 。商品腐乳中含有高水平的适度耐盐菌,其主导耐盐微生物是耐盐乳酸菌,它在腐乳的腌制和后酵过程中起着非常重要的作用,一定数量的乳酸菌在后酵过程中对腐乳风味物质的形成具有积极意义[1-5]。 乳酸菌是潜在地加快腐乳成熟和改进风味的协同菌株。研究表明,从特定食品中分离出的乳酸菌是该食品进行乳酸发酵的最佳出发菌株,因为它们比其它来源的乳酸菌具有更强的竞争力[6-8]。本文对青方、白方和红方腐乳中的乳酸菌进行了分离纯化和鉴定,旨在揭示腐乳中乳酸菌的群系分布特征,对腐乳发酵中风味乳酸菌的研究和开发提供依据,对乳酸菌应用于腐乳生产、改善腐乳风味的研究提供基础。 1 材料与方法 1.1 样品 收稿日期:2010-03-27 *通讯作者 基金项目:北京市优秀人才培养资助(20081D010*******);北京市自然科学基金(6093022)作者简介:王夫杰(1980-),女,硕士,研究方向为生物技术与发酵工程; 鲁绯,女,副教授,食品科学与工程博士。 98

浅谈乳酸菌在食品工程中应用

浅谈乳酸菌在食品工程中应用 摘要：我国食品行业的发展带动了全民的生活水平，随着食品行业技术的进步，越来越多新型的食品逐渐占据了市场。乳酸菌的诞生给我国的食品领域带来了巨大的发展商机。目前我国的乳酸菌种类之多，不同种类的乳酸菌都能够适应我国的食品生产过程。乳酸菌技术在我国的应用十分广泛，我国也利用其在食品领域取得了许多的进展，给食品行业引领了新的发展方向。本文将详细介绍常用的乳酸菌种类，同时分析各自的特点并详细分析乳酸菌对我国食品工程产生的影响。 关键词：乳酸菌技术；食品发展；应用技术；前景 我国自古以来一直讲究民以食为天的基本准则，饮食的质量安全直接关系到人们的日常生活，现在具备的食品工程已经远远不能够满足人们的实际需求，现如今人们更加追求食品的种类及入口的感觉，大家都十分注重食品的色香味、为了更好的满足广大群众的实际追求，乳酸菌的诞生解决了食品领域的这一问题，可以说乳酸菌是食品行业的一种有效工具，取得了十分广泛的应用。下述内容仅是笔者的个人意见，希望能够对相关的各位工作者有所助益。 1乳酸菌背景简介 乳酸菌是我国的一项新兴技术，它在食品领域的应用十分广泛，越来越多的乳品行业用该项技术能够制造出不同的奶制品，更好地迎合了大众的口味需求，同时也丰富了食品种类。目前乳酸卷在制造酸奶、奶酪等食品领域发挥了重要性的作用，相比于传统的食品工程来说，乳酸菌技术的应用促进了食品行业的发展，由此可以看出乳酸菌的作用之大，与此同时，乳酸菌更加广泛的应用能够增加企业的生产效率，降低应用成本，促进了企业的经济发展，提供了广大的利润空间。 2常见的乳酸菌种类 乳酸菌在我国的食品行业中应用十分广泛，种类也十分繁多，下面笔者将介绍目前应用较广泛的几种乳酸菌。 第一种乳酸菌：啤酒片球菌。该球菌主要在香肠的生产过程中应用十分广泛，生产香肠过程中，此种菌主要能够控制反映过程的pH值，pH值低的环境能够有利于香肠的生产，啤酒片球菌能够抑制反应过程中的腐败菌，降低食品发生腐败的情况，大大降低了不必要的浪费，此外啤酒片球菌还能够确保香肠的入口感良

乳酸菌在发酵食品中的应用

乳酸菌在发酵食品中的应用 段振楠梁华忠罗国超王沁峰谢建将曾泽生 （四川高福记生物科技有限公司，四川成都 611732）摘要：乳酸菌是食品发酵工业中重要的细菌，本文主要阐述了传统发酵泡菜、郫县豆瓣、传统豆酱、酱油、发酵肉制品中乳酸菌所起到的作用及其使用现代生物技术制造的制剂通过人工接种在发酵过程所显现出的效果。同时，阐述了乳酸菌在发酵乳制品中的发酵机理和一些特性功能。并对乳酸菌的应用前景进行了展望和建议。 关键词：乳酸菌，发酵食品，泡菜，豆酱，郫县豆瓣，肉制品发酵 Application Of Lactobacillus In The Fermented Food DUAN Zhen-nan, LIANG Hua-zhong,LUO Guo-chao, WANG Qin-feng, ZENG Ze-sheng,XIE Jian-jiang (SiChuan Gaofuji Biotechnology CO.,Ltd,Chengdu 611732,China) Abstract：Lactic acid bacteria is a important bacteria in food fermentation industry. The article focuses on the function of lactic acid bacteria in traditional fermented kimchi , Bean paste, Pixian traditional miso, soy sauce, fermented meat product and the use of modern biotechnology manufacturing by artificial inoculation in the fermentation process as demonstrated in the results. The article also demonstrate the ferment mechanism and certain features of lactic acid, prospect its applications and provide recommendations. Key words:Lactobacillus; Fermented Food; Kimch; Bean paste ;

乳酸菌菌种分离筛选方法

乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状， 一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常 添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸， 以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养

乳酸菌及在食品中的应用

乳酸菌及其在食品中的应用 系院名称：专业班级：学生姓名：学号：指导教师：

摘要 (3) Abstract (4) 1乳酸菌概述 (5) 1.1乳酸菌种类 (5) 1.2乳酸菌基本特征 (6) 1.3乳酸菌发酵类型 (6) 1.3.1同型乳酸发酵 (6) 1.3.2异型乳酸发酵 (6) 1.4乳酸菌代谢产生的抗菌物质 (6) 1.4.1产生有机酸 (6) 1.4.2产生细菌素 (7) 1.4.3产生过氧化氢 (7) 1.5乳酸菌保健功能 (7) 1.5.1产生特殊酶系 (7) 1.5.2具有粘附性和定植能力 (7) 1.5.3产生抑菌活性代谢产物 (8) 1.5.4降低胆固醇 (8) 1.5.5具有抗变异原性 (8) 1.5.6增强免疫功能 (8) 1.5.7具有营养作用 (9) 2乳酸菌在食品中的应用 (9) 2.1乳酸菌在乳制品中的应用 (9) 2.1.1酸奶 (9) 2.1.2凝固型酸奶 (9) 2.1.3乳酸菌奶粉 (9) 2.1.4酸奶油 (10) 2.1.5酸蛋奶冰淇淋 (10) 2.1.6酵母乳酸菌复合发酵奶 (10) 2.1.7干酪 (10) 2.1.8发酵果冻 (10) 2.2 在蔬菜深加工中的应用 (11) 2.3在肉制品生产中的应用 (11) 2.4乳酸菌在酒类产品中的应用 (11) 2.4.1乳酸茵在白酒中的应用 (11) 2.4.2乳酸菌在葡萄酒中的应用 (12) 3乳酸菌国内外研究现状 (12) 4研究目的与意义 (13) 5发展前景 (14) 参考文献 (15)

致谢 (16) 乳酸菌及其在食品中的应用 邢春卿 （黑龙江工业学院环境工程系，黑龙江鸡西 158100 ） 摘要:乳酸菌通过产生乳酸、分泌乳酸菌素等方式抑制病原菌与腐败微生物的活性，被认为是最有效的抗生素替代物。乳酸菌发酵的食品更是具有改善风味、延长保质期等特点，因此，乳酸菌在食品中的应用范围大大扩展，不再限于传统发酵的乳制品。本文对乳酸菌及乳酸菌的抑菌作用机理和在食品中的应用进行了概述，并列举了乳酸菌发酵的新型乳制品及其他一些食品。 关键词：乳酸菌；抑菌作用；乳酸菌发酵产品；应用前景

乳酸菌的分离与初步鉴定

学院：漓江学院年级专业：09生物技术 组员：吴汉川200913007005 杨隆荷200913007006 李翠200913007007 王志远200913007008 乳酸菌的分离及初步鉴定 一、实验目的 1了解和掌握放线菌的菌种特性和分离方法 2初步掌握军中筛选方法设计 3掌握平菌种的选育 二、实验原理 乳酸菌是指以糖为原料，属于真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科。乳酸细菌科根据细胞呈球状或呈杆状，又分成乳酸杆菌族和链球菌族。 在BCG 牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约1-3 mm，圆形隆起，表面光 的溶滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO 3 解圈。乳酸菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。 乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。乳酸菌革兰氏染色后呈蓝紫色。 平板涂布法平板涂布法是将样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。 生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。 四、实验器材与试剂 含乳酸菌的酸奶、结晶紫、卢哥氏碘液、95%乙醇、蕃红溶液、灭菌CaCO3粉末、NaCl； BCG牛乳培养基：(A)溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿(B.C.G)乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。(B)溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g, pH6.8, 121℃湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将(A)、(B)溶液混合均匀后倒平板。 1000ml烧瓶一个, 无菌培养皿9个, 500ml容量三角瓶2个，25ml无菌移液管1只，20ml无菌试管7只，1ml无菌移液管6只，培养基分装器一个，玻棒2根, 无菌涂布器3只，酒精灯一盏，接种环一个，天平，牛角匙，漏斗，漏斗架，载玻片，盖玻片，pH试纸若干，液体石蜡，棉塞，吸管，牛皮纸，线绳、标签等。 五、实验步骤 1.菌悬液的配制 取1洁净三角瓶，盛以225ml生理盐水；7只洁净试管，各盛9ml的生理盐水；加塞包扎于在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min，得到无菌生理盐水。

乳酸菌及其在食品工业中的应用

乳酸菌及其在食品工业中的应用 陈杰 （宜宾学院食品与科学工程2011级） 摘要：阐述了乳酸菌的定义、基本特征、分类、改善食品的品质和营养、抗菌、降低胆固醇、维持微生态环境、抗肿瘤、抗变异原和增强免疫力功能。综述了乳酸菌在酒类、乳制品、植物蛋白饮料、蔬菜深加工、肉制品生产、食品防腐及保鲜中的应用。 关键词:乳酸菌;分类;发酵特性；食品工业 随着生物技术的发展，对乳酸菌的研究越来越受微生物学家、营养学家、免疫学家和医学家们的关注和重视。由于乳酸菌是人体的正常菌群,也是食品加工和保藏的重要菌种,乳酸菌具有抗菌、降低胆固醇、维持微生态系统平衡、抑癌和增强免疫力等重要生物学功能，赋予食品特殊的风味，改进食品的品质和营养，所以在食品工业中被广泛的运用。 1 乳酸菌的定义 乳酸菌不是分类学上的名词,而是指一群可发酵碳水化合物、产生大量乳酸的革兰氏阳性球菌或杆菌的统称。它们具有以下基本特征:1)细胞为革兰氏阳性;2)细胞形态为杆菌或球菌;3)过氧化氢酶为阴性;4)消耗的葡萄糖50%以上产生乳酸;5)不形成内生孢子;6)无运动性,或极少运动;7)分解蛋白质,但不产生腐败产物;8)脂肪分解能力较弱。 培养特征：乳酸菌能够在空气或氧气下生长，是厌氧菌，耐氧。一方面乳酸菌的生长需要辅助因子，它们大多需要某些维生素(核黄素、硫胺素、泛酸、烟酸、叶酸、生物素)、氨基酸、嘌呤和嘧啶。另一方面乳酸菌具有大部分微生

物所没有的利用乳糖的能力。在固体培养基表面，一般仅形成少量的菌体生物量，仅长出淡色小菌落，直径1～2mm在液体培养基中细菌浓度很低，这些是由营养、代谢等生理特性所决定。 2 乳酸菌的分类 对于乳酸菌的分类,目前尚未有统一的定论,依据《伯杰氏系统细菌学手册》第9版第2卷(1986年),乳酸菌主要归于6个属。另外,工业上应用的肠球菌属和乳球菌属也包括在内。因为双歧杆菌所产的乳酸不足50%,所以双歧杆菌不归于乳酸菌,而单独另辟双歧杆菌属。但考虑其保健作用,双歧杆菌属和肠球菌属也包括到乳酸菌中。 3 乳酸菌的营养和保健功能 乳酸菌能分解食物中的蛋白质、糖类、合成维生素,对脂肪也有微弱的分解能力,能显著提高食物消化率和生物价,改善风味,促进消化吸收,提高营养价值,避免乳糖不耐症的发生,促进钙、磷等元素的吸收。乳酸菌是定居在肠道中的有益菌群,通过代谢产酸降低肠内pH值,或产生抗菌的细菌素,抑制有害菌生长繁殖,维持生态平衡和正常机能。乳酸菌产生的有机酸还能刺激肠管蠕动,增加粪便含水量,有润肠通便功效,对小儿下痢、成人溃疡性肠炎、细菌性下痢有显著治疗效果,并能有效缓解老年人和孕产妇的便秘症状。肠道微生物的水解酶类可以将食物中的致癌物质前体转化为致癌物，乳酸菌的抑癌能力发挥作用的是乳酸菌及其代谢产物对这些酶类(如B一葡萄糖7a-羟化酶、胰蛋白酶等)的抑制作用。乳酸菌细胞直接吸收胆固醇；乳酸菌的胆盐水解酶的活性使胆盐结合态转变为脱合态与胆固醇发生共同沉淀；菌体吸收和共同沉淀的联合作用，不同条件下乳酸菌会表现出某一种作用方式为主的能力。乳酸菌是一种被公认的益生菌，能够刺激免

乳酸菌的提取和鉴定

酸奶中乳酸菌的筛选试验 一、实验目的：熟悉从酸奶中分离和纯化乳酸菌的一般方法 二、实验原理： 市场销售的酸奶主要含乳酸菌，乳酸菌的主要作用是把牛奶中乳糖发酵成乳酸，此外酸奶中还含有其他球菌，利用它产酸等性质可以分离乳酸菌，分离培养基一般添加蛋白胨、酵母膏提供氮源、维生素、生长因子；葡萄糖为可发酵糖类；磷酸氢二钾为酸碱缓冲剂；柠檬酸铵、硫酸镁、硫酸锰、亚硫酸铁、吐温-80和乙酸钠为培养各种乳酸菌提供生长因子，其成分还能抑制某些杂菌；琼脂是培养基的凝固剂。、也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据。 .筛选方法：.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3 的培养基上产生CaCO3 溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。其中培养基中加入CaCO3 的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH、更利于乳酸菌的生长和分离 三、实验药品及仪器 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、乳糖、吐温-80、柠檬酸二铵、CaCO3 、K2HPO4 NaAc·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、琼脂、结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、石蜡、蒸馏水。 仪器：超净工作台、电子显微镜、接种环、恒温培养箱、接

种环、培养皿、涂布环、高压锅、试管、微波炉、电子天平、离心机 四培养基类型 ①改良MRS 培养基（乳酸菌分离培养基）：牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-80 1.0ml（它是一种很好的乳化剂和分散剂也就是说它的作用就是是培养基的营养成分更加的均匀就是对营养成分的再一次优化），K 2HPO4 2g，NaAc·3H2O 5g，柠檬酸二铵2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，补蒸馏水至1000ml（固体培养基中加琼脂 1.5%-2%），调pH 至6.4±0.2，121℃高压灭菌15min ②改良MC 培养基（乳酸菌选择培养基）：牛肉膏5g，蛋白胨5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乳糖20g，CaCO3 10g，琼脂20g，中性红0.05g（指示剂），最终pH6.5±0.2，补蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌15min。 配制方法：1把除CaCO3以外的成分称量溶解后.调PH至6.2～6.4； 2.称取20g CaCO3加入到100mL蒸馏水中，制成CaCO3乳浊液； 3.将培养基和CaCO3乳浊液分开灭菌； 4.倒平板前，待培养基融化冷却后，平板上加入一定量的CaCO3乳浊液，晾干了以后再接种。 五、实验流程 1、吸取酸奶1ml 2、10 倍梯度稀释平板涂布（改良MC Medium） 3、厌氧培养（28℃培养48h）待形成菌落 4、挑取溶钙圈较大的单菌落→ 观察、记录菌落形态与特征 5、Improved MC Medium 划线分离纯化 6、选取溶钙圈较大的单菌落进行G+染色 7、革兰氏阳性菌（G+菌）→ 记录菌株细胞形态

乳酸菌得分离、纯化与鉴定

乳酸菌得分离、纯化与鉴定 第一部分:乳酸菌得分离、纯化 一、实验器材: 1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙; 0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g; 2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤: 1、培养基配制(BCG牛乳培养基): (A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成) (B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2、药品配制 2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀,放置24小时后过滤即可。 2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。 2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭得棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。 2、4 0、1%得吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。混合A与B液即成,按1:100稀释即可。 2、4 生理盐水:称取9g氯化钠,溶解在少量蒸馏水中,稀释到1000毫升。 3、菌悬液得配制

乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养

分子技术在食品乳酸菌分类和鉴定中的应用

分子技术在食品乳酸菌分类和鉴定中的应用 近年来,乳酸菌的各种菌株用于多种食品和益生产品。由于乳酸菌的益生功效为菌株依赖性,而单纯采用表型鉴定方法都无法准确鉴别到种属水平。而基于DNA的基因型鉴定技术,因其检测的准确、稳定和灵敏可以实现乳酸菌种属甚至菌株水平的分类和鉴别。本文对目前的主要分子技术在乳酸菌菌株分类和鉴定中 的应用做一综述。 标签： 乳酸菌;益生菌;鉴定;食品;分子技术 随着人们生活品质的提高,人们广泛关注益生菌食品。益生菌是指一类活的,摄入足够量就可以通过改善肠道微生态平衡而促进人体健康的微生物。目前益生菌中应用较多的是乳杆菌和双歧杆菌。益生菌功效主要集中在维持和调节机体的正常肠道菌群上并由此产生一系列的益生作用,但其益生功效为菌株依赖性。由中国疾控中心营养与食品安全所牵头的研究结果证实,含有B益畅菌(即双歧杆菌DN173010)的酸奶能缩短肠道传输时间,对肠易激综合征人群、便秘人群的胃肠道有明显的改善效果。由于不同菌株改善肠道的机制不同,所以对乳酸菌在菌株水平的鉴定就至关重要。传统的表型法鉴定主要建立在形态学及生理生化特征基础上,但因其种间生化性状相似,单纯使用该法往往无法准确区分各个种。随着分子标记技术的发展,基因型鉴定法以核酸为检测对象,因其更加灵敏和准确而被国内 外学者用于乳酸菌的鉴定。 1 乳酸菌 乳酸菌是存在于人体内的益身菌。按照生化分类法,用于食品中乳酸菌分为5个属:乳秆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、明串珠菌属(Leuconostoc)和汁球菌属,每个属包括多种菌种,某些菌种还包括数个亚种。目前益生菌产品中应用较多的是乳杆菌属(Lactobacillaceae L)和双歧杆菌属(Bifidobacteria B)。乳杆菌属中同型发酵乳秆菌包括:德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、瑞士乳秆菌(L.helveticus)、嗜酸乳秆菌(L.acidophilus)和干酪乳杆菌(L.casei);异型发酵乳杆菌包括:短乳秆菌(L.brevis)和发酵乳杆菌(L.fermentum),主要用于发酵工业。双歧杆菌属目前已知的双歧秆菌有24种,而应用于发酵乳制品生产的仅有5种包括:两歧双歧秆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、短双歧秆菌(B.breve)、婴儿双歧秆菌(B.infantis)和青春双歧杆菌(B.adolescentis),它们都存在于人的肠道内。2001年我国卫生部公布的可用于保健食品的益生菌菌种包括:B.bifidum、B.infantis、B.longum、B.breve、B.adolescentis、L.bulgaricus、L.acidophilus、干酪乳杆菌干酪亚种(L.Casei subsp.casei)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。

PCR技术在乳酸菌分类鉴定中的应用

PCR技术在乳酸菌分类鉴定中的应用 王庭柱，高学军，杨振宇 东北农业大学教育部乳品科学重点实验室（150030） E-mail：wangtingzhu1980@https://www.wendangku.net/doc/9a3785423.html, 摘要：近年来，随着分子生物学和生物信息学的迅速发展，特别是作为生物技术里程碑的PCR技术以及核酸测序和电泳技术的不断改进与完善，产生了许多新的分类学方法，如RAPD、PCR-RFLP、T-RFLP、ARDRA、PCR-SSCP、PCR-DGGE、PCR-TGGE、AFLP、REP-PCR、S-PCR、LCR、LH-PCR、SBCS以及小卫星序列多态性和序列同源性分析等。本文即论述了这些技术在乳酸菌分类鉴定中的应用及其优势和局限性。 关键词：乳酸菌，PCR，分类，鉴定，分子生物学 1. 引言 乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）是一大类缺乏细胞色素、糖代谢主要以乳酸为终产物的革兰氏阳性非芽孢细菌，其过氧化氢酶反应为阴性、耐氧耐酸、营养要求复杂并且严格发酵。LAB这个名称就细菌分类学而言实属一个非正式、非规范的名称。目前从自然界中已发现的这类细菌在分类学上至少可划分为23个属，涉及到的有关菌种则更多，其代表性的菌属有乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、双歧杆菌属、肠球菌属、明串珠菌属、气球菌属、肉杆菌属、酒球菌属、足球菌属、四体球菌属和漫游球菌属等[1,2]。 传统的LAB鉴定方法主要依赖于表型分析，包括形态学观察、生长需要及特性、发酵图谱、细胞壁蛋白分析、血清学以及脂肪酸甲基酯分析等，其中有些技术已被证明适用于某些LAB的鉴定，但是也普遍意识到表型分析的一些缺点，如重现率及辨识能力低、相似的表型特性并不等同于相似的或者关系密切的基因型[3]。表型试验可能的固有问题是，不是每一给定种内的所有菌株都有一个共同的性状，而且即使是同一菌株也可能呈现出一定的生化变异性。此外，实验操作的一点改变也可能产生错误的结果。因此基于表型试验的常规技术并不能对菌株做出明确的鉴定[4]。一般来讲，准确地鉴定一株乳酸菌至菌种的水平，至少需要17种表型实验[5]，但是微生态系统的分离株需要更为简单快速的鉴定方法。因此，需要进行表型特性的分子水平研究和遗传特性的研究。 只有分子生物学技术才能解决LAB鉴定的复杂性。近年来发展起来的核酸技术如DNA 杂交和特定靶序列的扩增技术，对LAB的鉴定是一种改进和补充。在LAB分类学方面，代表性的遗传学方法是限制酶分析（restriction enzyme analysis, REA）的多态性（如PFGE、RFLP 和核糖分型）和PCR技术[3]。REA是进行基因组DNA的限制性内切酶消化。脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis, PFGE）是经酶切后，分离出大量的基因组片段；限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）指的是酶切后含同源序列的酶切片段在长度大小或数目上的差异；而核糖分型（Ribotyping）是以rDNA和/或其间隔区域作为探针，与基因组限制片段进行杂交。PFGE是菌株分类中最有识别力的方法，但是基因组DNA的所有限制片段的完全分离是个困难；迄今，最佳辨识力的遗传探针是种特异性的[6]；而PCR技术以及以PCR为基础的遗传指纹技术和群落分析技术甚至可以进行高度菌株特异性的LAB鉴定。 PCR技术的创立打开了LAB快速鉴定的大门，其不仅操作简便、快速可靠并且灵敏高效，而且还克服了对培养的依赖性（自然界中有85～99.9%的微生物至今还不能进行纯培

乳酸菌及在食品中的应用

乳酸菌及其在食品中的应用 系院名称： 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导教师：

目录 摘要 (3) Abstract (4) 1 乳酸菌概述 (5) 1.1 乳酸菌种类 (5) 1.2 乳酸菌基本特征 (6) 1.3 乳酸菌发酵类型 (6) 1.3.1 同型乳酸发酵 (6) 1.3.2 异型乳酸发酵 (6) 1.4 乳酸菌代谢产生的抗菌物质 (6) 1.4.1 产生有机酸 (6) 1.4.2 产生细菌素 (7) 1.4.3 产生过氧化氢 (7) 1.5 乳酸菌保健功能 (7) 1.5.1 产生特殊酶系 (7) 1.5.2 具有粘附性和定植能力 (7) 1.5.3 产生抑菌活性代谢产物 (8) 1.5.4 降低胆固醇 (8) 1.5.5 具有抗变异原性 (8) 1.5.6 增强免疫功能 (8) 1.5.7 具有营养作用 (9) 2 乳酸菌在食品中的应用 (9) 2.1 乳酸菌在乳制品中的应用 (9) 2.1.1 酸奶 (9) 2.1.2 凝固型酸奶 (9) 2.1.3 乳酸菌奶粉 (9) 2.1.4 酸奶油 (10) 2.1.5 酸蛋奶冰淇淋 (10) 2.1.6 酵母乳酸菌复合发酵奶 (10) 2.1.7 干酪 (10) 2.1.8 发酵果冻 (10) 2.2 在蔬菜深加工中的应用 (11) 2.3 在肉制品生产中的应用 (11) 2.4 乳酸菌在酒类产品中的应用 (11) 2.4.1 乳酸茵在白酒中的应用 (11) 2.4.2 乳酸菌在葡萄酒中的应用 (12) 3 乳酸菌国内外研究现状 (12) 4 研究目的与意义 (13) 5 发展前景 (14) 参考文献 (15) 致谢 (16)

乳酸菌的分离、纯化与鉴定

乳酸菌的分离、纯化与鉴定 第一部分：乳酸菌的分离、纯化 一、实验器材： 1. 实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液（溴甲酚绿、无水乙醇）、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、 95%L 醇、沙黄）、15/乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCI、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL（分析纯）、20gCaCO3固体、酵母膏20g、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g、蔗糖10g ； 2. 仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、 pH试纸、酸乳瓶、培养皿（?9或? 12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml 锥形瓶、250ml 锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤： 1. 培养基配制（BCG牛乳培养基）： （A）溶液：取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml, 混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅 80C灭菌20 min ; （1.6%溴甲苯酚绿（BCG 乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）（B）溶液：酵母膏10g，水500ml, CaCO3 10g琼脂20g,加热溶解，用精密pH 试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121 T高压蒸汽灭菌 20Mi n。 以无菌操作趁热将（A）（B）溶液均匀混合。 2. 药品配制 2.1结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫 2g溶于20ml 95%^醇中）20ml, 1%莊酸氨水溶液80ml。将两液混匀，放置24小时后过滤即可。 2.2卢哥氏碘液：碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。 2.3蕃红溶液：番红2.5g , 95%^醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml 与80ml蒸馏水混匀即可。 2.4 0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g ,95%^醇300ml; B液：0.01% K0H100ml。混合A和B液即成，按1： 100稀释即可。 2.4生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到 1000毫升。

乳酸菌的生理功能及其在食品加工中的应用

乳酸菌的生理功能及其在食品加工中的应用 摘要：本文从乳酸菌的分类鉴定到乳酸菌的生理特性方面入手介绍乳酸菌，并综述了在乳品加工、乳酸菌制剂和饮料、酒类酿造、酱油酿造及腌制酸菜等领域的应用概况，并展望其在食品中的应用。 关键字：乳酸菌生理功能食品应用 乳酸菌是一群能从可发酵性碳水化合物中产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称。它广泛存在于人、畜、禽肠道、许多食品、物料及少数临床药品中[1]。乳酸菌因可以提高食品的营养价值,改善食品风味,提高食品保藏性和附加值,近年来乳酸菌的特殊生理活性和营养功能,正日益引起人们的重视。研究表明[2]乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡,提高食物消化率和生物价,降低血清胆固醇,控制内毒素,抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生,制造营养物质,刺激组织发育,从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。由此可见,乳酸菌的生理功能与机体的生命活动息息相关[3]。由于乳酸菌拥有诸多特性，可广泛用于食品加工行业，制造出诸多美味又健康的食品，加上现代各种加工技术的飞速发展，乳酸菌与人类的关系将更加密切。 1 乳酸菌的分类 乳酸菌是指一类以糖为原料的，消耗葡萄糖50％以上，产生乳酸、革兰氏阳性菌，不形成芽孢，不运动或极少运动的过氧化氢酶阴性的细菌。乳酸菌在自然界中的种类很多，分布极广。目前自然界已发现的这类菌在细菌分类学上划分至少有18 个属，共有200 多种。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的，且具有重要生理功能的菌群，广泛存在于人体的肠道中[4]。乳酸菌包括乳酸杆菌属(Lactobacillus)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠球菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、气球菌属(Aerococcus)、奇异菌属(Atopobium)、漫游球菌属(Vagococcus)、利斯特氏菌属(Listeria)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacilus)、芽孢杆菌属(Bacillus)中的少数种、环丝菌属(Brochothrix)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、孪生菌属(Gemella)和糖球菌属(Saccharococcus)等[5]。乳酸菌主要归属于乳链球菌及乳酸杆菌两大家族，乳酸杆菌与人体保健有着密切的关系，有44 个种，连同亚种共51 个种。 2 乳酸菌的鉴定方法 在乳酸菌分类鉴定方面, 如以形态学、生理生化和化学特征等表型特征为主要指标, 则可能由于乳酸菌形态多样, 且易受培养条件的影响, 加之生理生化特征极其相似, 很难对乳酸菌相近种属做出正确鉴定, 在相同种属不同菌株的鉴定方面更是非常困难[6]。 2.1 表性特征鉴定 在食品工业和应用研究中, 表型性状测定仍然是乳酸菌鉴定的重要依据, 包

乳酸菌菌株鉴定

分子生物学实验作业 ——用分子生物学方法鉴定菌株 专业：生物化工 姓名：王晓娜 学号：1043111039

鉴定一株乳酸菌菌株 一、实验目的和方法 采用RAPD指纹图谱方法鉴定一株乳酸菌菌株 二、实验材料 2.1 菌株 实验给定的菌株 2.2 试剂 Taq DNA聚合酶、DNA电泳buffer、引物、dNTP、模板DNA

2.3 仪器 台式离心机，PCR仪，稳压稳流电泳仪，紫外检测仪，凝胶成像系统 三、实验步骤 3.1 制备细菌DNA样品 收集菌悬液于1.5mlepp管中，5 000r/min离心5min。去上清，在沉淀中加入567微升 TE缓冲液、30微升10％的SDS、5微升10mg/ml 的溶菌酶后，37℃水浴3h。再加入3微升20mg/ml的蛋白酶K，37℃水浴lh。加入100微升5mol/l NaCl，80微升CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10min。加入等体积的氯仿／异戊醇，12 000r/min离心5min。取上清，加入等体积酚／氯仿／异戊醇，12 000r／min离心5min。取上清，加入2倍体积的冰乙醇，12 000r/min离心10rnin，沉降DNA。去上清，将沉淀吹干，用100微升TE缓冲液(pH8．0)溶解。取l微升 DNA样品，稀释200倍后，紫外测定0D260和0D280。选取浓度1．8≤0D26l／0D280≤2．0的样品。然后，将DNA浓度稀释至48ng/μl作为模板备用。 3.2 PCR反应 扩增体积为25μl (含TapDNA聚合酶2u，10×PCR reaction buffer 2μl，dNTP 2μl，引物lμl，模板DNA 1μl)。扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，38℃复性lmin，72℃延伸2min，进行40个循环后72℃延伸10min。取12μl扩增产物进行电泳，电压为100V，琼脂糖凝胶为l％(0．5×TBE)电泳30—40min，用凝胶成像系统观察

乳酸菌的分离纯化与鉴定

乳酸菌的分离、纯化与鉴定 第一部分:乳酸菌的分离、纯化 一、实验器材: 1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙; 0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g; 2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤: 1、培养基配制(BCG牛乳培养基): (A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成) (B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2、药品配制 2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀,放置24小时后过滤即可。 2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。 2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。 2、4 0、1%的吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。混合A与B液即成,按1:100稀释即可。