T-RFLP技术在土壤微生物群落多样性分析中的研究进展

244 2017, V ol.37, No.18 农业与技术

※交流园地

T-RFLP 技术在土壤微生物群落多样性分析中的研究进展

马 琳1,2,3,4 张卫华1,2,3,4* 刘 淼1,5

（1.陕西省土地工程建设集团有限责任公司，陕西 西安 710075；2.陕西地建土地工程技术研究院有限责任公司，陕西 西安 710075；3.国土资源部退化及未利用土地整治工程重点实验室，陕西 西安 710075；4.陕西省土地整治工程技术研究中心，陕西 西安 710075；

5.陕西地建土地综合开发有限责任公司，陕西 西安 710075）

摘 要：土壤微生物群落多样性在保证作物健康生长、提高土壤质量、实现农业可持续发展等方面都具有十分重要的意义，

研究方法的选择尤为关键，T-RFLP 技术因其能快速获得大量数据、灵敏度高且稳定性好，近年来广泛应用于土壤微生物多样性研究中，本文从原理方法、重要环节及实际应用3个方面介绍T-RFLP 技术，分析其局限性，并对其应用前景进行展望，旨在为土壤微生物群落分析研究提供更可靠、高效的方法。

关键词：T-RFLP ；土壤微生物；多样性分析

中图分类号：S182 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20170932217

基金项目：陕西省重点科技创新团队计划项目（项目编号：2016KCT-23）*为本文通讯作者

微生物是土壤生物的重要组成部分，极大地影响着土壤中营养元素的循环、肥力的形成，在改善生态环境方面也起着非常重要的作用[1]。开展对土壤微生物多样性的研究，不仅能了解土壤的养分情况、预测土壤的环境质量变化，还可以知道土壤中微生物的种类及其功能。T-RFLP 技术具有较高的分辨率、精确度和灵敏度，且能够迅速获得大量数据，准确、快速、真实地反映土壤微生物的多样性[2]，近年来被广泛应用于土壤微生物群落多样性的分析中。

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T-RFLP 技术的基本原理和方法

末端限制性片段长度多态性（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism, T-RFLP ），是以分子生物学技术为基础的较为先进的微生物群落研究方法，它是PCR 技术、荧光标记技术、DNA 限制性酶切技术和DNA 序列自动分析技术的综合运用。

该技术要依据微生物的比较基因组学信息，确定合适的DNA 目的序列，然后根据基因的保守区设计通用引物，其中1个引物的5’端用荧光物质标记，常用的荧光物质有：四氯荧光素TET ，绿色的六氯荧光素HEX 和蓝色的六羧基荧光素6-FAM 。提取样品中的总DNA ，以总DNA 为模板进行PCR 扩增，PCR 产物纯化后用四碱基限制性内切酶酶切，消化产物在自动测序仪上进行检测，就可以检测出末端被荧光标记了的限制性片段，得到末端片段峰，而未用荧光标记的片段是检测不到的。不同的末端片段峰代表不同种类的微生物，所以通过峰高或峰面积的大小、峰的数量可以判断出微生物群落的结构、功能及其变化情况[3]。

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T-RFLP 技术应注意的环节及优化

2.1 土壤微生物总DNA 的提取

提取土壤中微生物总DNA 是运用T-RFLP 技术的关键步骤，总DNA 的产量和纯度会直接影响实验结果。土壤微生物DNA 的提取方法有2种，分别是直接提取法和间接提取法。直接提取法是通过化学、物理或酶等手段直接作用于土壤，破坏其微生物细胞，释放出DNA 分子，然后将DNA 纯化；间接提取法是先将微生物从土壤

中分离出来，然后进行DNA 的提取和纯化。Leff 等[4]分析比较了2种提取方法，结果发现2种方法各有优劣：直接提取法提取的DNA 产量较高，但DNA 损伤比较严重；间接提取法能获得纯度较高的DNA ，但产量较低。近年来，土壤DNA 提取试剂盒因其提取速度快、效果好、DNA 纯度高而受到广泛关注，用试剂盒提取出来的DNA 更适合做PCR 扩增分析，因此，在经济允许的条件下，尽量采用试剂盒法提取土壤微生物的总DNA 。2.2 限制性内切酶的选择

选择能够明显区分不同微生物的四碱基限制性内切酶，即酶切后产生的末端片段峰的大小有明显的差别，应尽量避免只相差1个碱基的情况，确保消化反应得到的单峰具有特异性，尽量减少杂峰的产生。需要注意的是，由于杂峰的存在会严重影响对样品微生物的分析和认识，所以不能单纯地将产生末端限制性片段的数量作为限制性内切酶的选择标准，应用纯培养物检验后再对样品进行分析，确保选择到合适的限制性内切酶。还可以选用多个限制性内切酶进行酶切，然后综合不同酶的酶切结果，这样可以大大提高检出效率。采用多种酶进行酶切时，不能将几个酶在同一个反应体系中进行，需要它们在各自的反应体系中分别进行酶切，因为双酶切有可能比单酶切产生的TRF 还要少[5]。2.3 图谱的解读

DNA 测序仪的荧光检测器可以检测到带有荧光标记物质的限制性片段（T-RF ），对应到T-RFLP 图谱上就是各个“峰”，峰的横坐标表示片段长度，是在比较各片段与标样中已知的DNA 片段在电泳中的位置后，通过计算得到的；峰的纵坐标表示带有荧光物质T-RF 的荧光强度，峰面积则表示片段长度相同的所有T-RF 的荧光强度之和，分析图谱的时候，通常将每个T-RF 作为一个“OTU ”（operational taxonomic unit ），根据图谱中OTU 的数目及其丰度计算多样性指数、均匀度指数等指标，进行群落多样性的分析研究。

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T-RFLP 技术在土壤微生物多样性研究中的应用

3.1 T-RFLP 图谱直观分析

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T-RFLP图谱可以反映出样品的很多信息，片段长度、荧光强度、丰富度等指标可采用直接观察法进行直观分析，一些研究将T-RFLP图谱进行比较，初步判断不同处理间是否存在差异：陈冬梅等[6]通过比对白肋烟不同种植年限的T-RFLP图谱发现，其根际细菌群落在团棵期和成熟期均呈现明显差异；张重义等[7]采用该方法分析得出，在块根膨大期，不同种植年限地黄根际细菌群落存在明显差异。还有些研究则根据T-RFLP图谱判断物种丰富度的变化趋势：杨宇虹等[8]将连作烟草根际土壤的T-RFLP图谱与对照处理进行比较，发现连作会使烟草根际土壤细菌群落数量减少，物种丰富度降低，趋于单调。封晔等[9]研究了8种植物根际细菌的多样性，发现8个T-RFLP图谱均有较多峰，且峰值间的差异较大，说明8种植物根际细菌的丰富度较高，但在数量、片段大小上存在一定差异。直接观察法只能对数据进行初步的判断分析，更深入的数据解析如多样性分析、聚类分析、冗余分析等还需要借助统计学、生物数学的算法以及Excel、SPSS等数据处理软件。

3.2 微生物多样性指数分析

多样性指数是土壤微生物群落多样性的重要指标，可根据T-RFLP图谱的OTU数目及其丰度计算多样性指数，然后用Biological Tools软件对其进行分析。不同的施肥制度会直接影响到农作物的生长及其产量，还会使土壤的理化性状发生改变，从而改变土壤微生物的数量、活性及群落结构组成。曾希柏等[10]分析了不同施肥模式下设施菜地的细菌群落，发现Shannon指数、Evenness 指数和Simpson指数在1/2MNPK处理0~20cm表层土壤中数值最大，说明不同施肥处理细菌的丰度及优势种群有显著差异，且表层土壤的微生物比较丰富。不同植物的根系分泌物对不同种类的土壤微生物有不同的影响，比如某个植物的根系分泌物会促进一些土壤微生物的生长，而对其他土壤微生物产生抑制作用。封晔等[9]分别计算了8种植物根际细菌的Shannon指数和Evenness指数，结果表明，六道沟流域内树种的不同是导致根际细菌多样性出现差异的因素之一。秦越等[11]对马铃薯连作栽培土壤进行微生物多样性分析，发现连作栽培马铃薯后土壤细菌和真菌DNA仍具有较高的T-RFLP多态性，但不同连作年限的根际土壤，其优势T-RFs片段不同，且长年连作会导致某些T-RFs消失。

4T-RFLP技术的局限性及应用前景

T-RFLP技术在研究土壤微生物群落多样性领域中，不论是从技术本身的灵敏度和精确度来看，还是从实验经费方面考虑，都具有很大的优势，但也存在一些局限性：T-RFLP技术前期需要进行PCR扩增和限制性内切酶酶切，如果近缘种微生物在扩增片段靠近荧光标记端的切点一样时，T-RFLP图谱上的1个峰就有可能代表多种微生物，因此无法区分近缘种微生物[12]；T-RFLP 技术只能根据原始数据计算出每个片段的相对丰度，因而得到的结果只能看出各类微生物所占比例，并不能确定某一生态系统中各类微生物的绝对含量，即便某些微生物在数量上有所改变，单从相对比例上也无法准确地看出其变化趋势；在原始数据的处理时，片段长度范围的确定、噪声峰的去除及大小相近的片段合并都会对结果造成影响，尤其是片段的合并存在很大的人为因素，不同的人处理的数据会有所差异，导致结果出现偏差，不能非常准确地反映土壤微生物群落结构。

尽管T-RFLP技术在某些方面存在一定的局限性，但综合来看，该技术仍是分析土壤微生物群落多样性的理想方法之一。近年来核酸测序技术的不断发展、数据库中核酸序列的不断丰富，因此利用分子手段分析土壤微生物群落多样性已成为必然趋势。随着T-RFLP技术自身参数的不断优化，再结合实时荧光定量PCR、克隆等定量分析技术，该技术必将会在土壤微生物群落分析研究中发挥更大的作用。

参考文献

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作者简介：马琳（1990-），女，硕士研究生，主要从事土地整治工程研究；张卫华（1983-），男，博士，工程师，主要从事水土资源管理和土地工程技术研究。