小麦SSCP分子标记体系的优化
文章编号:100028551(2007)042333206
小麦SSCP 分子标记体系的优化
余桂红
1,2
唐克轩1 马鸿翔2 周淼平2 张 旭2 任丽娟2 陆维忠
2
(11上海交通大学复旦-交大-诺丁汉植物生物技术研发中心,上海 200030;21江苏省农业科学院农业生物技术研究所,江苏南京 210014)
摘 要:SSCP 技术易受上样缓冲液、变性的时间及温度、电泳条件等诸多因素的影响。本研究对上样缓
冲液、变性的时间及温度、电泳条件等影响因素进行了研究,结果显示:上样缓冲液中不添加甘油、用量
为PCR 产物体积的115～3倍、变性温度98℃、变性时间10～15min 、电泳缓冲液为015×T BE ,常温下恒功率80W (2167W Πcm )电泳2h 左右,单链DNA 条带清晰,易于识别。
关键词:小麦;SSCP ;优化
OPTIMIZATION OF THE CON DITION S AFFECTING SSCP TECHNIQUE IN WHEAT
Y U G ui 2hong
1,2
T ANG K e 2xuan 1 MA H ong 2xiang 2 ZH OU Miao 2ping
2
ZH ANG Xu 2 RE N Li 2jian 2 LU Wei 2zhong
2
(11Fudan 2SJ TU 2Nottingham Plant Biotechnology R&D Center ,Shanghai Jiao Tong Univer sity ,Shanghai 200030;
21Institute o f Biotechnology ,Jiangsu Academy o f Agricultural Science ,Nanjing ,Jiangsu 210014)
Abstract :Single Strand C onformation Ploym orphism (SSCP )technique is easy to be affected by a g ood many factors such as loading buffer ,denaturalization tem perature and time ,and electrophoresis factors.The in fluences of loading bu ffer ,
denaturalization tem perature and time and electrophoresis factors (electrophoresis tem perature ,electrophoresis buffer and electrophoresis power )on SSCP technique were studied in wheat.The results were as follows when v olume of the loading bu ffer without glycerol was 115～3times of the v olume of the PCR bu ffer ;denaturalization tem perature was 98℃;denaturalization time was 10～15minutes ;electrophoresis buffer was 015×T BE ;the electrophoresis tem perature was about 25℃;the electrophoresis power was 80W (2167W Πcm ),the bands of the Single Strand DNA was clear and easy to read.K ey w ords :wheat ;SSCP ;optimization
收稿日期:2006212208
基金项目:国家自然科学基金项目(30671302)
作者简介:余桂红(19712),女,湖北随州人,硕士,助理研究员,从事小麦分子标记和转基因研究。T el :025*********,138********;E 2mail :
yuguihong @https://www.wendangku.net/doc/fa2334449.html,
通讯作者:马鸿翔(19662),男,江苏宝应人,博士生导师,研究员,从事小麦遗传育种研究。T el :025*********;E 2mail :mahx @https://www.wendangku.net/doc/fa2334449.html,
SSCP (Single Strand C on formation Ploym orphism )技术即DNA 单链构象多态性技术,其原理是DNA 分子中单个碱基的变化,可造成DNA 单链构象的巨大变化。DNA 双链经变性后产生单链,DNA 单链在中性凝胶上由于分子内的氢键等二级键的作用,形成二级结构,从而产生单链构象。相同长度不同构象的DNA 单链的电泳速率不同,电泳后在胶板上的位置不同,从而将在双链水平无法检测的DNA 微小变异在单链水平上检
测出来。Orita 等[1,2]
在1989年首先建立该方法,该方
法可检测出微小的DNA 突变或变异[3,4]
。目前该方法
在医学领域应用较多[4,5]
,在小麦的遗传学研究中的应
用报道极少。
SSCP 技术自建立以来,经过十几年的发展,方法不断完善,操作也日趋简便,对突变和变异检测的敏感性也有了很大的提高。但因为DNA 突变或变异的位置和性质不同,DNA 单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的构象会产生很大的变化,因此,虽然不同的学者建立了各自最佳的SSCP 技术条件,但由于SSCP 技术易受上样缓冲液、变性的时间及温度、电泳条件等因素的影响,目前尚无一套在不同物种中通用的SSCP 方法和实
3
33 核农学报 2007,21(4)
:333～338Journal o f Nuclear Agricultural Sciences
验条件[6]
。本文对小麦SSCP 技术的影响因素进行了
研究,以期通过对小麦SSCP 技术体系的优化来提高小麦SSCP 标记的稳定性与灵敏性。
1 材料与方法
111 试验材料
小麦材料为宁7840、Clark 、中国春、N3BT 3A 、
N3AT 3B 和N3DT 3A ,于2005年秋至2006年春种植于江苏省农业科学院农业生物技术研究所试验网室内。112 方法
11211 DNA 提取 采用小麦幼苗叶片,参照Saghai 2Maroof 等[7]
报道的CT AB 法进行。
11212 引物设计 根据NC BI 数据库内的小麦的EST
序列设计引物,采用Perpearl 软件设计,长度为20～24bp 。共使用3对引物,第1对序列,正向引物,5′AC AG T C AT CGG C AAG ATT CC3′,
反向引物,5′ACCCGG AAT AT C AAT C ACC A3′,第2对序列,正向引物,5′G CT CCT AG C AAG T ATG T CCC3′,反向引物,5′TTTG C AG AGG T CCT AG AT CC A 3′,第3对序列,正向引物,5′GG AG AATT CCCT ATG TGG TG 3′,反向引物,5′T C AT C AT CG T ATTG C AAAGG 3′。
11213 PCR 反应 PCR 反应体积为20
μl 。反应混合液包括1×bu ffer ,115mm ol ΠL MgCl 2,210mm ol ΠL dNTPs ,250μm ol ΠL SSCP 引物,50～100ng 模板DNA ,1U T aq 酶。反应程序为:94℃,5min ;94℃45s ,55℃～70℃,45s ,
72℃,45s ,40个循环;72℃,10min 。反应在PE 公司的G eneAm p PCR System 9600上进行。
11214 SSCP 分析 上样缓冲液含有98%的去离子甲酰胺,10mm ol ΠL E DT A (pH 810),01025%二甲苯氰FF
和01025%溴酚蓝,加或不加5%的甘油,上样缓冲液与PCR 产物混匀后,在PCR 仪上于95℃或98℃变性3
～25min ,取出后置于碎冰上5min 以上,上样6μL 于
12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上(交联度为29:1,胶尺寸为320mm ×300mm ×014mm ),电泳缓冲液为015×T BE 或1×T BE ,电泳槽为北京六一仪器厂的DY CZ 220C 型。在4℃或常温下电泳,电泳功率为80、60或40W ,电泳完毕进行银染,并观察照相。
2 结果与分析
211 上样缓冲液对SSCP 的影响
上样缓冲液选用测序胶的上样缓冲液,含有甲酰
胺,兼有变性和指示的作用。本试验对比了在上样缓冲液中添加5%的甘油和不添加甘油两种情况,结果显示:在上样缓冲液中添加5%的甘油电泳后,单链DNA 条带没有不添加甘油的清晰(图1)。如第1泳道,在上样缓冲液中不添加甘油的情况下,两条变性的单链DNA 条带可完全分开(图12a ),在上样缓冲液中添加5%的甘油的情况下,两条变性的单链DNA 条带则不能完全分开(图12b )
。
图1 上样液添加或不添加5%甘油对电泳效果影响的对比图(第1对引物)
Fig.1 The patterns of com paring effect of the loading buffer with or without 5%glycerol (Primer 1)
a :上样液不加甘油;
b :上样液中添加5%的甘油。1:宁7840;2:Clark ;3:中国春;4:N3BT 3A ;5:N3AT 3B ;6:N3DT 3A
a :loading bu ffer without glycerol ;
b :loading bu ffer with 5%glycerol 11:Ning 7840;2:Clark ;3:Chinese S pring ;4:N3BT 3A ;5:N3AT 3B ;6:N3DT 3A
上样缓冲液用量的多少可直接影响到变性的好坏和电泳单链条带的清晰度,上样缓冲液用量太少,变性
不充分、双链DNA 的条带清晰,单链DNA 的条带模
糊,出现弥散现象。上样缓冲液用量过多,变性虽然较为充分,但PCR 产物被稀释的程度大,导致电泳时单
链DNA 及双链DNA 条带均较淡,影响读带。经反复
4
33核 农 学 报21卷
试验,一般35～40个循环的PCR产物,上样缓冲液的
量为PCR产物115～3倍最佳(图2),低于1倍或高于
4倍的用量均会影响单链DNA条带的清晰度
。
图2 不同上样液量对电泳影响的效果对比图(第2对引物)
Fig.2 The patterns of com paring effect of v olume of the loading buffer(Primer2)
1、4、7、10、13、16、19、2
2、25:宁7840;2、5、8、11、14、17、20、2
3、26:Clark;3、6、9、12、15、18、21、2
4、27:中国春1上样液量ΠPCR产物量:
1～3:1Π2倍;4～6:2Π3倍;7～9:1倍;10～12:115倍;13～15:2倍;16～18:215倍;19～21:3倍;22～24:4倍;25～27:5倍1,4,7,10,13,16,19,22and25:Ning7840;2,5,8,11,14,17,20,23and26:Clark;3,6,9,12,15,18,21,24and27:Chinese S pring1Loading
bu fferΠPCR Product:1～3:1Π2×;4～6:2Π3×;7～9:1×;10～12:115×;13～15:2×;16～18:215×;19～21:3×;22～24:4×;25～27:5×
212 变性温度及时间对SSCP的影响
选择了95℃和98℃两个变性温度,进行PCR产物的变性。变性时间分为5、8、10、15min4个不同的时间,结果显示:98℃的变性温度各个时间段的结果均优于95℃的变性温度。98的变性温度可使单链DNA 条带清晰,而在95℃的变性温度下单链DNA条带模糊。在98℃的变性温度的各个时间段中以10min和15min效果最好(图3),低于10min的变性时间,将会影响部分PCR产物变性条带的清晰度。在随后的试验使用长达25min的变性时间,发现长时间的变性并不影响单链DNA条带的清晰度
。
图3 变性温度和时间对电泳影响的效果对比图(第1对引物)
Fig.3 The patterns of com paring effect of the different denaturalization tem perature and time(Primer1) a:变性温度为98℃;b:变性温度为95℃。1、7、13、19:宁7840;2、8、14、20:Clark;3、9、15、21:中国春;4、10、16、22:N3BT3A;5、11、17、23:N3AT3B;
6、12、18、24:N3DT3A;1～6:变性时间为5分钟;7～12:变性时间为8分钟;13～18:变性时间为10分钟;19～24:变性时间为15分钟
a:the denaturalization tem perature is98℃;b:the denaturalization tem perature:95℃11,7,13and19:Ning7840;2,8,14and20:Clark;
3,9,15and21:Chinese S pring;4,10,16and22:N3BT3A;5,11,17and23:N3AT3B;6,12,18and24:N3DT3A11～6:the denaturalization time is5m in;7～12:the denaturalization time is8m in;13～18:the denaturalization time is10m in;19～24:the denaturalization time is15m in
533 4期小麦SSCP分子标记体系的优化
213 电泳条件对SSCP 的影响
21311 电泳温度对SSCP 的影响 本试验在29∶1的
丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺配比、凝胶浓度为12%的
条件下,试验了4℃左右低温和常温(25℃左右)但电泳的T BE 缓冲液先预冷至0℃～4℃左右条件下电泳对单链DNA 条带的影响,结果显示单链DNA 条带在
常温下电泳更为清晰,特别是第1对引物的单链DNA
条带在常温下电泳较低温下清晰(图4)。但在低温条件下,可使一些在常温条件下不能分开的两条单链DNA 条带分开,如图4中的宁7840、N3AT 3B 和N3DT 3A 用第2对引物扩增的PCR 产物经变性后的单链DNA 条带
。
图4 不同的电泳温度对电泳影响的效果对比图
Fig.4 The patterns of com paring effect of the different electrophoresis tem perature
a 1低温条件下的电泳图;
b 1常温条件下的电泳图。1、7、13:宁7840;2、8、14:Clark ;3、9、15:中国春;4、10、16:N3BT 3A ;5、11、17:N3AT 3B ;6、12、18:
N3DT 3A ;a :1～6第3对引物,7～12第2对引物,13～18第1对引物;b :1～6第1对引物,7～12第3对引物,13～18第2对引物
a 1the electrophoresis tem perature is about 4℃;
b 1the electrophoresis tem perature is about 25℃11,7and 13:Ning 7840;2,8and 14:Clark ;3,9and 15:
Chinese S pring ;4,10and 16:N3BT 3A ;5,11and 17:N3AT 3B ;6,12and 18:N3DT 3A 1a :1～6Primer 3,7～12Primer 2,13～18Primer 1;
b :1～6Primer 1,7～12Primer 3,13～18Primer 2
21312 电泳时的离子强度对SSCP 的影响 本试验对比了1×T BE 电泳缓冲液和015×T BE 电泳缓冲液对
电泳结果的影响,结果显示:在015×T BE 的电泳缓冲液的离子强度下,电泳的单链DNA 条带较在1×T BE 电泳缓冲液的离子强度下清晰。21313 电泳时的功率对SSCP 的影响 本试验对比了不同电泳功率[80W (2167W Πcm )、60W (2W Πcm )、40W (1133W Πcm )]对电泳结果的影响,结果显示,80W 下单链DNA 条带较为清晰;60W 下同一PCR 产物的单链DNA 条带数增加,增加了一些模糊的单链DNA 条带;
40W 下不但同一PCR 产物的单链DNA 条带数增加,而
且所有单链DNA 条带均变模糊。随电泳功率的下降,
电泳时间延长,80W 的电泳时间为2h 左右;60W 的电泳时间为215～3h ;40W 的电泳时间为315～4h 。通过对上述小麦SSCP 技术影响因素的研究,确定上样缓冲液中不添加甘油、用量为PCR 产物体积的115～3倍、变性温度98℃、变性时间10～15min 、电泳缓冲液为015×T BE ,常温下恒功率80W (2167W Πcm )电泳2h 左右为最佳的条件组合。
633核 农 学 报21卷
图5 不同离子强度的电泳缓冲液对电泳影响的效果对比图(第1对引物)
Fig.5 The patterns of com paring effect of the different electrophoresis bu ffer (Primer 1)
a :电泳缓冲液为015×T BE;
b :电泳缓冲液为1×T BE;1:宁7840;2:Clark ;3:中国春;4:N3BT 3A ;5:N3AT 3B ;6:N3DT 3A
a :the electrophoresis bu ffer is 015×T BE;
b :the electrophoresis bu ffer is 1×T BE 11:Ning7840;
2:Clark ;3:Chinese S pring ;4:N3BT 3A ;5:N3AT 3B ;6:N3DT
3A
图6 不同电泳功率对电泳影响的效果对比图(第3对引物)
Fig.6 The patterns of com paring effect of the different electrophoresis power (Primer 3)
a :电泳功率为80W (2167W Πcm );
b :电泳功率为60W (2100W Πcm );
c :电泳功率为40W (1133W Πcm );1:宁7840;2:Clark ;
3:中国春;4:N3BT 3A ;5:N3AT 3B ;6:N3DT 3A
a :the electrophoresis power is 80W (2167W Πcm );
b :the electrophoresis power is 60W (2100W Πcm );
c :the electrophoresis power is 40W
(1133W Πcm )11:Ning 7840;2:Clark ;3:Chinese S pring ;4:N3BT 3A ;5:N3AT 3B ;6:N3DT 3A
3 讨论
上样缓冲液兼有上样和变性的作用,在本试验的预备试验中曾采用碱变性上样缓冲液,发现碱变性上样缓冲液不适于小麦的SSCP 分析,单链DNA 条带模糊,后采用含有变性剂甲酰胺的测序胶的上样缓冲液,单链DNA 条带变得较为清晰。在上样缓冲液中添加
甘油,造成了部分PCR 产物的单链DNA 条带模糊,可能原因是电泳时甘油随PCR 产物一起进入凝胶中,影响了单链DNA 的稳定构象的形成。上样缓冲液的用量也会对SSCP 造成影响,上样缓冲液的用量过少,变性的单链DNA 浓度较大,容易发生碰撞而聚合为双链,上样缓冲液的用量过多,双链和单链DNA 浓度均太小,造成电泳时双链和单链DNA 的条带均较淡,因此必须有一个适宜的上样缓冲液的用量。Hayashi
7
33 4期小麦SSCP 分子标记体系的优化
等[8]研究认为PCR产物的稀释倍数为4或5倍适于SSCP分析,低于3倍,会有大量单链完全复性或部分复性,导致迁移速度改变。杨志惠等[9]研究认为PCR 产物用上样缓冲液稀释4倍最好。从本试验的结果来看PCR产物用上样缓冲液稀释115～3倍最适于小麦的SSCP分析。
温度对SSCP的影响表现在变性时的温度和电泳时的室温两个方面。变性温度一般采用95℃和98℃两种温度,从本试验的结果来看,98℃明显好于95℃,说明小麦的PCR产物需要较高的变性温度才能变性的较为充分。电泳时环境温度对SSCP的影响可能表现在环境温度的高低对单链DNA内和单链DNA间氢键及其他二级键的形成的影响上,李卫等[10]报道SSCP 的最适温度与DNA正链中的C的碱基数(bp)成正相关,与A的碱基数(bp)成负相关。姜运良等[7]研究认为4℃左右的低温有利于SSCP的分析。Orita等[2]研究认为23℃较17℃有利于SSCP分析,然而也有研究表明室温条件也是适于SSCP分析的[6]。从本试验的研究的结果来看4℃左右的低温可使一些在常温条件下不能分开的两条单链DNA条带分开,然而也会造成一部分引物的PCR产物的单链DNA条带模糊。在本试验的预备试验中采用完全的室温条件也会造成部分PCR产物的单链DNA条带模糊,后进行改进采用电泳缓冲液先预冷至0～4℃左右,然后再进行电泳,有效地克服了完全低温和完全室温造成的部分PCR产物的单链DNA条带的模糊现象。同时从大量的试验经验中,作者发现当室温超过28℃时,也易造成部分PCR产物的单链DNA条带的模糊现象。温度对SSCP 的影响是比较复杂的,作者认为在电泳的开始阶段,应保持较低的温度,这样有利于保持单链DNA的单链状态,不利于复性,而当电泳开始一段时间以后,两条单链DNA已分开,较高的温度有利于单链DNA形成稳定的单链构象。
双链DNA和单链DNA分子都含有一定的电荷,同双链DNA一样,单链DNA分子内的电荷通过影响单链DNA分子的二级结构,从而影响到单链DNA分子电泳时的泳动速度。不同的电泳缓冲液的离子强度不同,单链DNA分子的电荷受到离子强度的影响,从而使单链DNA分子的二级结构产生一定的变异,当单链DNA分子的二级结构的变异达到一定的大小时,将会在电泳板上表现出来。姜运良等[11]报道1×T BE的电泳缓冲液有利于SSCP的分析[7],魏太云等[12]报道015×T BE电泳缓冲液有利于SSCP的分析[5]。本试验中,在015×T BE电泳缓冲液的离子强度下单链DNA 条带清晰,而在1×T BE电泳缓冲液的离子强度下单链DNA条带变得模糊。原因可能是015×T BE电泳缓冲液的离子强度有利于小麦单链DNA形成稳定的构象,电泳参数的不同主要也是影响到DNA分子的电荷,从而对DNA分子的构象和泳动速度产生影响。姜运良等[11]、魏太云等[12]研究认为在低电压、低功率的电泳条件下过夜电泳有利于SSCP分析。而在本试验的预备试验中发现在低电压、低功率的电泳条件下过夜电泳,会造成小麦单链DNA的条带模糊。试验发现高电压、高功率的条件有利于小麦的SSCP分析。在本试验中采用恒定功率,电流电压自动调整的电泳参数进行电泳。在恒定功率80W的条件下单链DNA条带清晰,而降低电泳功率至60W和40W均出现了模糊的单链DNA杂带。当电泳功率升至100W时,DNA条带出现微笑效应。因此小麦SSCP分析的电泳参数为恒定功率80W(2167WΠcm)、电流电压自动调整。
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