肿瘤诊断的新希望循环游离DNA检测

实用检验医师杂志２０１５年０６月第７卷第２期ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕrｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＰａｔｈｏｌｏｇｉｓｔ,Ｊｕｎｅ２０１５,Vｏｌ.７,Ｎｏ.２

【摘要】游离ＤＮＡ是指游离于细胞之外的一类ＤＮＡ，又称为循环核酸，１９４７年由Mａｎｄｅｌ和Méｔａｉｓ发现。肿瘤患者外周血ＤＮＡ水平高于正常人，且血液中游离ＤＮＡ具有肿瘤细胞ＤＮＡ的特征。随着肿瘤分子生物学的深入研究，血液中游离ＤＮＡ定量分析已开始应用于肿瘤的早期诊断、个体化治疗和预后判断等。本文从游离ＤＮＡ的来源、特点、提取、检测及临床应用方面对游离ＤＮＡ及其在肿瘤中的重要作用做一综述。

【关键词】游离ＤＮＡ；基因检测；肿瘤

ｄｏｉ：１０．３9６9／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－７１５１．２０１５．０２．０１４综述

肿瘤诊断的新希望—循环游离ＤＮＡ检测

黎四维韩露马培周新

作者单位：４３００７１武汉市，武汉大学中南医院基因诊断中心

通讯作者：周新，E－ｍａｉｌ：ｚｈｏｕxjｙk@１６３.ｃｏｍ

游离ＤＮＡ是一种游离于血液或体液中的ＤＮＡ。１９４７年，Mａｎｄｅｌ和Méｔａｉｓ［１］首次报道了外周血中存在游离ＤＮＡ，但这一发现并没引起足够的重视。在随后３０多年的时间中，人们先后在自身免疫性疾病和肿瘤中发现了游离ＤＮＡ的存在。１９９４年，Vａｓｉｏｕkｈｉｎ［２］和Sｏrｅｎｓｏｎ［３］等在急性髓性淋巴瘤、骨髓增生异常综合征和胰腺癌患者外周血游离ＤＮＡ中发现了ＲＡS基因的突变，这一发现才引起人们足够的重视。１９９６年，Ｎａwrｏｚ等［４］又在肿瘤患者血浆游离ＤＮＡ中发现了微卫星改变。随着新的研究结果的不断出现，医学界对于肿瘤患者游离ＤＮＡ的关注越来越多。

检测血浆或血清中游离ＤＮＡ可视为一种“液体活检”，有益于开展各种相关诊断，并能避免对肿瘤组织活检的需要。以血液为检测标本，使重复采集检测样本成为了可能，从而有利于对疾病的发展及肿瘤的治疗过程进行跟踪监测。虽然游离ＤＮＡ同时反映了生理和病理过程，并非肿瘤特异性，但自从发现血液游离ＤＮＡ含有肿瘤细胞ＤＮＡ相同基因突变后，其在肿瘤的早期诊断、预后评估、疗效监测等方面的潜在价值越来越受到关注。本文就游离ＤＮＡ的来源、生物学特性、检测方法及其在肿瘤诊断中的临床应用做一综述。

１游离ＤNＡ的来源及其特点

在健康人体内，血浆中可以发现少量的游离ＤＮＡ，片段主要在１８５～２００ｂｐ或其整数倍。健康人血浆中的游离ＤＮＡ主要来源于凋亡细胞。除此之外，所有的活细胞都自发性的向血液中释放ＤＮＡ片段，这些ＤＮＡ片段又称为代谢性ＤＮＡ片段。对于肿瘤患者外周血中游离ＤＮＡ的来源，人们提出了几种假设。肿瘤微环境中癌细胞凋亡和坏死后释放是其主要来源。肿瘤细胞主动分泌可能是其另一个潜在的来源。坏死和凋亡细胞主要被巨噬细胞或其他清道夫细胞吞噬。巨噬细胞吞噬坏死细胞后可以释放消化的ＤＮＡ到组织环境。体外的细胞培养实验［５］结果表明，巨噬细胞在释放ＤＮＡ的过程中可被激活或死亡，但细胞核酸的片段仍可以释放到外周血中。血液中循环的肿瘤细胞以及转移到骨髓或肝脏等处的肿瘤细胞也可以释放出游离ＤＮＡ，其大小主要分布在７０～２００ｂｐ，大的片段则可达到１００００ｂｐ以上。

血浆中肿瘤细胞释放出游离ＤＮＡ的多少，取决于肿瘤的性质、大小等。此外，血液中游离ＤＮＡ的含量也受到血液及淋巴循环对其清除、降解等的影响。血液中的游离ＤＮＡ由肝脏和肾脏清除，其半衰期从１５ｍｉｎ到几个小时不等。有研究［６］显示，某些形式的ＤＮＡ较其他形式的半衰期更长。把纯化的ＤＮＡ注入小鼠血液中，结果显示双链ＤＮＡ较单链ＤＮＡ在血液中存在的时间更长，环状的病毒ＤＮＡ较线性ＤＮＡ存活时间更长。然而，不论片段大小及形态，游离ＤＮＡ都能被快速有效的从血液中清除。

２游离ＤNＡ的提取及其检测方法

不同的实验室提取游离ＤＮＡ的方法各有不同，也有许多商品化的试剂盒可供使用，但目前并没有公认的标准提取方法和纯化步骤。许多试剂盒也没有对样本的分离、处理、分析进行明确的说明。目前，主要的提取方法有离子交换树脂法、盐析法和磁珠分离法等。

目前，对于采用血浆还是血清作为游离ＤＮＡ提取的最佳样本仍然存在争议。由于不同实验室采用不同的试剂和提取方法，因而无法对各实验室间的提取结果进行比较。从血

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实用检验医师杂志２０１５年０６月第７卷第２期ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕrｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＰａｔｈｏｌｏｇｉｓｔ,Ｊｕｎｅ２０１５,Vｏｌ.７,Ｎｏ.２

浆中分离得到游离ＤＮＡ较血清中少，这可能是因为凝血可以促使白细胞释放游离ＤＮＡ。这种由白细胞释放的ＤＮＡ对游离ＮＤＡ的定量或突变等的检测均有影响。

游离ＤＮＡ的定量检测目前尚无统一的操作标准，不同实验室间的检测方法也很难达到一致。各种分析前因素，如血液的处理延迟、凝固、冻融、储存温度、患者的基本情况等均会对游离ＤＮＡ的含量及完整性有很大的影响。长时间的储存，也会影响游离ＤＮＡ的含量，Sｏｚｚｉ等［７］的实验结果显示，血浆或ＤＮＡ储存在－８０℃一年后，其ＤＮＡ含量可下降约３０％。但无论采用何种方法，如荧光为基础的方法（如ＰｉｃｏGrｅｅｎ染色和紫外光谱法）或定量ＰＣＲ法（如SYBＲGrｅｅｎ和ＴａqMａｎ探针），均可检测到肿瘤患者游离ＤＮＡ较正常对照者升高［８］。

游离ＤＮＡ的定性检测按研究对象和目的不同可采用不同的方法，主要有单链构象多态性分析聚合酶链反应法、限制性片段长度多态性聚合酶链反应法、测序分析和特异性引物延伸法，上述方法主要用于游离ＤＮＡ未知突变的筛查、基因的遗传多态性分析、分析有无对应的已知突变等。如果采用游离ＤＮＡ作为肿瘤诊断、预后评估及疗效监测的生物标志物，进行更多大样本、多中心的临床研究并建立标准化的检测方法是很有必要的。

３游离ＤNＡ的临床应用

３．１游离ＤＮＡ突变检测检测游离ＤＮＡ中肿瘤特异性的基因突变具有较好的临床价值，如ＫＲＡS和ＴＰ５３等这些在多种类型肿瘤中具有高突变频率的基因，其检测对肿瘤的早期诊断具有重要的临床意义。最近的一项研究［９］通过大规模的芯片筛查显示，ＰＩＫ３ＣＡ、ＴＰ５３和GＡＴＡ３三个基因突变占到全部乳腺癌基因突变的１０％以上，其中ＬｕｍｉｎａｌＡ型乳腺癌最常见的突变为ＰＩＫ３ＣＡ基因（４５％），其次是MＡＰ３Ｋ１，GＡＴＡ３、ＴＰ５３、ＣＤＨ１和MＡＰ２Ｋ４。ＬｕｍｉｎａｌB型乳腺癌中ＴＰ５３和ＰＩＫ３ＣＡ基因突变均占总突变的２９％；ＨEＲ２E亚型乳腺癌中ＨEＲ２基因扩增达８０％，此外ＴＰ５３和ＰＩＫ３ＣＡ的突变分别为７２％和３９％；ｂａｓａｌ－ｌｉkｅ型乳腺癌中ＴＰ５３突变则达到８０％以上。

针对游离ＤＮＡ突变的检测，需要突变位点在肿瘤具有以下特点：发生频率高并具有肿瘤特异性。但是，突变往往发生频率较低。此外，还应考虑到正常细胞所释放的ＤＮＡ造成的干扰。通过血液游离ＤＮＡ相对高发的基因突变的检测，可以对相应疾病进行预警，并有利于进一步对疾病进行分型。３．２肿瘤特异性的微卫星改变游离ＤＮＡ中发现的基因改变包括以ＰＣＲ检测为基础的杂合性缺失（ｌｏｓｓｏｆｈｅｔｅrｏｚｙｇｏｓｉ-ｔｙ，ＬOＨ）。由于ＬOＨ只在肿瘤患者中出现，健康人体内不存在，因此其检测对肿瘤的诊断具有重要的临床意义。针对血清或血浆的游离ＤＮＡ的ＬOＨ检测方法均有报道，但结果之间存在很大的差异。这种差异一部分来自于游离ＤＮＡ与肿瘤组织间的差异，主要是游离ＤＮＡ中ＬOＨ发生率较低，另一部分则是方法本身的原因，包括技术原因和背景ＤＮＡ（由正常细胞释放的ＤＮＡ）对肿瘤ＤＮＡ的稀释作用。此外，在炎症或组织修复过程中，良性细胞的异常增殖导致细胞凋亡增加，血液中小片段的ＤＮＡ增加，也影响ＬOＨ的检测［１０］。

Sｃｈwａrｚｅｎｂａｃｈ等［１１］报道在３８８例乳腺癌患者的术前血浆标本中，检测了８个微卫星位点，其中对短片段游离ＤＮＡ的ＬOＨ检出率为３８％，而长片段检出率为２８％，二者与肿瘤组织的一致性均为３２.８５％。这些ＬOＨ改变与肿瘤分期、大小、淋巴结转移、孕激素受体阳性及ＨEＲ２受体具有相关性。此外，携带有Ｄ１２S１７２５位点（与细胞周期蛋白Ｄ２相关）ＬOＨ的患者总生存期较不携带患者更短。同样，Sｈａw等［１２］也报道，尽管ＬOＨ在血浆与配对组织中的检出率在不同患者差异很大，但ＬOＨ与患者淋巴结转移及生存期间存在显著相关。

目前ＬOＨ检测存在的主要问题是检出率较低，且与组织标本的符合率差异性较大。从技术上对其进行改进有利于其在肿瘤诊断中的应用。此外，多个ＬOＨ位点进行联合检测也可提高肿瘤检出率及检测效率。

３．３表观遗传学改变表观遗传学是指在不改变ＤＮＡ序列的前提下，通过某些机制引起可遗传的基因表达或细胞表现型的变化。表观遗传学的改变在肿瘤的发生、发展过程中起到了重要的作用。通过评估游离ＤＮＡ甲基化的水平来预测肿瘤的患病风险已成为一个重要的研究内容。

为了提高分析的效能，从众多已知的甲基化的基因中筛选出肿瘤相关基因至关重要。此外，表观遗传学改变与肿瘤并不是一一对应的，有些特定的肿瘤抑制基因，经常在某些肿瘤中甲基化并且表达下调。Ｃｈｉｍｏｎｉｄｏｕ等［１３］用甲基化特异性ＰＣＲ法检测了１２３例乳腺癌患者ＣSＴ６基因启动子甲基化情况，结果显示４９例（３９.８％）乳腺癌患者游离ＤＮＡ高甲基化，而健康个体均低甲基化。随后，该团队还检测了SOX１７基因启动子在原发性乳腺癌患者中的甲基化情况，发现５５例早期乳腺癌患者中有１９例高甲基化，５９例转移性乳腺癌患者中有２４例高甲基化，２３例健康人中有１例甲基化［１４］。同时，他们还检测了循环肿瘤细胞中甲基化的情况，结果表明循环肿瘤细胞甲基化的情况与游离ＤＮＡ之间存在相关性，从而也间接证明了游离ＤＮＡ的来源。

３．４游离ＤＮＡ完整性检测近年来，游离ＤＮＡ的完整性检测逐渐成为研究的热点。研究最多的是ＡＬＵ和ＬＩＮE１序列，他们最初被称为“jｕｎkＤＮＡ”。近来的研究［１５］表明，他们在ＤＮＡ修复、转录、表观遗传学和转座子等生理过程中可能起到了重要的作用。完整性检测主要是基于肿瘤坏死过程所释放的ＤＮＡ片段一般较长，也就是ＤＮＡ完整性较好，片段主要是２００～４００ｂｐ大小之间，而正常人群游离ＤＮＡ以凋亡为

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１２３主，其ＤＮＡ完整性较差。另一方面，由于ＡＬＵ和ＬＩＮE１序列分布在基因组的所有染色体上，因此在检测时具有较高的灵敏度，但同时也相应地降低了对肿瘤检测的特异性。研究［１６］表明，采用ＰＣＲ技术检测血浆游离ＤＮＡ的完整性可作为预测早期乳腺癌的发展及微转移（直径≤１ｍｍ的微小转移灶，通常须经病理组织学检查方能诊断）的一项重要指标。此外，游离ＤＮＡ的完整性分析也被用于膀胱癌、大肠癌、肝癌、胰腺癌和卵巢癌等肿瘤的诊断中。

目前，对于游离ＤＮＡ完整性的研究仍然较少，其是否可以作为多种肿瘤诊断的一个通用的生物学标志物在临床应用仍有待进一步深入研究。

３．５病毒ＤＮＡ检测有些肿瘤中可发现病毒的游离ＤＮＡ。

例如，EB 病毒（ｅｐｓｔｅｉｎ－ｂａrr vｉrｕｓ，EBV ）、乙型肝炎病毒（ｈｅｐ-

ａｔｉｔｉｓB vｉrｕｓ，ＨBV ）和人乳头瘤病毒（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａvｉrｕｓ，ＨＰV ），分别是鼻咽癌、肝癌、子宫颈癌的发病原因之一。

这些特定的病毒ＤＮＡ可以用来作为肿瘤诊断的分子标志物。已报道的游离ＤＮＡ与肿瘤间存在相关性的有：EBV 与霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和鼻咽癌相关；ＨBV 与某些类型的肝细胞癌相关；ＨＰV 与子宫颈癌相关等。多个大样本的研究［１７，１８］已证明，EBV 游离ＤＮＡ在鼻咽癌的诊断和预后判断中具有重要的临床价值。检测EBV 的游离ＤＮＡ作为评估鼻咽癌恶性程度的一项指标已在鼻咽癌的高发区—中国大陆、香港和台湾地区广泛开展。病毒游离ＤＮＡ检测的一个主要局限性是良性的病毒感染患者游离病毒ＤＮＡ水平也可升高，这对于临床的诊断筛查具有一定的干扰。因此建立具有临床诊断意义的ｃｕｔ－ｏｆｆ值是很有必要的。

４展望

检测技术的改进使得我们可以对游离ＤＮＡ进行分析。

通过分析肿瘤患者和健康个体游离ＤＮＡ的差异，为非侵入性肿瘤诊断方法提供了一种新的可能性。同时，我们应该认识到，目前大量的病例对照研究显示结果存在较大差异，因此将这一技术成功应用于临床仍需做更大量的研究及验证。特别是对于程序的标准化及标准的控制需要作出努力，从而为实验室成果转化为临床应用做好准备。

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（收稿日期：２０１５－０４－０６）

（本文编辑：李霦）

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２３４５６７８９１０１１１２１３１４效应分子）表达。然而，ＩＬ－２７在肝癌中可能起到促进肿瘤生长的作用。有研究［６］发现，ＩＬ－２７在肝癌患者血清中的水平显著高于对照组，这也是国内首次报道ＩＬ－２７在肝癌早期诊断中的临床意义。

本文研究对１００例原发性肝癌患者的６种常见的细胞因子进行检测，结果显示，５２例肝转移组患者中只有ＩＬ－１７和ＩＬ－２７水平均显著高于４８例无转移组患者，差异均有统计学意义（Ｐ均＜０.０５）。说明ＩＬ－１７和ＩＬ－２７均参与了肝癌的发生发展及癌细胞的转移，起到了促进肿瘤发展的作用。肝转移组患者的ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１０和ＴＮＦ－α水平也均高于无转移组患者，但差异均无统计学意义（Ｐ均＞０.０５）。说明上述细胞因子虽然也对肝癌的发生发展起到促进作用，但在肝癌转移后升高幅度不大，因此不能作为肝癌早期转移的检测指标。

对肝转移患者中６种细胞因子的相关性分析结果显示，只有ＩＬ－１β与ＩＬ－１７呈正相关，其余细胞因子间均无相关性。ＩＬ－１β为促炎型细胞因子，与ＩＬ－

１７共同作用起到促进肝癌细胞生长的作用。ＩＬ－２７

虽然也起到了促进肝癌细胞生长的作用，但其与其他细胞因子均无相关性，说明ＩＬ－２７在促进肝癌发生发展的过程中独立发挥作用。

采用ＲOＣ曲线评价ＩＬ－１７和ＩＬ－２７对肝癌转移的诊断效能，结果显示，ＩＬ－１７的ＡＵＣＲOＣ＝０.６６４，

ＩＬ－２７的ＡＵＣＲOＣ＝０.８１８，最佳诊断ｃｕｔｏｆｆ值分别为２.００５ｐｇ／ｍＬ和２３８.９５ｐｇ／ｍＬ，敏感性分别为８３.３％和９８.５％，特异性分别为３５.７％和６４.３％，ＰＰV 分别为５８.１％和６２.１％，ＮＰV 分别为４３.４％和４４.４％，约

登指数分别为３５.７和６２.８。ＩＬ－２７的ＡＵＣＲOＣ及其他临床诊断性能评价指标水平均高于ＩＬ－１７，说明虽然ＩＬ－１７和ＩＬ－２７都可作为评价肝癌是否出现转移的指标，但ＩＬ－２７的预测效果应更好。

综上，ＩＬ－１７和ＩＬ－２７均为促进肝癌细胞生长的细胞因子，可作为预测肝癌转移及预后的有效指标。其中ＩＬ－２７对检测肝癌细胞转移的灵敏度、特异性均高于ＩＬ－１７，可作为肝癌转移早期诊断及治疗的监测指标。

４参考文献

孙义长.调节性Ｔ细胞和Ｔｈ１７细胞在肝癌中的研究进展.医学信

１（收稿日期：２０１５－０４－２１）

（本文编辑：李霦）

ｔｅrｍｓｕrvｉvａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｎａｓｏｐｈａrｙｎｇｅａｌｃａrｃｉｎｏｍａｂｙｐｌａｓｍａEｐ-（上接第１２１页）

ｓｔｅｉｎ－Bａrr vｉrｕｓＤＮＡｌｅvｅｌｓ.Ｃａｎｃｅr ，２０１３，１１９：９６３－９７０.

循环肿瘤细胞研究进展任文君

循环肿瘤细胞研究进展 任文君，孙国平 (安徽医科大学第一附属医院肿瘤内科，安徽合肥230022) 摘要：循环肿瘤细胞（CTCs）存在于患者外周血中，是造成肿瘤转移和复发的主要原因。外周血中的CTC是非常罕见的，要求检测方法具有高敏感性及高特异性，成为临床常规检测的巨大挑战，但是检测CTC在协助诊断、早期发现肿瘤的微转移、指导个体化治疗、评价治疗效果及预后方面上具有重要的临床意义。该文将对其检测方法及临床应用进行探讨。 关键词：循环肿瘤细胞；检测；治疗 Ashworth曾在1986年首次发现并提出循环肿瘤细胞（CTCs）的概念［1］。CTC定义为自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞［2］。肿瘤转移是一个涉及多步骤多因素的复杂过程，肿瘤细胞由原发灶脱落，侵入循环系统，大部分由于机体的免疫识别、机械杀伤及自身凋亡在短期内死亡，只有极少数存活下来，在远隔脏器或原发脏器中定居，发展为转移灶［3-4］。有些播散的肿瘤细胞和微小转移灶在切除原发灶后可以保持休眠状态并在若干年后形成转移灶［5］。因此，在外周血中检测到CTC提示可能有早期转移存在，尤其是临床尚未发现的微转移病灶。 CTC的检测包括以下2个步骤：（1）富集，方法包括形态学或免疫学为基础的技术。（2）检测，方法包括细胞计数和核酸检测技术。因为CTC在外周血中是非常罕见的（1个CTC/106 107个单核细胞），富集细胞可提高检测的敏感性，富集之后则通过细胞计数或核酸检测技术利用肿瘤特异性标志物对CTC进行检测及分析。 1富集 1．1以形态学为基础的富集膜滤过分离肿瘤细胞技术（ISET）通过肿瘤细胞体积大小进行富集［6］，就像一个微孔过滤器根据CTC的大小差异使其分离，其隔离灵敏度阈值接近每毫升全血一个癌细胞［7］，其优势在于不破坏CTC的形态，利于后续对单个CTC进行形态学、免疫细胞学及遗传学特征的研究，但只适合部分肿瘤，不适合那些体积小于2倍粒细胞大小的肿瘤细胞。 基于密度梯度分离，单核细胞较其他血液成分密度低，因此可依据密度梯度差异将肿瘤细胞和单核细胞从其他血液细胞中分离出来，如Ficoll-Hypaque和Oncoquick。与传统的Ficoll 通信作者：孙国平，男，主任医师，博士生导师，研究方向：消化系统肿瘤，E-mail：sunguoping@anhmu．edu．cn 程序相比较，Oncoquick增加了多孔屏障，使得分离出的细胞更加纯化，检出率更高［8］。 由于这两种富集方法是借助细胞的物理特性，因此缺乏特异性，易导致缺乏相应体积大小及密度梯度的肿瘤细胞的丢失，同时所富集的细胞不仅含有肿瘤细胞，还存在不同种类的其他细胞（特别是单核细胞），在后续检测过程中可能会因为肿瘤细胞的异质性和基因标志物的非特异性，造成假阳性结果。 1．2以免疫学为基础的富集免疫磁性分离技术（IMS），基于特异性免疫识别原理的富集技术，是目前应用最广泛的方法，通过特异性抗体包被的磁珠与细胞表面抗原特异性结合，形成细胞抗原-抗体-磁珠免疫复合物，在外加磁场作用下，将CTC从血细胞中分离出来。免疫磁性分离方式有2种：阳性分选和阴性分选。阳性筛选获得目的细胞，阴性筛选去除无关细胞使目的细胞得以纯化，也可将两种模式结合，提高富集效率。这项技术最大的优势在于可保证分离靶细胞的形态和功能的完整，有利于下一步CTC的计数、免疫细胞化学、PCR 等检测。目前，免疫磁珠可达纳米级，结合时间短，灵敏度高10－7 10－6。 CellSearch系统是目前FDA唯一批准用于临床富集及检测分析的技术，是一种半自动技术，集合了免疫磁分选技术和免疫细胞化学法的分离检测技术。涂有抗EpCAM抗体的磁珠与靶细胞结合，在外加磁场作用下被保留下来，接着采用荧光标记（CK8/18/19，DAPI，CD45）来区别CTC与血细胞，CTC 标记为CK8/18/19、DAPI（+），CD45（－），随后采用半自动荧光显微镜Cell-Spotter Analyzer检测分析细胞大小和形态，最终确定CTC，只需要7．5mL血液样本，即可从400多亿血细胞中检测到一个CTC。这种半自动系统能快速分析样本，并有良好的重复性。一个多中心研究，有学者提出Cell Search系统有82%的高富集率，且在乳腺癌CTC检测上有极 ［34］Ikeda T．Stem cells and neonatal brain injury［J］．Cell Tissue Res，2008，331（1）：263－269． ［35］尹国才，张长征，张淼涛，等．人胎脑神经干细胞在年幼大鼠脑内的成神经元分化［J］．中国组织工程研究与临床康复，2008，12（12）：2281－2284． ［36］Toda H，Takahashi J，Iwakami N，et al．Grafting neural stem cells improved the impaired spatial recognition in ischemic rats［J］．Neu- rosci Lett，2001，316（1）：9－12． ［37］吴芳，杨佳勇，张敏，等．脐血间充质干细胞移植对脑性瘫 痪儿童神经系统功能的影响：20例分析［J］．中国组织工程研究 与临床康复，2008，12（16）：3198－3200． ［38］张敏，杨万章，吴芳，等．神经生长因子配合脐血源神经干细胞移植对脑瘫患儿运动功能的影响［J］．中国误诊学杂志，2008，8（23）：5596－5597． ［39］杨万章，吴芳，张敏，等．脐血源神经干细胞移植治疗神经系统疾病临床总结和分析［J］．中西医结合心脑血管病杂志，2009，7（3）：287－290． （收稿日期：2012－05－25，修回日期：2012－10－26） · 9 · 安徽医药Anhui Medical and Pharmaceutical Journal2013Jan;17(1)

人外周血循环肿瘤细胞检测试剂盒使用说明书

人外周血循环肿瘤细胞检测试剂盒使用说明书 （免疫磁捕获、免疫细胞化学鉴定） 简介： 本试剂盒利用免疫磁球捕获肿瘤病人全血中极少量的循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC），并通过免疫细胞化学鉴定所捕获的细胞，从而实现对CTC的灵敏检测。其中免疫磁球表面修饰有抗上皮细胞粘附分子（EpCAM）抗体。免疫细胞化学鉴定是通过异硫氰酸荧光素标记的细胞角蛋白抗体（FITC-anti-CK19）、Alexa Fluor594标记的抗白细胞共同抗原抗体（AF594-anti-CD45）和DAPI对细胞进行免疫荧光染色，DAPI染色阳性，CK19表达阳性，CD45表达阴性（DAPI+/CK19+/CD45-）的细胞被鉴定为CTC。本试剂盒对目标细胞的捕获效率高达90%，简便快速、特异性强、非常可靠，可以在3小时内完成对全血中CTC的检测。 试剂盒所含试剂：（10人份/盒） 试剂标号组分用途状态规格配制 试剂A牛血清白蛋白封闭固体粉末 试剂B免疫磁球磁捕获悬液200μL即用型试剂C4%多聚甲醛固定细胞液体5mL即用型试剂D1%Triton X-100通透细胞液体5mL即用型试剂E DAPI细胞染色液体50μL即用型试剂F FITC-anti-CK19细胞染色液体20μL即用型试剂G AF594-anti-CD45细胞染色液体50μL即用型试剂H1×PBS洗涤液体25mL即用型*保存条件：4-8℃ 用户自备试剂和材料： 1.试剂L：通透封闭液 于0.05g试剂A中加入0.5mL试剂D溶解待用，或按照此用量比配置所需用量的通透封闭液，标为“试剂L”。

2.试剂M：染色液 于0.01g试剂A中加入190μL试剂H溶解后，向其中加5μL的试剂E，2μL 的试剂F，5μL试剂G，或按照此用量比配置所需用量的染色液，标为“试剂M”，4℃避光保存待用。 4.磁力架（推荐Dynal公司123-20D） 5.移液器（吉尔森）、涡旋仪、超声波清洗器、进口耗材（离心管、枪头等）、恒温水浴摇床、荧光倒置显微镜等。 6.96孔板或PDMS小槽 检测步骤： 1.捕获 抽取约1.5mL病人血液于EDTA抗凝真空采血管中，将全血样品转移到2 mL的离心管内，加入20μL试剂B（试剂B预先用超声仪超声分散均匀），手摇或涡旋分散均匀后，置于恒温摇床上，150rpm，37℃下孵育30min。 2.细胞固定 将步骤1中的样品置于磁力架上，吸引约5min，用移液器延外侧轻轻吸出清液，再用400μL的试剂C重悬样品，室温放置10min。 3.细胞通透封闭 将步骤2中的样品于磁力架上，吸引约3min，用移液器去掉清液，再取400μL的试剂L重悬样品，室温放置20min。 4.细胞染色 将步骤3中的样品置于磁力架上，吸引约3min，用移液器去掉清液，再取200μL的试剂M重悬样品，37℃避光孵育30min。待孵育结束后，将样品置于磁力架上，吸引约3min，用移液器去掉清液；再用200μL的试剂H重悬，再磁吸引，去掉清液，用试剂H重复洗涤3次，最后用100μL的试剂H分散样品。 5．检测 将步骤4得到的样品转移到96孔板底部或者PDMS小槽内，磁富集到底部后用倒置荧光显微镜观察。 三通道同时观察并用CCD采集图片，其中DAPI+/CK19+/CD45-的细胞即为CTC。

关于循环肿瘤细胞(CTC)的一些认识

关于循环肿瘤细胞（CTC）的一些认识 摘要：通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞（circulating tumor cell）。随着人们对循环肿瘤细胞研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的广泛应用，CTC逐渐被人们所重视。循环肿瘤细胞的检测可有效地应用于体外早期诊断，化疗药物的快速评估，个体化治疗包括临川筛药、耐药性的检测，肿瘤复发的监测以及肿瘤新药物的开发等。检测CTC 有着良好的应用前景，随着这一研究领域的不断发展，必将产生新的诊疗手段，从而使肿瘤的治疗提高到一个崭新的阶段。 关键词：循环肿瘤细胞；CTC；检测方法；临床意义 早在1896年，Ashworth曾报道1例因癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）的概念[1]。随着人们对循环肿瘤细胞研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的广泛应用，CTC逐渐被人们所重视。 1、概述 CTC指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。随着肿瘤细胞的不断增殖,部分细胞可以通过分泌一种抑制黏附因子表达的物质,增加其运动能力并使之与肿瘤母体脱离。这些脱落的肿瘤细胞再分泌一种蛋白溶解酶，以破坏周边宿主结缔组织并进入脉管系统。诊疗操作也可使肿瘤细胞扩散进入外周血循环。 2、检测方法 2.1免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC） 这一检测方法基于抗原抗体结合反应的原理，利用单克隆抗体（McAb）与特异的肿瘤标记物结合，并通过酶与底物反应显色来判断肿瘤细胞的存在。检测的肿瘤标志物主要分三类：①上皮细胞角蛋白（CK），如CK19；②上皮细胞膜特异性抗原，如黏蛋白类，包括EMA、HMFG、HEA125等；③肿瘤相关糖蛋白（TAG），如TAG12。1980年，Sloane等首次 采用ICC的方法检测乳腺癌患者骨髓中的肿瘤细胞。该方法可以进行形态学分析，但是检 测的细胞量少，敏感性只有10－4～10－5（即在1万~10万个单核细胞中发现一个肿瘤细胞），而且许多分化差的肿瘤不能表达目标抗原，而非上皮细胞中细胞角蛋白和上皮细胞抗原亦可能阳性,故特异性不高。Braun等[2]认为由于CTC不表达白细胞共同抗原CD45，采用CD45－/CK＋双标技术可以提高ICC检测的特异性。 2.2多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） 该方法的原理是特异性扩增出肿瘤细胞中因癌基因、抑癌基因突变或染色体重排而产生 的DNA异常。这类基因的改变应满足以下条件：①该基因的突变在待检肿瘤中发生率较高，至少应达50％左右；②基因内发生碱基突变的部位应相对集中，如果过分分散，目前临床 应用有困难。这一方法检测肿瘤细胞的敏感性约1×10－6左右，比Southern印迹杂交法约提高10 000倍。应用PCR技术检测CTC受到缺乏肿瘤特异性和高表达标记的限制，该方法敏感度高，易出现假阳性，同时由于癌细胞的异质性亦可出现假阴性。目前多应用突变等位基因扩增（mutant allelie specific amplification, MASA）的PCR技术，检测大肠癌和胰 腺癌患者外周血中具有K-ras癌基因突变的肿瘤细胞。 2.3逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

循环肿瘤细胞(CTC)检测

循环肿瘤细胞（CTC）检测 一、什么是循环肿瘤细胞（CTC）？ 循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落，进入外周血循环的肿瘤细胞。 CTC非常稀少，每毫升血液中109血细胞只有几个CTC。大部分CTC在进入外周血后会发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者的死亡风险。 二、肿瘤的发生及检测诊断 全国肿瘤登记中心发布的2015年年报显示，2011年我国新增癌症病例约337万例，比2010年增加28万例——这相当于每分钟有6人被诊断为癌症。然而，令人担忧的是这样的情势似乎仍未到达峰顶，未来可能还会不断增加。 美国约翰-霍普金斯大学Kinmel 癌症中心的Bert-Vogelstein 等专家在2013年3月份的一篇综述文章中写道：在今年将死于癌症的一百万人里，绝大部分是因为他们的癌症没有在发生、发展的前90%的时间内被发现。因此，我们需要明确一点：癌症是一种慢性病，它只是被突然发现，并非是突然发生的。我们需要尽可能早的发现它，从而提高治愈率。 伴随肿瘤的发生过程，肿瘤细胞的大小也随之增大。传统方法诊断出癌症的时候，大部分已经是晚期。晚期癌症的治愈率极低，其五年生存率也很低。在肿瘤的发生过程中，早期到中期之间是最佳治疗期，因此，如果在早期就可以发现肿瘤的存在，必然可以提高治愈率。临床癌症研究（Clinical Cancer Research）杂志上发表的荟萃分析（Meta-analysis）证实CTC

在乳腺癌预测中的价值，结果表明早期和转移性乳腺癌患者的循环肿瘤细胞CTC检测是一个稳定的预测和预后工具。 如果将肿瘤易感性基因检测和循环肿瘤细胞检测完美结合，那么能够将肿瘤的早期发现率提高数倍。肿瘤易感性检测是对未来可能患有癌症的一种风险预测。如果风险等级高，除了改变生活方式外，还可以定期做循环肿瘤细胞检测，即CTC检测，而且检查频率可以适当增加，每2-3个月检查一次，从而达到实时监控的目的。 三、CTC 检测临床意义有哪些？ CTC 检查的临床意义主要表现在体外早期诊断，血液中肿瘤在1mm时，即可检出CTC，抓住最佳治疗期；另外还可以进行预后判断，根据治疗前后CTC个数判断预后与存活时间，制定最佳治疗方案；此外，还有肿瘤复发检测、耐药性检测、化疗药物的疗效评价以及新药的研发等。 四、哪些人需要做CTC检测？ 1. 普通健康人：通过检查血液中是否存在循环肿瘤细胞来早期检测肿瘤的发生，建议每年检测一次，以期在肿瘤萌芽阶段就能检测到，从而保证早期治愈率。 2. 肿瘤易感人群：有癌症家族史人群，患有HPV阳性、慢性肝炎、慢性胃炎、慢性肠炎等人群，长期吸烟者，经常接触有毒有害物质者，生活压力大、精神高度紧张的亚健康人群，以及基因检测肿瘤易感性风险等级高者，建议每3个月或者半年检测一次。 3. 癌症患者：已经确诊的癌症患者，通过CTC计数，用于预后判断、疗效评价、复发检测等；通过CTC单细胞基因组分析，选择精准治疗方案，实现真正的液体活检。

cellsearch循环肿瘤细胞ctc)试剂盒说明书自译中文版

7900001 16人份试剂盒 Cell Search 循环肿瘤细胞检测试剂盒 （上皮细胞） IVD 使用须知 本试剂盒仅用于体外诊断 CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒用于外周血中循环肿瘤细胞（CTC）的计数，这些细胞来源于上皮细胞，即表现为CD45阴性（CD45-），EpCAM阳性（EpCAM+），细胞角蛋白8,18阳性（CK8,18+）和（或者）CK19阳性(CK19+)的细胞。 用CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒检测的CTC，存在于外周血中，这类细胞与乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌*转移患者的无进展生存期和总生存期相关。因此，CTC可以用来监控乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者的肿瘤细胞是否发生转移。CTC应该进行持续检测，并与其他临床诊断方式联合起来监控上述肿瘤细胞的转移。在肿瘤发生过程中的任何时间段，对CTC数量进行评估，可以预估肿瘤患者治疗后的无进展生存期和总生存期。 *在该研究中，转移性前列腺癌患者定义为血清标志物PSA在标准激素基准上，高于参考水平具有两次连续增加。这些患者通常描述为具有非雄激素依赖性，激素抗性，或去势抗性的前列腺癌。 摘要说明 肿瘤转移是指当肿瘤细胞从原发灶或转移灶剥落后，这些肿瘤细胞进入循环系统并在机体的远端定植生长的情况。血液循环中的肿瘤细胞源自于上皮细胞，而这

类细胞在血液循环系统中是极罕见的。基于此，本公司推出的细胞自动化捕获仪(CELLTRACKS○R AUTOPREP○R System)通过预设程序并配合使用CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒(CELLSEARCH○R Kit)可以对样本进行标准化和自动化检测。用CELLTRACKS II分析仪或者CellSpotter分析仪，一种半自动荧光显微镜，可以对肿瘤细胞进行分析和计数。这种方法只计具有上皮细胞特性（EpCAM+, CK8,18+，和/或者CK19+）的细胞数量。 检测原理 CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒包括磁流体捕获试剂和荧光免疫试剂。磁流体试剂是一种具有磁芯的颗粒。其表面包被识别EpCAM抗原的抗体，EpCAM是CTC特异性抗原。因此，该磁微粒可以捕获CTC。经过免疫捕获和富集后，荧光试剂用来鉴定CTC和CTC计数。荧光试剂包括以下组成：抗CK-藻红蛋白（PE）的特异于细胞内蛋白质的细胞角蛋白抗体（上皮细胞特性）；DAPI，用于细胞核染色；和抗CD45-别藻蓝蛋白（APC）白细胞特异性抗体。 试剂/样品混合物被CELLTRACKS○R AUTOPREP○R系统分配到一个插入在MAGNEST?细胞呈现装置的暗盒中。所述MAGNEST?装置具有强磁场，能吸引磁微粒标记的上皮细胞在暗盒的表面上。CELLTRACKS ANALYZERII?分析仪，或者CellSpotter?分析仪自动扫描暗盒的整个表面，获取图像并向用户显示所有事件，其中CK-PE和DAPI荧光染料进行共定位。图像进行最终分类，并以画廊格式呈现给用户。所检测分析的事件当其形态学特征与肿瘤细胞一致并表现出EpCAM+，CK+，DAPI+和CD45-表型时，才被分类为肿瘤细胞。 试剂盒提供的材料 试剂说明 1. 3ml 包被抗EpCAM抗体的磁流体：含有浓度为0.022%的磁微粒，这些磁微

循环肿瘤细胞CTC检测及临床应用

循环肿瘤细胞C T C检测及 临床应用 Prepared on 22 November 2020

循环肿瘤细胞检测及临床应用 中文摘要：循环肿瘤细胞是从原发肿瘤扩散，进入到血液或淋巴系统的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞在血液中含量稀少，一般先将循环肿瘤细胞富集，然后再进行检测，现在已经开发了多种细胞富集和检测技术。本文主要对CTCs的富集和检测技术研究进展，以及CTCs在临床分析和研究上的应用进行了综述。 关键词：循环肿瘤细胞富集检测临床 Abstract:Circulatingtumorcellscomefromtheprimarytumorproliferation,andprolife ration,癌症转移的过程是循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells，CTCs)从原发肿瘤分离，通过循环系统扩散，进入血液或者淋巴系统，在远处形成新的肿瘤，最终导致大多数的癌症病人死亡。1869年，Ashworth在一例癌症死亡患者的外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出了CTCs的概念。从此，越来越多的研究表明，CTCs的出现与癌症密切相关。通过上皮-间质转化(EMT)，实体瘤的上皮细胞进行细胞的变化，使他们通过增加流动性和侵袭性脱离组织，进入到血液中，附着，、发展成远端转移。由于CTCs能够代表原发肿瘤的表型和遗传组成，并能够作为任何转移性肿瘤的”液体活检”，CTCs的富集分离和特征研究，十分具有吸引力。CTCs的富集和计数技术已经建立，其中CTCs的计数可以成为预测指标，当其大于已知的阈值时，就预示着病人就患有转移性乳腺癌，、前列腺癌，、结直肠癌等。 基于临床试验，美国FDA批准了一种临床检测CTCs的CellSearch技术，用于上述癌症的CTCs的富集和计数。CellSearch技术成功的证明了CTCs确实表征了疾病的活跃，CTCs数量的增加预示着病情的恶化，可以通过CTCs了解原发性和转移性肿瘤，以CTCs为基础的分析，可以帮助人们实时诊断和预测，对病情做出决定，并取样检测耐药性。大多数常规的癌症治疗方法在治疗转移性癌症方面难以成功，CTCs的可能促进肿瘤的临床研究。 CTCs在血液中极其稀少，数十亿的外周血细胞也阻碍了对CTCs的分离和分子鉴定。现在已经开发了大量的技术用于富集和检测CTCs，其中有些已经成功的用于测试或者临床评估。本文主要综述CTCs的富集和检测技术的研究进展，以及对CTCs的在临床分析和研究上应用。 1CTCs富集技术 为了从大量血液细胞中捕获数量稀少的CTCs，富集分离技术必须足够敏感性，可重复性，可靠，、快速，、便宜，并且所需获取血液量要尽量少，方便实现过程自动化，方便下游分析。此外，富集分离的CTCs要能够保持他们的活性，在富集分离的过程受到的干扰要尽量小，因为这可能改变CTCs的状态和表型。 CTCs富集的技术有很多种，这些技术使用多个性能参数评估(即捕获效率，纯度，细胞活力，富集速度，血液样本容量等)，然后通过检测临床样本进行验证。最佳的富集分离方法可能需要之间的性能参数的折衷，而且可能依赖于下游的应用。CTCs的富集技术主要根据免疫亲和性，物理性质和直接分析分为三类。 1.1免疫亲和性(Immunoaffinity)

cellsearch循环肿瘤细胞(CTC)试剂盒说明书自译中文版

7900001 16 人份试剂盒 Cell Search 循环肿瘤细胞检测试剂盒（上皮细胞） IVD

使用须知 本试剂盒仅用于体外诊断 Cellsearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒用于外周血中循环肿瘤细胞（ CTC ）的计数，这些细 胞来源 于上皮细胞，即表现为 CD45 阴性（ CD45- ）， EpCAM 阳性（ EpCAM+ ），细胞角 蛋白 8,18 阳性（ CK8,18+ ）和（或者） CK19 阳性 （CK19+） 的细胞。 用CellSearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒检测的 CTC ，存在于外周血中，这类细胞与乳腺癌、 结直肠癌和前列腺癌 *转移患者的无进展生存期和总生存期相关。因此， CTC 可以用来监控 乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者的肿瘤细胞是否发生转移。 CTC 应该进行持续检测，并 与其他临床诊断方式联合起来监控上述肿瘤细胞的转移。在肿瘤发生过程中的任何时间段， 对 CTC 数量进行评估，可以预估肿瘤患者治疗后的无进展生存期和总生存期。 *在该研究中， 转移性前列腺癌患者定义为血清标志物 PSA 在标准激素基准上， 高于参考水 平具有 两次连续增加。 这些患者通常描述为具有非雄激素依赖性， 激素抗性， 或去势抗性的 前列腺癌。 摘要说明 肿瘤转移是指当肿瘤细胞从原发灶或转移灶剥落后， 这些肿瘤细胞进入循环系统并在机体的 远端定植生长的情况。 血液循环中的肿瘤细胞源自于上皮细胞， 而这类细胞在血液循环系统 中是极罕见的。基于此，本公司推出的细胞自动化捕获仪 （CELLTRACKS R? AUTOPREP System ） 通过预设程序并配合使用 CellSearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒 （CELLSEARCH Kit ） 可以对样本进行标准化和自动化检测。 用 CELLTRACKS II 分析仪或者 CellSpotter 分析 仪，一种半自动荧光显微镜， 可以对肿瘤细胞进行分析和计数。 这种方法只计具有上皮细胞 特性（ EpCAM+, CK8,18+ ，和/或者 CK19+ ）的细胞数量。 检测原理 CellSearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒 包括磁流体捕获试剂和荧光免疫试剂。磁流体试剂是 一种具有磁芯的颗粒。其表面包被识别 因此，该磁微粒可以捕获 CTC 。经过免疫捕获和富集后，荧光试剂用来鉴定 计数。荧光试剂包 括以下组成：抗 白抗体（上皮细胞特性）； DAPI ， 胞特异性抗体。 试剂 /样品混合物被 CELLTRACKS 呈现装置的暗盒中。所述 MAGNEST ? 装置具有强磁场，能吸引磁微粒标记的上皮细胞在暗 盒的表面上。 CELLTRACKS ANALYZERII ? 分 析仪，或者 CellSpotter ? 分析仪自动扫描暗盒 的整个表面， 获取图像并向用户显示所有事件， 图像进行最终分类， 并以画廊格式呈现给用户。 胞一致并表现出 EpCAM+ ， CK+， DAPI+ 和 试剂盒提供的材料 试剂说明 1. 3ml 包被抗 EpCAM 抗体的磁流体： 含有浓度为 0.022% 的磁微粒，这些磁微粒表面偶 联有抗表 皮细胞表面标志物 EpCAM 的鼠源单克隆抗体。缓冲溶液中含有 0.03% 的 BSA 和 0.05% ProClin 300 作为保护剂。（棕色瓶盖） EpCAM 抗原的抗体， EpCAM 是 CTC 特异性抗原。 CTC 和 CTC CK-藻红蛋白（PE ）的特异于细胞内蛋白质的细胞角蛋 用于细胞核染色；和抗 CD45-别藻蓝蛋白（APC ）白细 ?AUTOPREP ?系统分配到一个插入在 MAGNEST ?细胞 其中 CK-PE 和 DAPI 荧光染料进行共定位。 所检测分析的事件当其形态学特征与肿瘤细 CD45- 表型时，才被分类为肿瘤细胞。

循环肿瘤细胞销售流程

C an c e r r e s e ar ch Cir c u la t in g T um o r C e l ls D e cisi o n T r ee 内部使用 肿瘤研究 循环肿瘤细胞 起始样品– 外周血/骨髓 您富集 CTC s ? 您直接分选 CTCs? M i cro be a d s Human : CD326 (E p C A M ) M i c r o B e a d s Anti-ErbB-2 M i c r obe ads Anti-Melanoma (MCSP) M i c r obead s I nd irec t M i cro B e a d s 您去除非 CTC s ? C D 45M i cro B e a d s 您做CTC 的分析吗? 您想做先富集再分析吗? H um an CD326 (E p C A M ) tumor c e ll E n r i c h m en t a nd Detection kit ErbB-2 tumor cell E n r i c h m en t a nd Detection kit A n t i -M e l a no ma (MCSP) cell E n r i c h m en t a nd Detection kit MACSQuant 您用流式细胞仪吗? E p C A M a n t i bod i e s , a n t i - E r b B -2 a n t i bod i e s , anti-Melanoma (MCSP) an t i bo di e s , CD45 an t i bo di e s , Available c on j ug a t ed to up to 8 f l uo r o c h r o m e s MACSQuant 您做免疫组化吗 (I H C )? Carcinoma Cell Detection K i t , I n s i de Stain K i t , A n ti -C y t o k e r a ti n Alkaline P h os ph a t a s e ; Anti-Cytokeratin (C K 3-3E 4), A n ti -C y t o k e r a ti n (CK3-6H5), C D 45, 您做分子分析吗? 您做基因表达谱分析吗? mRNA isolation k i t , cDNA isolation k i t , MultiMACS M96 T he rmo M i c r o a rr ay : labeling k i t s , s e rv i c e s , b i o i n f o r ma t i cs , superAMP

循环肿瘤细胞检测系统(CTC)仪器购买可行性报告

循环肿瘤细胞检测系统（CTC）设备购置 可行性报告 一、制造商基本情况 美国强生(Johnson & Johnson)成立于1886年，是世界上规模最大，产品多元化的医疗卫生保健品及消费者护理产品公司。1999年全球营业额高达275亿美元。强生在全球60个国家建立了250多家分公司，拥有约11万5千余名员工, 产品销售于175个国家和地区。 强生公司是世界上最具综合性、分布范围最广的卫生保健产品制造商、健康服务提供商，产品畅销于175个国家地区，生产及销售产品涉及护理产品、医药产品和医疗器材及诊断产品市场等多个领域。 美国强生公司研发的循环肿瘤细胞检测系统（CTC）2012年进入中国市场，立即被运用于肿瘤科研和临床检测，并受到业界好评。二、项目意义 随着循环肿瘤细胞检测技术的不断发展，循环肿瘤细胞（CTC）在肿瘤临床实践以及肿瘤基础科学研究领域得到了越来越多的重视。CTC数目已经被证实与晚期转移性乳腺癌，结直肠癌，前列腺癌等各种患者的无进展生存期和总生存期密切相关，CTC已经成为转移性乳腺癌等癌种的一种全新的，独立的预后因子，并被作为一种新的肿瘤生物标志物而广泛应用于新药开发，癌症机制研究等不同的领域。三、国内外研究 CTC是指存在于外周血循环中的肿瘤细胞，其含量非常稀少（1ml血液中可能只能检出1个CTC）。CellSearch系统是目前为止唯一获得FDA批准的可以应用于病人管理的自动化循环肿瘤细胞检测系统。检测技术的不断进步CTC越来越成为国内外癌症领域研究的热点。2004年，Cristofanilli等完成的前瞻性多中心临床研究表明治疗前

(基线期)和首次随访时的CTC水平对于转移性乳腺癌患者的无进展生存期和总生存期都是独立的预测指标。在177例转移性乳腺癌患者中，CTC水平较高者(≥5个/7.5ml全血)的平均无进展生存期只有2.7个月，总生存期只有10.1个月；CTC水平较低者则分别为7.0个月(P<0.001)和超过18个月(P<0.001)。随后又有多个研究证明治疗期间任何时间点CTC水平的升高都提示着疾病的快速进展和较差的预后。同时也出现了越来越多的不同癌种的关于CTC的研究，其结果也提示了CTC在前列腺癌，结直肠癌中也发挥了相同的预后作用。由于FDA 的批准，在美国CTC已经可以与传统肿瘤诊断检测方法相结合用于临床实践。国外也有较多的研究集中在了CTC的生物特性上，例如研究CTC表面的Her2抗体表达情况，进行CTC与原发肿瘤的抗体表达对照研究等。 此前，国内也有一些实验室开展了关于CTC的研究，但局限于手工磁珠法，PCR法等方法学问题，并没有取得国际认可的结果。不过随着CellSearch方法逐渐进入中国，越来越多的学者已经开始了关于CTC的研究。国内正在进行CellSearch的注册临床研究，将会验证CellSearch系统在中国人群中的有效性及安全性。同时一些国内的实验室也已经开始在CellSearch这一平台上进行不同的基础科学研究，包括CTC表面多重生物标志物分析，CTC分子生物学分析，CTC细胞FISH检测等，希望通过CTC这个全新的肿瘤标志物得到更多关于癌症发病机制，癌症转移机制等问题的答案。 四、国内开展现状 基于CellSearch平台的CTC检测技术是一种安全可靠的被美国FDA批准的癌症临床辅助诊断技术，随着中国注册临床试验的进行，CTC检测将会在中国得到越来越多的重视并迎来更加广阔的临床及科研应用前景。目前国内已有解放军307医院，复旦大学附属肿瘤医院，

循环肿瘤细胞检测的现状及发展

循环肿瘤细胞检测的现状及发展 作者：上海市第一人民医院检验科李莉教授 https://https://www.wendangku.net/doc/e08129172.html,/news/9/2802534.htm 恶性肿瘤远处转移是临床上实体恶性肿瘤治疗失败或复发的主要原因之一。而循环肿瘤细胞的存在正是实体恶性肿瘤远处转移的根源。肿瘤远处转移的最经典依据是1889年Paget[1]提出的“种子和土壤”学说，该学说认为肿瘤转移的发生和发展，是处于活跃或活化状态的肿瘤细胞作为“种子”，当遇到适合的器官、组织的基质环境，即“土壤”时，就会在此定居、生长即发生肿瘤的转移，从而部分解释了肿瘤原发灶与转移灶之间的关系。但原发部位的肿瘤（种子）是如何到达远处器官或组织（土壤）的这一问题一直困扰着人们。直到1869年，托马斯?阿什沃思（Thomas Ashworth）[2]在1例转移性癌症患者血液中观察到了外周血循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）—从实体瘤中脱离出来并进入血液循环的肿 瘤细胞。他推测，这些细胞在癌症转移过程中发挥了非常重要的作用，并可能提供疾病进展的相关信息，CTCs的概念初步形成。据统计，90%以上的肿瘤病人死于肿瘤的转移和复发，实体肿瘤或转移灶的肿瘤细胞在特定条件下，通过上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），从形态上发生向间充质细胞表型的转变并获得迁移的能力。间充质细 胞与上皮细胞相邻，只是其结构松散，缺乏细胞连接（cell adhesion）和细胞极性，并且具有转移和侵袭能力。因此，脱落的CTCs得以进入外周血液循环，这是肿瘤发生转移的必要前提。脱离原发灶入血的CTCs至少面临着血流剪应力、失巢凋亡、免疫细胞识别杀伤等三重致命考验，进入循环的大部分肿瘤细胞都会失去活性，只有不足0.01%可到达远端器官，通过迁移、粘附、相互聚集形成微小癌栓，并在适合的微环境条件下，CTCs又发生间质- 上皮转化（mesenchymal-epithelial transition，MET），生成新的肿瘤，从而导至肿瘤转移的发生。 从提出CTCs概念近一个多世纪的时间里，由于初期实验条件、技术的限制以及学者对CTCs 的认识的局限性，CTCs检测及临床应用进展不大。直至上世纪末尤其是本世纪初，随着分 子生物学、计算机技术的发展，免疫标记技术以及分子生物学技术的突飞猛进，CTCs分离 及分析鉴定技术得以迅速发展，CTCs检测和临床应用取得了重大进步，为早期发现肿瘤的 复发转移、评估手术、放疗、化学等疗效、判断预后、确定肿瘤分子特征、选择合适的个体化治疗等方面提供了重要的实验室依据。目前，学者所共识的循环肿瘤细胞的概念是：自发或受外界因素作用（如诊疗操作等）由原发灶或转移灶进入外周血循环的肿瘤细胞。肿瘤细胞的脱落、侵袭并进入血液循环是肿瘤转移的最初阶段，并为最终形成肿瘤转移灶提供了可能。进入循环系统的肿瘤细胞大部分在机体免疫识别及杀伤等作用下发生凋亡，有极少数肿瘤细胞在循环系统中存活下来，在一定条件下，进入血液循环而未被清除的肿瘤细胞通过迁移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶[3]。本文拟就CTCs分离技术、分析鉴定技术、临床应用、CTCs主要分析仪器作一介绍。 1 循环肿瘤细胞分离富集技术 越来越多的分子生物学和临床研究结果表明，肿瘤转移很可能在肿瘤发生的早期就已经出现，在外周血中检到CTCs是预示肿瘤转移最直接、重要的方法，在肿瘤早期转移的临床诊断、预后判断、监测疗效等方面具有重要意义。CTCs的发现有望改变临床上仍依赖于影像学检

cellsearch循环肿瘤细胞CTC试剂盒说明书自译中文版

c e l l s e a r c h循环肿瘤细胞C T C试剂盒说明书自 译中文版 This manuscript was revised by the office on December 22, 2012

7900001 16人份试剂盒 Cell Search 循环肿瘤细胞检测试剂盒 （上皮细胞） IVD 使用须知 本试剂盒仅用于体外诊断 CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒用于外周血中循环肿瘤细胞（CTC）的计数，这些细胞来源于上皮细胞，即表现为CD45阴性（CD45-），EpCAM阳性（EpCAM+），细胞角蛋白8,18阳性（CK8,18+）和（或者）CK19阳性(CK19+)的细胞。 用CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒检测的CTC，存在于外周血中，这类细胞与乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌*转移患者的无进展生存期和总生存期相关。因此，CTC可以用来监控乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者的肿瘤细胞是否发生转移。CTC应该进行持续检测，并与其他临床诊断方式联合起来监控上述肿瘤细胞的转移。在肿瘤发生过程中的任何时间段，对CTC数量进行评估，可以预估肿瘤患者治疗后的无进展生存期和总生存期。 *在该研究中，转移性前列腺癌患者定义为血清标志物PSA在标准激素基准上，高于参考水平具有两次连续增加。这些患者通常描述为具有非雄激素依赖性，激素抗性，或去势抗性的前列腺癌。 摘要说明 肿瘤转移是指当肿瘤细胞从原发灶或转移灶剥落后，这些肿瘤细胞进入循环系统并在机体的远端定植生长的情况。血液循环中的肿瘤细胞源自于上皮细胞，而这类细胞在血液循环系统中是极罕见的。基于此，本公司推出的细胞自动化捕获仪(CELLTRACKS○R AUTOPREP○R System)通过预设程序并配合使用CellSearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒(CELLSEARCH○R Kit)可以对样本进行标准化和自动化检测。用CELLTRACKS II分析仪或者CellSpotter分析仪，一种半自动荧光显微镜，可以对肿瘤细胞进行分析和计数。这种方法只计具有上皮细胞特性（EpCAM+, CK8,18+，和/或者CK19+）的细胞数量。 检测原理 CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒包括磁流体捕获试剂和荧光免疫试剂。磁流体试剂是一种具有磁芯的颗粒。其表面包被识别EpCAM抗原的抗体，EpCAM 是CTC特异性抗原。因此，该磁微粒可以捕获CTC。经过免疫捕获和富集后，荧光试剂用来鉴定CTC和CTC计数。荧光试剂包括以下组成：抗CK-藻红蛋白（PE）的特异于细胞内蛋白质的细胞角蛋白抗体（上皮细胞特性）；DAPI，用于细胞核染色；和抗CD45-别藻蓝蛋白（APC）白细胞特异性抗体。 试剂/样品混合物被CELLTRACKS○R AUTOPREP○R系统分配到一个插入在MAGNEST细胞呈现装置的暗盒中。所述MAGNEST装置具有强磁场，能吸引磁微粒标记的上皮细胞在暗盒的表面上。CELLTRACKS ANALYZERII分析仪，或者CellSpotter 分析仪自动扫描暗盒的整个表面，获取图像并向用户显示所有事件，其中CK-

循环肿瘤细胞检测及临床应用的研究进展

?４５０?肿瘤２００８年５月第２８卷第５期ＴｕｍｏｒＶ０１．２８，Ｎｏ．５，Ｍａｙ，２００８ ＤＯＩ：１０．３７８１／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－７４３１．２００８．０５．０２１ 循环肿瘤细胞检测及临床应用的研究进展 Ｒｅｖｉｅｗ?综述 黄同海１，王正‘，李富荣２ （暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院１．胸外科；２．临床医学研究中心，深圳５１８０２０） ［摘要］研究发现，实体瘤患者外周血中存在循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞的检测有助于发现早期肿瘤患者的微转移，重新确定临床分期，监测患者术后肿瘤是否复发与转移，评估预后，选择个体化的治疗策略。由于存在循环肿瘤细胞检测方法、原发肿瘤细胞的不连续脱落、基因组的不稳定性及无效转移等诸多问题，循环肿瘤细胞检测的生物学意义和临床意义仍存在很大争议。本文综述了对实体瘤患者循环肿瘤细胞检测的方法和结果，并探讨当前肿瘤研究领域面临的问题和潜在的进展。【关键词］肿瘤循环细胞；肿瘤转移；诊断技术和方法 ［中图分类号］Ｒ７３－３７；Ｒ７３０．４３［文献标志码］Ａ［文章编号］１０００－７４３１（２００８）０５－０４５０－０３ 肿瘤转移是一个涉及多步骤多因素的复杂过程。肿瘤细胞的脱落、侵袭并进入血液循环是实现肿瘤转移的最初阶段，并为最终形成肿瘤转移灶提供了可能。深入研究循环肿瘤细胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ＣＴＣｓ）有助于对肿瘤转移机制的了解，为抗转移治疗提供依据。随着检测技术的小断改进，研究者们对ＣＴＣｓ的生物学特性的认识得到不断更新和完善。这可能为肿瘤患者的预后评估、抗肿瘤药物的开发和肿瘤的个体化治疗提供强有力的工具。 ＣＴＣｓ是指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。由于宿主的免疫识别和机械杀伤作用以及肿瘤细胞自身因素，进入循环的肿瘤细胞很大一部分发生凋亡，不能形成转移灶，这种现象称之为“无效转移”¨ｏ。只有极少数具有高度转移潜能的肿瘤细胞在循环系统中存活下来，相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶。因此，在外周血中检测到肿瘤细胞预示着有可能发生肿瘤转移。 １ＣＴＣｓ的检测方法 １．１细胞计数法细胞计数法是最早应用于检测外周血ＣＴＣｓ的方法并且是当前鉴定骨髓中微转移的标准方法。细胞计数法的优点是，可在形态学上鉴别恶性表型并在单个细胞水平上进一步检测特定分子，但标准的光学显微镜和免疫细胞化学法存在敏感性低、检测繁琐、费时、易误诊等缺点。随着细胞自动成像和细胞富集方法等的产生，重新激起了研究者对应用细胞汁数法检测ＣＴＣｓ的兴趣。…。数字显微镜能自动扫描以核特征和细胞表面特征为摹础的血标本，而操作者只需确定分选的细胞即可。新近应用的上皮肿瘤细胞容量分离法（ｉｓｏｌａｔｉｏｎｂｙｓｉｚｅｏｆｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ＩＳＥＴ），不仅能计数肿瘤细胞，而且能进行免疫形态学和分子特征的分析¨Ｊ。ＦＣＭ广泛应用于血液领域，不仅能鉴定特定标本中细胞抗原性和形态学特征，还能使富集的目的细胞维持细胞形态并保持细胞活力，进一步扩大在体外的功能研究。 ［基金项目］国家科技攻关计划项目（编号：２００３ＢＡ３１０Ａ２３） ［作者简介】黄同海（１９８２一），男（汉族），硕士，住院医师 Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅｔｏ：ＷＡＮＧＺｈｅｎｇ（王正） Ｅ—ｍａｉｌ：Ｗａｎｇｚｎ０５０３＠１６３．ｔｏｍ１．２ＰＣＲ方法ＰＣＲ方法是检测ＣＴＣｓ最普遍的一种方法。该方法通过设汁获得与目的基因特异性互补的寡核苷酸引物而具有较高的特异性。应用ＰＣＲ方法可在１０６一ｌＯ７个正常细胞中检测出１个肿瘤细胞，相当于１～１０ｍＬ血中可发现１个肿瘤细胞，与光学显微镜检测（１０２一１０３个正常细胞中发现１个肿瘤细胞）和免疫组织化学方法（１０４—１０５个正常细胞中发现１个肿瘤细胞）相比具有更高的敏感性“。然而，由于该方法的高度敏感性，极易产生假阳性的结果。这是冈为外周血白细胞的非法转录、静脉穿刺时血标本的污染及假基因的干扰等造成，但随着实时定量ＰＣＲ技术的出现，使精确定量靶序列成为可能。 以ＤＮＡ作为ＰＣＲ的模板，其优势是它的稳定性和肿瘤细胞异常转录的独立性。但是它的缺点是敏感性低，并且不能鉴别目的基因ＤＮＡ来源于活细胞还是死细胞。 以ｍＲＮＡ作为模板进行ＲＴ—ＰＣＲ也是ＣＴＣｓ检测最常用的一种方法。首先将ｍＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ，随后用特异性的引物扩增获得日的基因。引物设计时可以跨越２个不同的外显子，为避免整个基因组的扩增，有利于消除假阳性结果。ＲＴ—ＰＣＲ的优点是可以检测原代活细胞，缺点是在某个特定肿瘤细胞内一个基因ｍＲＮＡ的拷贝数量在细胞周期中是不断变化的，并且存在去分化的现象，这可能影响标准ＰＣＲ的阳性率和实时定量ＰＣＲ检测的标志物水平，从而较难区别肿瘤细胞数量与ｍＲＮＡ表达水平之Ｉ’日Ｊ的变化。然而用多位点ＰＣＲ分别检测来自不同基因家族的ｍＲＮＡ标志物即可解决这个问题一－。 １．３细胞富集方法密度梯度离心法足目前实验室常用的一种收集肿瘤细胞的方法，但该方法缺乏特异性，因而易导致缺乏相应密度的肿瘤细胞丢失。新近发展起来的免疫磁性细胞富集法则具有较高的特异性和富集效率。其基本原理即采用均匀、球形具有超顺磁性及保护壳的纳米微粒制备成免疫磁珠，使之成为既能被磁铁所吸引，又能结合抗体的载体。磁珠上的抗体与含有特异性抗原物质的细胞结合后，则形成细胞抗原．抗体一磁珠免疫复合物，在磁力作用下发生力学移动，使复合物与其他物质分离，达到分离特异性细胞的目的。目前商业化的磁珠包括阳性分选磁珠和阴性分选 万方数据