酵母与大肠杆菌穿梭定点突变载体系统的构建及应用

克隆载体与表达载体

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体（Cloning vector ）：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。 （这是为携带”感兴趣的外源DNA实现外源DNA勺无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。） 其中，为使插入的外源 DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子 -- 核糖体结合位点 -- 克隆位点 -- 转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（ Expression vectors ）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体 pKK223-3 是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一 个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在 mRNAk有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3?10 bp处的由3 —9bp组成的序列。这段序列富含嘌吟核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体 RNA的识另U与结合位点。根据发现者的名字，命名为 Shine-Dalgarno 序列，简称 S-D 序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3 '端一部分序列互补，因此 S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA勺一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence（GCCACC）, Kozak sequence 是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境， 避免 ribosome 出现 leaky scan ） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内 都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1. 载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细 胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector ）。2. 载体的分类 按功能分成：（ 1）克隆载体 : 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体：具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（ 1 ）原核载体（ 2）真核载体（ 3）穿梭载体（ sbuttle vector ）指在两种宿 主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）.

《烟草突变体库创建与功能基因组学研究》项目内容与

附件： 《烟草突变体库创建与功能基因组学研究》项目内容与目标 一、总体要求 突变体通常指某个性状发生可遗传变异的材料，或某个基因发生突变的材料。长期以来，育种家尽力地发现和分离有价值的自然突变和变异材料。自20世纪70年代以来，γ射线和 EMS 理化诱变创制的人工突变体在遗传育种中开始应用，此后，T-DNA 插入和转座子标签等插入突变筛选突变体法的发展，大大地加快了突变体的创制步伐。水稻、番茄、油菜等作物中已建立了一系列突变体库，但烟草突变体库的创制基本没有开展。 建立烟草突变体库是烟草功能基因组学研究不可缺少的重要组成部分，是克隆和阐明烟草重要功能基因的基础和前提。随着烟草饱和突变体库的建立，可望直接获得突变基因的序列信息并确证基因序列与功能的关系，从而促进烟草重要功能基因的克隆鉴定。 利用理化诱变技术创制烟草突变体库本身也是一种传统的育种技术，通过筛选突变体，可望获得一系列性状特异、能稳定遗传、有利用价值的烟草育种材料，直接应用于新品种选育。 二、招标项目内容与目标

（一）攻关内容。 1．利用EMS、快中子诱变创建二倍体烟草（绒毛状烟草）、四倍体普通烟草的饱和突变体库。 2．利用逆转座子Tto1和Tto2创建四倍体烟草插入标签突变体库。 3．建立基于Tilling技术的烟草重要功能基因克隆与验证体系。 4．建立基于PCR技术的烟草重要功能基因克隆与验证体系。 5．建立基于逆转座子的烟草重要功能基因克隆与验证体系。 6．在建立功能基因克隆验证体系的基础上，对突变体进行初步的遗传分析并对重要农艺性状相关基因进行表达特性和功能分析。 （二）攻关目标。 1．创建烟草饱和的突变体库4个（二倍体、四倍体突变体，EMS突变体和快中子突变体），突变体数达8万个；逆转座子标签突变体2万以上。 2．建立基于Tilling技术、基于PCR技术、基于逆转座子的烟草重要功能基因克隆与验证体系并进行重要基因的克隆与功能鉴定。 3．阐明控制亚硝胺、钾含量、抗病等重要农艺性状的基因3个以上，获得低亚硝胺、高钾含量、高抗病的育种材料10个以上。

pET-32b(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-32b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5030 pET--‐32b(+) pET32b载体基本信息 别名: pET32b, p et 32b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5899bp 5' 测序引物: T7或者Trx--‐F 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; Trx--‐F: 5' T TCCTCGACGCTAACCTG 3' 载体标签: thioredoxin (N端); H is (中间和C端) 载体抗性: Ampicillin 备注: Production of soluble, active target proteins; N--‐term thrombin cleavage s ite; Nterm e nterokinase c leavage s ite; a,b,c v ary b y M CS 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pET32b载体质粒图谱和多克隆位点信息

pET32b载体简介 The pET--‐32a--‐c series is designed for cloning and high--‐level expression of peptide sequences fused with the 109aa Trx?Tag? thioredoxin protein (1). Cloning sites are available for producing fusion proteins also containing cleavable His?Tag? and S?Tag? sequences for detection and purification. Unique sites are shown on the circle map. Note that t he s equence i s n umbered b y t he p BR322 c onvention, s o t he T7 e xpression r egion i s reversed on the circle map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymerase is shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containing single--‐stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single--‐stranded sequencing should be performed u sing t he T7 t erminator p rimer . pET32b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT 181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGATATCG CCATGGCCTT GTCGTCGTCG TCGGTACCCA 241 GATCTGGGCT GTCCATGTGC TGGCGTTCGA ATTTAGCAGC AGCGGTTTCT TTCATACCAG 301 AACCGCGTGG CACCAGACCA GAAGAATGAT GATGATGATG GTGCATATGG CCAGAACCAG 361 AACCGGCCAG GTTAGCGTCG AGGAACTCTT TCAACTGACC TTTAGACAGT GCACCCACTT 421 TGGTTGCCGC CACTTCACCG TTTTTGAACA GCAGCAGAGT CGGGATACCA CGGATGCCAT 481 ATTTCGGCGC AGTGCCAGGG TTTTGATCGA TGTTCAGTTT TGCAACGGTC AGTTTGCCCT 541 GATATTCGTC AGCGATTTCA TCCAGAATCG GGGCGATCAT TTTGCACGGA CCGCACCACT 601 CTGCCCAGAA ATCGACGAGG ATCGCCCCGT CCGCTTTGAG TACATCCGTG TCAAAACTGT 661 CGTCAGTCAG GTGAATAATT TTATCGCTCA TATGTATATC TCCTTCTTAA AGTTAAACAA 721 AATTATTTCT AGAGGGGAAT TGTTATCCGC TCACAATTCC CCTATAGTGA GTCGTATTAA 781 TTTCGCGGGA TCGAGATCGA TCTCGATCCT CTACGCCGGA CGCATCGTGG CCGGCATCAC 841 CGGCGCCACA GGTGCGGTTG CTGGCGCCTA TATCGCCGAC ATCACCGATG GGGAAGATCG 901 GGCTCGCCAC TTCGGGCTCA TGAGCGCTTG TTTCGGCGTG GGTATGGTGG CAGGCCCCGT 961 GGCCGGGGGA CTGTTGGGCG CCATCTCCTT GCATGCACCA TTCCTTGCGG CGGCGGTGCT 1021 CAACGGCCTC AACCTACTAC TGGGCTGCTT CCTAATGCAG GAGTCGCATA AGGGAGAGCG 1081 TCGAGATCCC GGACACCATC GAATGGCGCA AAACCTTTCG CGGTATGGCA TGATAGCGCC 1141 CGGAAGAGAG TCAATTCAGG GTGGTGAATG TGAAACCAGT AACGTTATAC GATGTCGCAG 1201 AGTATGCCGG TGTCTCTTAT CAGACCGTTT CCCGCGTGGT GAACCAGGCC AGCCACGTTT 1261 CTGCGAAAAC GCGGGAAAAA GTGGAAGCGG CGATGGCGGA GCTGAATTAC ATTCCCAACC 1321 GCGTGGCACA ACAACTGGCG GGCAAACAGT CGTTGCTGAT TGGCGTTGCC ACCTCCAGTC 1381 TGGCCCTGCA CGCGCCGTCG CAAATTGTCG CGGCGATTAA ATCTCGCGCC GATCAACTGG 1441 GTGCCAGCGT GGTGGTGTCG ATGGTAGAAC GAAGCGGCGT CGAAGCCTGT AAAGCGGCGG 1501 TGCACAATCT TCTCGCGCAA CGCGTCAGTG GGCTGATCAT TAACTATCCG CTGGATGACC 1561 AGGATGCCAT TGCTGTGGAA GCTGCCTGCA CTAATGTTCC GGCGTTATTT CTTGATGTCT 1621 CTGACCAGAC ACCCATCAAC AGTATTATTT TCTCCCATGA AGACGGTACG CGACTGGGCG 1681 TGGAGCATCT GGTCGCATTG GGTCACCAGC AAATCGCGCT GTTAGCGGGC CCATTAAGTT 1741 CTGTCTCGGC GCGTCTGCGT CTGGCTGGCT GGCATAAATA TCTCACTCGC AATCAAATTC

克隆载体表达载体构建详细版

一、稀释引物 1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温） 2、根据OD值加DD水。 3、静置30min（冰上） 4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。 5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。 二、跑MIX检测引物（20ul体系）、 上引物0.8ul 下引物0.8ul Mix 10ul DNA（日本晴）1ul DD水7.4ul 三跑高保真酶（50ul体系） DNAorCDNA 2ul 上引物2ul 下引物2ul 5*buffer 10ul dNTPs 5ul DD水28ul Pfu（最后加）1ul 四胶回收流程 1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。 2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。 3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。 4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。 5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次） 6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。 7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。 8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。 五、胶回收产物检测（10ul）体系 上引物0.4ul 下引物0.4ul Mix 5ul 回收产物1ul DD水 3.2ul 六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系） 胶回收产物 3.5ul Blunt cloning 0.5ul 混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃

pET-48b(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-48b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4670 pET--‐48b(+) pET48b载体基本信息 别名: pET48b, p ET 48b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5605 b p 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; Trx--‐F: 5'--‐TTCCTCGACGCTAACCTG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐TGCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐Trx, N--‐His,N--‐HRV 3C, C--‐S, C--‐Thrombin 载体抗性: Kanamycin (卡那霉素) 备注: Same as pET47 but also has Nterm Trx Tag; contains HRV 3C Protease cleavage site for fusion tag removal at low temperatures; Cterm thrombin c leavage s ite. 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET48b载体质粒图谱和多克隆位点信息

pET48b载体简介 pET--‐48b载体含有N端Trx和His标签，在标签后面紧跟着的是HRV 3C蛋白酶切位点。HRV 3C蛋白酶能够高特异性的识别LEVLFQ↓GP蛋白序列，能够在低温下高效切割掉融合标签序列。pET--‐48b载体还含有一个可选择的C端Thrombin蛋白酶切位点，紧接着位点后是S标签。 pET48b载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够

拟南芥突变体购买流程-完全图解

最近要购买一批拟南芥突变体，想请教有经验的虫友购买拟南芥突变体的具体流程，例如我需要一个APETALA1的突变体，应到哪个网站进行搜索，怎样进行选择订购，越具体越好，有截图就更好了，谢谢大家了！ Step 1. 打开NCBI主页：https://www.wendangku.net/doc/035543025.html,/ 打开的页面如下： 如下 得到如下页面：

进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图： 记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因 接下来开始查找APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。。。。。。 但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法 它的搜索界面一目了然,使用也很方便。 下面介绍SALK突变体库的使用方法： Step 2：打开SALK主页：https://www.wendangku.net/doc/035543025.html,/ 点击T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：

显示如下，所有信息全在如下窗口中 从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向) 点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：

pET-22b(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-22b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5200 pET--‐22b(+) pet22b载体基本信息 别名: pET22b, p et 22b, p ET--‐22b(+) 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5500bp 5' 测序引物及序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐pelB; C--‐His 载体抗性: 氨苄 备注: pET22b载体含有PelB信号肽序列， 能够将表达的目的蛋白定位在细胞外周质腔。 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pet22b载体质粒图谱和多克隆位点信息

pet22b载体简介 pET--‐22b(+)载体携带有一个N端的pelB信号肽序列，能够将表达的目的蛋白定位于外周质腔，同时载体含有C端His标签。载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列的作用下终止蛋白翻译。 pet22b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT 181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGAATTAA TTCCGATATC CATGGCCATC GCCGGCTGGG 241 CAGCGAGGAG CAGCAGACCA GCAGCAGCGG TCGGCAGCAG GTATTTCATA TGTATATCTC 301 CTTCTTAAAG TTAAACAAAA TTATTTCTAG AGGGGAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCCC 361 TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GAGATCTCGA TCCTCTACGC CGGACGCATC 421 GTGGCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGTGCG GTTGCTGGCG CCTATATCGC CGACATCACC 481 GATGGGGAAG ATCGGGCTCG CCACTTCGGG CTCATGAGCG CTTGTTTCGG CGTGGGTATG 541 GTGGCAGGCC CCGTGGCCGG GGGACTGTTG GGCGCCATCT CCTTGCATGC ACCATTCCTT 601 GCGGCGGCGG TGCTCAACGG CCTCAACCTA CTACTGGGCT GCTTCCTAAT GCAGGAGTCG

pRSET-EmGFP大肠杆菌表达载体说明

pRSET-EmGFP 编号 名称 北京华越洋VECT--‐310 pRSET--‐EmGFP pRSET--‐EmGFP载体基本信息 载体名称: pRSET--‐EmGFP 质粒类型: 大肠杆菌表达载体；克隆载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 启动子: T7 载体大小: 3.6 k b 5' 测序引物及序列: T7 F orward 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: His T ag (6x)；Xpress E pitope T ag 载体抗性: 氨苄青霉素（Ampicillin） 克隆菌株: DH5alpha，TOP10F' 表达菌株: BL21(DE3)系列，推荐BL21Star（DE3) 备注: pRSET--‐EmGFP载体的功能是克隆荧光报告基因EmGFP或荧光蛋白EmGFP的表达和纯化，菌体裂解物在紫外灯下肉眼可见荧光。 含 EK (Enterokinase)识别位点。 稳定性: --‐--‐ 组成型/诱导型: 诱导型（IPTG) 病毒/非病毒: 非病毒 pRSET--‐EmGFP载体质粒图谱和多克隆位点信息

pRSET--‐EmGFP载体序列 ORIGIN 1 CGCGAAATTA ATACGACTCA CTATAGGGAG ACCACAACGG TTTCCCTCTA GAAATAATTT 61 TGTTTAACTT TAAGAAGGAG ATATACATAT GCGGGGTTCT CATCATCATC ATCATCATGG 121 TATGGCTAGC ATGACTGGTG GACAGCAAAT GGGTCGGGAT CTGTACGACG ATGACGATAA 181 GGATCGATGG GGATCCGAAT TCGCCACCAT GGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG 241 GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC 301 CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC 361 CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTGACCTACG GCGTGCAGTG 421 CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA 481 AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC 541 CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT 601 CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAAGGT 661 CTATATCACC GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA CCCGCCACAA 721 CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA 781 CGGCCCCGTG CTGCTGCCCG ACAACCACTA CCTGAGCACC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA 841 CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC 901 TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAACT CGAGAAGCTT GATCCGGCTG CTAACAAAGC 961 CCGAAAGGAA GCTGAGTTGG CTGCTGCCAC CGCTGAGCAA TAACTAGCAT AACCCCTTGG 1021 GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA GGGGTTTTTT GCTGAAAGGA GGAACTATAT CCGGATCTGG 1081 CGTAATAGCG AAGAGGCCCG CACCGATCGC CCTTCCCAAC AGTTGCGCAG CCTGAATGGC

突变体鉴定

作物突变体的细胞学研究 一、突变体的初步观察和遗传分析 在某品系材料A中发现一株突变体，将其命名为M，优先将M自交，得到具有突变性状的纯系，如果为不育等特殊性状则可以采取不断回交的方式得到相应 纯系；再将M与A和另外一品系Y分别正交和反交，得到F 1世代；将得到的F 1 自交得到各个的F 2世代；将F 1 与M进行回交，分别得到对应的BC 1 世代；如果需 要，还可以继续回交得BC 2 等世代。 观察M的突变性状在自交过程中是否始终存在，则能初步判别此突变性状是否为可遗传性状； 分别统计M与A，M与Y的正反交的表型数据，分析所有正交与反交的差异，可以判别此性状是由核基因控制或者细胞质基因控制，甚至为核质互作控制； 结合M自交过程中的突变性状的遗传特性和所有F 1 突变性状，可判别突变性状为隐性或显性； 统计分析F 2和BC 1 世代的突变表型数据，可判别控制突变性状为质量性状或 者数量性状，以及质量性状中的的基因的对数。 在数据的分析过程中要充分应用生物统计的方法，如方差分析，Χ2检验等。 二、突变体的细胞学观察 核型分析原理与步骤 核型分析是指在一个物种内，对其染色体数目。结构及其它特征进行描述性分析，从而对单一染色体进行初步分析的过程。在突变基因确定为核基因后，则可以进行核型分析。 不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。因此，染色体核型分析是植物遗传性研究的重要内容。 染色体核型分析主要包括染色体长度、染色体臂比、着丝点位置、次缢痕等。染色体的长度差异有两种，一种是不同种、属间染色体组间相对应的染色体的绝对长度差异，一种是同一套染色体组内不同染色体的相对长度差异。

拟南芥突变体购买流程-完全图解

Step 1. 打开NCBI主页： 打开的页面如下： 如下 得到如下页面： 进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图：

记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因 接下来开始查找 APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。。。。。。 但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法 它的搜索界面一目了然,使用也很方便。 下面介绍SALK突变体库的使用方法： Step 2：打开SALK主页：点击 T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：

显示如下，所有信息全在如下窗口中 从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向) 点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：

我们主要是从 ABRC 订购，点击进入页面，填写要求的相关信息，万事大吉。祝实验顺利！

pMal c X大肠杆菌表达载体说明

pMal-c2X 编号 名称 北京华越洋VECT--‐570 pMal--‐c2X pMalc2x载体基本信息 载体名称: pMal--‐c2X, p Malc2X, p Mal c2X 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达载体 表达水平: 高 启动子: Tac 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 6646 b p 5' 测序引物及序列: MalE引物: 5'--‐GGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC--‐3'; MBP--‐F: 5'--‐gatgaagccctgaaagacgcgcag--‐3' 3' 测序引物及序列: pBad--‐R: 5'--‐gatttaatctgtatcagg--‐3'; M13--‐F: 5'--‐TGTAAAACGACGGCCAGT--‐3' 载体标签: N--‐MBP, N--‐Factor X a 载体抗性: Ampicillin 氨苄 备注: 融合表达麦芽糖结合蛋白MBP，蛋白定位于细胞周质。 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 诱导表达 病毒/非病毒: 非病毒 pMalc2x载体质粒图谱和多克隆位点信息

pMalc2x载体简介 pMAL?系统是一种高效的蛋白融合表达及纯化系统。pMAL载体含有编码麦芽糖结合蛋白（Maltose B inding P rotein, M BP）的大肠杆菌malE基因，其下游的多克隆位点便于目的基因插入，表达N端带有MBP的融合蛋白。通过"tac"强启动子和malE翻译起始信号使克隆基因获得高效表达，并进一步利用MBP对麦芽糖的亲和性达到用Amylose柱对融合蛋白的一步亲和纯化。 The s ystem u ses t he p MAL v ectors w hich a re d esigned s o t hat i nsertion i nterrupts a l acZα gene allowing a blue--‐to--‐white screen for inserts on X--‐gal (5). pMAL--‐c2 series has an exact deletion of the malE signal sequence, resulting in cytoplasmic expression of the fusion protein. pMAL--‐p2 series contains the normal malE signal sequence, which directs the fusion protein through the cytoplasmic m embrane. p MAL--‐p2 f usion p roteins c apable o f b eing e xported c an b e p urified f rom the p eriplasm. B etween t he m alE s equence a nd t he p olylinker t here i s a s pacer s equence c oding for 10 a sparagine r esidues. T his s pacer i nsulates M BP f rom t he p rotein o f i nterest, i ncreasing t he chances that a particular fusion will bind tightly to the amylose resin. The vectors also include a sequence c oding f or t he r ecognition s ite o f a s pecific p rotease. T his a llows t he p rotein o f i nterest to be cleaved from MBP after purification, without adding any vector--‐derived residues to the protein (6). For this purpose, the polylinker includes a restriction site superimposed on the sequence coding for the site of the specific protease. This is where the gene of interest is inserted. An EcoR I site in the same reading frame as that of λgt11 and a number of other useful sites are present directly downstream. The vectors also include the M13 origin of DNA replication which allows the production of single--‐stranded DNA for sequencing and mutagenesis by i nfecting w ith M13KO7 h elper p hage. pMalc2x载体序列 ORIGIN 1 CCGACACCAT CGAATGGTGC AAAACCTTTC GCGGTATGGC ATGATAGCGC CCGGAAGAGA 61 GTCAATTCAG GGTGGTGAAT GTGAAACCAG TAACGTTATA CGATGTCGCA GAGTATGCCG 121 GTGTCTCTTA TCAGACCGTT TCCCGCGTGG TGAACCAGGC CAGCCACGTT TCTGCGAAAA 181 CGCGGGAAAA AGTGGAAGCG GCGATGGCGG AGCTGAATTA CATTCCCAAC CGCGTGGCAC 241 AACAACTGGC GGGCAAACAG TCGTTGCTGA TTGGCGTTGC CACCTCCAGT CTGGCCCTGC 301 ACGCGCCGTC GCAAATTGTC GCGGCGATTA AATCTCGCGC CGATCAACTG GGTGCCAGCG 361 TGGTGGTGTC GATGGTAGAA CGAAGCGGCG TCGAAGCCTG TAAAGCGGCG GTGCACAATC 421 TTCTCGCGCA ACGCGTCAGT GGGCTGATCA TTAACTATCC GCTGGATGAC CAGGATGCCA 481 TTGCTGTGGA AGCTGCCTGC ACTAATGTTC CGGCGTTATT TCTTGATGTC TCTGACCAGA 541 CACCCATCAA CAGTATTATT TTCTCCCATG AAGACGGTAC GCGACTGGGC GTGGAGCATC 601 TGGTCGCATT GGGTCACCAG CAAATCGCGC TGTTAGCGGG CCCATTAAGT TCTGTCTCGG 661 CGCGTCTGCG TCTGGCTGGC TGGCATAAAT ATCTCACTCG CAATCAAATT CAGCCGATAG 721 CGGAACGGGA AGGCGACTGG AGTGCCATGT CCGGTTTTCA ACAAACCATG CAAATGCTGA 781 ATGAGGGCAT CGTTCCCACT GCGATGCTGG TTGCCAACGA TCAGATGGCG CTGGGCGCAA 841 TGCGCGCCAT TACCGAGTCC GGGCTGCGCG TTGGTGCGGA TATCTCGGTA GTGGGATACG 901 ACGATACCGA AGACAGCTCA TGTTATATCC CGCCGTTAAC CACCATCAAA CAGGATTTTC 961 GCCTGCTGGG GCAAACCAGC GTGGACCGCT TGCTGCAACT CTCTCAGGGC CAGGCGGTGA 1021 AGGGCAATCA GCTGTTGCCC GTCTCACTGG TGAAAAGAAA AACCACCCTG GCGCCCAATA

大肠杆菌基因工程菌常用类型

1、大肠杆菌DH5a菌株 DH5a是世界上最常用的基因工程菌株之一。由于DH5α是DNA酶缺陷型菌株，有利于基因克隆，保存质粒，但该菌株的蛋白酶没有缺陷，表达的蛋白容易被降解，因此通常不作为表达菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2、大肠杆菌BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3、大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompThsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS，Camr 4、大肠杆菌JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补，从而显示β-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5、大肠杆菌TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU，galK，rps，(Strr) endA1，nupG 6、大肠杆菌HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验。 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7.XL10-Gold菌株：所制备的感受态细胞是目前转化效率最高的感受态细胞，缺失几乎所有已知的限制酶切系统；同时缺失核酸内切酶(endA)，提高了质粒DNA的产量和质量；重组酶缺陷型(recA)减少插入片段的同源重组概率，保证了插入DNA的稳定性，提高感受态转化效率及大质粒转化能力的宿主菌基因型。

为什么要先构建克隆载体再用表达载体

为什么要先构建克隆载体再用表达载体 构建克隆载体是大量扩增DNA片段，用以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作，构建表达载体是大量得到翻译产物——蛋白质。 为什么要先构建克隆载体，再用表达载体，我猜是因为： ①得到大量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR，而且每次都要重新提DNA和RNA才行，而且，PCR反应的试剂盒又不便宜，用PCR来制备大量DNA有点得不偿失。尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR），成功率不是极高，而且还要筛选，但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候用，摇个菌，就可以制备到大量的DNA。 ②测序需要。你想转表达，你首先得确定你扩增的目的片段是不是你要的，不要以为你设计了个特异性引物，然后跟你mark的长度就可以确定了，这也只是推测，在科学上不严谨。扩增出的基因片段保险起见或者经费允许，要拿去测序，而一般送测的序列都是构建到载体上的序列，克隆载体上一般也都带有测序引物，已确定这就是你要的那条序列。你要写论文必须要给人真凭实据。 先构建克隆载体再构建表达载体并不是一个必须的选择，如果你的扩增PCR目的条带很亮，而且单一性很好，我建议你可以直接克隆进入表达载体。 很多人选择先构建克隆载体，是因为在扩增基因时目的条带模糊，特异性不好，这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进行测序，增加测序的准确度，从而确认自己克隆基因序列的正确性。单纯的PCR产物往往是一些各种PCR片段的混合物，直接送过去测序，往往导致测序信号峰很杂，有时候并不能测出想要的信号序列。同时保存的PCR片段比较容易降解，而构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。 先构建克隆载体，一是为了便于测序，确认克隆序列正确，二是为了便于基因PCR片段的保存。 怎么构建克隆载体和表达载体？ 首先根据你的实验需要选择相应的载体。 其次分析你的基因序列以及载体序列上的酶切位点，切记在载体上所选择的酶切位点要和你