病毒感染实验诊断

病毒感染实验诊断

1. （1）一般原则是特异敏感、快速和简便。首先根据流行病学和临床特点，初步判断可能感染的病毒。

（2）然后根据可疑病毒的生物学特点、机体免疫应答和临床过程，以及病人当前所处的时机，确定实验诊断方法。

2.

（1）对潜伏期短，发病时尚无抗体产生，可选择测定病毒颗粒、病毒抗原或核酸。

（2）对潜伏期超过十天的感染，可检测特异性的IgM抗体来进行早期快速诊断，及区别初次和再次感染。

（3）对可在体内形成持续感染或潜伏感染的病毒，可检测急性期和恢复期双份血清的IgG 抗体有无4倍以上升高，或直接检测病毒核酸。

（4）对原因不明或有新病毒感染时，应采集标本进行病毒分离，同时应采取双份血清以确认分离的病毒为病原体。

（5）对同一症状可有多种病毒引起的情况，应同时检测几种相关病毒的病毒颗粒、抗原或抗体。

（6）对由多个型别组成的病毒可测定它们的共同抗原。

第一节标本采集与运送

一、标本的采集

1. 采样时间：尽可能在发病的初期，急性期或患者人院的当天进行。

2. 标本种类的选择：根据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感染病毒种类，选择相应部位采取标本。

常见分离病毒标本的选择：

3．常见标本的采集方法

(1) 血液：以无菌取抗凝血10ml。抗凝选用100n／ml肝素钠。用于分离CMV、HSV，、黄病毒、EBV、HIV-1及新生儿肠道病毒。

(2) 脑脊液：以无菌取脑脊液1～2ml，冰浴立即送检。在4℃可存放72h。用于分离柯萨奇病毒、ECHO病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。

(3) 宫颈或阴道拭子：采取病灶部位分泌物，或将拭子伸人宫颈约lcm停留5秒取出，冰浴立即送检。用于分离HSV、CMV。

(4) 粪便标本：取2～4ｇ粪便加10ml运送液立即送检，用于分离腺病毒、肠道病毒和轮状病毒。

(5) 含漱液：用无菌生理盐水让患者含漱。用于分离流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV

等。

(6) 喉拭子：用压舌板避免唾液污染，用拭子采取咽喉部表面。用于分离腺病毒、CMV、肠道病毒、HSV、流感病毒等。

(7) 尿道拭子及尿液标本：尿道拭子伸人尿道4cm转动3次，以获得较多的上皮细胞，用于分离CMV和HSV。

(8) 尸检标本：死亡后尽早采集各种器官，分别使用器械和容器。

二、标本的运送和保存

1. 病毒抵抗力弱，室温中容易灭活，用于分离培养的标本要尽快送检，4℃下数ｈ或-70℃。冻存液中加入甘油或二甲基亚砜(DMSO)等作保护。

2. 病毒传送培养基以Hanks液为基础加灭活的小牛血清。为抑制细菌生长加青霉素100U／ml和链霉素100μg／ml，为了抑制真菌的生长加入2．5μg／ml二性霉素B或40μg／ml 制霉菌素。

第二节病毒分离与鉴定

一、病毒的分离方法

1. 组织细胞培养根据细胞的来源、特性和传代次数分为：

(1) 原代细胞培养：将细胞悬液。加入营养液培养。形成的单层细胞，称之为原代细胞。

(2) 二倍体细胞株：仍保持二倍体特性。寿命一般为40～50代，如人胚肺细胞。广泛用于病毒分离和疫苗制备。

(3) 传代细胞系：来于肿瘤细胞，染色体特征类似肿瘤细胞。常用的有人宫颈癌细胞(Hela)、人喉上皮癌细胞(Hep-2)。

2．鸡胚接种鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、痘类病毒的较为理想的材料。

3．动物接种动物对病毒的敏感性是不同的，选择合适动物十分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分离病毒。

常用于病毒分离的细胞

二、病毒的鉴定：必须通过全面了解其特性才能得到鉴定。

1. 根据临床特点，流行病学资料，标本来源，大致了解病毒的一些特性，有助于确认病毒的种类。

2. 动物感染范围及特点病毒感染动物的范围、发病的潜伏期。

3. 细胞培养特点。

综合上述1/2/3资料作出鉴定。

4. 病毒鉴定的方法

（1）细胞培养的结果观察：

病毒增殖后导致细胞发生：

①细胞病变效应(CPE)。细胞肿大，变圆堆积成葡萄状，细胞溶解出现空斑，细胞融合形成多核巨细胞，胞浆内或核内出现嗜酸性或嗜碱性包涵体等；

②不出现细胞病变现象。

③细胞培养液pH的变化。

（2）中和试验：

病毒与特异性抗体进行免疫反应，使病毒失去感染性，在细胞培养和活的机体内不出现病变的试验。常用细胞培养进行中和试验。如果特异性抗体能中和病毒，使之失去感染性，不出现细胞病变效应，则该病毒为特异性抗体的同型病毒。

用于病毒的分型诊断最具敏感和准确性。也可用于检查患者病后或人工免疫后，机体血清中抗体增加情况。

（3）空斑或蚀斑形成试验：

空斑是指在单层细胞中被病毒感染引起死亡的细胞区域，周围被活细胞包围。一般而言，一个空斑是由一个感染性病毒颗粒感染所引起的。不同的病毒引起的空斑形态和大小不同。可进行病毒颗粒的计数、纯化，结合中和试验可进行病毒的鉴定。

（4）干扰现象：

某些病毒间存在着干扰现象，如某些型别的鼻病毒能干扰以后进入的副流感病毒的增殖，从而阻抑后者的红细胞吸附作用。

（5）红细胞吸附及吸附抑制试验：

正粘病毒，副粘病毒感染的宿主细胞，病毒增殖后产生细胞病变，但在细胞表面含有病毒某些抗原成分(血凝素)，能吸附鸡、豚鼠或猴红细胞。

可作为初步鉴定。如果在培养瓶中加入相应的血凝素抗血清后，不出现红细胞吸附现象，是为红细胞吸附抑制试验阳性，可作为病毒鉴定的依据。

（6）血凝试验及血凝抑制试验：

某些病毒可与一定种类的哺乳动物或禽类的红细胞产生血凝现象。加入相应的血凝素抗体可抑制血凝现象的发生，是为血凝抑制试验。可作为病毒型别确定的依据。

（7）病毒的大小及形态：可用电子显微镜观察病毒的大小及形态。

（8）核酸类型鉴别及序列测定：

利用5—溴-2-脱氧尿苷(BUDR)抑制DNA复制的特性，在细胞培养液中加入该物质，可抑制DNA病毒的复制和增殖，抑制细胞病变的出现，但对RNA病毒无抑制作用，以此判断病毒核酸类型。

对病毒核酸特异序列或全序列的碱基排列测定或DNA杂交、DNA-RNA杂交来鉴定病毒。

（9）耐酸试验：肠道病毒对酸有耐受力，而鼻病毒在酸性环境下易被灭活。

（10）乙醚敏感试验：

病毒外围如有类脂包膜，则易被乙醚破坏，而失去感染性，不能感染细胞。可作为病毒是否具有类脂包膜的依据，也可用氯仿或去胆酸钠代替乙醚进行试验。

（11）免疫荧光抗体染色：

将感染细胞固定，用特异抗血清荧光标记染色，在荧光显微镜下，可见细胞内荧光，即可确定型别。

第三节病毒感染快速诊断

通过测定病毒的特异标志成分，如特殊形态、特异的抗原成分及病毒的核酸，早期确认

病毒的感染，是病毒学诊断的重大发展。

一、形态学检查

1．光学显微镜

观察病毒感染细胞出现的包涵体。根据特点可作出辅助诊断。狂犬病病毒在脑细胞出现嗜酸性的圆形或椭圆形包涵体，称为内基小体。巨细胞病毒在上皮细胞的细胞核内出现周围绕有一轮晕似“猫头鹰眼”样大型嗜酸性包涵体。

2．电子显微镜检查

(1) 电镜直接检查：早期病毒感染标本的病毒颗粒。如“秋季泻”患儿粪便中的轮状病毒、甲肝患者粪便中的HA V，疱疹病毒的疱疹液，HBV患者血清，均可观察到特征性病毒颗粒。

(2) 免疫电镜检查：在标本中加入抗体。使病毒聚集成块负染观察，更易发现病毒体，灵敏度可提高100倍。

二、病毒抗原检测：病毒抗原是病毒特异性的标志，通过免疫学技术检测标本中特异性抗原存在，可以早期诊断病毒感染。

1．免疫荧光技术：

适合于型别少，细胞培养难以成功的病毒，如流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒等。肝活检组织中的肝炎病毒、神经组织中的单纯疱疹病毒、脑组织中的狂犬病毒或其他脱落细胞和活检组织中的病毒抗原检测。

2．酶免疫技术：

有酶免疫组化和酶免疫吸附(ELlSA)试验法。测定标本中游离的抗原或抗体。如检测乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)，HIV感染病人的P24抗体等。

3.其他技术：如固相放射免疫技术、发光免疫分析技术、胶体金标记的免疫层析技术等。

三、早期抗体检测

检测病毒感染机体后产生的早期特异性抗体，如测定特异性IgM可以快速明确诊断各种病毒引起的新生儿先天性感染，测定HA V感染后抗HA V的IgM抗体可以明确诊断HA 等。

四、病毒核酸检测：只要有完整的特异基因片段存在，就可进行诊断。

1．斑点杂交法

将待测的DNA或RNA直接点在杂交滤膜上，变性后，用标记的核酸探针进行杂交。用32p或131I同位素标记的探针通过放射白显影，可直接观察。现用地高辛、生物素等非同位素物质标记，然后采用酶反应或酶免疫技术进行检测，已被越来越多的实验室广泛使用。2．固相杂交技术

将核酸探针包被聚苯乙烯微孔板中，加人待测的核酸序列和标记的指示探针杂交液中进行杂交，洗涤后，用酶免疫技术进行检测。

3.原位分子杂交技术

在细胞原位暴露DNA或RNA，加入标记特异核酸探针进行杂交。通过显色技术可显示特定杂交探针在细胞内的位置和核酸的数量。

4.Southern印迹和Northern印迹法

Southern印迹法用于DNA的杂交。提取DNA,用内切酶切割后，进行琼脂糖电泳按分子量使DNA分开，将DNA移至硝酸纤维膜上，用标记探针进行杂交。可以检测病毒DNA 特异序列。

Northern印迹法用于RNA杂交分析。将琼脂糖电泳后的RNA移至DBM膜上，用标记探针进行杂交。用于检测RNA或mRNA。

5．聚合酶链反应(PCR)

(1) DNA病毒：可直接进行PCR扩增其特异片段。

(2) RNA病毒：可通过RT-PCR技术，将RNA逆转录为cDNA，再进行PCR扩增。

(3) 定量PCR技术：对扩增的产物进行原始标本定量，对病毒感染的诊断起到了量化的作用。同时，对研究病毒和机体之间的关系提供了参考。

6．病毒核酸的直接检测

有些病毒如轮状病毒的核酸具有典型的分节段特点。可以从标本中直接提取轮状病毒的核酸。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，观察其特有的11个核酸节段的条带排列情况，进行诊断。

五、病毒检验的结果评价

通过实验手段，从标本中获得有关病毒感染的证据，从而确定病毒感染和临床疾病之间的因果关系，是病毒实验诊断的目标。

通过分离和鉴定获得致病性病毒，发现病毒感染的特异征象，如机体内产生特异性抗体,急性期和恢复期血清中相应的特异性抗体有4倍以上的升高，细胞内包涵体的形成等,就可得出病原学诊断。

感染病毒的临床意义必须结合流行病学资料、临床表现、病毒种类及机体的病理变化作综合分析，才能判定。

PI染色检测细胞周期

1、离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。 2、加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定（4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃，有资料说-20℃可以保存一个月，个人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响）。 3、细胞染色 离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30分钟（PI我是直接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响）。 4、流式分析 以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。 分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞，具体如下图。 细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期),而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。 结果解读 G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76 G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43 S期占25.73 G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2） 峰的变异系数为4.54%（好） 细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。 总的细胞数（仪器检测到的）为17525个， 在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）

病毒感染实验诊断

病毒感染实验诊断 1. （1）一般原则是特异敏感、快速和简便。首先根据流行病学和临床特点，初步判断可能感染的病毒。 （2）然后根据可疑病毒的生物学特点、机体免疫应答和临床过程，以及病人当前所处的时机，确定实验诊断方法。 2. （1）对潜伏期短，发病时尚无抗体产生，可选择测定病毒颗粒、病毒抗原或核酸。 （2）对潜伏期超过十天的感染，可检测特异性的IgM抗体来进行早期快速诊断，及区别初次和再次感染。 （3）对可在体内形成持续感染或潜伏感染的病毒，可检测急性期和恢复期双份血清的IgG 抗体有无4倍以上升高，或直接检测病毒核酸。 （4）对原因不明或有新病毒感染时，应采集标本进行病毒分离，同时应采取双份血清以确认分离的病毒为病原体。 （5）对同一症状可有多种病毒引起的情况，应同时检测几种相关病毒的病毒颗粒、抗原或抗体。 （6）对由多个型别组成的病毒可测定它们的共同抗原。 第一节标本采集与运送 一、标本的采集 1. 采样时间：尽可能在发病的初期，急性期或患者人院的当天进行。 2. 标本种类的选择：根据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感染病毒种类，选择相应部位采取标本。 常见分离病毒标本的选择： 3．常见标本的采集方法 (1) 血液：以无菌取抗凝血10ml。抗凝选用100n／ml肝素钠。用于分离CMV、HSV，、黄病毒、EBV、HIV-1及新生儿肠道病毒。 (2) 脑脊液：以无菌取脑脊液1～2ml，冰浴立即送检。在4℃可存放72h。用于分离柯萨奇病毒、ECHO病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。 (3) 宫颈或阴道拭子：采取病灶部位分泌物，或将拭子伸人宫颈约lcm停留5秒取出，冰浴立即送检。用于分离HSV、CMV。 (4) 粪便标本：取2～4ｇ粪便加10ml运送液立即送检，用于分离腺病毒、肠道病毒和轮状病毒。 (5) 含漱液：用无菌生理盐水让患者含漱。用于分离流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV

PI染色检测细胞周期实验步骤

protocol : PI染色检测细胞周期 1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处 理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有 0.5-2 X 10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS （根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的 PBS J ;然后胰酶消化 （注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心（1000r/300g 5mi n）收集细胞沉淀。 2、用预冷的PBS清洗细胞两次。 3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇（乙醇终浓度70%），吹打混匀以免细胞团聚，4C固定2H至过夜。 4、细胞染色：离心（1000r/300g 5min ）收集固定的细胞，以1.8 mL的PBS洗细胞一次，离心（第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎）再次获取细胞沉淀后加入1 00卩IRNaseA 于37 C水浴30min，最后加入400卩lPI避光染色30 min （常温或4C 均可） 【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用P BS 临时配好总量，其中 PI 50ug/ml、RNase A 100ug/mL、Trit on X-100 0.2% ） 4 C避光染色30分钟】 5、流式分析以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结

果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-W和FL2-A显示，去除联体细胞。

病毒感染的实验诊断

病毒感染的实验诊断 病毒感染的实验诊断（一） ●考点 病毒的生物学性状 病毒的实验室检查方法 常见病毒的感染 [讲义编号NODE70103300270100000101：针对本讲义提问] 【内容讲解】 第一节概述 一类非细胞型微生物，个体极小，可通过细菌滤器，需用电子显微镜观察。 仅含一种核酸作为遗传物质，外被蛋白质衣壳或还有包膜。 病毒只能在活细胞内寄生，以复制的方式进行增殖。 在临床微生物感染中，近75%的传染病是由病毒引起的。 [讲义编号NODE70103300270100000102：针对本讲义提问] 一、病毒的基本性状 （一）形态结构 1.大小和形状： 大小：测量单位用纳米表示，一般在20-300nm之间。 形态大致可分为：球形或近似球形、杆状、弹形、砖形、蝌蚪形等。 [讲义编号NODE70103300270100000103：针对本讲义提问] 2.结构 [讲义编号NODE70103300270100000104：针对本讲义提问] （二）病毒的增殖 病毒必须依赖宿主细胞，

以特殊的自我复制方式进行增殖。 病毒的复制周期： 吸附、穿入、脱壳、生物合成、 组装与成熟、释放6个阶段。 [讲义编号NODE70103300270100000105：针对本讲义提问] 异常增殖： 顿挫感染：病毒进入细胞后的环境不利于它的复制，不能合成本身的成分或不能组装和释放有感染性的病毒颗粒。 缺陷病毒：由于病毒基因组不完整或基因位点改变而不能进行正常增殖的病毒。 干扰现象：当两种不同的病毒或两株性质不同的同种病毒，同时或先后感染同一细胞或机体时，可发生一种病毒抑制另一种 [讲义编号NODE70103300270100000106：针对本讲义提问] （三）噬菌体 以细菌、真菌等为宿主，能引起细菌等裂解的病毒。 噬菌体特异性识别细菌表面受体，可用于进行细菌的鉴定与分型。 噬菌体感染细菌后产生两种后果： 溶菌周期和溶源性周期。

第25章 病毒感染的检查方法

第25章病毒感染的检查方法 与防治原则 第一节病毒的诊断 随着对病毒感染从生物学及分子生物学水平的研究进展，病毒的诊断技术已由传统方法扩展至新的快速诊断技术。病毒感染的快速诊断有利于对病毒感染者的治疗；例如对有些病毒（如疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒）感染已有较特异的抗病毒药物治疗。早期诊断及早期治疗对控制病毒感染十分重要。此外，从群体感染角度分析，确诊病毒感染的病原在监测病毒的流行病学（如新型流感病毒、肺出血型汉坦病毒的发现等）方面也有重要的现实意义。 标本的采集与送检用于分离病毒或检测病毒及其核酸的标本应采集病人急性期标本。根据不同病毒感染采取不同部位的标本（如鼻咽分泌物、脑脊液、粪便或血液）。由于病毒在室温中很易被灭活，应在采集和运送标本中注意冷藏。如欲检测抗体，早期单份血清可用于检测IgM抗体，而欲检测早期与恢复期的抗体效价的变化，则需采集早期与恢复期双份血清。血清抗体检测标本应保存于－20℃。 病毒的分离、培养与鉴定目前最常用的方法是细胞培养。在注明欲检测的病毒后，病毒分离培养的实验室将选择适当的原代培养细胞（敏感性高）及传代细胞系（便于在实验室保存）作病毒分离培养。接种标本后，细胞可出现病变或也可并不出现病变而需用血细胞吸附等方法检测是否有病毒增殖，并进一步还需用特殊的抗体鉴定病毒的种类，例如用特异荧光抗体染色或抗体中和试验等。当无病毒增殖时，可能标本中病毒含量较低，未被检出，则需要盲目传代3次后方可明确标本中是否存在病毒。这一分离与鉴定病毒的全过程有时可长达2～3个月，而且仅在有设备、实验条件及合格工作人员的实验室方可进行。虽然这种方法所需时间长、步骤多，但在确定病原上是“黄金标准”，即其准确性高而无误。如我国台湾省确定由肠道病毒71型引起多数患儿发生脑膜炎并致死的研究报道，就是由分离培养及鉴定病毒所确诊。如欲提高病毒感染细胞培养的敏感性，可将病毒接种于内有盖玻片的细胞培养瓶，经低温离心后，以增加病毒与细胞接触的机率。再将盖玻片进行培养，并用单克隆抗体染色，藉以通过检测病毒的早期抗原进行诊断。 在流感病毒的分离培养中，最敏感而特异的方法是鸡胚接种，并用血凝和血

PI染色检测细胞周期实验步骤

protocol：PI染色检测细胞周期 1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS（根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】；然后胰酶消化（注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心(1000r/300g5min)收集细胞沉淀。 2、用预冷的PBS清洗细胞两次。 3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇(乙醇终浓度70%)，吹打混匀以免细胞团聚，4℃固定2H至过夜。 4、细胞染色：离心（1000r/300g5min）收集固定的细胞，以1.8 mL的PBS洗细胞一次，离心(第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎)再次获取细胞沉淀后加入1 00μlRNaseA于37℃水浴30min，最后加入400μlPI避光染色30 min（常温或4℃均可） 【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用P BS临时配好总量，其中PI 50ug/ml、RNase A 100ug/mL、Triton X-100 0.2%）4℃避光染色30分钟】 5、流式分析

以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞。

感染性疾病实验室诊断技术及其研究进展_龙海燕

DOI ：10.7507/1002-0179.20150280作者简介：龙海燕（1989－），女，重庆人，在读硕士，E m a i l ：longhaiyan1989@https://www.wendangku.net/doc/0416713717.html, 通讯作者：冯萍，Email: fengp_62@https://www.wendangku.net/doc/0416713717.html, 网络出版时间：2015-05-14 15:16网络出版地址：https://www.wendangku.net/doc/0416713717.html,/kcms/detail/51.1356.R.20150514.1516.022.html 感染性疾病实验室诊断技术及其研究进展 龙海燕，冯萍 四川大学华西医院感染性疾病中心（成都 610041） 【摘要】 目前全球感染性疾病现状严峻，应用于感染性疾病诊断的实验室技术种类繁多，为了解感染性疾病实验室诊断技术及其最新进展，帮助临床工作者早期、快速、准确地诊断感染性疾病，降低感染性疾病暴发的危险性，及时启动感染性疾病的正确治疗等，现从病原学检测、免疫学技术、分子生物学技术、生物传感器、流式细胞术这几个方面对感染性疾病诊断技术进行综述。 【关键词】 感染性疾病；免疫学；分子生物学；生物传感器；流式细胞术 目前全球感染性疾病现状严峻，很多经典疾病卷土重来或出现了新特点，如新变异型克-雅病、重症急性呼吸综合征（SARS ）、新型冠状病毒感染、H7N9禽流感等。以前从未认识到的感染性疾病正在持续不断出现，包括人类免疫缺陷病毒（HIV ）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、多重或广谱耐药的结核分枝杆菌、霍乱弧菌和登革热病毒所致疾病等[1]。从不断新发和再发的感染性疾病中可以看出，感染性疾病仍然给人类的生存带来了巨大的挑战，因此对感染性疾病的诊断技术提出了更高的要求。本文就现有的感染性疾病实验室诊断技术和最新研究进展进行综述，为临床工作者对感染性疾病的诊治 提供参考。 1　病原学检测 传统的病原微生 物实验室诊断技术以分离、培养、染色、生物化学鉴定为主，目前仍是许多病原体检测的“金标准”。传统人工病原学检测方法操作复杂、检测周期长（2～5 d ），干扰因素多，敏感性与特异性也有限。为了缩短传统细菌“鉴定”时间，微生物鉴定自动化技术也应运而生，如V i tek 系统、Mi c roScan 系统、Phoenix 系统、Mini API 系统等。自动化微生物鉴定系统是根据微生物代谢特点，如细菌分解底物后反应液中pH 值的变化，色原性或荧光原性底物的酶解，测定挥发或不挥发酸，或识别是否生长等方法来分析鉴定细菌，鉴定时间约15～24 h 。Crowley 等[2]采用Vitek2自动化微生物鉴定系统和 Vitek2革兰染色阴性鉴定识别卡对707例G ?菌株进行鉴定，准确率98%，10 h 内可以出结果。此类鉴定系统大大缩短了检测时间，降低了劳动强度，为疾病的确诊争取了宝贵时间。 2　免疫学检测 免疫学技术是通过检测病原微生物的抗原或抗体来进行快速鉴定的技术。该方法简化了病原微生物的鉴定步骤，因此广泛应用于临床。感染性疾病传统的免疫学技术包括凝集反应、沉淀反应、中和反应等，如临床上常用的肥达反应、免疫固定电泳、抗链球菌溶血素O 试验等。近二十几年来，免疫学分析方法 发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，灵敏度和特异度显著提高。目前常用的标志物有放射性同位素、酶、荧光素、电子致密物、化学发光物质、DNA 等。 放射免疫沉淀实验是敏感性很高的免疫标记技术，精确度高且易标准化和自动化，但由于放射性同位素有一定的危害性，其临床应用受到一定限制。酶联免疫吸附试验（ELISA ）是目前免疫酶技术中应用最广泛的，由此发展出了阵列-ELISA （array-ELISA ），同时具备简便、高通量、快捷等特点[3]。时间 分辨荧光免疫分析及上转换发光免疫分析技术拥有灵敏度高、示踪物稳定、不受样品自然荧光干扰、无放射性污染、多标记等优点[4-6]。胶体金免疫层析技术操作简单、成本低、结果判读直观快速，虽然只能定性，但可用于基层单位，可进行现场诊断或大规模检测等[7]。免疫-聚合酶链反应（PCR ）是1992年Sano 等[8]建立的一种检测微量蛋白的免疫标记技术。它是用一段已知的DNA 分子来标记特定的检测抗体作为探针，然后用此探针与待检抗原结合反应，再通过 PCR 方法扩增吸附在抗原抗体复合物上的这段标记 ?综述?

流式检测细胞周期要点

1.收集细胞； ～5000rpm离心5min，收集沉淀，重悬于200ul的PBS中，再次离心收集沉淀； ％冰冻乙醇（-20度保存）4度固定过夜or-20度固定1h； 4.离心收集沉淀，PBS洗一次（视沉淀量可忽略）； 5.沉淀重悬于200～500ul的PBS，加入Rnase A 37度水浴1h； 目纱布过滤至流式管，加入PI染色，4度避光30min-1h，上机器。 1、Q：要做胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查，但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？ A：我做过乳腺细胞的DNA含量测定，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，上机检测前再加PI综合染液。我就是这样做的，保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%. 2、实验中想用PI分析细胞周期及凋亡率，请教几个问题： Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？ A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。 Q：（2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？ A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的，不用担心。 Q：（3）Triton－x－100是固定剂吧，用了70％的冷乙醇（是4℃吗？），是不是就不用Triton－x－100固定了？ A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定剂，可以用75％的乙醇于-20度固定。 Q：（4）还要设什么内参标准（5％鸡红细胞）吗？

第23章病毒感染的实验诊断

第23章病毒感染的实验诊断 一、教学大纲要求 （1）标本的采集、处理与运送注意事项 （2）病毒形态学检查方法 （3）病毒的分离与鉴定程序及方法 （4）病毒感染的快速诊断方法 二、教材内容精要 （一）标本的采集、处理与运送 根据临床诊断及病期采集不同的标本，用于病毒学分离和鉴定的标本应在病程初期或急性期采集，要进行预处理才能用于接种和其他方法的检测。病毒的抵抗力通常较弱，在室温下很快灭活，标本采集后应立即送到病毒实验室，暂时不能检查或分离培养时，应将标本放入冻存液并加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）以防止反复冻溶使病毒灭活，存放在-70℃低温冰箱内保存。 （二）病毒形态学检查 1.光学显微镜 仅用于大病毒颗粒（如痘类病毒）和病毒包涵体的检查。 2.电子显微镜检查法 （1）电镜直接检查法 某些病毒感染的早期，临床标本中就可出现病毒颗粒。标本经粗提浓缩后用磷钨酸盐负染，电镜下直接观察，可发现病毒颗粒，获得诊断。 （2）免疫电镜检查法 将病毒标本制成悬液，加入特异性抗体、混匀，使标本中的病毒颗粒凝集成团，再用电镜观察，可提高病毒的检测率。本法比电镜直接检查法更特异，更敏感。 3.超过滤法 用不同孔径的火棉胶滤膜过滤病毒悬液，将获得的滤液接种于组织细胞、实验动物或鸡胚，或用血凝试验来测定病毒是否通过滤膜，从而估计病毒的大小。 4.超速离心法 根据病毒大小的不同，其沉降速度也不同。可用超速离心法测得病毒的沉降系数（S），借以计算病毒的大小。 5.X线晶体衍射法 根据X线衍射图谱，用数学方式处理来研究病毒结构亚单位和分子结构等。但标本必须为结晶，

可用于无包膜病毒的研究。 （三）病毒的分离与鉴定 1.病毒分离培养 实验室分离培养病毒的方法主要有三种：动物接种、鸡胚接种和组织培养。根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不同，可分为：原代和次代细胞培养，二倍体细胞培养，传代细胞培养。 2.病毒在培养细胞中增殖的指标 （1）细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。 （2）红细胞吸附 （3）干扰现象 （4）细胞代谢的改变 3.新分离病毒的鉴定 （1）病毒核酸类型的测定用RNA酶及DNA酶可鉴定出病毒核酸的类型。另外，DNA病毒受5-氟尿嘧啶的抑制，而RNA病毒不受影响。用此方法亦可区分DNA与RNA病毒。 （2）理化性状的检测对脂溶剂的敏感性：有包膜的病毒（如正粘病毒、副粘病毒、逆转录病毒等）含有脂类，对乙醚、氯仿和胆盐等脂溶剂均敏感，经作用后病毒失去感染性，而无包膜的病毒对脂溶剂有抵抗。耐酸性试验：肠道病毒与鼻病毒均属于小RNA病毒科，均耐乙醚。但前者可耐pH3，而后者在pH3~5环境中很快被灭活，故可将两者相区别。 （3）血清学鉴定病毒型别的最后鉴定必须依靠血清学方法。将分离的病毒与已知的诊断血清作各种试验进行鉴定。 （四）病毒的血清学检测 血清学试验是诊断病毒感染和鉴定病毒的重要手段，也是研究病毒的主要方法之一。血清学试验的方法很多，最常用的如中和试验、补体结合试验、血凝及血凝抑制试验等。 1.中和试验 中和试验是病毒型特异性反应，是指应用特异性抗体中和病毒的致病性或感染性的试验。将病人血清与一定量的已知病毒混合，作用一定时间后，接种于实验动物、鸡胚或细胞培养中，观察病毒的致病作用是否被中和而不出现感染指标。以此判断病人血清中有无特异性抗体存在。本法特异性高，但操作比较复杂，费时。主要用于鉴定病毒；分析病毒抗原的性质；测定免疫血清的抗体效价和疫苗接种后的效果；测定病人血清中的抗体，用于诊断病毒性疾病。 2.补体结合试验 特异性病毒抗原和相应的抗体结合形成免疫复合物时能结合补体。本实验操作繁琐，特异性较

细胞周期同步化

细胞周期同步化 在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂活动，其余细胞分别处于G1、S和G2各期。不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会影响实验的重复性，因此，需要获得周期一致性的细胞。利用细胞同步化技术可使细胞大量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体。细胞周期同步化(synchronization)是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相( 除了G0期的细胞)的现象。细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群和使细胞进入同步化生长的两层含义。 DNA 合成抑制法是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。高浓度TdR(胸腺嘧啶核苷)双阻断法是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法。它可逆地抑制DNA 合成，而不影响其他时期细胞的转运，最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处。其原理是: Td Ｒ是细胞DNA 合成不可缺少的前体，但向培养基中加入过量TdＲ，可形成过量的三磷酸腺苷，后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，从而抑制DNA 合成。它将细胞同步于G1 /S期交界处，同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化，但是容易产生非均衡生长，个别细胞体积增大。TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤和高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂，它们与TdR作用相似，均可通过抑制DNA合成达到同步化的目的。 中期阻断法是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法，常用的药物有秋水仙素等。秋水仙素通过抑制微管的聚合，进而抑制有丝分裂装置的形成，将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。中期阻断法非平衡生长问题不明显，但可逆性比较差，当阻断时间过长时，许多细胞产生异常分裂。过去研究中也发现，同步后的细胞的生长能力明显不如撤去阻断剂后得到的S期细胞旺盛。秋水仙胺、Nocodazole也是目前常用的中期阻断剂。 经过同步化之后的细胞可以通过流式细胞术对其周期进行分析。将细胞用PI（碘化丙啶）染液进行染色，使用流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。由于细胞的DNA含量在不同时期有显著的差异，因此可以将细胞分成

细胞增殖细胞周期的测定方法

苑中2011 届高三生物二轮专题复习学案 1 “细胞增殖”相关知识的建构（2 课时）一、减数分裂与基因的分离、自由 组合定律请画出能体现基因自由组合现象的细胞分裂图像 例1、（08 江苏）某种昆虫长翅（A）对残翅（a）为显性，直翅（B）对弯翅（b）为显性，有刺刚毛（D）对无刺刚毛（d）为显性，控制这3 对性状的基因均位于常染色体上。现有这种昆虫一个体基因型如下图所示，请回答下列问题。（1）长翅与残翅、直翅与弯翅两对相对性状的遗传是否遵 循基因自由组合定律，并说明理由。。（2）该昆虫一个初级精母细胞产生的精细胞的基因型为____________。（3）该昆虫细胞有丝分裂后期，移向细胞同一极的基因有。（4）该昆虫细胞分裂中复制形成的两个D 基因发生分离的时期 有______ 。（5）为验证基因自由组合定律，可用来与该昆虫进行交配的异性个体的基因型分别是 _______________________________________________ ____________________________ 。二、细胞分裂与可遗传变异请画出可遗传变异种类的概念图苑中2011 届高三生物二轮专题复习学案 2 1、基因重组（非同源染色体的自由组合、交叉互换）例2、（07 广东）在减数分裂中每对同源染色体配对形成四分体，四分体中的非姐妹染色单体 之间经常发生交换。实验表明，交换也可以发生在某些生物体的有丝分裂中，这种现

象称为有丝分裂交换。图39—1 是某高等动物一个表皮细胞发生有丝分裂交换的示意图，其中D 和d，E 和e，F 和 f 表示某对同源染色体上的三对等位基因。图39—1 交换 过程示意图（左：交换前的染色体；右：交换后的染色体）（1）请问该细胞在发生有丝分裂交换后，产生几种基因型 的子代表皮细胞？并分别写出基因型 _______________________________________________ __________________。（2）如果不考虑该生物产生配子时发生的交换，那么该生物产生的配子有几种基因型？并 写出基因型 _______________________________________________ _____________。（3）如果图39—1 是该生物的精原细胞在产生精细胞时发生减数分裂交换后的结果，请问由它产 生的配子类型有几种？并写出基因型 ______________________________。（4）如果细胞在减数分裂和有丝分裂中都发生交换，你认为哪一种分裂方式对于遗传多样性的贡献更大？为什么？ _______________________________________________。 2、染色体变异（染色体结构变异、染色体数目变异）例 3、（10 苏州高二期末）右下图表示某生物体的细胞进行减数 分裂过程中，其中联会的两对染色体之间出现异常的

第五节 病毒病的实验室诊断方法.

第二章病毒 第五节病毒病的实验室诊断方法 畜禽病毒性传染病是危害最严重的一类疫病，给畜牧业带来的经济损失最大。除少数如绵羊痘等可根据临床症状、流行病学、病变作出诊断外，大多数病毒性传染病的确诊，必须在临床诊断的基础上进行实验室诊断，以确定病毒的存在或检出特异性抗体。病毒病的实验室诊断和细菌病的实验室诊断一样，都需要在正确采集病料的基础上进行，常用的诊断方法有：包涵体检查、病毒的分离培养、病毒的血清学试验、动物接种试验、分子生物学的方法等。 一、病料的采集、保存和运送 病毒病病料采集的原则、方法以及保存运送的方法与细菌病病料的采集、保存和运送方法基本是一致的，不同的是病毒材料的保存除可冷冻外，还可放在50%甘油磷酸盐缓冲液中保存，液体病料采集后可直接加入一定量的青、链霉素或其他抗生素以防细菌和霉菌的污染。 二、包涵体检查 有些病毒能在易感细胞中形成包涵体。将被检材料直接制成涂片、组织切片或冰冻切片，经特殊染色后，用普通光学显微镜检查。这种方法对能形成包涵体的病毒性传染病，具有重要的诊断意义。但包涵体的形成有个过程，出现率也不是100%，所以，在包涵体检查时应注意。（能出现包涵体的重要畜禽病毒见表2-3） 表2-3 能产生包涵体的畜禽常见病毒 病毒名称感染范围包涵体类型及部位 痘病毒类 狂犬病病毒 伪狂犬病病毒 副流感病毒III型 马鼻肺炎病毒 鸡新城疫病毒 传染性喉气管炎病毒人、马、牛、羊、猪、鸡等 狼、马、牛、猪、人、猫、羊、 禽等 犬、猫、猪、牛、羊等 牛、马、人 马属动物 鸡 鸡 嗜酸性，胞浆内，见于皮肤的棘层细胞中 嗜酸性，胞浆内，见于神经原内及视网膜的神经节 层的细胞中 嗜酸性，核内，见于脑、脊椎旁神经节的神经原中 嗜酸性，胞浆及胞核内均有，见于支气管炎、肺泡 上皮细胞及肺的间隔细胞中 嗜酸性，核内，见于支气管及肺泡上皮细胞、肺间 隔细胞、肝细胞、淋巴结的网状细胞等 嗜酸性，胞浆内，见于支气管上皮细胞中 嗜酸性，核内，见于上呼吸道的上皮细胞中 三、病毒的分离培养 将采集的病料接种动物、禽胚或组织细胞，可进行病毒的分离培养。供接种或培养的病料应作除菌处理。除菌方法有滤器除菌、高速离心除菌和用抗生素处理三种。如用口蹄疫的水疱皮病料进行病毒分离培养时，将送检的水疱皮置平皿内，以灭菌的pH7.6磷酸盐缓冲液洗涤数次，并用灭菌滤纸吸干、称重，剪碎、研磨制成1∶5悬液，为防止细菌污染，每毫升加青霉素1000IU，链霉素1000μg，置2～4℃冰箱内4～6h，然后用8000～10000r/min速度离心沉淀30min，

流式检测细胞周期和凋亡实验步骤

流式细胞技术检测细胞周期分布 1) 已转染miRNA mimics的细胞培养达到85％融合时，用胰酶消化细胞。1000 rpm，离心5min，收集细胞沉淀； 2) 已消毒的PBS重悬细胞，1000 rpm/min，离心5 min，收集细胞。重复此步骤2次，以除去胰酶； 3) 加入预冷的70%乙醇固定细胞过夜； 4) 第二天1000rpm，离心5 min，收集细胞沉淀，PBS重悬两次，以除去乙醇； 5) 离心后加入500ul PBS重悬细胞，加入碘化丙锭(PI)染色液(含50mg/L PI，1g/L Triton X-100，100g/L RNase)混匀，4℃避光孵育30min。 6）流式细胞仪FACStar (美国BD公司) 检测。接收的信号经Cellquest软件处理，对检测细胞的荧光强度进行分析。实验重复3次。 2.11流式细胞技术检测细胞凋亡水平 1) 已转染BART6-3p mimics的细胞培养达到85％融合时，将上清培养液收集至离心管内；常常 2）PBS清洗贴壁细胞3次，用胰酶消化细胞（注意：消化时不可过度），收集于第一步的离心管内； 3) 1000 rpm离心5min，弃上清收集细胞，PBS轻轻重悬后，加入195 ulAnnexin V-FITC结合液，吹打混匀，重悬细胞，加入5ul Annexin V，轻轻混匀。避光室温孵育15min； 4) 加入10 ul PI染色液，轻轻混匀，避光孵育； 空白：Annexin V—FITC结合液200ul 双染：185ul结合液+5 ulAnnexin V—FITC+10ul PI 单染：195ul结合液+5ul Annexin V—FITC 190ul结合液+10PI 5) 进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

感染性疾病检查

感染性疾病检查 感染性疾病是由病原微生物（细菌、病毒、真菌、支原体、立克次体、螺旋体）和寄生虫（原虫或蠕虫）感染人体后产生的疾病。实验室检查对感染性疾病的诊断具有特殊的意义。病原学检查包括病原体直接检出和病原体分离培养，可直接确定诊断。而免疫学检查抗原或抗体亦可提供重要依据。荧光定量PCR 检测快速、特异、灵敏，被用于感染性疾病的早期快速诊断。 第一节感染性疾病一般检测 一、白细胞常规检查 白细胞总数显著增多常见于化脓性感染（尤其是革兰阳性球菌），如流行性脑脊髓膜炎、败血症和猩红热等；某些病毒感染（如传染性单核细胞增多症）。革兰阴性杆菌感染时白细胞升高不明显甚至减低，如布鲁菌病、伤寒及副伤寒等。病毒咸染时白细胞通常减少或正常，如流行性感冒、登革热和病毒性肝炎等。蠕虫感染时嗜酸粒细胞通常增多，如钩虫、血吸虫、肺吸虫等。 二、血清C反应蛋白检验测定 【参考区间】成人和儿童：0~8. 0mg/L. 【临床意义】C反应蛋白（CRP) 是一种能与肺炎链球菌C多糖体反应的急性时相反应蛋白，由肝细胞合成，是一种经典的、灵敏的、急性时相蛋白，此反应不受放射治疗、化学治疗、皮质激素治疗影响。 （1) CRP作为急性时相蛋白在各种急性炎症、组织损伤、心肌梗死、手术创伤、器官移植排斥、放射性损伤等疾病发作后数小时迅速升高，峰值可达500mg/L.病变好转时，又迅速降至正常。其升高幅度与疾病的程度呈正相关。 （2) 细菌和非细菌感染（病毒、支原体等）的鉴别诊断：细菌感染发生炎症后6~8小时CRP即可明显上升，CRP升高与感染的程度呈正相关。非细菌感染（病毒、支原体等）大多正常。 （3) 鉴别风湿活动期和稳定期：风湿活动期CRP含量可高达200mg/L.病情好转逐渐下降到正常，稳定期不升高。 （4) 鉴别器质性与功能性疾病：前者升高，后者不升高。 （5) CRP测定有助于孕妇并发感染的观察，对羊膜破裂早产并伴有绒毛膜炎的孕妇，CRP测定具有准确和早期预报作用。 （6) 恶性肿瘤患者CRP大都升高，如CRP与 AFP的联合检测，可用于肝癌与肝脏良性疾病的鉴别诊断。 三、降钙素原测定 【参考区间】健康人群小于100ng/L. 【临床意义】降钙素原（PCT) 是一种糖蛋白，是降钙素（CT) 的前肽，在正常

细胞周期测定实验

细胞周期测定实验 细胞计数法： 实验方法原理体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。 分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。 实验材料细胞 试剂、试剂盒胰酶甲醇培养液冰醋酸Giemsa染液 仪器、耗材CO2培养箱普通显微镜培养皿盖玻片吸管 实验步骤一、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。 二、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。 三、取出盖片，按下列顺序操作： PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。 四、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。 五、计算 分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100% 展开 注意事项1. 操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。 其他一、Giemsa染液配制 称Giemsa粉末0.5 g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33 ml）。56℃中保温90-120分钟。加入33 ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。使用时按

要求用PBS稀释。一般稀释10倍。 BrdU参入法 实验方法原理细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。 单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。 BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。 实验材料细胞 试剂、试剂盒BrdU 甲醇冰醋酸Giemsa染液秋水仙素SSC 柠檬酸三钠NaCl 仪器、耗材冰箱玻片水浴锅锅盖紫外灯光学显微镜 实验步骤一、试剂配制 1. BrdU配制 BrdU 10 mg加双蒸水10 ml ，4℃下避光保存。 2. 2×SSC配制 NaCl 1.75 g，柠檬酸三钠0.88 g，加水至100 ml，4℃保存。 二、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10 μg/ml。 三、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1 μg。 四、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

细胞周期同步化

在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂活动，其余细胞分别处于G1、S和G2各期。不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会影响实验的重复性，因此，需要获得周期一致性的细胞。利用细胞同步化技术可使细胞大量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体。细胞周期同步化(synchronization)是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相( 除了G0期的细胞)的现象。细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群和使细胞进入同步化生长的两层含义。 DNA 合成抑制法是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。高浓度TdR(胸腺嘧啶核苷)双阻断法是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法。它可逆地抑制DNA 合成，而不影响其他时期细胞的转运，最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处。其原理是: Td Ｒ是细胞DNA 合成不可缺少的前体，但向培养基中加入过量TdＲ，可形成过量的三磷酸腺苷，后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，从而抑制DNA 合成。它将细胞同步于G1 /S期交界处，同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化，但是容易产生非均衡生长，个别细胞体积增大。TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤和高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂，它们与TdR作用相似，均可通过抑制DNA合成达到同步化的目的。 中期阻断法是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法，常用的药物有秋水仙素等。秋水仙素通过抑制微管的聚合，进而抑制有丝分裂装置的形成，将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。中期阻断法非平衡生长问题不明显，但可逆性比较差，当阻断时间过长时，许多细胞产生异常分裂。过去研究中也发现，同步后的细胞的生长能力明显不如撤去阻断剂后得到的S期细胞旺盛。秋水仙胺、Nocodazole也是目前常用的中期阻断剂。 经过同步化之后的细胞可以通过流式细胞术对其周期进行分析。将细胞用PI（碘化丙啶）染液进行染色，使用流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。由于细胞的DNA含量在不同时期有显著的差异，因此可以将细胞分成 G1/G0期（1倍），S期（1-2倍）和G2/M期（2倍）。流式细胞仪可以根据DNA含量在不同时间内的变化,从而确定细胞周期的长短,也可以直接标记DNA复制（放射性同位素标记）,统计细胞数量与标记细胞的百分比,对细胞周期进行综合分析. 连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程为细胞周期(cell cyc1e)。细胞周期包含四个阶段：①G1期(first gap),又称合成前期，指前一次有丝分裂完成到DNA复制前的一段时期；②S期(synthesis phase),即DNA合成期，为真核细胞分裂(cell pision)间期中进行DNA合成的阶段；③G2期(second gap),为DNA合成后期，指DNA合成结束至有丝分裂开始之间的一个阶段；④M期 (mitosis or pision) ,又称D期，是染色体真正开始分离时期。细胞周期又可分为有丝分裂期（M期）和分裂间期(即G1→S→G2)两个时期。尽管细胞周期中各期的持续时间因不同细胞类型而异，但相对而言M期最短，S期较长。流式细胞仪（flow cytometer；FCM）的工作原理是在样品管中放入待测细胞，在气体的压力下使待测细胞进入充满鞘液的流动室。在细胞流动室里单细胞悬液被鞘流液包绕通过流动室内一定孔径的孔，形成细胞柱。然后通过对流动液体中单列的细胞进行逐一检测，得到单个细胞的光散射和荧光指标，在功能水平上定量分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等的物理、化学特征等多个参数。流式细胞仪不仅可以根据不同时间内DNA含量的变化来确定细胞周期的长短，还可以直接用放射性同位素标记DNA复制，通过统计细胞数目与比较各时相细胞的百分比来检测是否达到预期目的，从而对细胞周期各时相进行综合分析。流式细胞分析法与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，已成为当代最先进的细胞定量分析技术。

PI染色检测细胞周期实验步骤

P I染色检测细胞周期实 验步骤 标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]

p r o t o c o l：P I染色检测细胞周期1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS（根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】；然后胰酶消化（注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心(1000r/300g5min)收集细胞沉淀。 2、用预冷的PBS清洗细胞两次。 3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇(乙醇终浓度70%)，吹打混匀以免细胞团聚，4℃固定2H至过夜。 4、细胞染色：离心（1000r/300g5min）收集固定的细胞，以1.8mL 的PBS洗细胞一次，离心(第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎)再次获取细胞沉淀后加入100μlRNaseA于37℃水浴30min，最后加入400μlPI避光染色30min （常温或4℃均可）

【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用PBS临时配好总量，其中PI50ug/ml、RNaseA100ug/mL、TritonX-10 00.2%）4℃避光染色30分钟】 5、流式分析 以标准程序用检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞。

第四章实验室检查习题知识分享

第四章实验室检查习题 一．选择题 【A1型】 *1．严重细菌感染时不应出现 A白细胞总数增高B中性粒细胞增高C核左移 D酸性粒细胞增高E中性细胞出现中毒颗粒 2．可能导致中性粒细胞减少的疾病是 A急性病毒感染B急性溶血C急性中毒D急性失血E心肌梗死 **3．中性粒细胞核左移是指 A分叶核在2叶以上的细胞＞0.03 B分叶核在3叶以上的细胞＞0.03 C分叶核在4叶以上的细胞＞0.03 D分叶核在5叶以上的细胞＞0.03 E杆状核粒细胞≥0.05 4．嗜酸性粒细胞增多不应出现于 A支气管哮喘B急性支气管炎C钩虫病D皮肤湿疹E药物过敏 5．对缺铁性贫血认识正确的是 A红细胞↓=血红蛋白↓B红细胞↓＜血红蛋白↓C红细胞↓＞血红蛋白↓ D为大红细胞性贫血E以上都不对 6．下列哪种细菌感染WBC计数减低 A肺炎球菌B链球菌C葡萄球菌D大肠杆菌E伤寒杆菌 7．促使血沉增快的物质是 A清蛋白B胆固醇C血小板D纤维蛋白原E凝血酶原 **8．血沉增快不应出现于 A严重脱水B严重贫血C结核病D风湿病E恶性肿瘤 **9．出血时间延长不应出现于 A血小板减少症B过敏性紫癜C再生障碍性贫血D血小板无力症E血管异常 **10．可致血小板增高的病因是 A急性失血与溶血B再生障碍性贫血C白血病D放射病E淋巴瘤 11．镜下血尿是指尿沉渣红细胞数 A平均＞1个/HP B平均＞2个/HP C平均＞3个/HP D平均＞4个/HP E平均＞5个/HP 12．蛋白尿时蛋白定量试验为 A＞5mg/24h B＞15mg/24h C＞50mg/24h D＞150mg/24h E＞250mg/24h 13．下列疾病可出现蛋白尿，除了 A急性肝炎B急性肾小球肾炎C肾病综合征D妊娠中毒症E慢性肾炎 **14．尿常规检查不正常的是 A尿量1500ml/24h B尿比重波动于1.010±0.003/24h C外观清晰透明 D尿色微黄E尿沉渣见少量扁平上皮细胞