体内胰岛素的测定1
笫１７卷第４期分析科学学报
Ｖｏｌ１７Ｎｏ．４ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬＳＣＩＥＮＣＥ２００１年８月Ａｕｇ
２００ｌ
文章编号：１００６—６１４４（２００１）０４。０３４１—０５
体内胰岛素的测定
盛希群高秋华徐辉碧
（华中理工大学化学系，武汉．４３００７４）
摘要：体内胰岛素的分析方法发展已经四十年，无论在临床或实验室中，已有各种
各样的方法测定体内胰岛素的浓度。本文拟对体内胰岛素的测定方法作一综述。
关键词：伴内；胰岛素；分析方法；评述
中图分类号：０６５２文献标识码：Ａ
１引言
体内胰岛素的分析方法诞生已整整四十年，从１９５９年Ｙａｌｏｗ和Ｂｅｒｓｏｎ口３在Ｎａｔｕｒｅ上发表第一篇用放射免疫分析法定量测定人体血浆中的胰岛素含量以来，各种新的定量测定体内胰岛素的方法不断出现。下面试图就体内胰岛素检测方法的发展概况作一综述。
２分析方法简述
体内胰岛素的分析方法可概括为两类：免疫分析方法和非免疫分析方法。免疫分析方法包括放射免疫分析法、酶联免疫分析法和发光免疫分析法等‘２３；非免疫分析法包括同位素稀释法…、高效液相色谱法‘。１等。
２．１放射免疫分析法
放射免疫方法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａａｙ，ＲＩＡ）由Ｙａｌｏｗ和Ｂｅｒｓｏｎ［１１首创，由Ｍｉｌｅｓ和Ｈａｌｅｓ［５１发展，到了８０年代以后已臻完善［６。一，其方法上的改善经历了用放射性桉素标记胰岛素抗原到标记抗体，标记的抗体由多克隆抗体发展到单克隆抗体。该法的基本原理是：以放射性核素（如”５Ｉ）标记抗体，以过量的标记抗体与待测样品反应，待反应平衡后加入免疫吸附剂，吸附反应液中剩余的游离标记抗体，经离心分离；或者预先制备固相抗体，然后将待测品加入过量固相抗体中，反应一定时间后，再加标记抗体，生成固相抗体一抗原一标记抗体夹心复合物，经洗涤除去多余标记抗体。前一种方法称为免疫吸附法ＬＢｊ，后一种方法称为双位点夹心法口］。
磁性载体的出现，又使Ｒ１Ａ在操作上免去了离心的麻烦，使放射性免疫方法更加简便口…。
２．２放射受体分析法
１９５２年，Ｏｒｏｅｎ口”发现ｍ清中的胰岛素可促进大鼠隔膜摄取葡萄糖，据此比例关系曲线可近似地检测出血清中胰岛素的浓度。１９７０年Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ以组织受体为结合剂，建立了放射受体分析法（Ｒａｄｉｏｒｅｃｐｔｏｒａｓｓａｙ，ＲＲＡ）ｏ］。ＲＲＡ测定值代表具有生物活性物质的水平，而ＲＩＡ值代表具有免疫活性物质的水平，故两种方法对同一样品所测得的值常有差异。ＲＲＡ对测定胰岛素的效价可能更具实际意义““。但由于受体很不稳定，加之提取纯化较困难，须在冷冻条件下保存，也只能供短期内使用，这使得ＲＲＡ法的应用受到了限制。
收稿日期：１９９９１Ｚ２２通讯联系人：盛希群
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２．３酶联免疫分析法（Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＥＩＡ）
ＲＩＡ法虽有高灵敏度，但其关键试剂——标记的抗原或抗体不能长期存放（放射性棱素会随时间而产生衰变）。Ｅｎｇｖａｌｌ¨“等用酶标记抗原，建立了竞争性酶联免疫吸附分析法（Ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｒｔＡｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）测定免疫球蛋白后，ＥＬＩＳＡ就被用于胰岛素等激素的体内含量测定。酶联免疫分析法的基本原理与ＲＩＡ相似，只是将ＲＩＡ法中的示踪荆改为具有高效特异性催化作用的酶，根据酶催化反应产物与胰岛素之间量的比例关系来定量胰岛素。到了８０年代，酶的耦联也经过了与激素抗原、多克隆抗体和单克隆抗体等耦联的发展过程ＦＩ｜‘－－２０］。近十多年来，应用在ＥＩＡ中耦联的酶有碱性磷酸酶口“、辫根过氧化物酶０１ｌ、葡萄糖氧化酶和半乳糖苷酶０１等。ＥＩＡ的检测下限可达到与ＲＩＡ同样的水平，即ＬＯＤ为ｐｍｏｌ／Ｌ。有报道用ＥＩ．ＩＳＡ和ＲＩＡ一起检测大鼠体内胰岛素进行结果比较口…，发现ＥＬＩＳＡ在低含量区重现性较好，而Ｒ１Ａ在高舍量区的重现性较佳。但在实验操作上，ＥＬｌＳＡ比ＲＩＡ优越。另有报道口３，在对Ⅱ型糖尿病人血浆胰岛素浓度检测的对比中，ＥＬＩＳＡ的检测值低于ＲＩＡ的检测值，该文推测是由于ＥＬｌＳＡ中无交叉反应的干扰。但此假设被美国糖尿病学会的一篇研究报告所否定Ⅲ］。
９０年代，随着新材料、新工艺的出现，各种酶联免疫试剂盒已投入商品生产。特别是固栩吸附和微粒磁化技术的发展，使得Ｂ（ＢｏｕｎｄＡｎｔｉｂｏｄｙｏｒＡｎｔｉｇｅｎ）与Ｆ（ＦｒｅｅＡｎｔｉｂｏｄｙｏｒＡｎｔｉｇｅｎ）的分离既方便又快速，太大提高了ＥｌＡ法在临床诊断上的应用ｏ…。
２．４发光免疫分析法（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｉｎｍｍｎｏａｓｓａｙ，Ｉ。ＩＡ）
分子发光可分为荧光、磷光和化学发光三种ｃ２ｓ］。利用发光分子作为示踪剂与抗体或抗原朝联，根据发光分子的发光强度与被测胰岛素古量之间的关系建立的分析方法即是Ｉ。ＩＡ。ＬＩＡ包括荧光免疫分析、磷光免疫分析、化学发光免疫分析和生物发光免疫分析”１，
ＦＩＡ和ＰＩＡ具有与ＥＩＡ楣似的优点，但其灵敏度欠佳，其主要缺点是背景值过大，信噪比不理想＋有时重复性差。例如用Ｅｕ”的络台物作为发光剂与抗原或抗体藕联，在操作中就很易被重金属离子或非络合的稀土金属离子干扰口“。８０年代末，随着激发光源改成脉冲激光光源［ｚ“、偏振荧光分光光度计和时间分辨测量法的运用（相应的免疫分析方法分别称为荧光偏振免疫分析和时间分辨荧光免疫分析以及新的易耦联、易分离的发光试剂的出现和应用，显著降低了测量系统的本底值。Ｍａｎｔｒｏｖａ口“用单克隆抗体联上钯一类卟啉Ｐｄ—ＣＰ作为磷光发光剂、ＮａｎａｎｆｉＭａｓａｈｉｋｏ∞“用磺基苯并二口恶唑基团作为荧光试剂标记抗原定量分析胰岛素，其灵敏度与传统的ＲＩＡ和ＥＩＡ法相当。１９９７年Ｌｉｒａ口”等用已结合有钙黄绿素的脂质体作为示踪剂，将磷脂酶Ｃ与胰岛素相联，用胰岛素抗体先使磷脂酶Ｃ失活，然后加被测样品，由于被测样品中的胰岛素又可使磷脂酶复性，催化脂质体与ｅａｌｃｅｉｎ的裂解，利用裂解下来的Ｃａｌｅｅｉｎ产生的荧光强度与胰岛素浓度之间的线性关系即可测出样品中胰岛素的含量。该研究工作的一个显著特点是将检测系统从异相改为同相，其灵敏度可达８ｐＩＵ／ｍＬ，与异相ＥＩＡ、ＲＩＡ法相差不大。
ＣＩＡ是以鲁米诺及其衍生物标记抗原或抗体，ＢＩＡ是用从荧火虫、发光细菌等生物中提取的荧光素酶标记抗原或抗体。Ｃ１Ａ和ＢＩＡ的最低检测限虽可达１０“２～１０“５ｍｏｌ［ｚ］，但临床上应用的报道很少。２．５同位索稀释分析法（ＩｓｏｔｏｐｅＤｉｌｕｔｉｏｎａｓｓａｙ，１ＤＡ）
９０年代以前，同位素稀释法很少用于检测多肽或蛋白质。由于ＤＮＡ重组技术的发展“。，使标准氘带或”Ｎ、”Ｃ带多肽纯品容易获得，而且随着分离纯化技术及质谱仪性能的改进（如激光离子化技术的采用），使ＩＤＡ也能用于多肽分析。１９９７年，Ｓｔｏｃｋｌｉｎｎ一等首先报道了用准品稀释氘带胰岛素，待测品通过免疫亲和层析纯化后进行质谱分析，不仅胰岛素的检测范围宽（３～１７００ｐｍｏｌ／Ｌ），而且还能将内源性胰岛素和外源性胰岛素分开。ＩＤＡ不仅对胰岛素，而且在多肽类激素等兴奋剂的检测方面也得到广泛应用”。
２．６高效液相色谱法（ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＩ。ｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍｏｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）
ＨＰＩ。Ｃ在８０年代已成为分析蛋白质结构和纯度的重要工具。运用ＲＰ—ＨＰＬＣ不仅证明了重组人胰岛素与人胰腺胰岛素以及二者的混台物的ＨＰＬＣ图谱完全重合，而且还能将与人胰岛素仅有１、３个氨
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基酸之别的猪胰岛素、牛胰岛素分开“ｏ。但直接将ＨＰＬＣ用于生物基质中胰岛素的测定，存在较大困难，因为血清或血浆中的成份太复杂，其中已查明的可溶性蛋白质就有３００多种ｍ］，而且胰岛素含量极微，不经预处理，其中胰岛素的信号难以检测。直到１９９８年才有首例ＨＰＬＣ检测血清胰岛素含量的报道“１。该文直接采用二氯甲烷萃取样品，再用稀盐酸反萃取，过滤后直接进样，用ＲＰ—ｃ，。柱进行ＨＰＩ．Ｃ分析，紫外检测波长为２１４ｎｒｉｌ。该法检测下限虽不及ＲＩＡ或ＥＩＡ（仅为５０ＰＩＵ／ｍｌ，），但能区分内源性和外源性胰岛素。如果能在样品预处理上作些改进，ＨＰＬＣ将是一种廉价、快速而又准确的实验室分析方法。
２．７其它方法
经典的检测蛋白质的方法如双缩脲法、Ｌｏｗｒｙ法及染料法不能用于体内胰岛素的测定，因为这些方法无特异性，灵敏度也不够ｏ“。毛细管电泳（ＣＥ）虽有高灵敏度、高分辨率的特点，但同样需要样品的预处理，降低杂质含量，提高胰岛素的信号响应能力。由于胰岛素等激素类药物中的蛋白质含量比较单一?因此ＣＥ是激素类药物质控的一个良好手段。“。不过１９９６年有一篇用ＣＥ和激光诱导荧光法结合来检测单个胰岛细胞中胰岛素浓度的报道”…。也有人用改装的微电极来研究单个胰岛ｐ细胞分泌胰岛索的情况”…。这些研究一旦有突破，将大大促进人们对微观领域中许多胰岛素分泌奥秘的了解。
３影响胰岛素检测的因素
从文献报道的情况来看，９０年代关于体内胰岛素的分析大多集中于从方法比较上寻找影响胰岛素测定的因素和将成熟的分析方法应用于鼠、狗和鱼的体内胰岛素的测定心７卅川。有报道认为，样品出现溶血会降低胰岛素的检测值Ｈ““Ｊ，待测品中存在胰岛素抗体也会使检测值升高或失真““，胰岛素原、Ｃ肽及胰岛素的代谢片段等与抗体的交叉反应可能会使检测值产生偏差－２３Ⅲ。
１９９６年美国糖尿病协会（ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｂｅｔｅｓＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ＡＤＡ）在Ｄｉａｂｅｔｅｓ上发表了一篇关于体内胰岛素分析标准的研究报告口“。该报告指出：即使用同一种方法，甚至同一种试剂盒，不同的实验室检测同一个血样．胰岛素含量的检测值相差很太，擐高值是最低值的近三倍。在探寻产生巨大差异的原因时ｔＡＤＡ研究小组惊奇地发现，方法上的特异性差异并不是造成检测值差异的根本原因，因为在参加对同一血样测试的实验室中，声明自己的分析方法存在与胰岛索类似物（如胰岛素原及其降勰产物）有交叉反应的实验室，其检测结果并不比声明无交叉反应干扰的实验室的检测结果高。该报告认为，使结果产生偏差的原因有技术误差、标准试剂的差异以及分析标准的差异等。他们还发现，尽管各实验室的检测值有偏差，但每个实验室的偏差是基本恒定的，即偏高者总是偏高，偏低者总是偏低。ＡＤＡ的研究报告建议，分析生物基质中的胰岛索，除了需要操作经验的实验人员外，精确度、准确度、回收率、线性范围、最低检测限和定量最低检测限等分析指标要达到最低要求，而且实验室之间要对检测方法进行比较，这样才能提高生物样品中胰岛素检测值的可比性和可信性。
４结束语
Ｙａｌｏｗ和Ｂｅｒｓｏｎ创建了放射免疫分析法，使生物医学工作者有了一把探讨体内含量极微的激素分泌、代谢规律及与其紧密相关的一些疾病病理病因的钥匙。因此，ＲＩＡ被认为是分析方法上的一个重大突破，Ｙａｌｏｗ和Ｂｅｒｓｏｎ也因此获得了１９７７年Ｎｏｂｅｌ生理医学奖。Ｍｉｌｅｓ和Ｈａｌｅｓ虽然对Ｒ１Ａ法作了?些重大改进（他们的文章也因此能发表到Ｎａｔｕｒｅ上），但ＩＲＭＡ、ＥＩＡ、Ｉ。ＩＡ以及ＩＤＡ等分析方法在Ｂ与Ｆ的分离上都要借助免疫结合反应的基本原理。ＨＰＬＣ虽然没有采用抗原与抗体结合反应来分离纯化样品，但从仅有的一篇分析体内胰岛素的报道来看，其回收率、检测下限都不及Ｒ１Ａ和ＥＩＡ。但在区分外源性和内源性胰岛素方面，ＨＰＬＣ和ＩＤＡ有其独特性，而ＲＩＡ、ＥＩＡ、Ｉ。ＩＡ从现有的报道来看无能为力。ＩＤＡ法不仪已应用于运动员兴奋剂的检测上，而且可用于尸梭以确定死者是否因注射过量胰岛素而致死，只是质谱仪太昂贵，标准氘带试剂对于普通实骑室来讲其价格也偏高，才使ＩＤＡ法难以应用于临床。
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值得注意的是，对于体内胰岛素分析方法的命名目前没有统一的规定，有些概念虽然内涵上有所区别，但其基本的原理一致，因此本文将ＲＩＡ和ＩＲＭＡ、ＩＲＡ并称为ＲＩＡ，将ＥＬＩＳＡ以及利用酶联双位点双层甚至三层夹心原理的具体方法并称为ＥＩＡ，将ＦＩＡ、ＰＩＡ、ＣＩＡ、ＢＩＡ并称为ＬＩＡ，将质谱法列在ＩＤＡ中。有文献将ＦＩＡ称为ＥＩＡ，而有的文章所使用的方法很难区分究竟是哪一种方法。例如，Ｉ，ｉｍ的工作ｏ“既有酶耦联，又有荧光标记，既可说成是ＦＩＡ，又可算得上是ＢＩＡ，因为其使用的磷脂酶Ｃ是从梭状芽孢杆菌（ＣｌｏｓｔｒｉｄｌｕｍＰｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）中提取的。
尽管体内胰岛素的检测方法特别是ＲＩＡ和ＥＩＡ似乎很成熟，而且近十年除了ＩＤＡ和ＨＰＩ。Ｃ被尝试用于体内胰岛素的检测外，似乎大多数的报道集中于对方法的改进和完善上，但可以肯定的是，简便、快速、便宜、准确、重复性好、可鉴别内源性和外源性胰岛素、向微观领域渗透“““等是今后体内胰岛素分析的发展方向。
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ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＩｎｓｕｌｉｎｉｎＶｉｖｏ
ＳＨＥＮＧＸｉ—ｑｕｎ’，ＧＡＯＱｉｕ—ｈｕａ，ＸＵＨｕｉ—ｂｉ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｗ“ｈａｎ，４３００７４）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｒｅｖｉｅｗｗｉｔｈ４５ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｉｓｇｉｖｅｎｏｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｉｎｓｕｌｉｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｖｌｖｏ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｉｎｒｅｃｅｎｔｔｗｅｎｔｙｙｅａｒｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｉｎｓｕｌｉｎ｛Ｉｎｖｉｖｏ；Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ；Ｒｅｖｉｅｗ
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体内胰岛素的测定
作者：盛希群， 高秋华， 徐辉碧
作者单位：华中理工大学化学系,
刊名：
分析科学学报
英文刊名：JOURNAL OF ANALYTICAL SCIENCE
年，卷(期)：2001，17(4)
被引用次数：1次
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相似文献(10条)
1.学位论文施荟胰岛素口腔贴膜的研究2005
以胰岛素为模型药物，研究了几种吸收促进剂及其组合的促粘膜吸收效果，筛选出合适的口腔粘膜吸收促进剂；采用生物粘附性材料，制备了口腔粘贴膜，并进行体外质量评价、体内药效学研究及粘膜毒性的初步考察。目的在于研究蛋白质多肽类药物的口腔粘膜给药系统。
进行了胰岛素口腔粘膜吸收促进剂的筛选。分别以离体法及在体法对不同吸收促进剂及其组合的促粘膜吸收作用进行考察，采用激光扫描共聚焦成像技术研究促进剂对异硫氰酸荧光素标记右旋糖苷4000透大鼠颊粘膜吸收的促进作用。离体法未能在接受池中检测到胰岛素，这可能是胰岛素粘膜透过性低以及检测方法灵敏度不够所致。在体法研究结果显示5％牛甘氨胆酸钠、5％Laureth-9、5％油酸+1.5％吐温80及5％苄泽78并无显著促吸收作用，而5％Laureth-9+5％油酸+1.5％吐温80、5％牛甘氨胆酸钠+5％大豆磷脂及5％牛甘氨胆酸钠+0.4％油酸的吸收促进剂组合能显著促进胰岛素透颊粘膜吸收(P＜0.05)。Laureth-9与油酸合用时促吸收作用较二者单独使用时有所增强(P＜0.05)。牛甘氨胆酸钠与油酸配伍后促吸收作用显著优于牛甘氨胆酸钠，且随促进剂浓度降低而降低。激光扫描共聚焦成像结果显示5％牛甘氨胆酸钠+0.4％油酸对异硫氰酸荧光素标记右旋糖苷4000透颊粘膜有显著促进作用。
制备了胰岛素口腔贴膜并进行了理化性质的研究。采用几种生物粘附性材料与成膜材料，制备口腔贴膜，对其厚度、膨胀率、溶解百分比及粘附力进行考察。
进行了胰岛素贴膜大鼠体内药效学研究。分别采用正常大鼠及糖尿病模型大鼠进行颊粘膜给药，测定大鼠体内血糖水平变化，并用梯形法计算血糖经时曲线上面积。
采用组织切片的方法，对含促进剂的胰岛素溶液及胰岛素贴膜给药后粘膜的损伤及恢复情况进行考察。
2.期刊论文尹宗宁.陆彬.杨秀岑.王玮注射用胰岛素纳米囊对糖尿病大鼠缓释疗效研究-中国现代应用药学
2000,17(5)
目的:评价胰岛素聚氰基丙烯酸丁酯纳米囊皮下注射糖尿病大鼠体内后胰岛素在大鼠血液中的动力学过程.方法:利用放射免疫的方法测定大鼠体内游离胰岛素的浓度.结果:血药浓度与给药剂量有明显的相关性,胰岛素纳米囊能使胰岛素在大鼠血清中维持较长时间(约1周),72h一次重复给药可获得每天3次给予相同剂量胰岛素相当的血药浓度.结论:胰岛素纳米囊在体内具明显的缓释特征.
3.学位论文郭娟娟B10位突变对提高重组人胰岛素基因在糖尿病大鼠体内表达效率的研究2006
本文研究了B10位突变对提高重组人胰岛素基因在糖尿病大鼠体内表达效率。结果表明，含调控元件的两点及三点突变胰岛素基因逆转录病毒重组体成功导入糖尿病大鼠体内，并成功表达胰岛素，使血糖下降；在体内含调控元件的三点突变胰岛素基因逆转录病毒重组体表达效率较两点突变组显著提高，可使糖尿病大鼠的血糖恢复正常水平；含调控元件的三点突变胰岛素基因逆转录病毒重组体在糖尿病大鼠肝内的表达，受体内葡萄糖及胰岛素的生理性调控。
4.期刊论文杨天智.陈大兵.张强.YANG Tian-Zhi.CHEN Da-Bi ng.ZHANG Qiang不同吸收促进剂及酶抑制剂对胰岛
素体内及体外口腔黏膜渗透性的影响-北京大学学报(医学版)2001,33(3)
目的：研究不同的吸收促进剂及酶抑制剂对胰岛素透过口腔黏膜的影响。方法：体外实验中，在不同吸收促进剂及酶抑制剂作用下，测定胰岛素透过仓鼠和家兔口腔黏膜的渗透系数；体内实验中，在胰岛素口腔喷雾剂中加入不同的吸收促进剂及酶抑制剂，考察大鼠经口腔喷入胰岛素后的血糖降低情况。结果：SDCh， Brij78， SLS以及lecithin可以显著增加胰岛素透过口腔黏膜的渗透系数，而aprotinin，bacitracin， 1-menth ol 以及poloxamer的作用相对较小。胰岛素溶液中加入SDCh， Brij78， SLS以及lecithin 后，正常大鼠口腔喷雾给药，药理生物利用度都有显著的提高，而aprotinin ，b acitracin， 1-menthol 以及 poloxamer对血糖的影响较小。结论：对于考察吸收促进剂及酶抑制剂对胰岛素的促进吸收作用来说，体外实验与体内实验结果是一致的，可以通过体外实验来粗略地筛选吸收促进剂及酶抑制剂，为体内实验结果提供更多的线索和思路。
5.期刊论文皮下注射胰岛素微胶囊的体内降血糖效应研究-海峡药学2009,21(10)
目的 对胰岛素微胶囊的药效学进行了评价.方法 以昆明种小鼠为动物模型,以海藻酸钠为载体,以胰岛素注射液为芯核,载体包埋芯核构成微米级胰岛素微胶囊(微米级胰岛素微胶囊的平均粒径小于25μm),通过皮下注射给药,考察胰岛素微胶囊的降血糖效应.结果 皮下注射胰岛素及胰岛素微胶囊降糖作用在药物的吸收相具明显的量效关系.但将胰岛素制成微胶囊后,可明显延长胰岛素降血糖作用时间,药效优于相同剂量的胰岛素.结论 包膜微胶囊明显优于不包膜剂型对药物的缓控释效果.
6.学位论文刘囡重组人胰岛素基因质粒在糖尿病鼠体内表达的安全性初步研究2006
本文对重组人胰岛素基因质粒在糖尿病鼠体内表达的安全性进行了研究。结果表明，重组人胰岛素基因质粒导入糖尿病大鼠体内15天时，24小时饥饿试验未出现低血糖事件发生。表明该重组基因质粒导人体内实现了安全性调控表达；实验组动物病理解剖未见肿瘤，光镜下观察未见癌细胞及异形核细胞。逆转录病毒载体质粒导人体内未见到致突变性；导人逆转录病毒载体质粒的实验动物各组织PCR扩增未检测到复制完整型逆转录病毒的存在；几项功能性检查结果，包括ALT、ALB、Cr和BUN，实验组和正常对照组没有显著性差异。本实验用于提高表达效率的干预因素对肝肾功能无影响。
7.期刊论文杨天智.陈启龙.陈大兵.张强胰岛素口腔喷雾制剂在大鼠及家兔体内的药效学和药动学研究-中国药
学杂志2003,38(6)
目的探索胰岛素经口腔给药的可能性.方法以大鼠和家兔为动物模型,进行胰岛素口腔喷雾制剂的体内降糖实验,同时测定了口腔给药后的胰岛素水平变化.以皮下注射胰岛素溶液为对照,计算口腔给药的药理相对生物利用度,以及相对生物利用度.用3P87程序拟合了大鼠和家兔口腔给药及皮下注射给药的药动学参数.结果以皮下注射胰岛素溶液为对照,胰岛素口腔给药后,大鼠及家兔口腔给药的药理相对生物利用度分别为30.8% 和40.3%.相对生物利用度分别为22.50%及23.89%.胰岛素口腔喷雾剂经家兔给药的血药峰浓度及相对生物利用度均比大鼠高.大鼠口腔给药及皮下注射给药、家兔口腔给药及皮下注射给药的药-时曲线均符合权重为1/C/C的一室模型.大鼠与家兔皮下和口腔给药的吸收速率常数Ka有显著性差别,胰岛素喷雾剂经大鼠或者家兔口腔给药时的吸收较皮下注射给药时的吸收快.结论胰岛素口腔喷雾剂经口腔喷雾后,起效快,生物利用度较高,这证明了胰岛素制剂在口腔部位吸收的可能性,为以后开发胰岛素口腔给药制剂打下了基础.
8.学位论文黄嬛低分子量壳聚糖的制备及其载药纳米粒的体内药效学研究2005
壳聚糖是一类由氨基葡萄糖组成的阳离子聚合物，具有良好的生物相容性和低毒性，壳聚糖及其衍生物具有保护并促进生物大分子药物吸收的作用。但是壳聚糖在体内不易降解，长期使用易在体内产生积聚，且存在一定程度的血液相容性及对细胞的毒性等问题。目前使用的壳聚糖，分子量大、粘度高，无法在生理条件下溶解，作为药物载体的大分子量壳聚糖难以被人体吸收。因此，采用低分子量壳聚糖作为药物载体材料具有重要意义。
本课题采用纤维素酶水解技术，以脱乙酰甲壳素为原料，制备低分子量壳聚糖；采用超滤技术分离得到不同分子量的壳聚糖；以凝胶渗透色谱法测定壳聚糖分子量，由水解比色测定法测定壳聚糖的纯度与含量。以胰岛素为模型药物，以低分子量壳聚糖作为纳米粒载体材料，采用溶剂扩散法制备纳米粒，并筛选制备工艺条件。通过加入不同浓度脱吸附剂——十二烷基硫酸钠(SDS)，测定药物回收率，考察脱吸附剂的脱吸附效果，优选脱吸附剂的种类与浓度。采用粒度及表面电位分析仪，测定壳聚糖纳米粒的粒径、表面电位(Zeta电位)并对其理化性质进行考察。考察药物的体外释放和载药纳米粒经呼吸道插入给药的体内药效学。
通过控制酶水解时间，并采用截留分子量分别为50Kda和10Kda的中空纤维素膜进行截流与浓缩，得到低分子量壳聚糖。经凝胶渗透色谱法测定，其平均分子量为20Kda，纯度为96.60±1.56﹪。采用酶解法制备低分子量壳聚糖反应条件温和、过程容易控制，用超滤方法可实现不同分子量水解产物的有效分离；采用凝胶渗透色谱法和水解比色法测定，可进行水解壳聚糖质量的有效控制。经溶剂扩散法制备得到的壳聚糖纳米粒，呈类圆形球体，粒径分布较窄，且随制备工艺中无水乙醇加入量的增加、分散用超声次数的增多，而使粒径变小。壳聚糖纳米粒带正电荷，Zeta电位值大于+30mV，Zeta电位较高，体系相对稳定。高速离心过滤法测得的药物平均包封率为92.65±2.78﹪(n=3)。药物的体外释放研究结果显示，药物以近似零级速率从纳米粒中释放，24h释放了被包封药物总量的37.19﹪，释药速率方程为v=0.8963x+16.068，R2=0.9914。
经大鼠呼吸道插入给药的药效学研究表明，胰岛素壳聚糖纳米粒有明显的降血糖作用，起效时间与皮下注射给药的胰岛素溶液基本一致，到达最大降血糖作用时间与胰岛素溶液相近，但降血糖维持时间长，恢复到血糖起始值的时间为胰岛素溶液的6倍，体现出明显的长效作用，相对生物利用度为胰岛素溶液皮下注射的73.7﹪。
9.期刊论文牛力.徐焱成.郭敏.NIU LI.XU Yan-cheng.GAO Men人胰岛素基因在糖尿病大鼠体内的表达-公共卫生
与预防医学2005,16(3)
目的研究人胰岛素基因表达质粒在体外转染鼠成纤维细胞(NIH3T3)后对糖尿病大鼠血糖的影响.方法采用壳聚糖转染法将重组的人胰岛素基因表达质粒转染鼠成纤维细胞(NIH3T3),转染后72 h,经G418抗性筛选出阳性克隆并培养到第24 d,用免疫组织化学方法检测胰岛素的表达,同时用ELASA法监测转染后24 d的细胞培养液的胰岛素水平.并将阳性克隆大量扩增,注射至糖尿病大鼠腹腔内,并与转染空载体的对照细胞比较,观察在糖尿病大鼠体内的胰岛素表达及对血糖等变化的影响.结果转染PCMV.INS的NIH3T3细胞培养液的胰岛素水平明显高于未转染组(P＜0.01)及PCMV转染组(P＜0.01),未转染组与PCMV转染组细胞培养液的胰岛素水平无明显变化(P＞0.05).接受胰岛素表达载体细胞的糖尿病大鼠,血糖明显下降,体重逐渐恢复.结论人胰岛素基因能成功转染非胰岛β细胞,并表达目的基因使血糖水平下降说明基因治疗有望成为1型糖尿病的重要治疗手段,壳聚糖是一种很有前途的胰岛素基因载体.
10.学位论文李琳珊体内诱导骨髓干细胞分化为胰岛素分泌细胞对大鼠糖尿病的治疗2008
目的：糖尿病(Diabetes mellitus，DM)已成为发达国家中继心血管病和肿瘤之后的第三大非传染性疾病，对社会和经济带来沉重负担，是严重威胁人类健康的世界公共卫生问题。干细胞可定向分化为胰岛素分泌细胞(Insulin-producing cells，IPCs)的研究为糖尿病的治疗提供了新的思路。骨髓干细胞(Bone marrow stem cells，BMSCs)可能是干细胞中的一类有希望的候选细胞，该类细胞具有多向分化潜能和明显的可塑性。许多体外研究已经将骨髓干细胞成功诱导为胰岛素分泌细胞，并将其移植到糖尿病大鼠体内可以逆转高血糖，但是离体干细胞移植存在易污染、易变异等问题。因此，本研究探讨胃泌素(Gastrin)联合表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)是否能将骨髓干细胞体内诱导为胰岛素分泌细胞，并研究分化后的细胞对大鼠糖尿病是否有治疗效果。
材料与方法：
1、药物与试剂链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，重组人粒细胞集落刺激因子(recombination human Granulocyte-colony stimulating
factor，rhG-CSF，商品名特尔津)，表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)、胃泌素(Gastrin)，小鼠抗大鼠胰岛素单克隆抗体,即用型SABC试剂盒和DAB显色剂，大鼠血清胰岛素试剂盒。
2、动物分组与处理将40只wistar大鼠随机分为正常组、糖尿病组、动员组和动员并诱导组4组，每组10只。后三组大鼠一次性腹腔注射
2％STZ(55mg/kg)建立糖尿病模型，动员组皮下注射rhG-CSF(商品名特尔津，10mg/kg.d)，连续5天，动员并诱导组皮下注射rhG-CSF(商品名特尔津
，10mg/kg.d)，连续5天，在注射动员剂第2天开始同时腹腔注射3ug/mLGastrin(3ug/kg.d)和3ug/mLEGF(1ug/kg.d)，连续14天，正常组和糖尿病组同时腹腔注射相当剂量的生理盐水。
3、检测指标及方法实验过程中每周测体重，每2周测一次血糖，给药前和实验终止时各取血测空腹胰岛素一次(ELISA法)，至10周实验终止时10％水和氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，取肝脏、脾脏、胰腺用免疫组织化学(SABC法)检测其中胰岛素染色阳性细胞的表达。经图像采集分析系统对各组胰腺中胰岛素染色阳性细胞区域占胰岛区域百分比进行分析。
结果：
1、生化检测结果给药前糖尿病组、动员组、动员并诱导组血糖、胰岛素无明显差异。给药结束后动员组和动员并诱导组血糖均高于正常组，但较糖尿病组均下降(P<0.05)，实验终止时动员并诱导组血糖明显低于糖尿病组(P<0.01)，但仍高于正常组；胰岛素明显高于糖尿病组(P<0.01)，与正常组无显著性差异。动员组血糖和胰岛素与糖尿病组无明显差异(P>0.05)。整个病程中正常组体重始终高于其它各组(P<0.05)。
2、免疫组织化学及图像分析结果实验终止时免疫组织化学检测胰腺中胰岛素阳性细胞百分比发现正常组明显高于其他各组(P<0.01)，动员并诱导组低于正常组但是明显高于糖尿病组(P<0.05)和动员组(P<0.05)，而动员组与糖尿病组无显著性差异(P>0.05)。在动员并诱导组的肝脏中发现胰岛素染色阳性细胞表达，但脾脏中没有发现表达。其他各组肝脏脾脏中均没有胰岛素染色阳性细胞表达。
结论：
1、胃泌素联合表皮生长因子可以将骨髓干细胞体内诱导分化为胰岛素分泌细胞。
2、由骨髓干细胞分化而来的胰岛素分泌细胞对大鼠糖尿病有一定的治疗作用。
引证文献(1条)
1.贾娟娟抗胰岛素单克隆抗体的研制及酶联免疫分析方法的建立[学位论文]硕士 2005
本文链接：https://www.wendangku.net/doc/0710121756.html,/Periodical_fxkxxb200104019.aspx
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下载时间：2010年7月19日