人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定
中国组织工程研究 第19卷 第32期 2015–08–06出版
Chinese Journal of Tissue Engineering Research August 6, 2015 Vol.19, No.32
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5155
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CRTER .org
肖建红，女，1980年生，四川省绵阳市人，羌族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事造血干细胞抑制、干细胞与组织工程，以及免疫性血小板减少性紫癜的临床研究和基础研究。
通讯作者：张阳春，硕士，主治医师，中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700
中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2015)32-05155-07 稿件接受：2015-07-01 https://www.wendangku.net/doc/009107221.html,
Xiao Jian-hong, M.D., Attending physician, Department of Internal Medicine, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China
Corresponding author: Zhang Yang-chun, Master, Attending physician, Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China
Accepted: 2015-07-01
人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定
肖建红1，张阳春2，张常然1，杨 兴2(中山大学附属第一医院东院，1普通内科，2下肢骨科，广东省广州市 510700)
文章亮点：
1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。
2 实验发现第5代脂肪干细胞比较适合进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。
3 DAPI 是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI 不损伤细胞活性，对细胞标记率高。 关键词：
干细胞；脂肪干细胞；人来源的脂肪干细胞；细胞分化；脂肪组织；细胞培养；细胞鉴定；国家自然科学基金
主题词：
干细胞；皮下脂肪；细胞分化；细胞，培养的
基金资助：
国家自然科学基金青年项目(81500091)；广东省自然科学基金博士启动项目(2015A030310022)；广州市黄埔区科技计划项目(201444-02)
摘要
背景：脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞，在组织工程中比骨髓间充质干细胞具有更多优势，是当今的研究热点之一。
目的：在体外建立一种分离纯化人皮下脂肪来源脂肪干细胞的方法，进行体外培养扩增及诱导其向成骨、成脂细胞分化。
方法：通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。倒置显微镜下观察人脂肪干细胞的细胞形态和生长特性。选取第2代及第5代细胞，用CCK-8法检测细胞活性，绘制细胞生长曲线，用流式细胞仪检测细胞表面抗原标记。选取第5代细胞，分别进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。
结果与结论：①采用密度梯度离心和贴壁培养相结合方法，可成功从人脂肪组织中获得纯度较高的人脂肪干细胞。②人脂肪干细胞经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，符合正常细胞的生长规律，且其生长具有对数生长期，其倍增时间较短。③人脂肪干细胞表达干细胞表面抗原标记，具有低免疫原性，且具有成脂成骨多向分化潜能。④DAPI 是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI 不损伤细胞活性，对细胞标记率高。
肖建红，张阳春，张常然，杨兴. 人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定[J].中国组织工程研究，2015，19(32):5155-5161.
doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.013
Human subcutaneous adipose-derived stem cells: osteoblastic/adipogenic differentiation and identification
Xiao Jian-hong 1, Zhang Yang-chun 2, Zhang Chang-ran 1, Yang Xing 2 (1Department of Internal
Medicine, 2Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China)
Abstract
BACKGROUND: Adipose-derived stem cells are a kind of mesenchyam stem cells with multipotent differentiation capacity, which have more advantages than bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering research. OBJECTIVE: To establish a method to isolate and purify adipose-derived stem cells from human subcutaneous adipose tissues followed by in vitro amplification and osteoblastic/adipogenic differentiation.
METHODS: Adipose-derived stem cells were isolated from human subcutaneous adipose tissue and cultured by density gradient centrifugation and adherent culture. Cell morphology and growth features were observed under inverted microscope. Adipose-derived stem cells at passages 2 and 5 were selected for viability measurement using cell counting kit-8 method, and then cell growth curves were drawn. The immunophenotype identification was analyzed by flow cytometry. Passage 5 cells underwent osteoblastic/adipogenic induction to confirm the multi-differentiation potential.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Using density gradient centrifugation and adherent culture method,
high-purity human adipose-derived stem cells can be successfully isolated from human adipose tissues. (2) The growth process of human adipose-derived stem cells includes stagnant phase, logarithmic phase and plateau phase, which meets the growth rhythm of normal cells. Moreover, the population doubling time is shorter. (3).
Human adipose-derived stem cells are positive for stem cell-related antigens, with low immunogenicity and the
multi-differentiation potential. (4) Labeling human adipose-derived stem cells with DAPI is a simple efficient labeled method, and the labeling rate is high but the cytotoxicity is low
Subject headings: Stem Cells; Subcutaneous Fat; Cell Differentiation; Cells, Cultured
Funding: the National Natural Science Foundation of China, No.81500091; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No.2015A030310022; the Scientific Plan of Huangpu District of Guangzhou City, No.201444-02
Xiao JH, Zhang YC, Zhang CR, Yang X. Human subcutaneous adipose-derived stem cells: osteoblastic/adipogenic differentiation and identification. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2015;19(32):5155-5161.
0 引言 Introduction
干细胞是人体及各种组织细胞的最初来源，具有高度
自我复制、高度增殖和多向分化的潜能。干细胞研究正在
向现代生命科学和医学的各个领域交叉渗透，干细胞组织
工程已经成为最有影响力及最有应用前景的生命科学研究
领域，其基本含义是指在体外对干细胞进行操作，包括体
外增殖、定向诱导、横向分化、基因修饰和组织成型等。
间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期
的中胚层。目前大部分的实验和临床前研究多集中在骨髓
来源的间充质干细胞，但骨髓来源有限，抽取时给供者造
成巨大痛苦，故有必要找到一种新的间充质干细胞来源。
脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具
有多向分化潜能的间充质干细胞[1-3]。研究表明，脂肪干细
胞与骨髓间充质干细胞具有相似的生物学性质，它们在细
胞形态、生长动力学、表面标志、多向分化潜能等方面无
明显区别。脂肪干细胞还具有取材容易、并发症少、对机
体损伤小及增殖能力强等优点，而且其来源广泛、体内储
备量大、组织相容性好，逐渐成为近年来干细胞研究的新
热点[4]。此外，DAPI作为近年出现的一种标记物，其可与细胞核dsDNA稳定结合，掺入细胞的核酸序列中，且对活细胞无毒性，不改变细胞器的超微结构，荧光保持时间较长，具有操作简便、安全、敏感等特点，目前被广泛用于标记移植干细胞。
国内外对脂肪干细胞的研究开展较晚，其体外培养扩增和诱导成骨、成脂分化程度，及DAPI标记脂肪干细胞的效果如何，目前尚缺乏相关报道。本研究拟通过原代培养技术，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养，并进行成骨、成脂分化鉴定及DAPI标记，旨在为脂肪干细胞的进一步临床应用提供基础实验依据。
1材料和方法Materials and methods
设计：细胞学体外观察实验。
时间及地点：于2012年5月至2014年1月在中山大学附属第一医院及中山大学医学院?公共卫生学院完成。
材料：选取中山大学第一附属医院整形外科行外科手术的健康志愿者5名，年龄20-35岁，女性，取其脂肪组织。
实验方法：
人脂肪干细胞分离、体外培养：外科手术室无菌条件下取脂肪组织，迅速送至实验室，去除包膜和血管组织，无菌PBS冲洗3次以洗去红细胞，用显微剪剪成约1 mm3大小的碎块，加0.1%的Ⅱ型胶原酶于37 ℃摇床消化60 min，然后加入适量的L-DMEM完全培养基终止消化。将消化后的液体移至离心管中，200×g离心10 min，弃上清，用PBS 重悬细胞，离心，去掉漂浮的脂肪细胞和脂滴，连续清洗2次，用L-DMEM完全培养基重悬细胞，接种于25 cm2培养瓶中，置体积分数为5%CO2、饱和湿度、37 ℃培养箱培养，24 h后首次换液，去除悬浮细胞，以后每3 d换液1次。待细胞生长至80%-90%融合后，用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化，按1︰3比例传代。传代后的细胞为第1代细胞，当细胞生长至80%-90%融合时，用上述方法再次传代，使细胞不断纯化和扩增。在倒置显微镜下对不同生长时期的贴壁细胞直接拍照，进行细胞形态学观察。
活细胞计数：①准备细胞计数板及制备待测细胞悬液。
②染色：根据预计的细胞数不同，用0.4%锥虫蓝稀释细胞悬液至2×105-2×106L-1，稀释后总量为1 mL。如稀释10倍，则取100 μL的细胞悬液+900 μL锥虫蓝，放入EP管内。
③加样：用吸管轻吹打混匀细胞悬液，在计数板上盖玻片一侧加10 μL细胞悬液，加样时注意不要带有气泡，也不要溢出盖玻片。④计数：用10×物镜观察计数板四角大方格中的活细胞数(死细胞被染成蓝色，活细胞拒染)，细胞压人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定实验所用主要试剂及仪器：
试剂及仪器来源
L/H-DMEM培养基，青、链霉素双抗及0.25%
胰酶(含0.02%EDTA)
美国Gibco公司
Ⅱ型胶原酶、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)及
4，6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)
美国Sigma公司
二甲基亚砜美国Amresco公司
抗人CD14，CD29，CD31，CD34，CD44，
CD45，CD71，CD105，CD106，CD117抗体
及同型对照抗体
美国BD Biosciences
Pharmingen公司
苏木精、伊红、油红O 广州速聚生物公司
CCK-8试剂盒上海同仁
CO2培养箱美国Thermo公司
倒置荧光显微镜日本Nikon公司
Purifier class Ⅱ biosafety超净工作台美国Terra Universal公司
低温离心机、ELITE流式细胞仪美国Beckman Coulter公司
-80 ℃超低温冰箱美国Forma公司
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线则只计左侧和上方者。⑤细胞浓度=(4大格细胞数之和/ 4)×稀释倍数×107 L-1。
人脂肪干细胞的冻存：细胞生长融合度达80%-90%时，吸去上层培养基，PBS洗涤两三次。用含0.02%EDTA 的0.25%胰酶消化细胞，1-3 min后用适量完全培养基中止消化。用吸管轻轻吹打细胞，使其从培养瓶壁上脱落。
1 000 r/min离心5 min，弃掉上清，用PBS洗涤两三次，离心后弃上清，用细胞冻存液重新悬浮细胞，充分混匀，调整细胞浓度为1×109 L-1，移入细胞冻存管，再将其移入细胞冻存盒中，于-80 ℃低温冰箱放置24 h后，最后移入液氮罐冻存。
细胞生长曲线的绘制：选取第2代及第5代细胞，用L-DMEM完全培养基调细胞浓度为1×107 L-1，加入96孔培养板中，100 μL/孔，每个时间段设12个复孔，同时设6个调零孔(只加入等量培养基，无细胞)。分别于培养第1-7天轻轻吸取上清液20 μL，同时每孔加入CCK-8 20 μL，轻轻振荡混匀，继续培养4 h。用酶联免疫检测仪于波长570 nm处测定各孔吸光度值，复孔平均值与调零孔平均值的差值即为最终吸光度值。根据最终吸光度值绘制生长曲线。
流式细胞仪检测细胞表面抗原标记：选取第2代及第5代细胞，用L-DMEM完全培养基调细胞浓度为1×109L-1，取1 mL置于1.5 mL EP管中，2 000 r/min离心5 min，弃上清后用300 μL流式洗液重悬细胞，按照说明书在不同的EP 管加入抗人CD14-PE、CD29-FITC、CD31-FITC、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PerCP、CD71-PE、CD105-PE、CD106-PE、CD117-PE抗体及同型对照抗体，4 ℃避光孵育30 min，离心后弃上清，用流式洗液1 mL洗2次，离心后弃上清，用500 μL流式洗液重悬细胞，上机检测。
人脂肪干细胞成脂诱导分化及鉴定：①人脂肪干细胞成脂诱导分化：选取第5代细胞，以4×103/cm2的接种密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%时，吸去孔内培养液，成脂诱导组加入成脂诱导液2 mL，置37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养。诱导分化3 d后，再用成脂诱导保持液处理1 d。如此循环3次后，用成脂保持液处理7 d，每隔3 d换液1次。对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的H-DMEM培养基。19 d后应用油红O染色法检测脂滴形成。②油红O染色：诱导至第19天时吸去成脂保持液，细胞爬片用PBS清洗3次，每次5 min。
40 g/L多聚甲醛固定15 min。PBS洗涤3次，每次5 min。油红O染色15 min。60%异丙醇漂洗30 s，除去多余的染料。PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。
人脂肪干细胞成骨诱导分化及鉴定：①人脂肪干细胞成骨诱导分化：选取第5代细胞，以4×103/cm2的接种密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%时，吸去孔内培养液，成骨诱导组每孔加入成骨诱导液2 mL，置37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养，隔天换液1次，持续诱导3周。对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基。3周后应用茜素红染色法检测钙沉积。②茜素红染色：诱导至第21天时吸去成骨诱导条件培养基，细胞爬片用PBS洗涤3次，每次5 min。
40 g/L多聚甲醛固定30 min。PBS洗涤3次，每次5 min。茜素红染色液染色30 min。双蒸水洗涤5-10 s，洗3次。茜素红分化液洗涤15 s，洗1次。PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。
DAPI标记人脂肪干细胞：取第5代细胞，待细胞生长至80%融合时，更换新鲜培养基，将无菌的DAPI储存液加入培养的人脂肪干细胞上清中，至终质量浓度为50 mg/L，37 ℃培养箱中避光孵育1 h，弃去含有DAPI的培养液。加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基，常规培养24 h后，PBS洗涤细胞6次，以去除未与细胞结合的DAPI。荧光显微镜下计数视野中DAPI阳性细胞，同视野相差镜下计数视野中全部细胞，计算标记率=DAPI阳性细胞数/全部细胞数。离心收集细胞，用无血清的L-DMEM悬浮至移植所需浓度，置于冰上至少1 h备用。
DAPI标记后细胞活性检测：采用CCK-8方法观察DAPI标记后细胞活性。取第5代DAPI标记后细胞和未标记细胞，用L-DMEM完全培养基调细胞浓度为1×107L-1，加入96孔培养板中，100 μL/孔，每个时间段设12个复孔。同时设6个调零孔(只加入等量培养基，无细胞)。分别于培养第1-7天轻轻吸取上清液20 μL，每孔同时加入CCK-8 20 μL，轻轻振荡混匀，继续培养4 h。用酶联免疫检测仪在波长570 nm处测定各孔吸光度值，复孔平均值与调零孔平均值的差值即为最终吸光度值。比较DAPI标记后细胞和未标记细胞每天吸光度值的变化。
主要观察指标：人脂肪干细胞形态、生长曲线、表面抗原标记物阳性率、成骨成脂诱导分化能力、DAPI标记后细胞活性。
统计学分析：采用SPSS 12.0统计软件进行统计学分析。计量资料以x_±s表示，进行两独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。
2结果Results
2.1 人脂肪干细胞形态细胞刚接种时，培养物中混有大量的脂滴、未消化完全的脂肪组织和红细胞成分；接种24 h 后首次换液，以上成分大部分被去除，显微下可见稀疏分布的单个细胞贴壁生长，呈梭形、多角形、纺锤形成纤维样细胞，胞体较大，不透亮。接种48 h后，显微镜下可见细胞贴壁开始分裂增殖，多数细胞呈成纤维细胞样梭形，有的呈三角形，少量呈集落样生长，但也有少量圆形及卵圆形细胞生长。接种五六天时成纤维样细胞散在分布，呈集落样生长，呈同心圆状、漩涡状、放射状排列，集落中心细胞分布较密，外周较疏松。10-14 d时，可见约80%细胞融合。
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经过消化、传代，接种后即时观察，可见大量悬浮细胞散在分布，细胞小而圆，核透亮。接种后 2 h ，细胞开始贴壁，由小圆形向大圆形、多角形、梭形转变，有的有数个突起，突起个数和形态各异。接种后12 h ，细胞基本贴壁。传代后，一般经过四五天细胞生长融合度可达80%，并呈漩涡状生长(图1)。细胞呈梭形，核居中，有单核或双核仁，核呈圆形或卵圆形(图2)。传代后平均扩增时间为 5 d 。经一两次传代后，人脂肪干细胞形态较均一，增殖迅速，能稳定传代10代以上。
2.2 细胞生长动力学 第2代及第5代细胞生长曲线形态相似，均呈S 形，人脂肪干细胞生长于第0-3天时处于起始期，第3天细胞增殖加速并进入对数生长期，第7天时生长达到高峰，以后进入平台期(图3)。根据生长曲线可知，细胞的群体倍增时间约为26 h ，其平均扩增时间为5 d 。 2.3 流式细胞仪检测人脂肪干细胞表面抗原标记物 第2代人脂肪干细胞高表达CD29、CD44和CD105，阳性率分别为91.55%、99.22%和95.85%(图4A )。随着传代次数增加，第5代人脂肪干细胞CD29、CD44和CD105阳性表达率增加，分别为99.54%、99.78%和99.58%(图4B )。
第2代和第5代人脂肪干细胞均低表达或不表达造血系统及内皮系统抗原标记CD31、CD34、CD45、CD106及CD117。同时，人脂肪干细胞低表达免疫原性抗原标记CD14和CD71。以上表明，随着传代次数增加，阳性CD 分子表达率越来越高，细胞愈加纯化。 2.4 人脂肪干细胞体外具有多向分化潜能
2.4.1 人脂肪干细胞成脂诱导分化 第5代人脂肪干细胞
贴壁生长80%汇合后，加入间质干细胞成脂诱导液，诱导3 d 后，细胞内开始有脂滴出现，光镜下可见部分细胞沿胞膜下出现环形细颗粒层。随着时间的延长，脂滴逐渐增大，颗粒逐渐增多变大，并向细胞核中央逼近，细胞仍呈梭形，但胞体变大、变宽，细胞两极变短。约2周后脂滴数量增加并相互融合，细胞由长梭形变为扁圆形，诱导3周油红O 染色显示有葡萄样红色脂滴(图5)。
2.4.2 人脂肪干细胞成骨诱导分化 第5代人脂肪干细胞贴壁生长80%汇合后，加入间质干细胞成骨诱导液，诱导培养三四天后，细胞体积开始增大，呈条索状；诱导1周后，细胞形态发生明显变化，由纺锤形逐渐转变为多角形，胞质内细胞颗粒明显增多；诱导2周后，细胞质内充满颗粒，
图1 第5代脂肪干细胞接种4 d 后增殖迅速，呈漩涡状分布(×40) Figure 1 Clone formation of passage 5 cells at the 4th day, with rapid proliferation and swirl distribution (×40)
图2 高倍镜下可见第5代脂肪干细胞呈梭形，核居中，有单核或双核仁，核呈圆形或卵圆形(×200)
Figure 2 Passage 5 adipose-derived stem cells were adherent cells and grew into spindle-shaped, fibroblast-like appearance cells with spherical or orbicular-ovate nucleus under high power lens
(×200)
吸光度值
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
培养时间(d)
A 吸光度值
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
培养时间(d)
B 图3 第2代及第5代人脂肪干细胞的生长曲线
Figure 3 The growth curve of adipose-derived stem cells at passages 2 and 5 图注：图中A 为第2代人脂肪干细胞生长曲线；B 为第5代人脂肪干细胞生长曲线。由图可见人脂肪干细胞生长曲线呈S 形，第0-3天时处于起始期，第3天细胞增殖加速并进入对数生长期，第7天时生长达到高峰，以后进入平台期。
B
图4 第2代(A)及第5代(B)人脂肪干细胞表面抗原标记物的表达
Figure 4 The expression of surface antigens in passage 2 and 5 adipose-derived stem cells
图5 人脂肪干细胞经成脂分化诱导后油红O染色可见细胞内大量葡
萄样的红色脂滴(×100)
Figure 5 After adipogenic induction, oil red O staining showed a
great amount of red lipid droplets in human adipose-derived stem
cells (×100)
图6 人脂肪干细胞经成骨分化诱导后茜素红染色证实钙化结节形成
(×100)
Figure 6 Human adipose-derived stem cells were positive for
alizarin red staining after osteogenic induction and calcified nodules
formed (×100)
图7 荧光显微镜下DAPI未标记和标记细胞图像
Figure 7 DAPI-labeled and unlabeled human
adipose-derived stem cells under fluorescent
microscope
图注：图中A为DAPI未标记人脂肪干细胞24 h(×100)，
几乎无蓝色荧光显示；B为DAPI标记人脂肪干细胞24 h
(×200)，可见明亮蓝色荧光。
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细胞仍保持良好的增殖能力，细胞间可见钙质沉积；诱导3周后，细胞结节中心的细胞结构逐渐丧失，钙结节大量形成，经茜素红染色可见大量红色结节(图6)。
2.5 DAPI标记人脂肪干细胞荧光显微镜下，DAPI标记1 d的人脂肪干细胞，细胞核可见明亮蓝色荧光，标记率达100%(图7)。DAPI标记细胞和未标记细胞的生长曲线无差异。
3讨论Discussion
目前，骨髓来源的间充质干细胞已经成为干细胞生物学领域的最重要细胞来源。但是，骨髓的抽取往往给供者造成较大痛苦，并且来源有限。脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞，由于其来源广泛、分离培养方法简单、扩增能力强等特点使其逐渐成为种子细胞的新来源[5-7]。
脂肪组织抽取后残留于供区的脂肪组织仍可继续扩增，易于大量获取，对供区组织的损伤也较小。目前取材多集中于脂肪含量较多的动物，尤其是对兔和大鼠皮下脂肪的分离培养[8-9]。人体脂肪干细胞研究材料主要来源于吸脂术得到的液化脂肪[10]，但抽脂术对皮下脂肪的加热液化过程可能会破坏组织的完整性，而且抽脂术有一定的危险性和死亡率。本实验通过外科手术获取脂肪组织应该更有利于干细胞的分离培养，也更具安全性，并且在取材时尤其应注意对脂肪组织的保护，如将其置于低温条件中，迅速送至实验室进行分离培养，保证了细胞的活力。脂肪干细胞的分离效率较其他干细胞高，平均300 mL脂肪组织可获得(2-6)×108个有核细胞。在消化脂肪组织时，现有的实验方法常采用胶原酶或胶原酶与胰酶共同消化，消化时间从30 min-3 h不等。本研究采用单纯胶原酶消化、离心和换液来分离培养人脂肪干细胞，在实验过程中用显微剪将脂肪组织尽量剪碎成1 mm3，选用0.1%胶原酶Ⅱ37℃摇床消化60 min，不仅增加了脂肪组织与胶原酶接触面积，提高消化效率，而且缩短了胶原酶的作用时间，减少胶原酶的毒性，增加了消化后细胞的数量和活性。另外，传统的分离方法中通常加入了氯化胺(NH4Cl)溶液裂解红细胞，然后再进行贴壁培养[2]，但考虑NH4Cl裂解红细胞的同时，可能会不同程度地影响目标细胞，故本实验未采用NH4Cl溶液对分离出细胞预处理。为避免裂解液对脂肪干细胞的损伤，直接进行贴壁培养，用换液的方法去除红细胞和其他杂细胞。结果表明，细胞获得率与文献报道基本一致[11]。
体外增殖能力是评价干细胞的一个重要参数。实验分别检测了第2，5代人脂肪干细胞的生长曲线，结果显示在体外培养条件下人脂肪干细胞经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，符合正常细胞的生长规律。研究结果显示，传代细胞比原代细胞增殖速度加快，但也存在1-3 d的潜伏期，第3天后细胞增殖快速，平均倍增时间为26 h，约7 d达到生长平台期，这与以往的文献报道一致[12-13]。细胞扩增至第5代，仍然能够稳定保持快速增殖的能力，具有第2代细胞类似的生长曲线，细胞在体外可连续稳定传代10代以上，说明使用本实验的分离方法及扩增方法，能够维持人脂肪干细胞的增殖能力，易于获得大量有分化能力的细胞。通过流式细胞仪检测细胞表面抗原表明，第2代与第5代人脂肪干细胞均高表达CD29、CD44和CD105，显示其具有干细胞抗原的特性；而脂肪干细胞不表达CD31、CD34、CD45及CD117，证明其为非造血内皮类细胞，这与以往的文献报道一致[10，14-15]。同时，人脂肪干细胞低表达免疫原性抗原标记CD14和CD106，表明它们具有极少量与移植排斥相关的抗原分子，提示脂肪干细胞具有低免疫原特性，可以进行异体移植。另外，随着连续传代，第5代细胞比第2细胞更纯，增殖能力更强。
多向分化潜能是干细胞最重要的生物学特性，由于成体干细胞目前尚无特异性的表面抗原标记物，故需进一步进行多向分化潜能的鉴定。实验着重研究了人脂肪干细胞的成骨成脂分化潜能，对分离的人脂肪干细胞(第5代)分别进行了成骨和成脂诱导分化。成骨过程大致可分为3个阶段[16]，即细胞增殖及基质分泌期、细胞外基质成熟期、细胞外基质矿化期，其中Ⅰ型胶原为早期骨形成的标志物，碱性磷酸酶常出现在基质成熟期，而细胞外基质矿化期最突出的表现为大量钙盐沉积[2]。钙沉积是成骨细胞分泌的功能指标。茜素红钙结节染色可检测细胞内的钙沉积情况，可作为成骨细胞成熟的鉴定指标。本研究所用的骨诱导培养液，含有维生素C、β-甘油磷酸钠及地塞米松的成分，已经用于骨髓间充质干细胞的诱导成骨[17]。与成骨过程相对应，在地塞米松对脂肪干细胞的增殖以及成骨分化全程调控下，维生素C参与早期Ⅰ型胶原的合成，β-甘油磷酸钠被细胞分泌的碱性磷酸酶水解而释放出无机磷从而参与细胞外基质矿化。最终经上述3者的联合干预，成骨过程基本完成。在成骨诱导3周后细胞基质矿化物形成明显，茜素红染色证实钙化结节形成，证实脂肪干细胞经诱导后能够分化为成骨细胞。除了进行成骨分化潜能研究以外，还对所分离获得的细胞进行了成脂诱导。成脂诱导的培养液里包含地塞米松、牛胰岛素、吲哚美辛和IBMX。高浓度的地塞米松(1 μmol/L)和胰岛素、IBMX共同作用能激活细胞表面糖皮质激素受体，使其分化为脂肪细胞[18]。诱导约3 d后，细胞体积增大，显微镜下可观察到胞质内有小的透亮脂滴，随着诱导时间延长，脂滴逐渐增多、增大融合，折光性增强，细胞核由细胞中央被挤到细胞的边缘位置。3周后油红O染色显示强阳性，可见细胞内含有大量的成葡萄样紫红色脂滴，证明脂肪干细胞经诱导后实现了向成脂分化，从而证实脂肪干细胞具有多向分化的潜能。
综上所述，利用原代培养技术从人脂肪组织中成功分离培养出脂肪干细胞，其具有干细胞特性、低免疫原性，且具有多向分化潜能，并在多次传代后仍保持遗传稳定性。与文献报道一样，再次证实了脂肪干细胞无论从细胞形态、生长
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动力学、分离培养条件，还是从表面标志、多向分化潜能等方面均与骨髓来源干细胞无明显区别[19]，更重要的是同样具有免疫调节作用[20-22]。这种免疫调节能力在慢性炎症和自身免疫疾病的治疗中具有重大意义。与骨髓间充质干细胞相比较而言，脂肪干细胞具有以下优点：①取材方便，对供区影响小，并发症少。②分离培养简单，容易获得，增殖能力强，细胞移植不需在体外长期培养扩增。③来源相对充足，体内储备量大。④在诱导因子作用下具有定向分化能力。⑤组织相容性好，能适应体内环境，保持良好的生物学特性且不引起免疫排斥反应等。脂肪组织是人体内含量十分丰富的组织。随着肥胖症患者的增多，人类脂肪开始富余并渐成为累赘，利用脂肪抽提术提取脂肪分离干细胞，作为免疫治疗的种子细胞来源，具有重大的临床价值。因此，脂肪干细胞正逐渐成为干细胞在免疫治疗领域的研究热点。
致谢：感谢中山大学医学院公共卫生学院实验平台。
作者贡献：实验设计为肖建红，实验实施为肖建红、张阳春，实验评估为张阳春，资料收集为杨兴。肖建红成文，张常然审校，肖建红对文章负责。
利益冲突：文章及内容不涉及相关利益冲突。
伦理要求：脂肪组织标本的采集经中山大学附属第一医院伦理委员会批准，并签署知情同意书。
学术术语：细胞培养中的密度梯度离心法？密度梯度离心法亦称平衡密度梯度离心法，用离心机对物质溶液加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降试管内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里有不同密度物质，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在离心力和浮力平衡的位置，集聚形成不同密度梯度带状物。在达到沉降平衡后，获取所需的物质。
作者声明：文章为原创作品，无抄袭剽窃，无泄密及署名和专利争议，内容及数据真实，文责自负。
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胚胎干细胞的体外诱导分化模型
胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源 李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1 胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。 胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2 胚胎干细胞为基础的分化模型 胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1 神经细胞 体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化 化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。 参考文献 1 Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147. 2 Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731. 3 Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486. 4 裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)
人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定
中国组织工程研究 第19卷 第32期 2015–08–06出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research August 6, 2015 Vol.19, No.32 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5155 www. CRTER .org 肖建红，女，1980年生，四川省绵阳市人，羌族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事造血干细胞抑制、干细胞与组织工程，以及免疫性血小板减少性紫癜的临床研究和基础研究。 通讯作者：张阳春，硕士，主治医师，中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2015)32-05155-07 稿件接受：2015-07-01 https://www.wendangku.net/doc/009107221.html, Xiao Jian-hong, M.D., Attending physician, Department of Internal Medicine, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China Corresponding author: Zhang Yang-chun, Master, Attending physician, Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China Accepted: 2015-07-01 人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定 肖建红1，张阳春2，张常然1，杨 兴2(中山大学附属第一医院东院，1普通内科，2下肢骨科，广东省广州市 510700) 文章亮点： 1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。 2 实验发现第5代脂肪干细胞比较适合进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。 3 DAPI 是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI 不损伤细胞活性，对细胞标记率高。 关键词： 干细胞；脂肪干细胞；人来源的脂肪干细胞；细胞分化；脂肪组织；细胞培养；细胞鉴定；国家自然科学基金 主题词： 干细胞；皮下脂肪；细胞分化；细胞，培养的 基金资助： 国家自然科学基金青年项目(81500091)；广东省自然科学基金博士启动项目(2015A030310022)；广州市黄埔区科技计划项目(201444-02) 摘要 背景：脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞，在组织工程中比骨髓间充质干细胞具有更多优势，是当今的研究热点之一。 目的：在体外建立一种分离纯化人皮下脂肪来源脂肪干细胞的方法，进行体外培养扩增及诱导其向成骨、成脂细胞分化。 方法：通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。倒置显微镜下观察人脂肪干细胞的细胞形态和生长特性。选取第2代及第5代细胞，用CCK-8法检测细胞活性，绘制细胞生长曲线，用流式细胞仪检测细胞表面抗原标记。选取第5代细胞，分别进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。 结果与结论：①采用密度梯度离心和贴壁培养相结合方法，可成功从人脂肪组织中获得纯度较高的人脂肪干细胞。②人脂肪干细胞经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，符合正常细胞的生长规律，且其生长具有对数生长期，其倍增时间较短。③人脂肪干细胞表达干细胞表面抗原标记，具有低免疫原性，且具有成脂成骨多向分化潜能。④DAPI 是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI 不损伤细胞活性，对细胞标记率高。 肖建红，张阳春，张常然，杨兴. 人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定[J].中国组织工程研究，2015，19(32):5155-5161. doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.013 Human subcutaneous adipose-derived stem cells: osteoblastic/adipogenic differentiation and identification Xiao Jian-hong 1, Zhang Yang-chun 2, Zhang Chang-ran 1, Yang Xing 2 (1Department of Internal Medicine, 2Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China) Abstract BACKGROUND: Adipose-derived stem cells are a kind of mesenchyam stem cells with multipotent differentiation capacity, which have more advantages than bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering research. OBJECTIVE: To establish a method to isolate and purify adipose-derived stem cells from human subcutaneous adipose tissues followed by in vitro amplification and osteoblastic/adipogenic differentiation. METHODS: Adipose-derived stem cells were isolated from human subcutaneous adipose tissue and cultured by density gradient centrifugation and adherent culture. Cell morphology and growth features were observed under inverted microscope. Adipose-derived stem cells at passages 2 and 5 were selected for viability measurement using cell counting kit-8 method, and then cell growth curves were drawn. The immunophenotype identification was analyzed by flow cytometry. Passage 5 cells underwent osteoblastic/adipogenic induction to confirm the multi-differentiation potential. RESULTS AND CONCLUSION: (1) Using density gradient centrifugation and adherent culture method, high-purity human adipose-derived stem cells can be successfully isolated from human adipose tissues. (2) The growth process of human adipose-derived stem cells includes stagnant phase, logarithmic phase and plateau phase, which meets the growth rhythm of normal cells. Moreover, the population doubling time is shorter. (3).
干细胞诱导分化具体步骤及注意事项
干细胞诱导分化具体步骤及注意事项 一、技术简介 干细胞诱导分化是诱导干细胞定向分化，使之成为成熟的功能细胞，是目前干细胞研究的关键环节。干细胞是一种未充分分化，具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。如：骨髓间充质干细胞是位于骨髓基质中的一类中胚层来源的未分化细胞，在体内外均发现有极强的增殖能力，具有很强的自我更新和多向分化潜能。在一定诱导条件下，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞等，还可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞等骨髓基质细胞，具有发育为骨、软骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能。 在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异，这种基因表达差异除由细胞内在发育程序决定外，还受细胞外环境影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。干细胞体外定向诱导分化的原理，就是选择适当的诱导剂和诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化，然后将这些定向分化的细胞进行分离和培养传代，从而得到人们所需要的细胞类型。 二、实验流程 1. 干细胞的分离、原代和传代培养。 2. 定向诱导干细胞分化。 3. 成长曲线测定。 4. 诱导分化后细胞鉴定。 5. 结果统计分析。
诱导性多功能干细胞——产生,发展,应用及展望
诱导性多功能干细胞 ——产生，发展，应用及展望 张博文，杨星九，李玖一，白末* 摘要：在胚胎干细胞研究因伦理道德和免疫排斥问题而受阻的时候，诱导性多功能干细胞(induced pluripotent stem cell，以下简称iPS细胞)的横空出世为干细胞研究指明了一条新的方向。近几年来iPS细胞研究取得了许多突破性的进展，其广泛的应用前景更向人们昭示着一个新的时代的到来。本文主要从iPS细胞的发展历程入手，综述了iPS细胞的理论及应用研究的关键进展，并对之后的研究进行了展望。 关键词：诱导性多功能干细胞，胚胎干细胞，病毒，癌变，细胞治疗 Abstract:When the embryonic stem cell research was blocked by ethical issues and immune rejection, induced pluripotent stem cell (hereinafter referred to as iPS cells), turned out for stem cell research indicated a new direction. iPS cells’ research in recent years has made many breakthroughs, prospects for its wide application to remind people of a new era. This article summarizes the theory and application of iPS cells, and the key to progress in the study, from the iPS cells to start the development process, and discussed the study in the future. Key words：induced pluripotent stem cell, embryonic stem cell, virus, Canceration, cell therapy IPS细胞是通过向体细胞中导入诱导基因，使体细胞重编程获得具有胚胎干细胞样特性的多能干细胞。iPS细胞的产生可谓干细胞领域的新里程碑。近几年，iPS细胞的研究突飞猛进，本文中结合最新的研究结果，综述了iPS细胞的产生背景、发展历程及其应用前景，并对今后iPS的研究发展进行了客观的展望。 1产生背景 干细胞(stem cells, SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。其中胚胎干细胞(Embrtibuc stem cell)更是具有全部的全能性，能够分化成人体内的所有细胞，具有非常广阔的应用前景。 早在上个世纪，人类就已经开始针对干细胞进行研究，试图通过各种不同的方法得到多能干细胞，其中突出的方法有胚胎干细胞（ES细胞）直接植入法；体细胞核转移 ----------------------------------------- *张博文，杨星九，李玖一：资料查阅与论文编写白末：资料查阅与论文整合
干细胞向成骨细胞诱导分化染色及鉴别方法
干细胞向成骨细胞诱导分化染色及鉴别方法 碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶之一。1 Gomori钙钴法 【染色原理】ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。 【孵育液配制】3%β-甘油磷酸钠5ml 2%巴比妥钠5ml 蒸馏水10ml 2% CaCl2 10ml 2% MgSO4 1ml 【步骤】 （1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。 （3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。 （4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。 （5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。 【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。 2 偶氮偶联法： 【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸盐20mg DMSO 0.5ml 0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2）50ml 六偶氮副品红0.5ml 1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。 （六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合）【步骤】 （1）细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。 （2）蒸馏水冲洗。 （3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。 （4）流水冲洗，晾干。 （5）甘油明胶封固。 【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。 3 碱性磷酸酶染色试剂盒法： 【作用原理】细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。 【作用液配制】取2号储备液10ml，加3号液200ul，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，立即过滤到细胞爬片上。 【步骤】 （1）细胞爬片滴加数滴1号液，室温固定一分钟（不可以延长），流水漂洗2分，晾干。 （2）滴加作用液数滴，置湿盒内于37℃孵育2小时，流水冲洗2分钟。 （3）滴加5号液数滴，复染5分钟，流水冲洗2分钟，晾干。 【结果】阳性结果是胞浆内出现蓝色沉淀。 1 茜素红法 【步骤】
胚胎干细胞体外诱导分化综述
胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞
关于诱导多功能干细胞的介绍和思考
关于诱导多功能干细胞的介绍和思考 ——2012年诺贝尔生理学或医学奖解读班级：生物技术基地姓名：林立梅学号：0131122635 【摘要】John B. Gurdon和Shinya Yamanaka获得2012年诺贝尔生理学或医学奖，他们的相继研究成果证明，成熟、分化的细胞可以被重新组装或诱导重新编程，变成未成熟的干细胞，能够发育成机体内所有种类的组织。 【关键字】重新编程干细胞诱导定向分化临床医学 【内容】 （一）两位科学家的实验概述 （1）约翰.格登：用“细胞核重编程”克隆出新动物 所谓“细胞核重编程”，就是将已经分化了的成年体细胞进行诱导，让其重新回到发育早期多能性干细胞状态，重新获得发育成各种类型细胞的能力。通俗一点讲，就是在细胞层面实现“返老还童”。 1962年，格登做了一个划时代的实验：他假设：这些细胞的基因组仍然包含着驱动它发育成机体所有不同类型的细胞所需的信息。并进行相关实验，将非洲爪蟾（Xenopus，一种蛙）卵细胞内不成熟的细胞核移除，然后把非洲爪蟾的成熟肠细胞的细胞核注入其中。在此过程中，他采用核标记技术（Elsdale et al，1960），将标记的供体细胞核移植到未标记的受体卵。在实验中，控制由囊胚或原肠胚（简称胚胎细胞核）穿插与转让肠细胞核。移植的胚胎中，所有那些超出了囊胚期的细胞中包含明显的被标记的核，可以证明它们来源于核移植而不是从卵核。核标记只出现在渡过了囊胚期胚胎中。整个实验的目的很简单，就是想看看这个卵子最终会变成什么。结果发现，一部分卵依然可以发育成蝌蚪；其中的一部分蝌蚪，可以继续发育成为爪蟾。 (2)山中伸弥：用基因技术制造出“诱导多能干细胞” 2006年Shinya Yamanaka教授从数据库中筛选出大约100个有可能在ES细胞中特别活跃的基因。再经过近4年的紧张工作，从这100个基因中筛选出24个活跃
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养
干细胞成骨诱导后的染色方法和步骤
碱性磷酸酶(ALP)是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。 以ALP为目标物的检测方法： 1 Gomori钙钴法 【染色原理】 ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。 【孵育液配制】 3%β-甘油磷酸钠5ml 2%巴比妥钠5ml 蒸馏水10ml 2% CaCl2 10ml 2% MgSO4 1ml 【步骤】 (1)将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。 (2)PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。 (3)入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。 (4)2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。 (5)1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。 【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。 2 偶氮偶联法： 【孵育液配制】 萘酚AS-BI磷酸盐 20mg DMSO 0.5ml 0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液(PH 9.2) 50ml 六偶氮副品红0.5ml 1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。 (六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合) 【步骤】 (1)细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。 (2)蒸馏水冲洗。 (3)将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。 (4)流水冲洗，晾干。 (5)甘油明胶封固。 【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。 3 碱性磷酸酶染色试剂盒法： 【作用原理】细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。 【作用液配制】
胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景
龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/009107221.html, 胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景 作者：王士珍李雪甫陈培 来源：《科技视界》2012年第23期 【摘要】胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞)主要来自于胚胎发育早期囊胚中内细胞群(inner cell mass, ICM), 具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性。理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞，可作为细胞移植、组织替代, 甚至器官克隆的细胞供体，为将来治疗人类诸多难治性疾病提供细胞来源。本文简述了胚胎干细胞的诱导分化方法、定向分化的一些细胞种类以及应用前景。 【关键词】胚胎干细胞；诱导；分化 ES细胞是由囊胚的内细胞群或胎儿的原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)经体外抑制分化培养而获得的一种具有多向分化潜能的细胞。英国剑桥大学的Evans等[1]于1981年首次建立了小鼠胚胎干细胞系。Thomson等[2]于1998年利用临床上体外受精的胚胎，采用免疫法分离出内细胞群，首次成功分离出人胚胎干细胞系。同年，Sham blott等[2]以STO作为饲养层首次建立了人胚胎生殖细胞(hEGC)系。一般情况下，可将胚胎干细胞和胚胎生殖细胞统称 为胚胎干细胞。饲养层或白血病抑制因子（LIF）是ES细胞体外培养过程中保持未分化状态的必要条件。当培养条件有轻微改变时，例如在培养液中添加某些诱导分化因子（维甲酸RA、DMSO等），ES细胞就会发生分化；另外，如果把脱离饲养层的ES细胞进行悬浮培养，会发育成大小不一的拟胚体（embryoid boby, EB）,然后可诱导EB向不同类型细胞分化。至今，已从ES细胞诱导分化出心肌细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞、造血细胞、脂肪细胞、胰岛素细胞、神经细胞、内皮细胞等。这些诱导后的细胞有望为器官移植、损伤器官的修复提供原材料，具有十分广阔的临床应用前景。所以，近年来有关胚胎干细胞的定向分化研究已成为全世界研究的热点。 1诱导ES细胞定向分化的方法 目前，通常针对人们设想要得到的终末靶细胞，而采用不同的诱导分化方法，使ES细胞最终定向分化为目的细胞。最常用的诱导方法一般包括以下四种：化学试剂诱导法、细胞因子诱导法、共培养诱导法以及转基因诱导法等。 1.1化学试剂诱导法 维甲酸（retinoic acid，RA）是体内维生素A的代谢中间产物，主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。Schuldiner等[3]用一定浓度的RA（10-6M）诱导人ES细胞向神经细胞分化。实验证实：产生的神经细胞比未用RA处理的对照组增加了22%。目前，RA诱导ES细胞分化为神经细胞的机制还没有完全弄清楚。一般认为RA进入细胞后，最先与细胞质中维甲酸结合蛋白 (cellular RA binding protein，CRABP)形成复合物，然
诱导多功能干细胞研究涉及的技术
综述 诱导多功能干细胞研究涉及的技术 作者李建雄09级七年制二系093335 摘要 诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是体细胞在外源因子作用下，经直接细胞核程序重整而重新获得多潜能的干细胞．iPSCs在疾病的模型建立与机理研究、细胞治疗、药物的发现与评价等方面有着巨大的潜在应用价值．在过去几年中，科学家们致力于改进体细胞重编程技术并取得许多突破．本文就iPS细胞研究关键环节—一诱导系统涉及的技术进行综述与展望。 关键词 体细胞重编程，诱导多潜能干细胞, 整合型载体,非整合型载体，新型载体，蛋白质转染, 细胞膜的通透性观察，DNA甲基化, RNA干扰实验，信号通路 引言 干细胞是人体及各种组织细胞的最初来源，具有高度自我复制能力、高度增殖及多向分化潜能，从发现之日起一直倍受学者关注。20世纪末以来，胚胎干细胞成为各国研究的重点。然而，胚胎干细胞的获取主要还是来自早期发育的囊胚，而这一阶段涉及许多对生命的界定问题，各国因信仰、民俗及文化背景的不同引起胚胎干细胞研究激烈而敏感的伦理之争；同时，胚胎干细胞的获取和保存也受现实条件的限制。因此，怎样采用非胚胎材料直接产生多能性干细胞成为生命科学研究发展的重要瓶颈。作为细胞重编程研究的里程碑，2006年，Yamanaka小组“将Oct4、Sox2、c．Myc和KH4等4个转录因子导入小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonic fibroblasts，MEFs)中，成功获得与小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在表型、生长特性、基因表达和分化潜能等方面高度相似的小鼠诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPS cell) 【1】，从此，iPS细胞的研究日趋火热。美国Thomson 小组报道了通过转染Oct-4、Sox2、Nanog及Lin284个基因可将人的成纤维母细胞重编程为iPS细胞【2】。iPS细胞在其形态学、增殖特性、干细胞标志物的表达、表观遗传修饰上都与ESCs无显著差别【3-4】，研究表明：鼠iPS细胞能有效分化为造血和神经祖细胞，并能在体内和体外分化为血液及神经系统的各种细胞【5-6】。亦有研究证明，人体iPS细胞和小鼠iPS 细胞均可分化为心肌细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞【7-9】；同时，iPS细胞孕育而成的活体小鼠，有力地证明了iPS细胞具有真正的“全能性”【10】。但到目前为止，iPS细胞的研究才刚刚起步，一些重要的科学问题与关键技术问题还没有完全解决，iPS细胞走向临床应用为时尚早。本文就近几年iPS 细胞研究所涉及的技术作一回顾，从具体操作上把握iPS 研究和应用方向，加深对ips的认识，以期对有志于此的医学生未来的学习研究工作有所帮助． 1、基因导入技术 把已知基因转移到真核细胞,并且整合到基因组中得到稳定表达的技术,称为基因导入。基因导入技术是制备ips细胞的主要技术，而基因载体又是推动无遗传修饰ips细胞的建立的关键。载体主要有整合型载体、非整合型载体以及新型载体。 1.1.整合型载体介导的基因导入技术 早期使用的病毒载体，如逆转录病毒载体、慢病毒载体、诱导表达的慢病毒载体、单一慢病毒载体及piggyBac转座子都属于整合型载体【11】。反转录病毒载体的结构包括已切除了病毒的结构基因gag，大部分pol和env，以及两侧的LTR，被选择(标记)基因和目的基因插入的多聚位点所取代，同时还带有包装信号ψ。逆转录病毒载体制备首先要有适当的包装细胞系，以利于产生高滴度的病毒，另外还具有适当的结构。如：ψ2(第一代包装细胞)，
细胞分化和细胞全能性教学案例
《细胞分化和细胞全能性》课例分析 一教学背景 克隆生物和干细胞治疗疾病，这些都是当今生物科学的热点，学生在媒体中经常看到相关的报道，但干细胞为什么能治疗疾病？克隆生物怎样制造出来的？等等，这些都是学生感到困惑的问题。依据新的课程理念，生物教学应注重与现实生活相联系，确定本节课的教学目标是“说明细胞的分化”和“举例说明细胞的全能性”，这都是“理解水平”的要求；为增强学生理论联系实际，关注生命科学的热点问题，培养学生资料搜集和分析能力，以及表达与交流的能力，也确定开展“搜集有关克隆技术的相关资料”为教学目标。 二教材分析 多细胞生物体的生长发育与细胞的分化密切相关，细胞的分化是个体发育中重要的生理过程和生理现象，细胞分化是一种持久的、稳定的变化。分化的细胞在一定条件下又具有全能性，动物细胞核全能性的具体应用——克隆技术又是当今生命科学的热点。本节内容既是对细胞结构、功能、分裂等知识的拓展和延伸，又为学习遗传、变异打下基础。同时，本节知识与当今许多科技新进展热点问题都有紧密地联系，因此能联系实际了解或解决一些实际问题就显得很重要，也会激发学生了解科学的积极性，也是激发学生社会责任感的良好契机。三学情分析 学生在初中对“细胞分化”的知识有初步的了解，在学完“细胞的增殖”后学习本节，使学生对生物的个体发育有一个系统的理解，对于本节涉及到克隆技术、植物组织培养等知识，学生既无直观印象，也少有相关的信息储备。因此，收集与处理信息的能力、联系实际的能力是学好本节的基础。 四教学思路 细胞分化是多细胞生物体发育的基础和核心，为提高学生的学习兴趣，联系校园网上“青浦青年造血干细胞捐献志愿者”活动的通知，引导学生思考，为什么要捐献骨髓干细胞？只要平时关注媒体报道的学生，大多数能说出“是因为骨髓中有造血干细胞，能治疗白血病。”就此引入细胞分化的学习。 细胞分化的概念，内涵较深刻，也是学生较难理解的，可通过提供充分的感性材料如：图像信息，多媒体课件演示动物个体发育过程，层层设问，帮助学生理解，并且将有丝分裂与细胞分化联系起来，构建合理的知识网络。 细胞的全能性是教学的难点，引导学生从细胞有丝分裂的结果来分析。对植物细胞的全能性，用试验过程介绍，让学生了解植物组织培养的过程。最后让学生交流搜集到的有关克隆技术的知识，并对克隆技术的应用就利弊两方面展开辩论，培养他们交流表达能力以及对生物理论知识的理解、应用能力。 五教学设计方案 教学目标 1.知识和技能 1)理解细胞分化的概念、特点和意义 2)理解细胞全能性的概念 2.过程能力和方法 1)通过介绍胡萝卜根韧皮部组织培养实验，使学生理解植物细胞的全能性。 2)详细介绍“多利”羊的诞生过程，使学生了解细胞生物学实验方法； 3)通过搜集资料，课堂讨论理解克隆技术的两面性。
细胞分化与全能性
第17练细胞的分化及细胞的全能性 一、基础题 1．（2011安徽）干细胞移植现已成为治疗糖尿病的一种临床技术。自体骨髓干细胞植入胰腺组织后可分化为胰岛样细胞，以替代损伤的胰岛B细胞，达到治疗糖尿病的目的。下列叙述正确的是（） A .骨髓干细胞与胰岛样细胞的基因组成不同，基因表达产物不同 B.骨髓干细胞与胰岛样细胞的基因组成相同，基因表达产物不同 C.胰腺组织微环境造成骨髓干细胞基因丢失，分化成为胰岛样细胞 D.胰腺组织微环境对骨髓干细胞分化无影响，分化是由基因决定的 2．（2011山东）下列发生了细胞分化且能体现体细胞全能性的生物学过程是（） A．玉M种子萌发长成新植株 B．小鼠骨髓造干细胞形成各种血细胞 C．小麦花粉经离体培养发育志单倍体植株 D．胡萝卜根韧皮部细胞经组织培养发育成新植株 3．（2011上海）关于哺乳动物细胞体外培养的难易程度，下列表述正确的是（） A．乳腺癌细胞易于乳腺细胞，胚胎细胞易于脂肪细胞 B．乳腺细胞易于乳腺癌细胞，胚胎细胞易于脂肪细胞 C．乳腺细胞易于乳腺癌细胞，脂肪细胞易于胚胎细胞 D．乳腺癌细胞易于乳腺细胞，脂肪细胞易于胚胎细胞 4．（2011山东潍坊高考模拟）2010年，德国一家物技术公司申请了一项专利技术：从血管中萃取的成熟的白细胞可以转变为具有可编程特性的细胞，并进一步分化为不同功能的细胞。下列对该项技术的理解不合理的是（） A.“编程”的实质就是对遗传物质进行改造 B．该技术的操作过程类似与植物组织培养中的脱分化和再分化 C．该技术不能将人成熟的红细胞转变成可编程细胞 D．可编程细胞类似于干细胞 5.（2012天津）下列关于细胞的叙述，错误的是（） A.自体干细胞移植通常不会引起免疫排斥反应 B.胚胎干细胞在体外培养能增殖但不能被诱导分化 C.组织的细胞更新包括细胞凋亡和干细胞增殖分化等过程 D.造血干细胞具有分化出多种血细胞的能力，可用于治疗白血病 6．（2012江苏）下列事实能体现细胞全能性的是（） A．棉花根尖细胞经诱导形成幼苗 B．单细胞的DNA在体外大量扩增 C．动物杂交瘤细胞产生单克隆抗体 D．小鼠体细胞经诱导培育成小鼠 7.（原创）下列有关细胞分化的叙述中，错误的是（） A．神经元、胰岛A细胞和红细胞一般不具有分裂能力 B．细胞分化是生物界的一种普遍存在的生命现象 C．分化后的细胞只保留与其功能相关的一些遗传物质 D．细胞分化的实质是基因选择性表达
胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景
胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景 【摘要】胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞)主要来自于胚胎发育早期囊胚中内细胞群(inner cell mass, ICM), 具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性。理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞，可作为细胞移植、组织替代, 甚至器官克隆的细胞供体，为将来治疗人类诸多难治性疾病提供细胞来源。本文简述了胚胎干细胞的诱导分化方法、定向分化的一些细胞种类以及应用前景。 【关键词】胚胎干细胞；诱导；分化 ES细胞是由囊胚的内细胞群或胎儿的原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)经体外抑制分化培养而获得的一种具有多向分化潜能的细胞。英国剑桥大学的Evans等[1]于1981年首次建立了小鼠胚胎干细胞系。Thomson等[2]于1998年利用临床上体外受精的胚胎，采用免疫法分离出内细胞群，首次成功分离出人胚胎干细胞系。同年，Sham blott等[2]以STO作为饲养层首次建立了人胚胎生殖细胞(hEGC)系。一般情况下，可将胚胎干细胞和胚胎生殖细胞统称为胚胎干细胞。饲养层或白血病抑制因子（LIF）是ES细胞体外培养过程中保持未分化状态的必要条件。当培养条件有轻微改变时，例如在培养液中添加某些诱导分化因子（维甲酸RA、DMSO等），ES细胞就会发生分化；另外，如果把脱离饲养层的ES细胞进行悬浮培养，会发育成大小不一的拟胚体（embryoid boby, EB）,然后可诱导EB向不同类型细胞分化。至今，已从ES细胞诱导分化出心肌细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞、造血细胞、脂肪细胞、胰岛素细胞、神经细胞、内皮细胞等。这些诱导后的细胞有望为器官移植、损伤器官的修复提供原材料，具有十分广阔的临床应用前景。所以，近年来有关胚胎干细胞的定向分化研究已成为全世界研究的热点。 1诱导ES细胞定向分化的方法 目前，通常针对人们设想要得到的终末靶细胞，而采用不同的诱导分化方法，使ES细胞最终定向分化为目的细胞。最常用的诱导方法一般包括以下四种：化学试剂诱导法、细胞因子诱导法、共培养诱导法以及转基因诱导法等。 1.1化学试剂诱导法 维甲酸（retinoic acid，RA）是体内维生素A的代谢中间产物，主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。Schuldiner等[3]用一定浓度的RA（10-6M）诱导人ES细胞向神经细胞分化。实验证实：产生的神经细胞比未用RA处理的对照组增加了22%。目前，RA诱导ES细胞分化为神经细胞的机制还没有完全弄清楚。一般认为RA进入细胞后，最先与细胞质中维甲酸结合蛋白(cellular RA binding protein，CRABP)形成复合物，然后复合物进入细胞核内，与染色质上的受体结合，从而调控一系列基因的表达，使细胞的表型发生转变。二甲基亚砜（DMSO）是一种含硫的有机化合物，不仅能用于细胞的常规冻存，而且还是一种常用的细胞分化诱导剂，能够诱导ES细胞分化为骨骼肌细胞、心肌细胞等，其作用机制主要是影响c-myc基因表达，降低细胞的内源性聚腺苷二磷酸核苷表达水平。也有研究证明，DMSO能使细胞内储存的钙释放出来，而细胞内钙离子浓度升高在诱导细胞分化中可能起着重要作用。除了RA、DMSO外，还有β-磷酸甘油、维生素C(VC)、地塞米松、维生素K3(VK3)以及2，5-羟基维生素D3等化学试剂，也能诱导ES细胞定向分化为特定类型细