Penicillium expansum脂肪酶选择性拆分外消旋萘普生
脂肪酶的概述及应用
脂肪酶的概述与应用 一脂肪酶概述、 脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veeraragavan等）。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。 脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这一现象。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。 脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。 脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸。 酶是一种活性蛋白质。因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。
脂肪酶的微生物生产技术综述
脂肪酶的微生物生产技术综述 By 夏远川 脂肪酶是一种普遍存在于动植物和微生物体内的酶，也是最早研究的酶类之一，早在1834年就有关于兔胰腺脂肪酶活性的报道。[1] 脂肪酶是一类特殊酯键水解酶，一般用于催化水解和合成反应，在油水界面上，它催化三酰甘油的酯键的水解，生成甘油一酯、甘油二酯或直接生成甘油和脂肪酸。[2]脂肪酶还可催化酯类化合物的醇解、酯化、酯交换等反应，且不需要辅酶，在工业生产和研究工作中均有广泛应用。[3] 脂肪酶按作用时的适应温度可分为高温脂肪酶、中温脂肪酶、低温脂肪酶；按适宜pH可分为碱性脂肪酶、中性脂肪酶、酸性脂肪酶。 脂肪酶的主要工业应用方向： 1、洗涤工业：在洗涤剂中添加脂肪酶可使洗涤剂对脂质类污渍的去除效果大大提高，并可减少表面活性剂及无机助剂（尤其是三聚磷酸钠）的用量，大大减少洗涤剂带来的环境污染。用于洗涤剂的脂肪酶为碱性脂肪酶，在碱性范围内有活性、活性不受表面活性剂影响、对氧系漂白剂稳定、热稳定性好，并且由于大多数加酶洗涤剂都适当配有蛋白酶，因此用于洗涤剂的脂肪酶还应具抗蛋白酶降解的能力。[4] 1988年，丹麦NOVO公司将碱性脂肪酶应用于洗涤剂中并推向市场。1992
年，这家公司构建了商业上第一株产脂肪酶菌株。[1] 2、食品工业：油脂改性是食品加工过程中的一个重要环节，脂肪酶可通过催化酯交换、酯转移、水解等反应，改变油脂的的物理化学性质，使便宜的、营养价值低的油脂升级为昂贵的、营养价值高的油脂；此外脂肪酶还可用于合成广泛应用于食品工业的糖酯类产品、合成不带副产物或毒性物质的芳香味酯类化合物、合成抗坏血酸酯类抗氧化剂如异抗坏血酸等。[5] 3、造纸工业：使用脂肪酶处理纸浆可减少胶黏物（绝大多数胶黏物都含有大量酯键）对造纸毛毯网间空隙的堵塞，提高纸机的运行效率和成纸品质，并降低环境污染，减少废水处理的负荷。 此外脂肪酶脱墨技术在废纸利用方面也起到非常大的作用，与传统脱墨技术相比脱墨效果更好环境污染更低，具有很大的优势。[6] 4、皮革生产：脂肪酶应用于制革和毛皮加工过程中的脱脂，相对于传统的脱脂方法具有脱脂均匀、脱脂废液中的油脂更易分离回收、减少甚至不使用表面活性剂、降低生产成本、提高成品质量等诸多优点，将碱性脂肪酶与脱脂剂在碱性条件下进行毛革两用皮革的脱脂，可大大提高脱脂效果。[7] 此外脂肪酶在饲料工业、生物表面活性剂、化妆品、生物传感、聚合物合成、手性化合物拆分、生物柴油等方面都具有重要的应用前景。 由于微生物生长繁殖快、所产脂肪酶种类多、微生物脂肪酶具有比动植物来源的脂肪酶更广的作用条件范围，且多为胞外酶，更适合于工业规模生产和获得高纯度产品，因此成为工业用脂肪酶的主要来源。[7]上世纪初，微生物学家
萘普生
化学制药工艺学论文 萘普生的生产工艺研究 姓名：袁富中 学号：180112008043 专业年级：2008级药学
概述 萘普生（Naproxen , 1-1）,化学名为（+）– 6 –甲氧基–α–甲基– 2 –萘乙酸 [ ( + ) –6 – methoxy –α– methyl – 2 – naphthaleneacetic acid ] 。 （1-1） 本品为白色或类白色结晶性粉末；无臭或几乎无臭，无味。熔点153-158℃。在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中略溶，在水中几乎不溶。在日光照射下颜色变深。本品为S构型，加氯仿溶解并定量稀释制成每毫升中含10mg本品的溶液，比旋度[α]D20为+63.0-+68.5°。加甲醇制成每毫升中含30ug本品的溶液，在262nm、271nm与331nm的波长处有最大吸收。 萘普生为芳基丙酸类非甾体消炎镇痛药（NSAIDs），具有明显抑制前列腺素合成的作用，并可稳定溶酶体活性。具有较强的抗炎、抗风湿和解热镇痛作用。口服吸收迅速而完全，1次给药后 2～4小时血浆浓度达峰值，在血中99％以上与血浆蛋白结合，t1/2为13～14小时。约95％自尿中以原形及代谢产物排出。对于类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊椎炎、痛风、运动系统(如关节、肌肉及腱)的慢性变性疾病及轻、中度疼痛如痛经等，均有肯定疗效。中等度疼痛可于服药后1小时缓解，镇痛作用可持续7小时以上。对于风湿性关节炎及骨关节炎的疗效，类似阿司匹林。对因贫血、胃肠系统疾病或其他原因不能耐受阿司匹林、吲哚美辛等消炎镇痛药的病人，用本药常可获满意效果。可安全地与皮质激素合用，但与皮质激素合用时，疗效并不比单用皮质激素时好。本晶与水杨酸类药物合用也不比单用水杨酸类好。此外，阿司匹林可加速本晶的排出。 研究进展 20世纪60年代末，第一个芳基丙酸类消炎镇痛药布洛芬（Ibuprofen 1-2）通入市场，标志着此类药物的研究进入了一个新时代。芳基丙酸类药物因作用强、毒副作用小，在非甾体消炎镇痛药中，研究进展很快，品种层出不穷。先后开发了萘普生（1-1）、酮基布洛芬（Ketoprofen ，1-3）、氟比洛芬（Flurbiprofen ，1-4）、洛索洛芬（Loxoprofen ，1-5）、扎托洛芬（Zaltoprofen ，1-6）等。目前，世界上该类药物已上市品种有30多个。 萘普生由美国Syntex公司开发，1968年获美国专利权，1972年正式生产并在墨西哥出售，1976年在
脂肪酶特性与应用
饲料研究FEED RESEARCH NO .6,2011 5 脂肪酶特性与应用 陈倩婷广州博仕奥集团 饲料资源不足一直是我国养殖业面临的一个大问题，在耕地和水资源严重紧缺的情况下，粮食产量很难提高。我国动物生产中饲料转化率低，猪、鸡和奶牛等的饲料转化率均比国际先进水平低0.3 %~0.6 %，使饲料资源不足的问题更加严峻。饲料用酶制剂的开发和应用极大的缓解了饲料资源的不足，酶制剂在饲料工业中的有效应用使得饲料工业和养殖业安全、高效、环保和可持续发展成为可能。 目前研究较多的饲用酶制剂有蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶及植酸酶等。脂肪酶也是一种重要的酶制剂，它能够水解脂肪（三脂酰甘油或三酰甘油）为一酰甘油、二酰甘油和游离脂肪酸，最终产物是甘油和脂肪酸。 产物脂肪酸为动物体生长和繁殖提供能量，部分中链脂肪酸能抑制肠道有害微生物，改善肠道菌落环境，从而促进消化，起到类似抗生素的作用，脂肪酶在常温常压下反应，反应条件温和，转化率高，具有优良的立体选择性，不易产生副产物，避免因化学催化法而带来的有害物质，不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。 1 脂肪酶的特性 1.1 脂肪酶的来源 脂肪酶按其来源主要分为3类：1）动物源性脂肪酶，如：猪和牛等胰脂肪酶提取物；2）植物源脂肪酶，如：蓖麻籽和油菜等；3）微生物源性脂肪酶。由于微生物种类多、繁殖快且易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH、作用温度范围及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，所以，微生物脂肪酶是主要的研究对象。产微生物脂肪酶菌种的研究主要集中在真 菌包括，根霉、黑曲霉、镰孢霉、红曲霉、黄曲霉、毛霉、犁头霉、须霉、白地霉、核盘菌、青霉和木霉；其次是细菌，如：假单胞菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌工程菌、无色杆菌、小球菌、发光杆菌、黏质赛氏杆菌、无色杆菌、非极端细菌和洋葱伯克霍尔德菌等；另外还有解酯假丝酵母和放线菌。1.2 特性1.2.1 催化特性 脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。其催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，溶于水的酶作用于不溶于水的底物，对均匀分散的或水溶性底物不作用，反应在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。Macrae 等研究表明：在油水界面上油脂量决定脂肪酶活性，增加乳化剂量，可提高油水界面饱和度，从而提高脂肪酶活性，增加油水界面面积，可承载更多脂肪酶分子，也可增加催化反应速率。而在水体系中，大多数脂肪酶活性很低或没有活性。 由于脂肪酶在非均相体系中表现出的高催化活性，且在酶催化反应中不需要辅酶，所以可利用非水相中的脂肪酶催化完成各种有机合成及油脂改性反应，如：酯化、酸解、醇解、转酯、羟基化、甲基化、环氧化、氨解、酰基化、开环反应和聚合等反应。 1.2.2 底物特异性 不同来源脂肪酶对底物不同碳链长度和饱和度脂肪酸表现出不同反应性，圆弧青霉和金黄色葡萄球菌脂肪酶水解短链(低于C 8)脂肪酸所形成的三脂酰甘油，黑曲霉和根霉对中等长链(C 8~C 12)脂肪酸形成的三脂酰甘油有强烈特异性，猪葡萄球菌脂肪酶偏爱磷脂为底物，也可以水解脂肪酸链长短不一的各种油脂。解脂无色杆菌对饱和脂肪酸表现出 收稿日期：2011 - 05 - 09
2脂肪酶的概念
脂 肪 酶 脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3) 脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。 脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。 1 脂肪酶的来源 脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。 2 脂肪酶的性质 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等(Hara；Schmid)。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同(Veeraragavan等)。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性(Schmid等；Kazlauskas等)。 脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda 和Desnnelv 就发现了这一现象。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。这是脂肪酶区别于酯酶的一个特
药物化学实验讲义(萘普生)2011版
手性药物萘普生的光学拆分法制备 一：实验目的 掌握用光学拆分法制备手性药物萘普生，了解拆分消旋化合物的原理，学习用旋光仪分析手性药物中间体光学纯度的方法。 二：实验原理 具有手性的药物其对映体往往有完全不同的药理活性，单一对映体的手性药物因其药效高、副作用低和安全等优点，受到了化学家和制药企业的重视，近二、三十年，手性药物得到了很大的发展，其销售额以每年15％的速度在增长。 萘普生为非甾体类抗炎镇痛药，用于治疗风湿性和类风湿性关节炎、胃关节炎、强直性脊柱炎、痛风、关节炎、腱鞘炎.亦可用于缓解肌肉骨骼扭伤、挫伤、损伤以及痛经等所致的疼痛。研究表明（S）-萘普生的药效是（R）-萘普生的28倍。 目前获得单一手性化合物的方法主要有：①手性源合成法：以手性物质为原料合成其他手性化合物。②不对称催化合成法：是在催化剂或酶的作用下合成得到单一对映体化合物的方法。③外消旋体拆分法：是在拆分剂的作用下，利用物理化学或生物方法将外消旋体拆分成两个对映体，其中化学拆分法是工业生产上广泛应用的方法。化学拆分法是利用如果外消旋体分子含有的活性基团与某一光学活性试剂（拆分剂）进行反应，生成两种非对映异构体的盐或其它复合物，再利用它们物理性质（如溶解度）和化学性质的不同将两者分开，最后把拆分剂从中分离出去，便可得到单一对映体。 本实验拆分的反应式如下： H3CO CHCOOH CH3 (±)-萘普生 H3CO CHCOOH CH3 (+)-萘普生 (-)-葡辛胺 拆分 反应结束后得到的产物（S）-萘普生，需测定其对映选择性，即产物的对映体过剩（ee 值）。其测定方法有多种，本实验利用的是旋光仪的方法。 三、仪器和试剂 旋光仪；熔点仪；磁力搅拌器（带加热控温）；搅拌子；100 ml烧瓶；冷凝管；布氏漏斗；烘箱；小勺。 主要原料、试剂的规格和用量 名称规格用量外消旋萘普生 C.P. 2.5 g （—）-葡辛胺 C.P. 3.2 g 甲醇 C.P. 50 mL 氢氧化钠 A.R. 少量 盐酸少量
微生物脂肪酶的纯化方法概述
微生物脂肪酶的纯化方法概述 摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。 关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术 1.脂肪酶概述 脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。 1.1脂肪酶的结构与性质 在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶
中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。 与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。 1.2产脂肪酶微生物 微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。 与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶具有许多优点:(一)微生物脂肪酶种类多、来源广、生长周期短；(二)具有比动植物脂肪酶更广的pH和作用温度适应范围以及更广的底物适应类型；(三)微生物脂肪酶便于进行工业化生产，同时容易制取高纯度制剂。 目前，工业生产脂肪酶菌株主要集中在根霉、曲霉、假丝酵母、青霉、毛霉、须霉以及假单胞菌等。
脂肪酶实验方案
脂肪酶实验方案 富集培养基( %) :酵母膏0. 02 , Na2HPO4 0.35 , K2HPO4 0. 15 , MgSO4·7H2O 0. 05 , NaCl 0.05 , 橄榄油1. 0 , pH 7. 0. 溴甲酚紫筛选平板分离培养基 ( %) : 牛肉膏0. 5 , 蛋白胨1. 0 , NaCl 0. 5 ,葡萄糖0. 3 ,聚乙烯醇1. 0 ,橄榄油2. 5 , 琼脂1. 5 ;灭菌后加入过滤灭菌的溴甲酚紫(50 mg/ 100 mL) 0. 4 mL , pH 6. 0 ,7.0 ,8. 0. 种子培养基( %) :葡萄糖2. 0 , (NH4 ) 2SO4 0.5 , K2HPO4 0. 1 ,MgSO4·7H2O 0. 05 , 蛋白胨2. 5 ,橄榄油1. 0 , pH 7. 0. 发酵培养基( %) :蛋白胨2. 0 , 蔗糖0. 5 , 橄榄油1. 0 , (NH4 ) 2SO4 0. 1 , MgSO4 〃7H2O 0. 05 ,K2HPO4 0. 1 ,pH 自然 产脂肪酶菌株的筛选：将细菌接种到种子培养基上，于30 ℃,200 r/ min 摇床培养24 h，划线于溴甲酚紫筛选平板分离培养基上。观察已生长的菌落周围有无透明圈,有红色水解圈的菌落对应的菌株即为产脂肪酶菌株。 脂肪酶高产菌株的筛选： （1）产脂肪酶菌株发酵培养：将产脂肪酶菌液按1 %的接种量接入50 mL 发酵培养基中(250 mL 三角瓶) ,30 ℃,200 r/ min 摇床培养48 h； （2）上清液的制备：经6000 rpm/min离心10 min，收集上清液，用0.20 μm滤膜对上清液过滤除菌，滤液分装后-20℃保存待用； （3）(i)度法测定各菌株产酶相对大小：在pH7.5, 30℃条件下, 每分钟释放 1 μmol 对-硝基酚( ρ- nitrophenol) 所需的酶量, 定义为一个活力单位。脂肪酶催化对- 棕榈酸硝基苯酯分解产生ρ- nitrophenol, 在该过程中不断测定其光吸收值的变化。根据单位时间产生ρ- nitrophenol 的量来反应脂肪酶的活力。（本实验采用如下方法：分别向各菌株等量上清液中加入等量过量的对- 棕榈酸硝基苯酯，在反应过程中不断测定其光吸收值的变化，根据吸光值变化幅度确定产酶量大小。） [A液:16.5mmol/L的对硝基苯棕搁酸酯(p一NPP)的异丙醇溶液(冷藏，两周内使用)。B液:含有0.4%Trilonx一100和0.1%阿拉伯树胶的50mmol/L的Tris一HCI缓冲液(pH8.0)。测定时，将相应的A液与B液1:9混和，取100ul适当浓度的酶液加人900ul的上述混和液中，混匀，37℃反应10min后，用可见分光光度计(410nm)读取A值。在此反应条件下，对硝基苯的消光系数是1.46x105cm3/mol。1个单位的脂肪酶活力定义为每分钟分解p一NPP并释放出1umol对硝基苯所需的酶量。] (ii)平板法：采用三丁酸甘油脂平板鉴定法,鉴定板含2 %的三丁酸甘油脂乳化液和2 %的琼脂粉。取10μl粗酶液加入鉴定板上各小孔(直径0. 20cm) 中,特定温度下放置12h 后,通过水解透明圈的直径大小来测定脂肪酶酶活性大小。 菌株产酶条件的优化 碳源对产酶的影响；分别选用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、玉米粉、糊精、玉米淀粉、大豆油、橄榄油为碳源(均为2 %) 进行发酵,以平板透明圈法测定其产酶情况。
脂肪酶
脂肪酶的应用进展综述 09生物技术0902021040 陈莹莹 摘要：脂肪酶被认为是工业中很重要的一利酶。本文概述了当前研究中广泛使用的脂肪酶及其固定化产品的应用途径, 包括在食品加工、饲料、纺织、医药、生物柴油和传感器等领域中的应用。脂肪酶应用的主要障碍是其成本高。但技术进步尤其是基因技术的发展有望使成本降低, 脂肪酶在药物合成中的应用在本文中也作了展望。 关键词：脂肪酶；性质；生产；来源，应用 脂肪酶（Triacylglycerol lipase E C3.1.1.3）是广泛存在的一种酶，在脂质代谢中发挥重要的作用。在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。脂肪酶反应条件温和，具有优良的立体选择性，并且不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。 一、脂肪酶的来源 脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。 二、脂肪酶的性质 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等(Hara；Schmid)。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同(V eeraragavan等)。总
脂肪酶综述
脂肪酶综述 摘要：脂肪酶（Triacylglycerol lipase E C3.1.1.3）是广泛存在的一种酶，在脂质代谢中发挥重要的作用。在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。脂肪酶反应条件温和，具有优良的立体选择性，并且不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。本文着重介绍脂肪酶的特点及应用。 关键字：脂肪酶性质来源应用
一、脂肪酶简介 脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。它是分解脂肪的酶。在动植物体和微生物中普遍存在,是一类特殊的酯键水解酶,催化如下反应:甘油三酯+ 水= 甘油+ 游离脂肪酸。它的另一重要特征是只作用于异相系统,即在油(或脂) 一水界面上作用,对均匀分散的或水溶性底物无作用即使作用也极缓慢,因此脂肪酶也可说是专门在异相系统或水不溶性系统的油(脂) —水界面上水解酯的酶。 二、脂肪酶的来源 脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。 三、脂肪酶的性质 1.脂肪酶的理化性质 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水 不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质 方面存在不同。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、
黑曲霉脂肪酶的分离纯化
黑曲霉脂肪酶的分离纯化 （1）背景简介： 脂肪酶全称为三酰基甘油水解酶，是一类能够将长链脂肪酸甘油酯水解成脂肪酸和二甘酯、单甘酯或甘油的生物酶。它除了能够水解脂肪外，还具有催化酯化反应、酯交换反应、酸解反应、醇解反应以及氨解等反应的性质。 （2）理论途径： 脂肪酶是蛋白质，因此大部分蛋白质的纯化方法也适用于脂肪酶。常见的非特异性 蛋白纯化方法有沉淀法、疏水层析、离子交换层析和凝胶过滤等。 文献研究以从极端生境下筛选得到的一株产脂肪酶菌株为研究对象，采用层析的方法分离纯化得到纯脂肪酶，并对其酶学性质进行了研究。 （3）具体操作流程及方法： 1）利用形态分析和分子方法对产脂肪酶菌株进行鉴定，并对产酶条件进行优化； 2）研究温度、pH、金属离子和蛋白酶抑制剂对粗酶活性影响； 3）利用硫酸铵盐析、阴离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等分离纯化脂肪酶； 4）对纯脂肪酶进行酶学性质研究和一级结构鉴定。 （4）分离纯化具体方法及结果 采用植物油1%（v/v）、酵母提取物1%（w/w）、KH2PO4 0.2%（w/w）、MgSO4 0.05%（w/w）、KCl 0.05%（w/w）等组成的培养基，接种量为1.5%（v/v）时，在28℃、180 r/m 下培养96h 后，发酵液中脂肪酶水解活性最大达到30IU/mL。 经过硫酸铵沉淀、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析，从黑曲霉发酵液中分离纯化了脂肪酶，脂肪酶的酶活回收率为22.1%，纯化倍数为203 倍。获得的脂肪酶在SDS- PAGE 图谱上显示为单条带，分子量约为41kDa。酶的最适反应温度为50℃，在20-60℃内有较好的稳定性，60℃处理12h 仍 残留90%的酶活；最适反应pH 为 5.0，在pH 3.0-5.0 内具有较好稳定性，pH 3.0 时处理20h 仍存有99%的酶活。Cu2+、Ca2+对酶活有较大促进作用，而Fe2+基本使酶完全失活；多种极性较大的有机溶剂对其有激活作用。 经MALDI-TOF-MS 鉴定，该脂肪酶与黑曲霉CBS513.88 酯酶具有较高的同源性。 （5）参考文献： [1]刘光. 黑曲霉脂肪酶的分离纯化及其性质研究[D]. 华南理工大学, 2013.
微生物脂肪酶应用及研究进展
微生物脂肪酶应用及研究进展 摘要微生物脂肪酶主要来源于真菌和细菌，它是一类能够催化酯的水解反应以及在非水相体系中催化脂肪酸和醇类发生酯化反应的酶类。因其具有高底物专一性、区域选择性和对映选择性，而被广泛应用。本文主要论述了脂肪酶的结构、脂肪酶的理化性质以及脂肪酶在食品行业、医药工业、纺织和化工工业方面的应用，并对其未来的发展进行了展望。 关键词脂肪酶，酯化，应用，研究进展 Progress in research and application of microbial lipase Abstract Microbial lipases are mainly derived from fungi and bacteria, it is a kind of can catalyze hydrolysis of ester and enzyme catalyzed esterification of fatty acids and alcohols in non aqueous system. Because of its high substrate selectivity, regioselectivity and enantioselectivity, and is widely used. This paper mainly discusses the structure, properties and application of lipase in food industry, medicine, industry, and the future of its development was prospected. Key words lipase, esterification, application, research progress of 脂肪酶( EC 3.1.1.3) 又称三酰基甘油酰基水解酶，广泛存在于动植物和微生物体内。脂肪酶不仅可水解三脂酰甘油生成二脂酰甘油和脂肪酸（其中的二脂酰甘油可进一步被水解为一脂酰甘油、甘油和游离脂肪酸），并且能催化水解反应的逆反应——酯化反应(张数政，1984)。目前脂肪酶生产主要有提取法和微生物发酵法。由于微生物脂肪酶种类多，作用温度及范围比动植物脂肪酶广、底物专一性高，并且便于工业生产和获得较高纯度的酶制剂，因此微生物脂肪酶已成为工业生产脂肪酶的主要来源，关于脂肪酶在工业应用的研究也越来
11双水相系统分离纯化南极假丝酵母脂肪酶
第37卷第5期2009年5月 化 学 工 程CHE M I CAL E NGI N EER I N G (CH I N A ) Vol .37No .5 May 2009 作者简介:杨建军(1973—),男,工程师,博士生,研究方向为生物催化与生物质转化,E 2mail:mysyjj@https://www.wendangku.net/doc/b910405128.html,;马晓迅(1957—),男,教授, 博士生导师,通讯联系人,电话:(029)88302633,E 2mail:maxy m@nwu .edu .cn 。 双水相系统分离纯化南极假丝酵母脂肪酶 杨建军,马晓迅 (西北大学化工学院,陕西西安 710069) 摘要:对南极假丝酵母脂肪酶(CAL )在双水相中的分配情况进行了研究,考察了温度、聚乙二醇(PEG )相对分子质量、NaCl 质量分数和(NH 4)2S O 4质量分数对分配系数K (C AL )的影响,结果表明:温度对K (C AL )影响不大;低相对分子质量PEG 与蛋白质的疏水作用可促进C AL 的分配;二相间电势差等对分配平衡、有较大影响。在PEG 2000/(NH 4)2S O 4双水相体系中,CAL 最佳的萃取分离条件为:室温下,质量分数20%PEG2000,12%(NH 4)2S O 4,1.5%NaCl,此时,K (CAL )为8.16,C AL 回收率为91.2%。 关键词:脂肪酶;双水相;分离纯化 中图分类号:Q 814.1 文献标识码:A 文章编号:100529954(2009)0520049204 Separati on and puri fi cati on of Candida an ta rctica li pase i n aqueous two 2phase syste m YANG J i a n 2jun,M A X i a o 2xun (School of Che m ical Engineering,North west University,Xi ′an 710069,Shaanxi Pr ovince,China ) Abstract:The partiti on behavi or of Candida an tarctica li pase (CAL )in aqueous t w o 2phase syste m (ATPS )was investigated .The effects of te mperature,relative molecular mass of polyethylene glycol (PEG ),the mass fracti on of NaCl and (NH 4)2S O 4on partiti on coefficient of CAL K (CAL )were studied .The results show that in ATPS,te mperature was uni m portant for partiti on coefficient of CAL K (CAL ),while the electric potential difference bet w een t op and bott om phase was i m portant .It was als o discovered that the less the molecule mass of PEG was,the more favorable conditi ons f or the CAL congregati on int o the phase because of the increased hydr ophobicity for med .A t the r oom te mperature,the op ti m ized extracti on conditi ons were as foll ows:mass fracti on 20%PEG 2000,12%(NH 4)2S O 4,1.5%NaCl,and K (CAL )was 8.16,the recovery rate of CAL was 91.2%.Key words:li pase;ATPS;purificati on 固定化脂肪酶催化酯交换反应生产生物柴油已成为近年来新能源研究的热点之一。为了消除杂质的负面影响,提高固定化脂肪酶的催化效率,本文通过研究聚乙二醇(PEG )/硫铵双水相系统(ATPS )中脂肪酶的分离行为,介质条件变化对分 离过程的影响,为生物柴油生产用脂肪酶的纯化提供技术条件。1 材料与方法1.1 材料 考马斯亮兰250,PEG1000,PEG2000,PEG 10000,牛血清蛋白,国药集团;PEG4000,PEG6000, 天津科密欧。1.2 方法 1.2.1 蛋白质质量分数测定 每一相中总的蛋白质质量分数在吸光度595n m 处采用B radf ord 法测定,以牛血清白蛋白为标准蛋白 [1] 。 1.2.2 脂肪酶活力测定 脂肪酶活力测定按照QB /T180321993标准。1.2.3 双水相体系制备 在PEG/硫铵双水相体系中,成相所需的PEG 质量分数较PEG/磷酸盐体系低,又由于硫铵的水化能较低,相同相对分子质量的PEG 成相所需硫铵的质量分数也较低 [2] 。故选PEG/硫铵体系作为研究对象。 按照实验选定的条件,将质量分数50%的PEG 溶
萘普生(学生姓名-班级)
萘普生（Naproxen ） 异 名：甲氧萘普酸，消痛灵，Naprosyn ，Proxen ，Equiproxen ，Methoxypropriocin 化学名：（S ）－（+）－2－（6′－甲氧基－2′－萘基）丙酸 （S ）－（+）－2－（6′－Methoxy －2′－Naphthyl ）Propionic Acid 分子结构式： 萘普生为非甾体消炎镇痛药，具有抗炎镇痛解热作用。萘普生用于各种原因引起的发热及疼痛的对症治疗。并常用于风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊椎炎、肌腱炎、神经痛、痛风等症，尤其适用于上述疾病的急性发作期，另外也可用于原发性痛经及中、小手术后的止痛。目前国内的生产厂家有：广西柳州东风化工有限责任公司，徐州第三制药厂，浙江京新制药，金华制药厂，浙江仙居化工厂，杭州民生药厂，余姚第二制药厂，黄岩曙光化工厂等。 一、合成方法 萘普生的合成方法很多，由于萘普生是手性化合物，因此还涉及拆分。主要有两种方法：一种是先合成消旋得（±）－萘普生，再通过化学拆分获得。另一种方法是不对称合成，即用手性试剂参与反应过程，不经拆分可直接得到光学纯的S －萘普生。 合成方法一：（2－甲氧基－6－溴萘法） 由β－萘酚经溴化，甲基化得到2－甲氧基－6－溴萘，然后经格氏反应，缩合，水解，拆分得萘普生（Ⅰ）。 CHCO 2H CH 3O CH 3 ( I )OH 324CH 3O M g Br 3O CHCO 2CH 3O CH 3 2H CH 3 ( I )
COCH 3CH 3O Darzens 反应23 C CH 3O CH 3 CH CO 2CH 3BF 乙醚 C CH 3O CH 2 CH CO 2CH 3OH NaOH C CH 3O CH 3 C CO 2CH 3 O 2H CH 3 ( I )（拆分）H 2O 2CH 3O HO 3合成方法二：（Darzens 反应法） 6－甲氧基－2－乙酰萘与氯乙酸甲酯发生Darzens 反应，然后开环消去，异构化，脱羰，拆分得萘普生（Ⅰ）。 合成方法三：（双键环氧化法） COCH 3CH 3O C CH 3O CH 3C CN COOC 2H 5CNCH 2COOC 2H 5 CH 3COOH 4苯22Na 2WO 4 环氧化C CH 3O CH 3O C CO 2C 2H 5CN 25
产脂肪酶菌株的分离
产脂肪酶菌株的分离 13生技1班黄涵 摘要:被油脂污染的土样中含有可产脂肪酶的菌体,经富集培养之后通过初筛、复筛能获得已分离的可产脂肪酶的菌株. 关键词:脂肪酶菌株分离纯化 脂肪酶也叫三酰甘油脂水解酶,是一类重要的酯键水解酶,能够在油-水界面上催化天然油脂(甘油三脂)生成游离的脂肪酸、甘油和甘油单酯或甘油二酯,广泛存在于动物、植物和微生物中.相对于动、植物脂肪酶,微生物脂肪酶具有生产成本低,易分离提纯且应用广泛,对金属离子、有机溶剂、表面活性剂的耐受性强,易于进行工业化生产等特点,使得微生物脂肪酶继淀粉酶、蛋白酶后再次掀起酶工业化应用的热潮.针对脂肪酶在工业中的需求,如何分离产脂肪酶菌株是其研究开发的基础. 1 试验内容 1.1 试验样品 试验采用的样品有食堂地沟边的土壤等样本. 1.2 培养基 1.2.1 富集培养基 富集培养基的主要成分（%）：橄榄油1.0，酵母浸膏0.2，K2HPO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.05，NaCl 0.15，（NH4）2SO4 0.2。pH 值为7.0。 1.2.2 初筛培养基 初筛培养基的主要成分（％）：乳化橄榄油5.0，琼脂粉1.8，K2HPO4 0.1，MgSO4·7H2O 0.01，CaCl2 0.01，（NH4）2SO4 0.1，NaCl 0.05，灭菌后加罗丹明B。 1.2.3 复筛培养基 复筛培养基的主要成分（％）：橄榄油1.0，酵母浸膏0.2，K2HPO4 0.2，MgSO4 ·7H2O 0.05，（NH4）2SO4 0.1，葡萄糖1.0。 1.3 脂肪酶活力测定 脂肪酶活力的定义：在40 ℃，pH 值为7.5 的条件下, 将每分钟从橄榄油中释放 1 μmol 脂肪酸的酶量定义为一个酶活单位（U）。采用滴定法测定脂肪酶酶活[3]。 1.4 菌株筛选方法 1.4.1筛选路线 采样→富集培养→初筛→复筛→酶活性测定→菌种鉴定→固定化。 1.4.2筛选方法 （1）富集培养 将采集的土样稀释后，取1 ml 放入装有50 ml 富集培养基的三角瓶中,在温度为45 ℃,转速为220 r/min 的摇床上培养5 d, 并将富集培养液持续转接3～4 次。 （2）菌株初筛 将富集培养液稀释后涂布于加有罗丹明B为指示剂（也可以选用溴甲酚紫为指示剂）的选择培养基上,培养观察菌落周围是否出现透明圈，然 后分别保存出现透明圈的菌落。 （3）菌株复筛
脂肪酶的技术开发及其应用
脂肪酶的技术开发及其应用 一.脂肪酶 脂肪酶(LipaseEC3．1．1．3甘油水解酶)是一类特殊的酰基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。同时还催化其他一些水性酯类的水解(Hydrolyze)、醇解(Alchoholysis)、氨解(Aminolysis)、酯化(Esterification)、转酯化(Transesterification)以及酯类逆向合成反应。 (1)水解反应： RCOOR’+H20¨RCOOH-4-R’OH (2)合成反应： A 酯化：RCOOH+R’OH----RCOOR’+H20 B 酯交换：RCOOR'+R”COOR----RCOOR+R”COOR’ C 醇解：RCOOR’+R”OH---- RCOOR7’+R’0H D 酸解：RCOOR％R”COOH----R”COOR“RCOOH 脂肪酶广泛存在于动植物与微生物当中。动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织等。而植物中含脂肪酶较多的是油料作物种子。 目前脂肪酶的生产方法有提取法和微生物发酵法。 由于微生物脂肪酶具有种类多、比动物脂肪酶具有更广的作用pH和作用温度范围、便于进行工业生产和获取高纯度制剂等优点而得到广泛应用，特别是在油脂化工和有机合成工业中，酶催化的反应具有条件温和、耗能低、原料要求低、成品质量高等优点。尤其是l，3专一脂肪酶可用于特殊脂肪酸、单甘酯的合成及立体选择性化学合成和拆分，具有巨大应用潜力。因此微生物脂肪酶已经成为生产脂肪酶的主要来源，关于微生物脂肪酶在工业上的生产也越来越多。 二．微生物脂肪酶 微生物脂肪酶的生产： 以微生物为来源生产脂肪酶较动植物更具有巨大的潜力和优势。目前，国内外微生物脂肪酶的研究、生产和应用都取得很大的进展。 产脂肪酶的微生物共65个属，其中纲菌28个属，放线菌4个属，酵母菌10个属，其他真菌23个属(Jaeger 1994)。随着发现范圈的不断扩大，脂肪酶获得和制备的手段也产生了显著变化，从动植物提取到微生物纯种培养再到目前新兴的体外设计，重组表达。 经近20年来的深入研究，能应用于工业生产的微生物脂肪酶种类不断增加，目前已遍及细菌、酵母及霉菌各大类中，最近公布的36种不同来源的商业化脂肪酶中有19种来源于真菌，8种来源于细菌。我国微生物脂肪酶的生产，就目前而言，碱性脂肪酶仅绿微康独家生产，假丝酵母产中性脂肪酶也仅l、2家，绿微康碱性脂肪酶罐上发酵单位可稳定在6000u／ml左右，产品酶活可由几千吨到几万吨，甚至更高。我国微生物脂肪酶已实现产业化，虽然目前生产量还低，但已在诸多产业中逐步推广使用。由于价低质优，在国际市场中极具竞争力，绿微康已首次实现我国碱性脂肪酶的出口，而且份额正在逐步扩大之中． 三．提高脂肪酶产量 要提高脂肪酶的产量的途径主要有两个：育种改良和发酵工艺优化。 (1)育种改良 育种改良主要途径有：育种驯化、诱变育种和基因工程菌改造等。